專利名稱:Asia1型口蹄疫病毒感染性cDNA及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及單股正鏈RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其構建方法，本發(fā)明還涉及由該Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA和表達T7RNA聚合酶的真核表達載體所組成的江蘇譜系Asial型ロ蹄疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)；本發(fā) 明還進一歩涉及該感染性cDNA通過體外轉錄以及該反向遺傳操作系統(tǒng)通過體內轉錄的方式在拯救ロ蹄疫病毒中的應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
ロ蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)屬于小 RNA病韋科ロ蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA，其基因組RNA全長約8. 5kb。ロ蹄疫是嚴重危害偶蹄動物的重要傳染病之一，該病引起幼畜死亡、產奶量下降、肉食減少、肉品下降、動物的生產性能降低，導致巨大的經濟損失。此外，由于貿易的限制和禁止而引起的損失更大，全世界毎年由此造成的直接經濟損失可達數(shù)百億美元。2005年以來在我國江蘇、山東、甘肅、北京、河北等地爆發(fā)了 Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登錄號EF149009)，由于在我國江蘇省首先分離，被稱作Asial型江蘇譜系。該譜系ロ蹄疫病毒在我國牛群中ー經流行，傳播趨勢迅猛，造成的損失極為嚴重。因此，積極開展Asial型FMD江蘇譜系毒株的研究，對我國FMD的防控具有重要的意義。
反向遺傳操作系統(tǒng)是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通過對病毒基因組進行定點突變、缺失、替換基因組的任意部分以產生突變體，借此在分子水平上研究病毒基因的結構與功能、了解決定病毒毒力的分子基礎、宿主嗜性與跨種傳播的機制。感染性克隆還可用于抗原表位的研究，特別是構象表位的研究。為研究病毒減毒奠定了實驗基礎，為研制新型疫苗提供了有力的工具。
目前已經有報道成功構建了牛源毒株OlK株(Zibert A, Maass G, Strebel K, etal.Infectious loot-and—mouth disease viruses derived from acloned full-lengthcDNA[J], J Virol，1990,64 :2467-2473)、牛源毒株 A12 株(Rieder E, Bunch T, Brown F,et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruses with poly (C) tractsof two nucleotide arevirulent in mice[J]. J Virol, 1993,67 :5139-5145)、豬源毒株0H/99 株(Guanqing liu, et al. Generation of an infectious cDNA clone of anFMDVstrain isolated from swine. Virus Research, 2004,104 :157-164)以及兔化弱毒疫苗株ZB/CHA/58 (att)(中國專利公開號CN101225395A，發(fā)明名稱亞洲ー型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其構建方法。)ロ蹄疫病毒的感染性cDNA，并在此基礎上對FMDV進行了探索性的研究。但上述感染性克隆與我國近年來流行的江蘇譜系Asial型ロ蹄疫病毒有著很大的遺傳偏離，因此構建符合我國流行情況的江蘇譜系Asial型ロ蹄疫病毒的反向遺傳操作平臺，對開展Asial型ロ蹄疫病毒結構與功能研究以及新型疫苗的研制具有重要的意義。

發(fā)明內容
[0005]本發(fā)明的首要目的是提供ー種Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA，該全長感染性cDNA包含了保證所合成的轉錄本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poly (C)序列；
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶啟動子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位點；其中，所述的3’末端限制性酶切位點是EcoRV酶切位點或NotI酶切位點；5’末端上游具有SphI酶切位點。
