專利名稱：將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置及粘附方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底上的裝置及粘附方法，特別涉及一 種以有序可控方式將多種細(xì)胞粘附到同一基底上的裝置及粘附方法。
背景技術(shù)：
在細(xì)胞生物學(xué)、組織生物學(xué)的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，以及生物醫(yī)學(xué)工程和基于細(xì)胞和細(xì)胞 之間作用的藥物檢測的應(yīng)用性研究中，往往需要在同一表面固定兩種或多種細(xì)胞。近來， 已經(jīng)有相關(guān)方法的一些方法報道。
例如在文獻(xiàn)1: Chiu, D. T.; Jeon, N. L.; Huang, S.; Kane, R. S.; Wargo, C. J.; Choi， I. S.; Ingber， D. E.; Whitesides, G. M.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97， (6), 2408-2413中， Whitesides實(shí)驗(yàn)小組公開了一種運(yùn)用三維結(jié)構(gòu)的微流管道在同一表面固定多種細(xì)胞，而 且可以形成由多種細(xì)胞組成的復(fù)雜圖案的方法。這種方法首先制備出三維結(jié)構(gòu)的聚二亞 甲基硅氧垸"印章"，然后在"印章"與細(xì)胞培養(yǎng)盤基底結(jié)合后，往不同的管道入口通入 不同的細(xì)胞，這樣不同種細(xì)胞被運(yùn)送到基底的不同位置，待培養(yǎng)一段時間后，細(xì)胞長滿， 就可以出現(xiàn)設(shè)計好的圖案。但是，這種方法得到的粘附了多種細(xì)胞的基底，在實(shí)驗(yàn)過程 中如果把含有三維結(jié)構(gòu)的聚二亞甲基硅氧烷"印章"拿開，粘附在管道中的細(xì)胞會自由 爬動，使得固定的細(xì)胞圖案被破壞。另一方面，如果始終不能去掉"印章"，不同種細(xì)胞 間不能夠相互作用，不利于進(jìn)一步研究細(xì)胞間的相互作用。此外，這種方法將多種細(xì)胞 粘附到基底上時，需要復(fù)雜的微加工方法。
在文獻(xiàn)2: Yousaf， M. N.; Houseman, B. T.; Mrksich, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001, 98, (11), 5992-5996中，Mrksich實(shí)驗(yàn)小組公開了一種非接觸式、在同一表面固定兩 種不同細(xì)胞的方法。此方法首先運(yùn)用微接觸印刷技術(shù)把一種細(xì)胞固定在表面，然后運(yùn)用 電化學(xué)技術(shù)改變表面沒有粘附細(xì)胞的區(qū)域化學(xué)組成，從而可以固定第二種細(xì)胞。這種方 法的優(yōu)點(diǎn)是需要很少的物理操作，缺點(diǎn)是需要復(fù)雜的化學(xué)合成。
在文獻(xiàn)3: Li, Y" Bo， Y" Ji， H" Han, D., Chen, S.， Tian, F., Jiang, X., Angew. Chem. Int. Ed.，2007,46(7)， 1094-1096中，蔣興宇研究小組結(jié)合納米尺度的自組裝單分子膜、電化 學(xué)以及微流控技術(shù)，把本來不能使細(xì)胞粘附的基底表面某些區(qū)域選擇性"活化"，使得不
同種細(xì)胞在指定空間粘附。該小組同時申請專利，申請?zhí)枮?00710098280.4 (其在先申 請?zhí)?00610089251.7，在先申請日為2006.08.11)的申請構(gòu)建了一種將多種細(xì)胞粘附到同 一基底上的裝置及粘附方法；但是它的不足之處在于把不同種細(xì)胞要有序粘附在同一表 面，需要長時間的電化學(xué)解吸附過程，不利于此方法的推廣。
本申請人的申請?zhí)枮?00710117815.8，申請日2007年6月25日的發(fā)明專利申請構(gòu) 建了將多種細(xì)胞以有序陣列方式粘附到同一基底上的裝置及粘附方法，此方法過程簡單， 但無法構(gòu)建連續(xù)距離變化的有序多細(xì)胞排列。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在將多種細(xì)胞粘附到同一基底表面時，操作復(fù)雜， 不能很好的控制粘附的細(xì)胞的運(yùn)動，使得固定的細(xì)胞圖案被破壞或是根本不能相互作用， 從而提供一種將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置及粘附方法，其裝置結(jié) 構(gòu)簡單和易操作，能夠有效控制不同種細(xì)胞間的間隔距離，并且可以控制不同種細(xì)胞間 的運(yùn)動，便于研究不同種細(xì)胞間相互作用。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-
本發(fā)明提供的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，包括 一基底；所述基底的上表面上蒸鍍有一鈦粘附層或鉻粘附層，該鈦粘附層或鉻粘附 層上蒸鍍有一金層；所述鈦粘附層或鉻粘附層的厚度為2 10nin;所述金層厚度為20
一下表面上具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅氧
垸印章；
所述微凹槽單元包括 位于中間位置的直線型中間凹槽；
位于所述直線型中間凹槽一側(cè)依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第 第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，所述第一凹槽、 第二凹槽和第三凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述 直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相鄰凹槽之間的間距均為50 500，
位于所述直線型中間凹槽另一側(cè)依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述 第四凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第四凹槽中間段的遠(yuǎn)離直線型中 間凹槽的一側(cè)槽邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，槽寬向遠(yuǎn)離直線型中間凹 槽方向增加50 30(Vm，呈一階梯狀槽寬的凹槽中間段；所述第五凹槽和第六凹槽的中
