專利名稱：：一種檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法。技術(shù)背景通過(guò)水傳播的病原微生物是危害人類健康和生態(tài)安全的重大隱患，全世界約有1/4的疾病是由水中病原微生物直接或間接引起的(Gerba,C.P.，Pathogensintheenvironment.In:Pepper,I丄，Gerba,C.P.，Brusseau，M丄(Eds.),PollutionScience.AcademicPress,NewYork,1996.p.279-299)。輪狀病毒是水環(huán)境中廣泛存在的病原微生物之一，主要來(lái)自人和動(dòng)物的排泄物(MortezaAbbaszadegan，PeterStewart,1andMarkLeChevallierAStrategyforDetectionofVirusesinGroundwaterbyPCRAppliedandEnvironmentalMicrobiology,February1999，65(2):444-449)。在全球范圍內(nèi)，輪狀病毒是引起腹瀉最主要的原因，每年因水傳播輪狀病毒造成腹瀉人數(shù)約為1.11億，死亡人數(shù)高達(dá)44萬(wàn)(UmeshD.Parashar，ErikG.Hummelman，JosephS.Bresee，MarkA.Miller,卞andRogerI.GlassGlobalIllnessandDeathsCausedbyRotavirusDiseaseinChildrenEmergingInfectionsDiseases2003Vol.9，No.5)。我國(guó)秋冬季節(jié)50%60%的嬰幼兒腹瀉都是由輪狀病毒引起的(常汝需，何翠娟.腹瀉患兒糞便標(biāo)本中輪狀病毒檢測(cè)方法比較[J].中華兒科雜志，2000，38(11):703704)。同時(shí)，輪狀病毒還可以感染動(dòng)物，是動(dòng)物病毒性腹瀉的主要原因(Bernd-AndreasSchwarz，ReinhardBange,ThomasW.Vahlenkamp，ReimaxJ"ohne，HermannMullerDetectionandquantitationofgroupArotavirusesbycompetitiveandreal-timereversetranscription-polymerasechainreactionJournalofVirologicalMethods105(2002)277-285)。這些輪狀病毒進(jìn)入水環(huán)境中后，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里仍保持較高的傳染性和致病性，常規(guī)的水處理和消毒工藝不能完全將其去除禾口滅活(Hambidge，A.，Reviewingefficacyofalternativewatertreatmenttechniques.HealthEstate2001.55(6)，23-25)，已有眾多研究者在污水(Baggi，F(xiàn).，Peduzzi，R.，2000.GenotypingofrotavirusesinenvironmentalwaterandstoolsamplesinSouthernSwitzerlandbynucleotidesequenceanalysisof189basepairsatthe5—endoftheVP7gene.J".Clin.Microbiol.38，3681-3685)、地表水(Baggi,F.，Peduzzi，R.，2000.GenotypingofrotavirusesinenvironmentalwaterandstoolsamplesinSouthernSwitzerlandbynucleotidesequenceanalysisof189basepairsatthe5—endoftheVP7gene.J.Clin.Microbiol.38，3681-3685;Gilgen,M.，Germann,D.,Luthy，J".，Hubner,Ph.,1997.Three-stepisolationmethodforsensitivedetectionofenterovirus,rotavirus,hepatitisAvirus,andsmallroundstructuredvirusesinwatersamples.Int.J.FoodMicrobiol.37，189-199)、地下水以及飲用水(Gratacap-Cavallier，B.，Ge畫(huà)laz，0.，Brengel-Pesce，K.，Soule，H.，Innocenti-Francillard,P.，Bost，M.,Gofti，L，Zmirou，D.，Seigneurin，J.M.,2000.Detectionofhumanandanimalrotavirussequencesindrinkingwater.Appl.Environ.Microbiol.66，2690-2692)中檢測(cè)出輪狀病毒。因此，快速準(zhǔn)確檢測(cè)水環(huán)境中的輪狀病毒，對(duì)于降低輪狀病毒感染風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防控制輪狀病毒疾病爆發(fā)流行、保障水質(zhì)安全具有十分重要的意義。水環(huán)境樣品中輪狀病毒傳統(tǒng)檢測(cè)方法是細(xì)胞培養(yǎng)法，這種方法操作復(fù)雜、所需時(shí)間長(zhǎng)，特異性不強(qiáng)，而且此方法還需要專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員，限制了其在水質(zhì)管理中的廣泛應(yīng)用。