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA克隆除了啟動子，poly (A)序列和PoIy(C)序列之外，其余的核苷酸序列與ロ蹄疫 病毒基因組天然序列相差不超過6個核苷酸序列；
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA克隆的poly (C)結構具有14-20個聚合C，poIy(A)尾具有19-22個A(更優(yōu)選為具有19個A) ；poIy(C)結構及其側翼序列是通過RT-PCR直接擴增得到，利用FMDV基因組中自然存在的兩個限制性內切酶識別位點，將獲得的包含PoIy(C)結構的片段導入全長cDNA中。
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA以pBluescriptSK (+)為載體；
進ー步優(yōu)選的，所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA，包含SEQ ID NO 1所示的序列。
一種構建上述Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA的方法，包括
(I)以Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒RNA為模板，應用5’RACE方法擴增基因組的5’末端序列片段；
(2)采用RT-PCR獲得ロ蹄疫病毒基因組各部分的6個片段，包括poly (C)結構及其側翼序列；
(3)將所擴增的PCR片段采用限制性內切酶酶切克隆的方法組裝克隆到質粒載體中，全長cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶啟動子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位點；
(4)將所述cDNA各片段連接，構成帶有基因組全長cDNA的質粒載體；純化回收包含病毒基因組全長cDNA的質粒，即得。
其中，步驟(I)所用到引物序列為SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16所示；步驟(2)中所用到引物序列為 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQID NO :12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14 所示；
步驟(3)中所述的質粒載體是pBluescript II SK (+)載體；
本發(fā)明的另ー目的是提供ー種Asial型ロ蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng),該Asial型ロ蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)由上述的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA和表達T7RNA聚合酶的真核表達載體所組成。
所述的表達T7RNA聚合酶的真核表達載體pT7RNAP，其構建方法包括將T7RNA聚合酶基因克隆到真核表達載體PCDNA3. I中，并在該基因的5'端引入Kozak序列，以確保T7RNA聚合酶的高效表達；
同吋，為檢測表達載體pT7RNAP是否表達pT7RNAP以及該酶是否具有轉錄活性，構建了以綠色熒光蛋白為檢測信號的檢測載體PT7-IRES-EGFP，該載體是利用FMDV的IRES能夠介導非帽依賴性表達外源基因的特性，將FMDV的IRES和EGFP順次克隆到原核表達載體PET-28a中，并使之受控于ロ蹄疫病毒的IRES元件下；
把上述兩個重組質粒共轉染BHK-21細胞，培養(yǎng)20 48h，在紫外顯微鏡下觀察，能夠看到典型的綠色熒光，表明PT7RNAP載體能夠表達I7RNA聚合酶并具有轉錄活性。[0022]本發(fā)明的另ー個目的是將所構建的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA用于拯救ロ蹄疫病毒，包括將所述Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA采用體外轉錄的方式轉染BHK-21細胞；或者是將所述Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA與表達I7RNA聚合酶的真核表達載體共轉染(體內轉錄)BHK-21細胞以拯救ロ蹄疫病毒；
試驗證明，利用本發(fā)明所構建的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA不倫是采用體外轉錄還是采用體內轉錄(與表達I7RNA聚合酶的真核表達載體共轉染)的方式均可以成功的拯救出ロ蹄疫病毒。