間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第五凹槽和第六凹槽的中間段分別為與所述第 四凹槽的中間段的階梯狀邊形狀相同，槽寬相等的階梯狀凹槽中間段；所述第四凹槽、 第五凹槽和第六凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述 直線型中間凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中的相鄰凹槽之間的間距為50 500,
所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第 三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中間段端點(diǎn)開始的第一段凹槽的寬度均在 50 300nm范圍內(nèi)；
所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；
所述經(jīng)氧化處理后的的具親水表面的聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基 底的金層之上，所述的直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、 第五凹槽和第六凹槽與所述基底的金層可逆結(jié)合形成封閉的管道；
和
在封閉的管道形成10min內(nèi)，通過向所述中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管 腔中通入濃度為20 200嗎/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液；隨后向所述第一凹槽、 第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽的流通管腔中通入濃度為1 5mM硫醇的PBS磷酸緩沖 液；而于1 3h后，在所述中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽內(nèi)的金層上形成的細(xì)胞外基 質(zhì)蛋白；在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽內(nèi)的金層表面上及周圍形成由 1 5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液構(gòu)成的惰性單分子膜層；
所述的硫醇是六聚聚乙二醇鏈取代的甲硫醇化合物。
所述的硫醇是HS(CH2)u(OCH20CH2)60H 、 HS(CH2)u(OCH2OCH2)5OH 、或 HS(CH2)u(OCH20CH2)30H。
所述的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
所述的惰性單分子膜為通過在1 5mM的HS(CH2) (0CH20CH2)60H 、 HS (CH2) (0CH20CH2) 50H或HS (CH2) (0CH20CH2) 30H的PBS磷酸緩沖液中自組裝在所述金層 表面上的惰性單分子膜層。
本發(fā)明提供將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，包括如下的步驟 1)在干凈的玻璃基底上表面上先蒸鍍一層鈦粘附層或鉻粘附層，然后再在所述的鈦 粘附層或格粘附層上蒸鍍一層金層；所述鈦粘附層或鉻粘附層的厚度為2 10nrn;金層
的厚度為20 50nrn;
2) 使用光刻技術(shù)，在一硅片上制備具有至少一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的圖案，所述 凸型條型微結(jié)構(gòu)單元包括
位于中間位置的直線型中間凸型條；
位于所述直線型中間凸型條一側(cè)依次排列的第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條; 所述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，所 述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凸 型條的方向傾斜；所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條中的 相鄰?fù)剐蜅l之間的間距均為50 50C^m;
位于所述直線型中間凸型條另一側(cè)依次排列的第四凸型條、第五凸型條和第六凸型 條；所述第四凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第四凸型條中間段 的遠(yuǎn)離直線型中間凸型條的一側(cè)邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，其凸型條 寬向遠(yuǎn)離直線型中間凸型條方向增加50 30(Him，呈一階梯狀凸型條寬的凸型條中間段； 所述第五凸型條和第六凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第五凸型 條和第六凸型條的中間段分別為與所述第四凸型條中間段的階梯狀邊形狀相同，凸型條 寬相等的階梯狀凸型條中間段；所述第四凸型條、第五凸型條和第六凸型條的中間段之 外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凸型條的方向傾斜；所述直線型中間凸型條、第四凸型 條、第五凸型條和第六凸型條的相鄰?fù)剐蜅l之間的間距均為50 50(Vrn;
所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條、第三凸型條、第四凸型條、第 五凸型條和第六凸型條的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凸型條、第一凸 型條、第二凸型條、第三凸型條、第五凸型條、第六凸型條和第四凸型條的自中間段端 點(diǎn)開始的第一段凸型條的寬度均在50 300^tm范圍內(nèi)；
3) 用聚二亞甲基硅氧烷對步驟2)得到的具有至少一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的硅片
進(jìn)行翻膜，制得一與所述凸型條型微結(jié)構(gòu)單元相對應(yīng)的具有至少一組微凹槽單元的聚二 亞甲基硅氧烷印章；
所述微凹槽單元包括-位于中間位置的直線型中間凹槽；
位于所述直線型中間凹槽一側(cè)依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第 第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，所述第一凹槽、 第二凹槽和第三凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述
直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相鄰凹槽之間的間距均為50 500,
