專利名稱：對(duì)多種皮膚細(xì)胞修復(fù)具持續(xù)作用的人血清白蛋白重組融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是中國(guó)專利ZL021428816和ZL2004100428148的繼續(xù)申請(qǐng)。本發(fā) 明涉及基因重組及表達(dá)的人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法，并涉及單 一融合蛋白或不同融合蛋白組合使用的方法。特別涉及利用酵母菌表達(dá)生 產(chǎn)由人血清白蛋白與人細(xì)胞生長(zhǎng)因子所形成的融合蛋白(HSA/GF)。細(xì)胞 生長(zhǎng)因子包括表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、 血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)和類胰島素生長(zhǎng) 因子(IGF)等。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中蛋白總 量的一半。白蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分 子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持血壓的一個(gè)重要因素。血清白蛋白是一種 球狀非糖基化的、分子量為65千道爾頓、具有585個(gè)氨基酸的血清蛋白質(zhì)。 這一蛋白(白蛋白前體)再通過(guò)高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除引導(dǎo)多肽，而 分泌到細(xì)胞外。血清白蛋白有35個(gè)半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一個(gè)有 17個(gè)二硫鍵的單體(參見(jiàn)Brown JR，"白蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用"Pergamon， 紐約，1977 )。當(dāng)沒(méi)有分泌多肽時(shí)，在酵母細(xì)胞內(nèi)的白蛋白產(chǎn)物是錯(cuò)配狀 態(tài)，將失去90%的抗原性(與血漿中自然狀態(tài)白蛋白相比)，并且形成不 溶性的白蛋白聚合體，不具有白蛋白的生物活性。現(xiàn)在用于臨床的白蛋白 均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達(dá)白蛋白(rHSA)的生產(chǎn)已在 專利EP330451、 EP361991和中國(guó)專利申請(qǐng)CN2004010057313. 7中公開(kāi)。
白蛋白是血液中的主要成分，在人體內(nèi)含量為每升血液含40克，其半 衰期壽命為14-20天。綜上所述，治療性蛋白質(zhì)與白蛋白形成融合蛋白后， 融合蛋白將具有極大的優(yōu)勢(shì)使之可抵御生物體內(nèi)酶解作用，并可使治療性 蛋白質(zhì)在體內(nèi)體外的壽命大大提高，還可以較高劑量使用。
人源或重組人血清白蛋白在美容產(chǎn)品中的使用也獲得了十分有意義的 實(shí)際應(yīng)用,并在專利CN01810411. 8中有具體的描述。
在藥物制劑組成中，白蛋白也常被用作藥物的穩(wěn)定劑，尤其是生物藥。
利用基因工程技術(shù)，將人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)基因融合在酵母菌 中表達(dá)為融合蛋白，可增加治療性蛋白質(zhì)在血清中和儲(chǔ)存時(shí)的穩(wěn)定性，和 較長(zhǎng)的半衰期，達(dá)到蛋白藥物的長(zhǎng)效化。該項(xiàng)蛋白藥物體內(nèi)修飾公共技術(shù) 平臺(tái)，在于在林、富巖中國(guó)授權(quán)專利ZL02142881. 6和ZL200410042814. 8 中已公開(kāi)，在此引為參考文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明了人血清白蛋白與細(xì)胞
生長(zhǎng)因子形成的融合蛋白可刺激細(xì)胞增生，并具有比單體的細(xì)胞生長(zhǎng)因子 在體內(nèi)和體外停留更長(zhǎng)的時(shí)間(長(zhǎng)半衰期和持續(xù)性)，細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)