本發(fā)明ロ蹄疫病毒感染性cDNA不同于國內外ロ蹄疫病毒感染性cDNA的地方主要有以下幾點
(I)美國的感染性cDNA是以A型ロ蹄疫病毒為材料研制出來的，德國的感染性cDNA是以歐洲流行毒株的代表株OlK為原材料的，分離自牛體。本發(fā)明所選用的毒株為我國流行的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株，分離自牛體，反映了我國ロ蹄疫的流行特點，因此本發(fā)明ロ蹄疫病毒感染性cDNA對我國ロ蹄疫的研究更具有針對性，對我國ロ蹄疫的防控具有積極的意義。
(2)研制感染性cDNA的策略不同
美國的A株感染性cDNA是用人工方法合成一系列長度的poly (C) (Cn = 2、6、16、25，35)，并人為的在poly(C)兩端加上限制性內切酶識別位點，并在基因組全長cDNA片段下游中加入相應的內切酶識別位點，從而將Poly(C)導入全長cDNA序列中，這種策略會在全長cDNA中造成堿基的改變并引入非基因組的核苷酸。
德國的0IK株感染性cDNA是利用末端轉移酶的酶促活性，給全長cDNA加上poly (C)結構，這種方法不能人為控制，可操作性差，而且也需要改變全長cDNA的真實序列。
本發(fā)明通過RT-PCR直接擴增獲得poly(C)及其側翼序列，利用FMDV基因組中自然存在的限制性內切酶識別位點，將Poly(C)結構導入全長cDNA中，不需要改變基因組的真實序列，可操作性強。
(3)所包含的poly(A)尾巴序列長度不一樣美國的A型感染性cDNA含有15個A,德國的OlK株感染性cDNA含有90個A。本發(fā)明感染性cDNA含有19個A這ー長度的poly(A)結構，能夠保證病毒感染性的需要。
(4)國內外建立ロ蹄疫病毒的反向遺傳操作平臺均是使用體外轉錄的方法拯救病毒，而本發(fā)明建立了拯救ロ蹄疫病毒的體內轉錄和體外轉錄的雙系統(tǒng)。
目前，判斷所構建的ロ蹄疫病毒感染性cDNA是否符合要求關鍵要滿足以下幾點要求
(I)病毒基因組在分子克隆過程中要確保其真實性因開放閱讀框中的一個堿基的變化就有可能會影響整個基因組的結構從而導致整個全長質粒不具備感染性；此外，因為RNA病毒自身的特點，其基因組并不穩(wěn)定；
(2)要保證所構建的感染性cDNA含有足夠長的poly (C)序列和poly (A)尾巴結構；
(3) 3’末端具有合適的限制性酶切位點；
本發(fā)明所述的全長感染性cDNA除了啟動子、poly (A)序列和poly (C)序列之外，其余的核苷酸序列與ロ蹄疫病毒基因組天然序列相差不超過6個核苷酸序列，poIy(C)結構及其側翼序列是通過RT-PCR直接擴增得到，所以本發(fā)明感染性cDNA在克隆過程中其真實性高；另外，本發(fā)明全長感染性cDNA的poIy(A)尾具有19-22個A ;所述poly (C)結構具有14-20個聚合C，含有足夠長的poIy(C)序列和poIy(A)尾巴結構；所述感染性cDNA的3’末端具有EcoRV酶切位點或NotI酶切位點。
本發(fā)明的感染性cDNA的成功構建將為研究ロ蹄疫提供ー個有力的基因技術操作平臺，可以方便人們對ロ蹄疫病毒基因組的操作。具體應用主要有以下幾個方面
(I) 了解基因的結構與功能；
(2) 了解病毒的致病機理和基因組的復制、表達調控機制；
(3)研究病毒與宿主細胞的相互作用；
(4)研究病毒的B細胞表位特別是構象型B細胞表位；
(5)通過反向遺傳操作系統(tǒng)制備不會發(fā)生毒力返祖的減毒疫苗株；
(6)研究開發(fā)新型ロ蹄疫疫苗；
本發(fā)明的Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA，能夠在分子水平上通過突變、插入、缺失和替換來研究ロ蹄疫病毒的復制、毒力的分子決定因素和減毒機制、分子致病機理、基因產物的結構與功能、宿主嗜性改變與跨種傳播，以及減毒活疫苗、表位疫苗、核酸疫苗、標記疫苗等新型疫苗的研究開發(fā)，是進一歩研究ロ蹄疫病毒和防制ロ蹄疫的極有價值的工具。


圖lAsial/YS/CHA/05株FMDV基因組拼接策略示意圖。
圖2pET_28a(+)載體的結構示意圖。
圖 3pBluescript II SK(+)。
圖4pcDNA3. I (+)。
圖5全基因組cDNA的酶切鑒定圖A lkb Ladder ；B =Sphl和Notl雙酶切鑒定；C Ikb Ladder ；D EcoRl 單酶切鑒定。
圖6體外轉錄的RNA電泳圖。
圖7 (A)拯救病毒感染的BHK-21細胞⑶正常BHK-21細胞。
圖8 ロ蹄疫病毒粒子的免疫電鏡觀察(bar = IOOnm)。
圖9搖救病毒分子標簽的鑒定(A) lanel :IOObp DNA Ladder ;lane2 :親本毒PCR產物PstI酶切鑒定；lane3 :拯救病毒PCR產物PstI酶切鑒定(B)親本毒株基因組PstI位點區(qū)的序列分析(C)拯救病毒PstI位點消除的序列分析驗證。