近十多年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，呈現(xiàn)靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，為水環(huán)境中輪狀病毒的快速檢準(zhǔn)確檢測(cè)提供了新手段，成為水環(huán)境中輪狀病毒檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。Kittigula等(LeeraKittigula,SomEkchaloerakieta，F(xiàn)uangfaUtraxachkija，KanokratSiripanichgona，DusitSujiraratb，SupomvitPungchittona，AugsanaBoonthumcAnefficientvirusconcentrationmethodandRT—nestedPCRfordetectionofrotavirusesinenvironmentalwatersamplesJournalofVirologicalMethods124(2005)117-122)在RV的VP7上設(shè)計(jì)引物，利用RT-nest-PCR方法檢測(cè)河流、生活污水和污水中的RV，最低可檢測(cè)到1.67PFU的RV，進(jìn)而對(duì)RT-nest-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，所有的結(jié)果都符合VP7的基因序列。但是單純利用這些方法只能確定水環(huán)境樣品中是否存在輪狀病毒的核酸，并不能提供其是否具有感染性等信息。(Clinicalmicrobiologicalreview65:4118—4125，2003)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法，是將待檢測(cè)樣品和輪狀病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)，然后提取所述宿主細(xì)胞的總RNA，利用由核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR，如待檢測(cè)樣品中得到300-400bp的PCR產(chǎn)物，則所述待檢測(cè)樣品中有感染性輪狀病毒。所述PCR產(chǎn)物的大小具體為318bp。所述共培養(yǎng)的時(shí)間具體可為24-72小時(shí)。該方法中，其培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)宿主細(xì)胞的條件。所述待檢測(cè)樣品具體可為水樣。其中，所述待檢測(cè)樣品在與輪狀病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)之前，需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行如下處理1.將大體積水樣濃縮，如濃縮至lml。2.將待測(cè)樣品用0.2um的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。3.向除菌后的待測(cè)樣品中加入無(wú)菌胰酶，混勻，37"C溫育lh，以提高輪狀病毒感染宿主細(xì)胞的能力。所述輪狀病毒的宿主細(xì)胞優(yōu)選為容易培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，如MA-104細(xì)胞(恒河猴腎細(xì)胞系)。其中，序列表中序列1的核苷酸序列是5'-CCTCACTTATACACTTTGCC-3';序列表中序列2的核苷酸序列是5'-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3'。本發(fā)明中所用的上下游引物分別為序列1和序列2，該引物位于與輪狀病毒感染性密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白VP7的保守區(qū)域，因此基于此建立的方法可檢測(cè)廣泛的、具有感染性的輪狀病毒，提高了檢測(cè)范圍和精度。本發(fā)明的方法將傳統(tǒng)檢測(cè)輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)法與RT-PCR方法相結(jié)合，利用RT-PCR方法快速、靈敏、特異地檢測(cè)感染性輪狀病毒在宿主細(xì)胞(如MA-104)中復(fù)制產(chǎn)生的RNA來(lái)檢測(cè)具有感染性的輪狀病毒。本發(fā)明方法一方面通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)法識(shí)別擴(kuò)增環(huán)境樣品具有感染性的輪狀病毒，提高其檢測(cè)的敏感性，降低環(huán)境樣品中雜質(zhì)對(duì)后續(xù)RT-PCR反應(yīng)的干擾，另一方面利用輪狀病毒致病基因VP7保守片斷設(shè)計(jì)的特異性引物及優(yōu)化后的RT-PCR反應(yīng)條件，快速靈敏準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞中復(fù)制的輪狀病毒RNA，最終達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測(cè)環(huán)境中具有感染性輪狀病毒的目的。