現(xiàn)融合蛋白具有與治療性蛋白單體相同的摩爾生物活性。當(dāng)復(fù)合使用由HSA 和不同生長(zhǎng)因子形成的融合蛋白(HSA/GF)的組合時(shí)，可具有同時(shí)刺激多 種皮膚細(xì)胞的修復(fù)和具協(xié)同增效作用，而適用于美容、創(chuàng)傷和疾病的治療， 由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明所涉及的細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GF)包括但不局限于，表皮細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF-2)和類胰島素細(xì)胞生長(zhǎng)因子(IGF)。下面就其特 性分別簡(jiǎn)述如下
① 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Epidiuen cell Growth Factor, EGF ):是EGF是 人體分泌的由五十三個(gè)氨基酸所組成的具有生物活性的蛋白質(zhì)，它廣泛分 布在血液、唾液、尿液等體液中。它具有廣泛的生物學(xué)活性，能促進(jìn)表皮 細(xì)胞的分裂，加速細(xì)胞的新陳代謝，使新生的表皮細(xì)胞迅速替代老化的細(xì) 胞(Carpenter,實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究，164: 1-10， 1986 )。
② 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Keratinocyte Growth Factor, KGF, KGF-2):有多 種角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在在動(dòng)物體中。以KGF-2 (也叫FGF10)是一種由 208個(gè)氨基酸組成的堿性蛋白，來(lái)源于胚胎上皮細(xì)胞、新生或成年間質(zhì)成 纖維細(xì)胞的KGF。 KGF-2具有促進(jìn)上皮細(xì)胞有絲分裂的作用。能通過(guò)吸引成 纖維細(xì)胞和結(jié)締組織向傷口處移行，促進(jìn)損傷上皮的修復(fù)，表現(xiàn)為溫和的 促細(xì)胞再生作用(Rubin JS等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86: 802 - 806, 1989; CN00809802. 6 )。
③ 血小板書(shū)亍生生長(zhǎng)因子(Platelet Derived Growth Factor, PDGF):血小 板衍生生長(zhǎng)因子是一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的生長(zhǎng)因子。人PDGF是由A鏈與 B鏈通過(guò)二辟"定連接的二聚體。PDGF的A鏈之間可形成二聚體(PDGFAA)。 近期發(fā)現(xiàn)，PDGFAA對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的發(fā)育起著決定性的作用，提示 PDGFAA對(duì)于生殖系統(tǒng)某些疾病的診斷和治療可能具有重要意義。PDGF的B 鏈之間也可形成二聚體(PDGFBB),對(duì)于表皮細(xì)胞的增值、再生和受損組織
的修復(fù)具有極強(qiáng)功效,有效促進(jìn)多種細(xì)胞分裂和新皮膚再生，修復(fù)受損組織， 促進(jìn)膠原蛋白的生成(Josephs等，科學(xué)，225 (4662): 636-639, 1984; 李培旺等，生命科學(xué)研究，9: 346 - 350， 2005 )。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Factor, FGF):主要有酸性 (aFGF)和堿性(bFGF)兩種分子。FGF是來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多功 能細(xì)胞因子(Zhao等，移植，56, 1177-1182, 1993; Florkiewicz等，紐 約科學(xué)年報(bào)，638: 109-126， 1991)。具較強(qiáng)的有絲分裂作用。對(duì)血管內(nèi) 皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等都有促分裂作用。研究表明，通過(guò)小鼠、大鼠、家 兔等不同的動(dòng)物模型，觀察到FGF等活性多肽具有顯著誘導(dǎo)細(xì)胞修復(fù)，加 速創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成的功效。bFGF還能特異地促進(jìn)體黑色素細(xì)胞的 分裂。動(dòng)物試驗(yàn)證明aFGF能促進(jìn)缺血組織的新生，^旦由于aFGF在血液中
的半衰期太短，而沒(méi)有在臨床試驗(yàn)中顯示有明顯的效果。