圖10拯救感染BHK-21細胞的免疫熒光檢測(A)拯救病毒感染的BHK-21細胞(B)親本病毒感染的BHK-21細胞(C)正常BHK-21細胞對照。
圖11拯救病毒和親本病毒的一步生長曲線。[0056]圖12I7RNA聚合酶的表達和活性檢測(A)pI7RNAP和pT7_IRES_EGFP載體共轉BHK-21細胞后48h EGFP表達情況；(B)pEGFP-Nl載體轉染BHK-21細胞作為陽性對照；(C)PT7-IRES-EGFP載體轉染BHK-21細胞作為陰性對照。[0057]圖13pT7RNAP 載體和 p!7-IRES_EGFP 載體示意圖。
具體實施方式
一、試驗材料、有關術語和方法
在本發(fā)明中，所述的術語“反向遺傳操作”指的是相對于經典遺傳學而言的，是在獲得ロ蹄疫病毒(Asial/YS/CHA/05株)基因組全部序列的基礎上，按組成順序構建全長病毒基因組，讓其裝配出具有生物活性的病毒粒子，為進ー步對ロ蹄疫病毒病毒基因進行必要的加工和修飾，如定點突變、基因插入/缺失、基因置換等，從而研究基因組的結構與功能，以及這些修飾可能對病毒的表型、性狀有何種影響等方面的內容奠定實驗基礎。
本發(fā)明所述Asial型ロ蹄疫病毒毒株指的是Asial/YS/CHA/05株。
本發(fā)明中所用到的參考文獻(I)王海偉，涂亞斌，周國輝，楊德成，張亞科，于力，Asial型ロ蹄疫病毒感染性克隆的建立。中國預防獸醫(yī)學報，2008年第12期；(2)楊德成，涂亞斌，王海偉，周國輝，于力，0型ロ蹄疫病毒泛亞譜系感染性克隆的建立，中國預防獸醫(yī)學報，2009 年第 I 期；(3) Zibert A, Maass G, Strebel K, etal. Infectiousloot-and—mouth disease viruses derived irom a clonea lull—length cDNA. J Virol,1990,64 :2467-2473 ； (4)Rieder E, Bunch T, Brown F, et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruseswith poly (C) tracts of two nucleotide are virulentin mice. J Virol, 1993,67 :5139-5145.
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室指南》(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)中所述的條件進行。
在本發(fā)明的實施例中，使用的含ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株完整基因組的質粒PASi(保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保藏號為=CGMCC2689 ;其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)) ；T7 RNA聚合酶的真核表達載體質粒PT7RNAP (保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保藏號是CGMCC 2688，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli));檢測17 RNA聚合酶活性的載體質粒PI7-IRES-EGFP (保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保存號是=CGMCC 2690 ;其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli))。
在本發(fā)明的實施例中，使用的質粒與菌株pBluescript II SK(+)載體購自Stratagene公司，DH5a感受態(tài)細胞、BHK-21細胞由本實驗室保存。
在本發(fā)明的實施例中，使用的其他試劑PrimeSTAR DNA聚合酶、各種限制性內切酶、dNTPs、DNA Ladder Marker、5’FULL-RACEKit 購自 TaKaRa 公司；堿性磷酸酶、T4 DNA 連接酶New EnglandBiolabs公司；TRIzol購自GibcoBRL公司，體外轉錄米用Promega公司的 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_T7 試劑盒。轉染試劑米用 QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent轉染試劑盒，羊抗鼠突光二抗購自Sigma公司。SDS、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、Tris、EDTA、焦碳酸ニこ酯(DEPC)等試劑均為國外產品國內公司分裝；氯化鈉、氯仿、異丙醇、こ醇、異戊醇、NaCl、MgCl2、磷酸ニ氫鈉、飽和酚等均為國產分析純試劑。