位于所述直線型中間凹槽另一側(cè)依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述 第四凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第四凹槽的中間段遠(yuǎn)離直線型中 間凹槽的一側(cè)槽邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，其槽寬向遠(yuǎn)離直線型中間 凹槽方向增加50 300網(wǎng)，呈一階梯狀槽寬的凹槽中間段；所述第五凹槽和第六凹槽的 中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第五凹槽和第六凹槽的中間段分別為與所述 第四凹槽的中間段的階梯狀邊形狀相同，槽寬相等的階梯狀凹槽中間段；所述第四凹槽、 第五凹槽和第六凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述 直線型中間凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中的相鄰凹槽之間的間距為50 500,
所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第 三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中間段端點(diǎn)開始的第一段凹槽的寬度均在 50 300^m范圍內(nèi)；
所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；
然后將所制得的聚二亞甲基硅氧烷印章的具有微凹槽單元的面朝上，在等離子清洗 器中氧化2 5min,制成一下表面上具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表 面的聚二亞甲基硅氧烷印章；
4) 將步驟3)中的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅氧垸印章的具有微凹 槽單元的面朝下與步驟1 )所述基底的金層進(jìn)行可逆的接觸性連接，形成封閉的流通管腔；
5) 在封閉的流通管腔形成10min內(nèi)，將濃度為20 200 pg/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS 磷酸緩沖液通入所述的中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中；
隨后，將濃度為1 5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液通入所述第一凹槽、第三凹槽、第 四凹槽和第六凹槽的流通管腔中；
待l 3h后，所述中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽的基底的金層表面上吸附有細(xì)胞 外基質(zhì)蛋白；由于所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽管道中通入硫醇的PBS 磷酸緩沖液具有高的浸潤性，使得通入細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液的管道周圍都 被抗拒蛋白和細(xì)胞粘附的惰性單分子膜表面限制；而在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹 槽和第六凹槽內(nèi)的金層表面上及周圍形成由1 5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液構(gòu)成的惰性 單分子膜層；
6) 制備不同種的待粘附細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為106+/ml，然后將把含有不同 種細(xì)胞的懸浮溶液通入中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，
在37。C， 二氧化碳體積濃度5%，培養(yǎng)30 60min，所通入的細(xì)胞粘附在流通管腔內(nèi)的金 表面上；揭掉聚二亞甲基硅氧烷印章，將生長有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液中，12 24h后，細(xì)胞在各自限定區(qū)域內(nèi)生長，以完成多種細(xì)胞粘附于同一基底上，其中中間位置 的細(xì)胞與一種細(xì)胞保持平行的等距離排列粘附，而與另一種細(xì)胞的間隔逐漸遞增。
本發(fā)明提供將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，還可在不同種細(xì)胞有序 固定在基底表面后，將電壓為1.0 1.4 V的電源的正極連接于細(xì)胞培養(yǎng)溶液中，負(fù)極連 接于細(xì)胞粘附的基底的金表面上，進(jìn)行電解吸，檢測該不同種細(xì)胞之間的互相爬動；電 解吸持續(xù)時間為30 60s。
所述步驟5)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
所述步驟5)的硫醇是六聚聚乙二醇鏈取代的甲硫醇化合物。
所述步驟5)的硫醇可以是HS(CH2) (OCH2OCH2)6OH、 HS(CH2)u(OCH2OCH2)5OH、 或HS(CH2)n(OCH20CH2)30H。
所述的惰性單分子膜層為通過在1 5rnM的HS(CH2)U(0CH20CH2)60H 、 HS (CH2) u (0CH20CH2) 50H或HS (CH2) u (0CH20CH2) 30H的PBS磷酸緩沖液中自組裝在所述金層 表面上的惰性單分子膜層。
本發(fā)明提供一種上述方法制得的粘附了多種細(xì)胞的基底，其允許粘附的細(xì)胞間通過 分泌的可溶性生物分子相互作用。
本發(fā)明的這種粘附了多種細(xì)胞的基底可以用于藥物篩選，在粘附的細(xì)胞培養(yǎng)的條件 下加入待篩選的藥物，與沒有加入藥物的樣品進(jìn)行比較，可以了解哪種藥物可以影響這 幾種細(xì)胞之間的相互作用；或者進(jìn)行電解吸，觀察細(xì)胞的移動，從而為新藥篩選，提供 一種極為便利的方法。
本發(fā)明提供的裝置及方法，首先是在基底表面覆蓋其上具有凹槽結(jié)構(gòu)的聚二亞甲基 硅氧烷印章，然后在相應(yīng)管道中分別通入細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液和硫醇的 PBS磷酸緩沖液，由于硫醇的PBS磷酸緩沖液具有高的浸潤性，所以它會從所在凹槽的 限制區(qū)域擴(kuò)散出來，由于其擴(kuò)散能力大于凹槽間的間隔，所以能夠很好的限制住細(xì)胞粘 附的區(qū)域，待單分子膜自主裝完成后，在可粘附細(xì)胞的凹槽分別通入不同種細(xì)胞，細(xì)胞 粘附后，把PDMS拿開，幾種不同的細(xì)胞便有序的、距離可以人為連續(xù)調(diào)控的粘附在同一 表面。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1、本發(fā)明利用表面化學(xué)和微流控的結(jié)合，來構(gòu)筑復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)體系，可以讓多 種細(xì)胞在可調(diào)控的空間和時間，有序地在表面的粘附、生長。