⑤胰島素樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Insulin-like Growth Factors, IGFs):是一 類結(jié)構(gòu)上與胰島素部分同源并具有胰島素樣活性的多肽，既有促細(xì)胞分化 和增殖活性，又具有胰島素樣作用，對(duì)維持正常胰島素敏感性和血糖穩(wěn)態(tài) 調(diào)節(jié)都有重要作用。國(guó)內(nèi)外許多研究均表明，IGFs與糖尿病慢性并發(fā)癥的 產(chǎn)生密切相關(guān)。IGF-1 (somatomedin C)的促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，物質(zhì)代謝等方 面的作用報(bào)道較多。IGF-2 (somatomedin A ; GenBank: MIM 147470), IGF-3 (somatomedin B; GenBank: MIM 193190)也有新的研究發(fā)現(xiàn)。
除以上所簡(jiǎn)述的細(xì)胞生長(zhǎng)因子外，還有其它生長(zhǎng)因子可以與人血清白 蛋白形成融合蛋白，它們可以單獨(dú)或復(fù)合使用，可以和白蛋白單體或白蛋 白融合蛋白單獨(dú)或復(fù)合使用，并用以細(xì)胞修復(fù)以達(dá)美容或創(chuàng)傷、疾病治療 的目的。
細(xì)胞生長(zhǎng)因子在保存中不穩(wěn)定。以EGF為例，在實(shí)際使用過(guò)程中，EGF 在皮膚傷口環(huán)境中也是極不穩(wěn)定，它被傷口中存在的蛋白酶水解失活，半 衰期僅l小時(shí)，但皮膚損傷后的愈合過(guò)程中，DNA的合成卻需要8-12小 時(shí)。因此，在皮膚或角膜傷口上單次使用EGF對(duì)愈合沒(méi)有明顯促進(jìn)作用。 只有多次反復(fù)使用才能對(duì)愈合起促進(jìn)療效。因此，在醫(yī)學(xué)及化妝品領(lǐng)域的 實(shí)際應(yīng)用受到很大限制(Manning等，藥學(xué)研究，6: 903 - 917, 1989; CN03011136 )。
因此，本發(fā)明涉及如下幾個(gè)方面 1) HSA/GF融合蛋白
本發(fā)明提供一種用基因工程方法生產(chǎn)的人血清白蛋白(HSA)和細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(GF)融合蛋白，該融合蛋白是由核苦酸編碼的HSA和一種GF形成的 融合蛋白，即HSA/GF融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方法，任何一種白蛋白或其 變異體均可與一種GF形成一種融合蛋白。
GF可以是任何一種蛋白，其可刺激細(xì)胞的分化、增生或修復(fù)。GF最典 型的一個(gè)例子是細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GF)在臨床上的應(yīng)用，如hEGF和hKGF已 分別被批準(zhǔn)用于創(chuàng)傷和潰瘍的臨床治療的個(gè)例。
本發(fā)明的GF可以是下列蛋白質(zhì)類別中的任何一員，包括但不局限于， 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰 島素樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子(IGF)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因 子(KGF)、血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PDGF)、促生長(zhǎng)釋放因子(GHRF -6)等。
GF可以直接以N末端與HSA的C-末端相連以構(gòu)成融合蛋白，或可在 HSA和GF之間增加一個(gè)連接肽(Linker),以構(gòu)成融合蛋白HSA/L/GF或 GF/L/HSA (L-連接肽)。連接肽長(zhǎng)度可為2-100，常用的是10-50個(gè)氨基酸， 優(yōu)選的是14-30個(gè)氨基酸。連接短肽可以使HSA和GF之間有更大的變化空 間并有更好的柔韌性或剛性，或因更大的變化空間使GF與受體的結(jié)合更容 易些。連接肽的結(jié)構(gòu)可為(G4S)3-4。連接肽的加入可能使融合蛋白在作為 藥物的使用時(shí)產(chǎn)生額外的免疫原性，最優(yōu)選的是沒(méi)有連接肽。融合蛋白可以是分泌型的，其可與特異識(shí)別的抗人血清白蛋白抗體相 結(jié)合。融合蛋白也可與特異識(shí)別的GF的抗體相結(jié)合。融合蛋白的分泌肽可 使用人血清白蛋白的分泌肽或其自然界中存在的多肽或是如果合成的具有 將融合蛋白分泌到宿主細(xì)胞外功能的多肽。具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核苦酸鏈，該核香酸鏈 編碼一種HSA與人KGF-2所形成的融合蛋白(HSA/hKGF-2),編碼該融 合蛋白的核苷酸鏈與Seq ID No. 1有至少90°/。的序列同源性，優(yōu)選的該核 苷酸鏈與Seq ID No. 1有95°/ 的序列同源性。由該核苷酸鏈編碼的蛋白質(zhì) 多肽的氨基酸序列為Seq ID No. 2。