實施例I Asial型ロ蹄疫病毒江蘇譜系反向遺傳操作系統(tǒng)的建立
在本發(fā)明的實施例中，BHK-21單層細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，在含5% C02的培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。Asial型ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株與Asial/JS/CHA/05毒株(GenBank登錄號EF149009)的核苷酸序列同源性在98 %以上，屬于相同來源，其基因組全長8193bp,包含14nt poly(C)和19nt poly(A)。病毒在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中繁殖，當80%的細胞出現(xiàn)CPE時收獲病毒，反復凍融三次后，2000 Xg (40C )離心 lOmin，上清于-70°C保存。I. I引物設計
根據ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株的全基因組測序結果，設計引物，分別作為PCR擴增的引物；
I. 2 5' RACE
用5’FULL-RACE試劑盒，采用“去帽法原理”，測定病毒基因組5’末端的真實序列。簡言之，用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5’端帽子結構，之后用T4RNA Ligase將5’ RACEAdaptor連接到mRNA的5’端，最后用5’ RACE Adaptor上的引物與已知序列部分的引物進行反轉錄和PCR擴增5’末端序列，采用的引物見表I。
表I FMDV Asial/YS/CHA/05株基因組PCR擴增的引物
權利要求
1.一種Asial型江蘇譜系口蹄疫病毒的全長感染性cDNA，其特征在于所述的全長感染性cDNA序列為SEQ ID NO 1所示的序列。
2.—種Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，由權利要求
I所述的Asial型江蘇譜系口蹄疫病毒的全長感染性cDNA和表達I7RNA聚合酶的真核表達載體所組成。
3.按照權利要求
2所述的Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于所述的表達17 RNA聚合酶的真核表達載體是pT7RNAP，其構建方法包括將17 RNA聚合酶基因克隆到真核表達載體p⑶NA3. I中，并在該基因的5'端引入Kozak序列。
4.按照權利要求
2或3所述的Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于還包括一種檢測表達I7RNA聚合酶的真核表達載體是否表達以及所表達的酶是否具有轉錄活性的檢測表達載體。
5.按照權利要求
4所述的Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于所述的檢測表達載體是PI7-IRES-EGFP，其構建方法包括將FMDV的IRES和EGFP順次克隆到原核表達載體PET-28a中，并使EGFP受控于口蹄疫病毒的IRES元件下，即得。
6.權利要求
I所述全長感染性cDNA在拯救口蹄疫病毒中的應用，包括將所述的全長感染性cDNA和17 RNA聚合酶的真核表達載體共轉染哺乳動物細胞，拯救得到口蹄疫病毒。
專利摘要
本發(fā)明公開了Asial型江蘇譜系口蹄疫病毒感染性cDNA及其構建方法和應用。所述感染性cDNA包含了保證合成轉錄本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poIy(C)序列，所述poIy(A)尾具有19-22個A；所述poIy(C)結構具有14-20個聚合C；其5’末端具有T7RNA聚合酶啟動子序列，3’末端具有單一的限制性酶切位點。所述感染性cDNA可以和表達T7RNA聚合酶的真核表達載體組成反向遺傳操作系統(tǒng)。該感染性cDNA及其反向遺傳操作系統(tǒng)可用于拯救口蹄疫病毒，為研究口蹄疫病毒基因的結構與功能、病毒的分子致病機理、開發(fā)口蹄疫病毒減毒疫苗株和新型口蹄疫疫苗等奠定了實驗基礎。
文檔編號C12N7/00GKCN101724636 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200810171258
公開日2012年9月5日 申請日期2008年10月30日
發(fā)明者于力, 周國輝, 楊德成, 涂亞斌, 王海偉 申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),