2、 在不同種細(xì)胞有序固定在表面后，也可以進(jìn)行電解吸檢測幾種細(xì)胞之間互相爬動 的影響
3、 這幾種細(xì)胞的密度和相間的距離可以精確調(diào)控，以便檢測幾種細(xì)胞之間的反應(yīng)。
因?yàn)榭梢钥刂萍?xì)胞密度、幾種細(xì)胞之間的間隔，所以分析的精度是前所未有。
4、 在這種方法得到的粘附了多種細(xì)胞的基底為細(xì)胞生物學(xué)、組織生物學(xué)的基本研究
提供了平臺。高精度的在時間和空間上對細(xì)胞進(jìn)行分析，同時，還可以作為基于細(xì)胞和 細(xì)胞之間作用的藥物檢測，為發(fā)現(xiàn)藥物和有毒物質(zhì)的分析提供了新的途徑。
5、 可以讓細(xì)胞之間僅僅通過溶液中的物質(zhì)進(jìn)行信號交換而相互作用；也可以讓細(xì)胞 直接接觸進(jìn)行信號交相互作用。
圖1為本發(fā)明的將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2—1至圖2—4為本發(fā)明將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底設(shè)定位置處的步驟示意圖。
具體實(shí)施例方式
圖1為本發(fā)明的將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖， 由圖1可知，本發(fā)明提供的將多種細(xì)胞有序粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，包括
一基底1;所述基底1為在干凈的玻璃基底上表面上先蒸鍍一層鈦粘附層或鉻粘附 層，然后再在所述的鈦粘附層或鉻粘附層上蒸鍍一層金層；所述鈦粘附層或鉻粘附層的 厚度為2 10nm;金層的厚度為20 50nm;
一下表面上具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅 氧烷印章2;結(jié)合圖2-l所示，所述微凹槽單元包括位于所述直線型中間凹槽一側(cè)依次 排列的第一凹槽21、第二凹槽22和第三凹槽23;所述第第一凹槽、第二凹槽和第三凹 槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中間段 之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、 第二凹槽和第三凹槽中的相鄰凹槽之間的間距均為50 50(^m;
位于所述直線型中間凹槽另一側(cè)依次排列的第四凹槽24、第五凹槽25和第六凹槽 26;所述第四凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第四凹槽的中間段遠(yuǎn)離 直線型中間凹槽的一側(cè)槽邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，其槽寬向遠(yuǎn)離直 線型中間凹槽方向增加50 300Hm，為一呈階梯狀槽寬的凹槽中間段；所述第五凹槽和 第六凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第五凹槽和第六凹槽的中間段分 別為與所述第四凹中間段凹槽形狀相同，槽寬相等的階梯狀凹槽；所述第四凹槽、第五
凹槽和第六凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述直線 型中間凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中的相鄰凹槽之間的間距為50 500Mm;
所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第 三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中間段端點(diǎn)開始的第一段凹槽的寬度均在 50 300tim范圍內(nèi)；
所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第
六凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；
把所制得的聚二亞甲基硅氧烷印章的具有微凹槽單元的面朝上，在等離子清洗器中
氧化2 5rain，制成一下表面上具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的 聚二亞甲基硅氧烷印章；
經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅氧烷印章的具有微凹槽單元的面朝下與 所述基底1的金層進(jìn)行可逆的接觸性連接，形成封閉的流通管腔；
然后在10min內(nèi)，將濃度為20 200 pg/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液通入 所述的中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽流通管腔中；
隨后，在第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽通入濃度為1 5mM硫醇的PBS 磷酸緩沖液；
待l 3h后，所述中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽的基底的金層表面上吸附有細(xì)胞 外基質(zhì)蛋白；
由于所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽管道中通入硫醇的PBS磷酸緩 沖液具有高的浸潤性，使得通入細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液的管道周圍都被抗拒 蛋白和細(xì)胞粘附的惰性單分子膜表面限制；
所述硫醇是六聚聚乙二醇鏈取代的甲硫醇化合物。
所述的硫醇可以是HS(CH2) (OCH2OCH2)6OH、 HS(CH2)n(OCH20CH2)50H、或 HS(CH2)u(OCH2OCH2)3OH。
所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
所述的惰性單分子膜層為通過在1 5mM的HS(CH2) (0CH20CH2)60H、 HS(CH2)u(0CH20CH2)50H或HS(CH2) (0CH20CH2)30H的PBS磷酸緩沖液中自組裝在所述金層 表面上的惰性單分子膜層。 實(shí)施例1、