具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核苦酸鏈，該核香酸鏈 可編碼一種HSA與人EGF形成的融合蛋白(HSA/hEGF)，編碼該融合蛋白的 核苦酸鏈與Seq ID No. 3有至少90°/。的序列同源性，優(yōu)選的該核香酸鏈與 Seq I D No. 3有至少95°/。的序列同源性。優(yōu)選的，該核苷酸序列編碼的蛋 白質(zhì)多肽的氨基酸序列為Seq ID No. 4。具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核香酸鏈，該核苷酸鏈 可編碼一種HSA與人IGF1形成的融合蛋白(HSA/hlGFl),編碼該融合蛋 白的核苷酸鏈與Seq ID No. 5有至少90%的序列同源性。優(yōu)選的該核苷酸 鏈與Seq ID No. 5有至少95°/。的序列同源性。優(yōu)選地，該核芬酸編碼的蛋 白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID No. 6。具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核苷酸鏈，該核苷酸鏈 可編碼一種HSA與人bFGF形成的融合蛋白(HSA/hbFGF)。編碼該融合蛋 白的核苷酸鏈與Seq ID No. 7有至少90°/。的序列同源性，優(yōu)選地，該核苷 酸序列與Seq ID No. 7有至少95°/。的序列同源性。優(yōu)選地，該核苷酸序列 編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID No. 8。具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核苦酸鏈，該核苷酸鏈 可編碼一種HSA與人aFGF所形成的融合蛋白(HSA/haFGF )。編碼該融合 蛋白的核苷酸鏈與Seq ID No. 9有至少90%的序列同源性，優(yōu)選地，該核 苷酸序列與Seq ID 9有至少95°/。的序列同源性。優(yōu)選地，該核苷酸序列編 碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID No. 10。再具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核苷酸鏈，該核苷酸 鏈可編碼一種HSA與PDGF-B所形成的融合蛋白(HSA/hPDGFB)。編碼該 融合蛋白的核苷酸鏈與Seq ID No. 11有至少90%的序列同源性，優(yōu)選地， 該核苷酸序列與Seq ID 11有至少95%的序列同源性。優(yōu)選地，該核苷酸 序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID No. 12。與上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指例如，能編 碼一種HSA/GF融合蛋白，并在相似的核苷酸序列之間具有至少95%的序列 同源性的核苷酸。其包括核苷酸鏈上每百個(gè)核苷酸有5個(gè)點(diǎn)突變，并也是7
編碼HSA/GF融合蛋白的核苷酸序列。換句話講，任何核苷酸鏈與上述編碼 HSA/GF融合蛋白的核苷酸鏈具有95°/。的序列同源性，即，即便有多達(dá)5%的 核苷酸個(gè)體可以被替換、刪減或插入等，均與本發(fā)明所指的核普酸序列相 同。無(wú)論是在5，或3，端，或在兩端之間的任何位點(diǎn)發(fā)生的突變，還是以 單體或多體發(fā)生的突變均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)踐上，任何特指的核酸分子，只要具有90%、 95%、 96%、 97%、 98% 或99°/ 的相似性，就在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。而且由核苷酸序列編碼的 HSA/GF融合蛋白也可由常規(guī)已知的計(jì)算機(jī)軟件，如Bestfit軟件 (Wisconsin)序列分析軟件包來(lái)獲得。Bestfit應(yīng)用區(qū)域同源性比較方法 (文獻(xiàn)Smith和Waterman,應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2: 482-489 ( 1981 )來(lái)尋找兩 個(gè)序列之間最佳的同源序列。當(dāng)應(yīng)用該軟件或其它任何具有類似的DM序 列對(duì)比分析時(shí)，某一特定的序列如與本發(fā)明所^^出的序列有95%以上的序 列同源性，均視為與本發(fā)明所述的序列相同源。GF基因序列可以從不同組織來(lái)源的總RM中用PCR擴(kuò)增的方法獲得， 也可以用如果合成全DNA序列的方法來(lái)獲得。