本發(fā)明不僅具有特異性好、靈敏度高、抗雜質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且還能提供環(huán)境介質(zhì)中輪狀病毒潛在的感染效應(yīng)等信息，為快速檢測(cè)環(huán)境介質(zhì)中具有感染性的輪狀病毒、評(píng)估環(huán)境中輪狀病毒感染風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防輪狀病毒疾病爆發(fā)流行提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。圖1為T(mén)rizol法提取RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖2為不同退火溫度的PCR結(jié)果圖3為ICC-RT-PCR方法檢測(cè)不同感染時(shí)間的輪狀病毒的情況圖4為ICC-RT-PCR方法檢測(cè)飲用水中具有感染性的輪狀病毒結(jié)果具體實(shí)施方式實(shí)施例1、檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法1.輪狀病毒滴度測(cè)定采用組織培養(yǎng)半感染量(Mediantissuecultureinfectiondose，TCID5。)滴定。1)輪狀病毒宿主細(xì)胞MA-104細(xì)胞系的培養(yǎng)將恒河猴腎細(xì)胞系MA-104細(xì)胞株接種于5ml含有10%FBS的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液中，37°C5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2—3天傳代一次。傳代時(shí)取長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，棄去陳舊細(xì)胞培養(yǎng)液，用少量PBS溶液清洗細(xì)胞表面一次，加入少量胰酶消化液(能蓋住細(xì)胞表面即可)，37'C消化。顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞腫脹、變圓時(shí)，加入含有10X胎牛血清的DMEM(高糖)細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打幾次，形成均勻的細(xì)胞懸液，900rpm離心5min，棄上清，加入10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，按l:2比例移至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C5%(:02培養(yǎng)。取生長(zhǎng)到90X匯合的MA-104細(xì)胞，用2.5X的胰酶消化MA-104細(xì)胞，吹打成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，配成8000—10000個(gè)細(xì)胞/100wl的細(xì)胞懸液。迅速加入到96孔板中，每孔100ul，在加入96孔板的過(guò)程中不斷吹打混勻。37°C，5%0)2孵育24h左右，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合，用于接種病毒。2)輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)(1)取約500u1輪狀病毒SA-11株(ATCC號(hào)為VR-1565)病毒液，加入等體積0.002%的胰酶，混勻，37。C溫育lh。(2)將胰酶處理后的RVSA-11接種于生長(zhǎng)良好的MA-104單層細(xì)胞，37。C吸附2h，每隔20min搖動(dòng)一次，以便RV與細(xì)胞充分接觸。(3)去除所有吸附液體，加入5ml含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基。(4)37°C，5%0)2孵育5-8天，見(jiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)CPE(細(xì)胞變大變圓、脫落)。(5)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，800rpm離心5min，去除細(xì)胞碎片。(6)混勻后分裝，一8(TC保存?zhèn)溆谩?)輪狀病毒感染宿主細(xì)胞MA-104細(xì)胞系分別取100yl輪狀病毒SA-ll株培養(yǎng)液，按l:IO梯度稀釋，g卩l(xiāng)OOiU病毒液加入900ul無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，混勻。依次稀釋，更換吸頭。使其成為10°、10—1、10_2、10—3、10—4、10—5、10—e共7個(gè)稀釋梯度。將不同稀釋梯度的病毒液加到96孔板種，每個(gè)稀釋度重復(fù)6孔，每孔加入100yl病毒稀釋液，37°C,5%C02孵育lh，每孔加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別設(shè)置病毒陽(yáng)性對(duì)照(100y110°稀釋度SA-11株培養(yǎng)液)和陰性對(duì)照(lOOulDMEM培養(yǎng)基)。每日觀察、記錄不同稀釋梯度發(fā)生細(xì)胞病變(CPE)的孔數(shù)，直到陰性對(duì)照細(xì)胞完全脫落為止。根據(jù)Reed-Muench，計(jì)算TCID50。