請參見圖2—1、圖2—2、圖2—3和圖2—4:
1)在一干凈的玻璃載波片l (厚度(U5mm)表面蒸鍍10nm (2 10nm均可)的鈦
粘附層，然后再在鈦粘附層上蒸鍍40nm (20 50nm均可)厚的金層，制得基底l;
把制得的基底1切成2x2 cir^的小塊，用乙醇的水溶液(濃度為50% 100%)浸 泡，再用氮?dú)獯蹈蓚溆茫?br>
2) 使用光刻技術(shù)，在一硅片上刻制具有至少一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的圖案，其制 做步驟為首先用作圖軟件L-edit設(shè)計出所要圖形七條并排的凸型線，該七條并排的凸 型線構(gòu)成一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元，包括
位于中間位置的直線型中間凸型條；
位于所述直線型中間凸型條一側(cè)依次排列的第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條; 所述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，所 述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凸 型條的方向傾斜；所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條中的 相鄰?fù)剐蜅l之間的間距均為50 500^ra;
位于所述直線型中間凸型條另一側(cè)依次排列的第四凸型條、第五凸型條和第六凸型 條;—所述第四凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第四凸型條的中間 段遠(yuǎn)離直線型中間凸型條的一側(cè)邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，其凸型條 寬向遠(yuǎn)離直線型中間凸型條方向增加50 300^un，為一呈階梯狀凸型條寬的凸型條；所 述第五凸型條和第六凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第五凸型條 和第六凸型條的中間段分別為與所述第四凸型條階梯狀邊形狀相同，凸型條寬相等的階 梯狀凸型條；所述第四凸型條、第五凸型條和第六凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn) 離直線型中間凸型條的方向傾斜；
所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條、第三凸型條、第四凸型條、第 五凸型條和第六凸型條的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凸型條、第一凸 型條、第二凸型條、第三凸型條、第五凸型條、第六凸型條和第四凸型條的自中間段端 點(diǎn)開始的第一段凸型條的寬度均在50 30(^m范圍內(nèi)；
3) 然后打印為分辨率為3600dpi的膠片；接著再涂膠(SU-8系列負(fù)膠)，利用甩膠 機(jī)均勻地將光刻膠，涂在硅片基底上，經(jīng)高溫烘烤硬化后，把膠片垂直放在涂有光刻膠 的基板上，顯影曝光后就在涂有光刻膠的硅片上制成了所述具有至少一組凸型線型微結(jié) 構(gòu)單元；
4) 用聚二亞甲基硅氧烷(PDMS)對步驟3)得到的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻膜， 得到一與上述微結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的、具有凹型圖案的PDMS印章；然后在圖案中各凹槽的端 點(diǎn)處打孔，使其上下表面連通，再把印章有凹型圖案的面向上，在等離子清洗器中氧化 2min，形成具有親水表面的PDMS印章；
5) 將步驟4)中的印章取出后，把有凹型圖案的面向下與步驟2)的硫醇化的基底 接觸，形成封閉的管腔；然后在封閉的管腔形成10min內(nèi)把100 pg/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖 維結(jié)合蛋白(fibronection))的PBS磷酸緩沖液(pH7.4)通入中間凹槽、第三凹槽和第 四凹槽流通管腔中通入，隨后，在第一凹槽、第二凹槽、第五凹槽和第二凹槽通入濃度 為1 5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液；讓凹槽中所含溶液的分子在基底表面吸附lh;
6) 制備不同種的粘附細(xì)胞——Hela細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液， 細(xì)胞密度均為106個/ml，然后將NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液通入中間管腔中，把Hela細(xì) 胞的懸浮溶液通入第三管腔中，把MDCK細(xì)胞的懸浮溶液通入第四管腔中，放入細(xì)胞培 養(yǎng)箱，于37'C、 二氧化碳濃度5% (體積濃度)，培養(yǎng)40min，細(xì)胞粘附在管腔內(nèi)的金表 面上；把PDMS印章揭掉，把長有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液(胎牛血清濃度 10% )中，12h后，細(xì)胞就會長滿各自的限定區(qū)域，得到一粘附了三種細(xì)胞的基底。 實(shí)施例2、
1) 在一干凈的玻璃載波片(厚度0.15mm)表面蒸鍍5nm (2 10nm均可)的鉻粘 附層，然后再在鉻粘附層上蒸鍍20nm (20 50nm均可)厚的金層，制得基底1;
把制得的基底1切成2x2 cn^的小塊，用乙醇的水溶液(濃度為50% 100%)浸 泡，再用氮?dú)獯蹈蓚溆茫?br>
2) 使用光刻技術(shù)，在一硅片上刻制具有至少一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的圖案，其制 做步驟為首先用作圖軟件L-edit設(shè)計出所要圖形七條并排的凸型線，該七條并排的凸 型線構(gòu)成一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元，包括
位于中間位置的直線型中間凸型條；
位于所述直線型中間凸型條一側(cè)依次排列的第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條； 所述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，所 述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凸 型條的方向傾斜；所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條中的 相鄰?fù)剐蜅l之間的間距均為50 500|xm;