人工合成的基因在其核苷酸 編碼同一氨基酸氏可，采用表達(dá)系統(tǒng)喜好的核普酸，HSA/hEGF融合蛋白表 達(dá)重組酵母菌，已保藏在中國(guó)科學(xué)院微生物所中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)獲得保藏號(hào)CGMCC-2072,作為本發(fā)明中的HSA/GF融合蛋白的代表作。在室溫或更高的溫度下，HSA和GF形成的融合蛋白與GF單體相比， 在同樣條件下，具有2倍以上，優(yōu)選達(dá)5倍或10倍或更優(yōu)選達(dá)20倍以上 的貯存期和半衰期。本發(fā)明還涉及用白蛋白作為載體，攜帶治療性的蛋白質(zhì)藥物，如GF來(lái) 美容和治療各種創(chuàng)傷、疾病或異常，或那些以加強(qiáng)細(xì)胞增生、修復(fù)為目的 的人，如創(chuàng)傷、潰瘍患者。在本發(fā)明中，HSA/GF融合蛋白可以用于脊推動(dòng) 物，優(yōu)選地是人類，并通過(guò)不同途徑，包括但不局限于涂抹、噴涂、口月良、 非經(jīng)腸胃、腹腔膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、舌下、肌內(nèi)、腸內(nèi)、唾液 腺、鼻內(nèi)、PEG化、脂質(zhì)法，通過(guò)吸入、注射、陰道、眼內(nèi)方法給藥。HSA/GF 也可通過(guò)局部性釋放(如導(dǎo)管或Stent)，包括皮下、脂肪下、關(guān)節(jié)下及膜 內(nèi)，并可以做成緩釋劑。具體地，融合蛋白可通過(guò)涂抹、噴涂給藥。本發(fā)明涉及將一個(gè)白蛋白分子或其變種或片段與一個(gè)GF分子或其變 種或片段通過(guò)基因工程融合在一起，所形成的融合蛋白較未經(jīng)融合的GF延 長(zhǎng)了半衰期。為方便起見(jiàn)，本發(fā)明只提及人血清白蛋白(HSA)和細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(GF),即人KGF、人EGF、人IGF、人PDGF、 人VEGF和人SGF等形成 的融合蛋白。當(dāng)然其它脊稚動(dòng)物的白蛋白與GF形成的融合蛋白均可包括在 內(nèi)。優(yōu)選地，在GF或其變種或片段的N-末端部分，與HSA或其變種、或 片段的C-末端部分形成融合蛋白后，在融合蛋白與受體結(jié)合時(shí)所有負(fù)效應(yīng) 達(dá)最小化。同樣具有信號(hào)傳導(dǎo)、受體結(jié)合作用的由GF形成的融合蛋白，或 者含有GF或其一個(gè)變體或片段的融合蛋白均包括在本發(fā)明中。本發(fā)明中的HSA/GF融合蛋白或其配方均可通過(guò)傳統(tǒng)方法，包括非經(jīng)胃
腸道(如皮下或肌肉)注射或靜脈輸注的方式給藥。治療包括在一段時(shí)間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。本發(fā)明中的融合蛋白HSA/GF可單獨(dú)使用，而 優(yōu)選地，可與一種或多種可接受的載體或另一種HSA/GF或HSA或多種 HSA/GF —起成藥物制劑的形式使用。所述載體特別是另一種HSA/GF或多 種HSA/GF必需是相互兼容的且對(duì)受體自身不產(chǎn)生有害影響的載體。"可接 受的"典型的載體為水和鹽水，其應(yīng)是無(wú)菌、無(wú)熱原也無(wú)額外免疫原性的。 不同HSA/GF之間，當(dāng)具有相容性、協(xié)同增效性或僅起協(xié)助制劑作用時(shí)，也 可考慮共同使用。HSA/GF融合蛋白可以制劑形式或單元?jiǎng)┝康谋憬莘绞浇o藥，也可經(jīng)由 任何藥學(xué)領(lǐng)域已知和認(rèn)可的方法制備，該方法包括將HSA/GF與具有一種或 多種輔助成份的載體結(jié)合到一起的步驟。概括地講，將活性成分和液相載 體或組合固相載體、助劑或其它試劑均勻地結(jié)合而制備制劑，然后根據(jù)需 要，將產(chǎn)品成型。適合于非經(jīng)胃腸道途徑使用的HSA/GF制劑包含水相或不含水相的無(wú) 菌注射液，可含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和助溶劑、或增加藥物滲透性 與平衡劑。含水或不含水的無(wú)菌懸浮液包括懸浮劑和增稠劑。該制劑可貯 存于單元?jiǎng)┝炕蚨嘣獎(jiǎng)┝康娜萜髦?，如密封的安瓿瓶中和小管中，在冰?(凍干法)條件下貝i存。使用前加入無(wú)菌液態(tài)載體，如注射用水，制成臨 時(shí)性注射液和懸浮液。將HSA/GF融合蛋白送入動(dòng)物體內(nèi)后，與GF單體相比，HSA/GF在血液 中的半衰期具有長(zhǎng)約2倍，優(yōu)選地是長(zhǎng)約4倍，更優(yōu)選地為長(zhǎng)約6倍，再 更優(yōu)選為長(zhǎng)約IO倍的半衰期。本發(fā)明的HSA/GF融合蛋白可以與由自然界 分離的或重組型的人血清白蛋白共同使用。優(yōu)選與重組的人血清白蛋白組 成具有療效的劑量和比率?？梢韵嘈湃诤虾?，治療性蛋白質(zhì)有較高的半衰期并在使用中在作用部 位停留較長(zhǎng)的時(shí)間，在制成產(chǎn)品時(shí)貯存條件和運(yùn)輸?shù)囊蠼档停梢越档?