結(jié)果如表l所示，表明SA-11株TCID50在10—3(100%)和10—4(17%)之間，距離比=(高于50%的百分?jǐn)?shù)一50)/(高于50%的百分?jǐn)?shù)一低于50%的百分?jǐn)?shù))=(92.8—50)/(92.8—14.3)=0.5將計(jì)算得到的距離比0.5加在高于50%的病毒稀釋度的對(duì)數(shù)(3)上，因此該病毒的TCIDs。為100u110—"稀釋的病毒液，査反對(duì)數(shù)，為3548，即該病毒液100ul稀釋3548倍，為1個(gè)TCID50。lmLTCID50為10—45，Log(TCID5。/mL)為4.5。實(shí)驗(yàn)測(cè)得步驟2)獲得含SA-11株病毒液的滴度為10"TCID5。/mL。表l、SA-11株TCID50測(cè)定原始數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、RT-PCR的方法A、細(xì)胞RNA提取及質(zhì)量鑒定方法(1)取lml滴度為101'5TCID5。/mL輪狀病毒SA-11株(ATCC號(hào)為VR-1565)的輪狀病毒液，分別加入100u1的0.002%的胰酶37。C孵育lh。(2)取培養(yǎng)至90%匯合的MA-104細(xì)胞(25cm2)，用無(wú)菌PBS緩沖液洗2次，接種胰酶處理后的輪狀病毒液，37'C吸附2h，每隔20min搖動(dòng)一次細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便病毒充分接觸細(xì)胞。(3)去除所有吸附液，加入3mL含2XFBS的DMEM培養(yǎng)基，37°C，5%0)2培養(yǎng)2天，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。B、Trizol法提取細(xì)胞總RNA(1)去除細(xì)胞瓶中所有培養(yǎng)液，迅速加入lmLTrizol提取試劑，搖動(dòng)5min，使得Trizol與細(xì)胞充分接觸，以充分裂解蛋白，吸入到1.5ml離心管中。(2)加入200nl三氯甲烷，劇烈振蕩30slmin，室溫放置510rain;4°C，13000rpm，離心15min。(3)吸取上層液體于等體積(約600iU)異丙醇中，劇烈振蕩30slmin，室溫放置10min，4°C，13000rpm，離心15min(在離心管底部可看到少許沉淀。)。(4)棄上清，加lmL75X乙醇(DEPC水配制)，輕輕彈起沉淀，4°C，8000rpm，離心8min。(5)棄上清，室溫干燥5min，待乙醇完全揮發(fā)，加入20ulDEPC水，充分融解RNA。(6)立即做逆轉(zhuǎn)錄或者保存于一80°C。C、RNA質(zhì)量檢測(cè)RNA質(zhì)量檢測(cè)主要通過(guò)一下兩種方法完成(l)用微量核酸定量?jī)x測(cè)定0D260/0D280值及RNA的濃度，以O(shè)D260/OD280值處于1.92.2之間為好。部分樣品檢測(cè)結(jié)果如表2。表2Trizol法提取細(xì)胞RNA質(zhì)量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)瓊脂糖凝膠電泳取RNAlyl加入上樣口，1%瓊脂糖凝膠電泳，120V，電泳1015min，EB染色后凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果，呈現(xiàn)兩條明顯的主帶，分別為28S和18S，表明提取RNA質(zhì)量較好。其中，部分樣品檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，圖1中，1-6為用本發(fā)明的方法提取的不同樣品。D、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1)RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA反應(yīng)體系(10nl)為5XRT-buffer2u1dNTPMixture(各10mM)0.5u1OligodTPrimer(50mM)0.5u1Rtase(200U/U1)0.25u1RnaseInhibitor(40U/ul)0,25ulRNaseFreedH205.51RNA1u12)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C1015min95°C2min逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA直接用于PCR反應(yīng)或者一2(TC保存。E、PCR反應(yīng)的建立及優(yōu)化1)引物設(shè)計(jì)在NCBI網(wǎng)站中下載人輪狀病毒和猴輪狀病毒株SA-ll的所有VP7的序列，利用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和合成，引物的GC含量在40-60%之間，引物長(zhǎng)度在1825bp之間，擴(kuò)增產(chǎn)物〈400bp。設(shè)計(jì)引物序列如下VP7-sense(5-3):CCTCACTTATACACTTTGCC(序列1)VP7-antisense(5-3):TTCGCTTCGTCAGTTTGCT(序列2)2)退火溫度選擇其溫度梯度由梯度PCR儀自動(dòng)生成(表3)。其中，陰性對(duì)照模板為滅菌后的去離子水。表3梯度PCR的溫度梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，退火溫度如表3。