位于所述直線型中間凸型條另一側(cè)依次排列的第四凸型條、第五凸型條和第六凸型 條；所述第四凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第四凸型條的中間 段遠(yuǎn)離直線型中間凸型條的一側(cè)邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，其凸型條 寬向遠(yuǎn)離直線型中間凸型條方向增加50 300^ra，為一呈階梯狀凸型條寬的凸型條；所 述第五凸型條和第六凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第五凸型條 和第六凸型條的中間段分別為與所述第四凸型條階梯狀邊形狀相同，凸型條寬相等的階 梯狀凸型條；所述第四凸型條、第五凸型條和第六凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)
離直線型中間凸型條的方向傾斜；
所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條、第三凸型條、第四凸型條、第 五凸型條和第六凸型條的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凸型條、第一凸 型條、第二凸型條、第三凸型條、第五凸型條、第六凸型條和第四凸型條的自中間段端 點(diǎn)開始的第一段凸型條的寬度均在50 300^un范圍內(nèi)；
3) 然后打印為分辨率為3600dpi的膠片；接著再涂膠(SU-8系列負(fù)膠)，利用甩膠 機(jī)均勻地將光刻膠，涂在硅片基底上，經(jīng)高溫烘烤硬化后，把膠片垂直放在涂有光刻膠 的基板上，顯影曝光后就在涂有光刻膠的硅片上制成了所述具有至少一組凸型線型微結(jié) 構(gòu)單元；
4) 用聚二亞甲基硅氧垸(PDMS)對步驟3)得到的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻膜， 得到一與上述微結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的、具有凹型圖案的PDMS印章；然后在圖案中各凹槽的端 點(diǎn)處打孔，使其上下表面連通，再把印章有凹型圖案的面向上，在等離子清洗器中氧化 2min，形成具有親水表面的PDMS印章；
5) 將步驟4)中的印章取出后，把有凹型圖案的面向下與步驟2)的硫醇化的基底 接觸，形成封閉的管腔；然后在10min內(nèi)把50嗎/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖維結(jié)合蛋白
(fibronection))的PBS磷酸緩沖液(pH7.4)通入中間凹槽、第三凹槽和第四凹槽流通 管腔中通入，隨后，在第一凹槽、第二凹槽、第五凹槽和第二凹槽通入濃度為1 5mM 硫醇的PBS磷酸緩沖液；讓凹槽中所含溶液的分子在基底表面吸附lh;
6) 制備不同種的粘附細(xì)胞——Hela細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度均 為106個/ml，然后把Hela細(xì)胞的懸浮溶液通入第三和四管腔中，將NIH 3T3細(xì)胞的懸 浮溶液通入中間管腔中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，于37'C、 二氧化碳濃度5% (體積濃度)，培 養(yǎng)40min，細(xì)胞粘附在管腔內(nèi)的金表面上；把PDMS印章揭掉，把長有細(xì)胞的金表面放 入普通細(xì)胞培養(yǎng)液(胎牛血清濃度10% )中，24h后，細(xì)胞就會長滿各自的限定區(qū)域， 得到一粘附了兩種細(xì)胞的基底。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1或?qū)嵤├?得到的粘附了多種細(xì)胞的基底浸入普通細(xì)胞培養(yǎng)液(胎牛血 清濃度10% );在溶液處通正電極，在硫醇化的基底的金表面通負(fù)電極，電壓為1.4V， 通電時間為30 s，進(jìn)行一次電化學(xué)解析附，指定圖案以外的金表面區(qū)域的硫醇解析附， 重新變?yōu)榭梢晕降鞍踪|(zhì)和細(xì)胞的表面層，粘附在指定圖案內(nèi)的細(xì)胞就可以自由移動了。
另外，本發(fā)明所述的凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的凸型條還可以根據(jù)需要，在最外側(cè)的凸 型條的外側(cè)增加與之形狀相同且平行的凸型條；所述的微凹槽單元的凹形槽也可以根據(jù)需 要，在最外側(cè)的凹形槽外側(cè)增加與之形狀相同且平行的凹形槽。
權(quán)利要求
1、一種將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，包括本發(fā)明提供的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，包括一基底；所述基底的上表面上蒸鍍有一鈦粘附層或鉻粘附層，該鈦粘附層或鉻粘附層上蒸鍍有一金層；所述鈦粘附層或鉻粘附層的厚度為2～10nm；金層的厚度為20～50nm；一下表面上具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅氧烷印章；所述微凹槽單元包括位于中間位置的直線型中間凹槽；位于所述直線型中間凹槽一側(cè)依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相鄰凹槽之間的間距均為50～500μm；位于所述直線型中間凹槽另一側(cè)依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述第四凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第四凹槽的中間段遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的一側(cè)槽邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3～5mm，其槽寬向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽方向增加50～300gm，呈一階梯狀槽寬的凹槽中間段；所述第五凹槽和第六凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第五凹槽和第六凹槽的中間段分別為與所述第四凹槽的中間段的階梯狀邊形狀相同，槽寬相等的階梯狀凹槽；所述第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的長度均在1.2～2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中間段端點(diǎn)開始的第一段凹槽的寬度均在50～300μm