成本，同時(shí)較長(zhǎng)半衰期也可減少GF的使用劑量和使用次數(shù)。相同的策略也可用于研發(fā)具有美容作用功效的穩(wěn)定的含有融合蛋白的 產(chǎn)品。例如皮膚的美容、保濕、除皺、防皺、美白。產(chǎn)品的組合中可含有 一種融合蛋白或兩種以上融合蛋白，或其它組分(如HSA)作為主劑，還 可有增綢劑、保濕劑、乳化劑、防腐劑等。2)用于HSA/GF融合蛋白表達(dá)的宿主系統(tǒng)本發(fā)明中的HSA/GF核苷酸可利用重組克隆技術(shù)引入宿主細(xì)胞，以使融 合蛋白得以表達(dá)。 一般來(lái)說(shuō)，宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染) 方法將攜帶有本發(fā)明中所提到的各種可能組合的HSA/GF載體質(zhì)粒以侵入 方式、病毒感染"噬菌體，，等形式轉(zhuǎn)入宿主系統(tǒng)中。工程宿主細(xì)胞可以在 含常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并經(jīng)過(guò)適當(dāng)修改以利于啟動(dòng)子。以適當(dāng)?shù)?操作方式控制選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼HSA/GF的核香酸鏈的培養(yǎng)條件，如溫 度，pH和選纟奪表達(dá)細(xì)胞。 按本發(fā)明所述，重組載體攜帶有包含編碼HSA/GF融合蛋白的核苷酸。 重組載體可以是一個(gè)表達(dá)載體，可在宿主細(xì)胞內(nèi)由攜帶的核苷酸編碼來(lái)表 達(dá)融合蛋白。形式可為，但不局限于，HSA/CPSA、 GF/HSA、 HSA/L/GF或 GF/L/HSA(L-連接肽)。宿主生物體及體細(xì)胞包括，但不局限于，脊推動(dòng)物 (如人、猴、鼠、兔等)魚(yú)、雞、昆蟲(chóng)、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等。編碼HSA/GF的核苷酸是在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子作用下表達(dá)HSA/GF融合蛋白。 可利用的適合啟動(dòng)子包括，但不局限于，腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要的 后期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 可有MMT啟動(dòng)子、熱刺激啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、ApoAI啟動(dòng)子和人球蛋 白啟動(dòng)子；病毒胸腺嘧啶脫氧核苷酶啟動(dòng)子則有皰滲病毒胸腺激酶啟動(dòng)子； 反轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子包括經(jīng)修飾后的LTR啟動(dòng)子；P -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子； 人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。也可用天然啟動(dòng)子來(lái)控制核苷酸編碼表達(dá)HSA/GF融合 蛋白。根據(jù)本，明，e重組細(xì)胞，有表，編碼HSA'/GF融合蛋白核酸序列的能HSA/L/GF或GF/L/HSA。重組工程細(xì)胞形式包括，但不局限于4推動(dòng)物(即 人、牛、豬、猴、鼠、兔、魚(yú)、雞等)昆蟲(chóng)、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等 細(xì)胞。優(yōu)選的用于表達(dá)HSA/GF的酵母屬宿主包括，但不局限于，釀酒酵母屬 (Saccharomyces )、畢氏酵母屬(Phichia )、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces )、 念珠菌屬(Candida)、漢森酵母(Hancenula)、孢 園酵母屬(Tarulaspora )和裂殖酵母屬(Schizosaromyces )等。更優(yōu)選 地，宿主系統(tǒng)可為畢氏酵母屬巴斯德菌種。具體地講重組載體質(zhì)粒可為 pPICZ-A、 B或C。根據(jù)選用不同的宿主來(lái)表達(dá)HSA/GF融合蛋白。本發(fā)明中表達(dá)的蛋白多 肽可以是糖基化或非糖基化的。優(yōu)選地，當(dāng)在宿主系統(tǒng)中得到表達(dá)時(shí)， HSA/GF在脊推動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠(CH0)中得到表達(dá)的蛋白為糖基化蛋 白。