4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取10!xl加2"1混勻，經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳3040分鐘后于紫外儀上觀察；若在318bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為輪狀病毒陽(yáng)性，否則為陰性。PCR結(jié)果如圖2所示，表明適于VP7引物的退火溫度為59。C。圖2中，l至8對(duì)應(yīng)于表3中的樣品號(hào)，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)100bpDNALadder。F、在不同感染時(shí)間本發(fā)明的方法可檢測(cè)到輪狀病毒的最低感染滴度主要步驟如下-1.取培養(yǎng)增殖的輪狀病毒液，依次稀釋為lml滴度為(10—2510—85TCID5。/mL)的樣品。2.向步驟1輪狀病毒樣品中加入100u1的0.002%的胰酶，37t:孵育lh。3.取培養(yǎng)至90%匯合的脆-104細(xì)胞(25cm2)，用無(wú)菌PBS緩沖液洗2次，接種步驟2處理后的輪狀病毒液，37。C吸附2h，每20min搖動(dòng)一次細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便病毒充分接觸細(xì)胞。4.去除所有吸附液，加入3mL含2%FBS的DMEM培養(yǎng)。5.分別感染1，2，3，8天后，按照步驟B用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。6.按照步驟D和E，對(duì)提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。其中，PCR的退火溫度為59i:。結(jié)果如圖3所示，表明在感染時(shí)間為2448h時(shí)，該方法最低可檢測(cè)到lml滴度為10—"TCID5。/mL的輪狀病毒；延長(zhǎng)感染時(shí)間至72h，最低可檢測(cè)lml滴度為l(T25TCID5。/mL的輪狀病毒；培養(yǎng)感染輪狀病毒的MA-104細(xì)胞8天，該方法可以檢測(cè)到lml滴度為10—"的輪狀病毒；觀察細(xì)胞均沒(méi)有明顯病變現(xiàn)象。圖3中，M:100bpDNALadder;(A):16，lml滴度分別1025，10"，10°'5，10—°5,l(T15，10—25TCID50/ml的輪狀病毒感染MA-104細(xì)胞1天(24h)后檢測(cè)結(jié)果；7，陽(yáng)性對(duì)照；8，陰性對(duì)照。(B):911，lml滴度分別為10—15,l(T25，10—35TCID50/ml的輪狀病毒感染MA-104細(xì)胞2天(48h)后檢測(cè)結(jié)果；12，陽(yáng)性對(duì)照；13，陰性對(duì)照。(C):1416，lml滴度分別為10—15，10—25，10—35TCID50/ml的輪狀病毒感染MA-104細(xì)胞3天(72h)后檢測(cè)結(jié)果；17，陽(yáng)性對(duì)照；18，陰性對(duì)照。(D):1926，lml滴度分別為10—25，10—3.5，10-4.5，10-55，10-65,10—75，10—85TCID50/ml的輪狀病毒感染MA-104細(xì)胞8天后檢測(cè)結(jié)果；18，陰性對(duì)照。其中，陽(yáng)性對(duì)照為細(xì)胞內(nèi)參照e-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對(duì)照模板為滅菌后的去離子水。其中+表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，一表示檢測(cè)結(jié)果為陰性。實(shí)施例2、ICC-RT-PCR方法檢測(cè)飲用水中感染性輪狀病毒1.分別向1L飲用水中投加100、10、1、0.ly1滴度為104'5TCID5。/ml的輪狀病毒，使水樣中輪狀病毒的滴度分別為10°5、10—°5、l(T15、10—25TCID5。/ml，室溫?cái)嚢?0min。2.分別水樣中加入氯化鋁，使其終濃度為0.05mol/L，攪拌。3.用孔徑為0.45ym、直徑為47mra的醋酸纖維濾膜過(guò)濾水樣，濾速為100ml/min。使病毒吸附在濾膜表面。4.用50mlpH為3.0的112504溶液通過(guò)濾膜，濾速為100ml/min，以洗去濾膜表面陽(yáng)離子。5.取下濾膜，用滅過(guò)菌的剪刀將濾膜剪碎，放入50ml離心管中，加入10mlpH為10.5的NaOH溶液，劇烈振蕩3060s，放置510min，再劇烈振蕩3060min。然后加入50ul50raMH2S04和200ul50XTE緩沖液，振蕩以充分混勻。以洗脫濾膜吸附的病毒。6.將所有洗脫液轉(zhuǎn)移至超濾管(截留分子量為50000道爾頓)中，4°C，2500rpm離心510min，濃縮至O.5lml。7.用孔徑為0.2ixm的無(wú)菌濾器過(guò)濾濃縮至lml的待測(cè)水樣，以去除細(xì)菌。8.將除菌后的水樣加入100u1無(wú)菌的0.002%的胰酶37。C孵育lh，以提高病毒感染宿主細(xì)胞的能力。9.然后用2ml無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基通過(guò)濾器，以減少水樣通過(guò)濾器損失。10.