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述經(jīng)氧化處理后的的具親水表面的聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基底的金層之上，所述的直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽與所述基底的金層可逆結(jié)合形成封閉的管道；和然后在封閉的管道形成的10min內(nèi)，通入所述的中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽流通管腔中的濃度為20～200μg/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液；隨后通入所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽的濃度為1～5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液，而于1～3h后在所述中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽內(nèi)的金層上形成的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽內(nèi)的金層表面上及其周圍的由1～5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液形成的惰性單分子膜層。
2、 按權(quán)利要求1所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，其特征在 于，所述的硫醇是六聚聚乙二醇鏈取代的甲硫醇化合物。
3、 按權(quán)利要求1所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，其特征在 于，所述的硫醇是HS(CH2)u(OCH20CH2)60H 、 HS(CH2) (OCH2OCH2)5OH 、或 HS(CH2)u(OCH2。CH2)30H。
4、 按權(quán)利要求l所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，其特征在 于，所述的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
5、 按權(quán)利要求1所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置，其特征在 于，所述的惰性單分子膜為通過在1 5mM的HS(CH2) (0CH20CH2)60H 、 HS (CH2) (0CH20CH2) 50H或HS (CH2) u (0CH20CH2) 30H的PBS磷酸緩沖液中自組裝在所述金層 表面上的惰性單分子膜層。
6、 一種將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，包括如下的步驟1) 在干凈的玻璃基底上表面上先蒸鍍一層鈦粘附層或鉻粘附層，然后再在所述的鈦 粘附層或鉻粘附層上蒸鍍一層金層；所述鈦粘附層或鉻粘附層的厚度為2 10nm;金層 的厚度為20 50nm;2) 使用光刻技術(shù)，在一硅片上刻制具有至少一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的圖案，其制 做步驟為首先用作圖軟件L-edit設(shè)計出所要圖形七條并排的凸型線，該七條并排的凸 型線構(gòu)成一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元，包括位于中間位置的直線型中間凸型條；位于所述直線型中間凸型條一側(cè)依次排列的第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條； 所述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，所 述第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凸 型條的方向傾斜；所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條和第三凸型條中的 相鄰?fù)剐蜅l之間的間距均為50 500pm;位于所述直線型中間凸型條另一側(cè)依次排列的第四凸型條、第五凸型條和第六凸型 條；所述第四凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第四凸型條中間段 的遠(yuǎn)離直線型中間凸型條的一側(cè)邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，凸型條寬 向遠(yuǎn)離直線型中間凸型條方向增加50 300pm，為一呈階梯狀凸型條寬的凸型條；所述 第五凸型條和第六凸型條的中間段與所述直線型中間凸型條平行，并且該第五凸型條和 第六凸型條的中間段分別為與所述第四凸型條階梯狀邊形狀相同，凸型條寬相等的階梯 狀凸型條；所述第四凸型條、第五凸型條和第六凸型條的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離 直線型中間凸型條的方向傾斜；所述直線型中間凸型條、第一凸型條、第二凸型條、第三凸型條、第四凸型條、第 五凸型條和第六凸型條的長度均在1.2 2.0 11范圍內(nèi)；所述直線型中間凸型條、第一凸 型條、第二凸型條、第三凸型條、第五凸型條、第六凸型條和第四凸型條的自中間段端 點(diǎn)開始的第一段凸型條的寬度均在50 30(^m范圍內(nèi)；然后打印為分辨率為3600dpi的膠片；接著再涂膠(SU-8系列負(fù)膠)，利用甩膠機(jī)均 勻地將光刻膠，涂在硅片基底上，經(jīng)高溫烘烤硬化后，把膠片垂直放在涂有光刻膠的基板 上，顯影曝光后就在涂有光刻膠的硅片上制成了所述具有至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元；3)用聚二亞甲基硅氧烷對步驟2)得到的具有至少一組凸型條型微結(jié)構(gòu)單元的硅片 進(jìn)行翻膜，制得到一與所述凸型條型微結(jié)構(gòu)單元相對應(yīng)的具有至少一組微凹槽單元的聚 二亞甲基硅氧垸印章；所述微凹槽單元包括位于中間位置的直線型中間凹槽；位于所述直線型中間凹槽一側(cè)依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第 第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，所述第一凹槽、 第二凹槽和第三凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述 直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相鄰凹槽之間的間距均為50 