當(dāng)表達(dá)在畢氏酵母菌中則為非糖基化或部分糖基化的蛋白。如上所述，在本發(fā)明中提到的白蛋白融合蛋白，優(yōu)選使用基因工程技 術(shù)構(gòu)建來(lái)表達(dá)。獲得融合蛋白的優(yōu)選方法是利用載體質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn) 染或感染的方式來(lái)表達(dá)融合蛋白。特別是利用可轉(zhuǎn)化酵母的表達(dá)載體，來(lái) 轉(zhuǎn)化畢氏酵母，并使融合蛋白分泌到培養(yǎng)液中。利用酵母菌表達(dá)HSA/GF的優(yōu)勢(shì)在于，酵母菌體系可以產(chǎn)生高質(zhì)量成熟 的融合蛋白，并可以分泌到培養(yǎng)液中而便于純化。酵母菌遺傳工程的進(jìn)展使外源基因可以在酵母菌中得到表達(dá)并分泌蛋 白產(chǎn)品到細(xì)胞外。利用酵母菌表達(dá)分泌型蛋白的優(yōu)點(diǎn)為，但不局限于，高 表達(dá)產(chǎn)量、蛋白質(zhì)為可溶性的、正確的折迭和易于大規(guī)模生產(chǎn)和純化。經(jīng)由白蛋白天然信號(hào)肽，HSA/GF融合蛋白可分泌到酵母菌培養(yǎng)液中。 HSA/GF融合蛋白的多肽可由信號(hào)肽主導(dǎo)并通過(guò)分泌途徑而得到加工。白蛋 白的前導(dǎo)肽序列可用在酵母菌中，使融合蛋白分泌到酵母菌外。其它分泌肽，如天然的釀酒酵母的a-因子分泌信號(hào)肽，也可用于分泌本發(fā)明中的融 合蛋白。優(yōu)選實(shí)例為應(yīng)用巴斯德酵母菌系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明中提及的HSA/GF融 合蛋白。其優(yōu)于利用其它表達(dá)系統(tǒng)。畢氏酵母菌具有許多高等真核細(xì)胞表 達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)點(diǎn)，例如蛋白質(zhì)的加工、折迭、轉(zhuǎn)錄后的修飾以及如同 培養(yǎng)細(xì)菌或釀酒酵母一樣的易于大規(guī)模培養(yǎng)，與其它系統(tǒng)如桿狀病毒、脊 推動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比更具有簡(jiǎn)捷、快速的表達(dá),產(chǎn)量更高。畢氏酵母還有另 外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是具有10-100倍高的表達(dá)水平。這些特性使得畢氏酵母變成十 分有力的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。與釀酒酵母菌相比，畢氏酵母菌在對(duì)分泌的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化的程度 上有著更大的優(yōu)點(diǎn)。即畢氏酵母不會(huì)有過(guò)度糖基化的現(xiàn)象。釀酒酵母和 畢氏酵母均有N-連接糖基甘露糖的修飾。然而寡糖化物鏈加在表達(dá)的蛋白 上，在畢氏酵母菌中只有8-14個(gè)糖基，遠(yuǎn)短于在釀酒酵母中的50-150甘 露糖鏈。在畢氏酵母菌中連接的糖基化較少發(fā)生。釀酒酵母的核心糖基化 帶有a-l，3連接的末端物，而在畢氏酵母菌中則沒(méi)有。研究表明由釀酒酵 母產(chǎn)生的糖基化蛋白具有較強(qiáng)的抗原反應(yīng)，而使得這些蛋白不適于用在特 別是治療目的上的使用。當(dāng)然這也表明減少了用畢氏酵母菌來(lái)表達(dá)蛋白在 糖基化上的擔(dān)憂。利用畢氏酵母做為表達(dá)系統(tǒng)有許多試劑盒可以使用。如Invitrogen 的易選EasySelectTM畢氏酵母表達(dá)試盒。表達(dá)載體上有一個(gè)A0X1啟動(dòng)子可 以使外源基因在畢氏酵母中利用曱醇來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)還有一個(gè)抗生素 Zeocin抗性基因，可做為選擇重組子的標(biāo)記。在本發(fā)明中，表達(dá)融合蛋白啟動(dòng)子是非常重要的因素。在畢氏酵母系統(tǒng)中，A0X1基因啟動(dòng)子是十分強(qiáng)勁的啟動(dòng)子。特別是 在畢氏酵母菌中，在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶，A0X1和A0X2。 A0X1 具有在細(xì)胞中產(chǎn)生合成大量的乙醇氧化酶(A0X1 )的活性。A0X1基因的表達(dá)受到緊密控制并由曱醇誘導(dǎo)而達(dá)到極高的水平。典型地當(dāng)用曱醇做為唯 一碳源時(shí)，在所有的可溶性蛋白中A0X1基因的產(chǎn)物就達(dá)3(T/。。 A0X1基因已 分離得到。A0X1基因啟動(dòng)子也用于本發(fā)明的載體質(zhì)粒中用以驅(qū)動(dòng)編碼目的 基因的外源蛋白的表達(dá)(Ellis等，1985; Koutz等,1989， Tschopp等， 1987a)。