取培養(yǎng)至90X匯合的MA-104細(xì)胞(25cm2)，用無(wú)菌PBS緩沖液洗2次，將過(guò)濾后的水樣和DMEM培養(yǎng)基接種于MA-104細(xì)胞，37。C吸附2h，每20min搖動(dòng)一次細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便病毒充分接觸細(xì)胞。11.去除所有吸附液，加入3mL含2XFBS的DMEM培養(yǎng)基，37°C，5%0)2培養(yǎng)。12.感染2天后，按照實(shí)施例1的Trizol法提取細(xì)胞總RNA。13.對(duì)提取的RNA按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行RT-PCR、瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。其中，PCR的退火溫度為59°C。結(jié)果如圖4所示，輪狀病毒的滴度分別為10°'5、IO一05、10—15、10—25TCID50/ml的水樣檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。圖4中，M:lOObpDNALadder;14，1L輪狀病毒滴度分別10°'5，10-。5，,5，1(F25TCID50/ml的飲用水樣經(jīng)濃縮后，感染MA-104細(xì)胞2天(48h)的檢測(cè)結(jié)果；5，未感染的MA-104細(xì)胞對(duì)照；6，陽(yáng)性對(duì)照模板為滴度為10"TCID5。/mLSA-ll株病毒培養(yǎng)液；7，陰性對(duì)照模板為滅菌后的去離子水。其中+表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，一表示檢測(cè)結(jié)果為陰性。序列表<160>2〈210〉1<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223><400>1cctcacttatacactttgcc20〈210〉2<211〉19<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉2ttcgcttcgtcagtttgct19權(quán)利要求1、一種檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法，是將待檢測(cè)樣品和輪狀病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)，然后提取所述宿主細(xì)胞的總RNA，利用由核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR，如待檢測(cè)樣品中得到300-400bp的PCR產(chǎn)物，則所述待檢測(cè)樣品中有感染性輪狀病毒。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)的時(shí)間為24-72小時(shí)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR產(chǎn)物的大小為318bp。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞為MA-104細(xì)胞。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述待檢測(cè)樣品為水樣。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述水樣在與輪狀病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)之前，對(duì)所述水樣進(jìn)行如下處理將水樣濃縮，過(guò)濾除菌；向除菌后的待測(cè)樣品中加入無(wú)菌胰酶，混勻，37'C溫育lh。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法。該檢測(cè)感染性輪狀病毒的方法，是將待檢測(cè)樣品和輪狀病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)，然后提取所述宿主細(xì)胞的總RNA，利用由核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR，如待檢測(cè)樣品中得到300-400bp的PCR產(chǎn)物，則所述待檢測(cè)樣品中有感染性輪狀病毒。本發(fā)明不僅具有特異性好、靈敏度高、抗雜質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且還能提供環(huán)境介質(zhì)中輪狀病毒潛在的感染效應(yīng)等信息，為快速檢測(cè)環(huán)境介質(zhì)中具有感染性的輪狀病毒、評(píng)估環(huán)境中輪狀病毒感染風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防輪狀病毒疾病爆發(fā)流行提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101126107SQ20071012035公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2007年8月16日優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日發(fā)明者苗何,麗劉,施漢昌,丹李,胡秀華申請(qǐng)人:清華大學(xué)