500,位于所述直線型中間凹槽另一側(cè)依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述 第四凹槽的中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第四凹槽中間段的遠(yuǎn)離直線型中 間凹槽的一側(cè)槽邊自中間段端點(diǎn)開始，其長度每增加3 5mm，槽寬向遠(yuǎn)離直線型中間凹 槽方向增加50 30(^m，為一呈階梯狀槽寬的凹槽中間段；所述第五凹槽和第六凹槽的 中間段與所述直線型中間凹槽平行，并且該第五凹槽和第六凹槽的中間段分別為與所述 第四凹中間段凹槽梯形邊形狀相同，槽寬相等的階梯狀凹槽；所述第四凹槽、第五凹槽 和第六凹槽的中間段之外的兩端部段向遠(yuǎn)離直線型中間凹槽的方向傾斜；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的長度均在1.2 2.0cm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第 三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中間段端點(diǎn)開始的第一段凹槽的寬度均在50 30(Vm范圍內(nèi)；所述直線型中間凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第 六凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；然后把所制得的聚二亞甲基硅氧烷印章的具有微凹槽單元的面朝上，在等離子清洗 器中氧化2 5min，制成一下表面上具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表 面的聚二亞甲基硅氧烷印章；4) 將步驟3)中的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅氧烷印章的具有微凹 槽單元的面朝下與步驟1 )所述基底的金層進(jìn)行可逆的接觸性連接，形成封閉的流通管腔;5) 然后在流通管腔形成10min內(nèi)，將濃度為20 200昭/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS 磷酸緩沖液通入所述的中間凹槽、第二凸槽和第五凸槽流通管腔中；隨后，在第一凹槽、 第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽通入濃度為1 5mM硫醇的PBS磷酸緩沖液；待l 3h 后，所述中間凹槽、第二凸槽和第五凸槽的基底的金層表面上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白； 而在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽內(nèi)的金層表面上及周圍形成由l 5mM 硫醇的PBS磷酸緩沖液構(gòu)成的惰性單分子膜層；6)制備不同種的待粘附細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為106+/ml，然后將含有不同種 細(xì)胞的懸浮溶液通入中間凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱， 在37'C， 二氧化碳體積濃度5%，培養(yǎng)30 60min，所通入的細(xì)胞粘附在流通管腔內(nèi)的金 表面上；揭掉聚二亞甲基硅氧烷印章，將生長有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液中，12 24h后，細(xì)胞在各自限定區(qū)域內(nèi)生長，以完成多種細(xì)胞粘附于同一基底上，其中中間位置 的細(xì)胞與一種細(xì)胞保持平行的等距離排列粘附，而與另一種細(xì)胞的間隔逐漸遞增。
7、 按權(quán)利要求6所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，其特征在于， 還包括在不同種細(xì)胞有序固定在基底表面后，將電壓為1.0 1.4 V的電源的正極連接 于細(xì)胞培養(yǎng)溶液中，負(fù)極連接于細(xì)胞粘附的基底的金表面上，進(jìn)行電解吸，檢測該不同 種細(xì)胞之間的互相爬動。
8、 按權(quán)利要求6或7所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，其特征 在于，所述步驟5)的硫醇是六聚聚乙二醇鏈取代的甲硫醇化合物。
9、 按權(quán)利要求6或7所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，其特征 在于，所述步驟5)的硫醇是HS(CH2)u(OCH2OCH2)6OH、 HS(CH2)n(OCH20CH2)sOH、 或HS(CH2)u(OCH2OCH2)3OH。
10、 按權(quán)利要求6或7所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，其特征在于，所述步驟5)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
11、 按權(quán)利要求6或7所述的將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的方法，其 特征在于，所述的惰性單分子膜為通過在1 5mM的HS(CH2)u(0CH20CH2)e0H、 HS (CH2) u (0CH20CH2) 50H或HS (CH2) u (0CH20CH2) 30H的PBS磷酸緩沖液中自組裝在所述金層 表面上的惰性單分子膜層。
全文摘要
一種將多種細(xì)胞粘附至同一基底設(shè)定位置處的裝置及制法和用途，包括上表面蒸鍍鈦/鉻粘附層和金層的基底，下表面具有至少一組微凹槽單元的經(jīng)氧化處理后的具親水表面的聚二亞甲基硅氧烷印章；印章上凹槽槽端處設(shè)有與相應(yīng)凹槽相通的垂向通孔；印章下表面貼覆于基底金層之上可逆結(jié)合形成封閉的管道；在封閉管道形成10min內(nèi)，向印章的中間、第二和第五凹槽中通FN；隨后向第一、第三、第四和第六凹槽通EG6，1～3h后，中間、第二和第五凹槽內(nèi)的金層上形成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，第一、第三、第四和第六凹槽內(nèi)的金層及周圍形成惰性單分子膜層。本發(fā)明將多種細(xì)胞可調(diào)有序地粘附于同一基底，可用于了解藥物對不同種細(xì)胞的作用和用于藥物篩選。
文檔編號C12Q1/04GK101363020SQ200710119999
公開日2009年2月11日 申請日期2007年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者勇 李, 蔣興宇, 陳振玲 申請人:國家納米科學(xué)中心