而A0X2和A0X1基因有97°/。的同源性，其在曱醇中的生長(zhǎng)速度比 A0X1基因慢。這種緩慢的生長(zhǎng)狀態(tài)，可以分離到Mut+(A0X1 )抹。除了 A0X1 基因啟動(dòng)子外，酵母菌中的其它啟動(dòng)子也可用于驅(qū)動(dòng)HSA/GF融合蛋白。這 些啟動(dòng)子包括，但不局限于PGK1、 GAPDH、 Gall、 CallO、 Cycl、 PH05、 TRP1、 ADH1或ADH2基因啟動(dòng)子。表達(dá)質(zhì)粒也可同時(shí)用于細(xì)菌宿主，如大腸肝菌DH5a (Gibcol/BRL)和 酵母宿主中?？股豘eocin、組氨酸缺陷型培養(yǎng)基作為選擇標(biāo)記已應(yīng)用在 本發(fā)明的各實(shí)施例中。
表達(dá)載體含有編碼HSA或HSA/GF融合蛋白的核苷酸，4安Invitrogen 試劑盒所描述的方法轉(zhuǎn)化酵母菌.,經(jīng)過(guò)抗性選擇出轉(zhuǎn)化的酵母菌菌落。這 些細(xì)胞可表達(dá)HSA/GF融合蛋白，當(dāng)接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中時(shí)，分析這些酵 母菌表達(dá)分泌融合蛋白于培養(yǎng)基中的能力。蛋白質(zhì)的收獲可在細(xì)胞連續(xù)培 養(yǎng)中進(jìn)行?；蛟谂颗囵B(yǎng)結(jié)束后一并收獲，本發(fā)明所述的融合蛋白經(jīng)培養(yǎng) 的酵母菌表達(dá)后，以能維持蛋白活性和藥效活性的蛋白提純方法來(lái)加以分 離純化。
在此還需提及的是，其它表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明的HSA/GF融合蛋白 的表達(dá)，包括，但不局限于，細(xì)菌、枯草桿菌(B. Subtitis)、釀酒酵母、 克魯維酵母菌屬、漢森酵母、念珠菌屬、孢圓酵母屬、裂殖酵母屬、固嚢 酵母屬(Citeromyces) 、 Pachysoler，德、巴利酵母屬(Debaromyces)、梅 奇酵母屬(Metschumikowia )、紅冬孢屬(Rhodospor idium)、無(wú)色擔(dān)子 孢子屬(Leucosporiduum)、葡狀子嚢菌屬(Botryoascus)、鎖擲酵母屬 (Sporidiobolcus )、擬內(nèi)孢霉屬(Endomyucopsis )、動(dòng)物、植物和昆蟲(chóng) 細(xì)胞等。
3) HSA/GF融合蛋白單獨(dú)應(yīng)用和組合應(yīng)用
本發(fā)明中的任何蛋白可以單獨(dú)應(yīng)用外，還提供了一種不同HSA/GF融合 蛋白的組合應(yīng)用。
這種獨(dú)特的融合蛋白的組合可以提供使用者身體細(xì)胞的多種細(xì)胞的同 時(shí)增生、分化成熟、或具有對(duì)某一特定類細(xì)胞具有協(xié)同增效作用。特別地， 本發(fā)明中的HSA和不同細(xì)胞生長(zhǎng)因子形成的不同融合蛋白，共同組合使用 的結(jié)果是同時(shí)刺激多種細(xì)胞的增生和成熟。應(yīng)用HSA/GF的定向作用于不同 類型的細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或多種細(xì)胞的產(chǎn)生途徑，可以在只需一次使用 于使用者身上后，使諸如表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和肌細(xì)胞、纖維細(xì)胞等都得 到明顯的修復(fù)和增生。
在本發(fā)明中，白蛋白的血漿傳遞功能和GF的治療功能因蛋白發(fā)生融合 而得到整合。當(dāng)在血液中循環(huán)時(shí)，由于與白蛋白融合而賦予GF抵抗蛋白酶 降解的超級(jí)穩(wěn)定性，結(jié)果大大延長(zhǎng)了 GF在血液中的半衰期。由于大量白蛋 白的存在，不同的GF與白蛋白形成融合蛋白，經(jīng)組合可以減少并形成較小 的生物學(xué)功能上的相互干擾現(xiàn)象。這種千擾現(xiàn)象常出現(xiàn)在"GF單體"之間 的組合。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)， 一個(gè)與白蛋白融合的GF，可以在血液系統(tǒng)中停留相 當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間而得到緩慢釋放，因而減低了在常規(guī)方法下，單獨(dú)使用大 劑量單一GF時(shí)，帶來(lái)的急性反應(yīng)，毒性及副作用。這種融合蛋白緩慢釋放 作用形式，以本發(fā)明中的使用劑量，注射次數(shù)減少，而更進(jìn)一步降低GF注 射的副作用。
根據(jù)本發(fā)明，血清白蛋白與此類GF形成融合蛋白后，可在進(jìn)入體內(nèi)后 因緩慢釋放而減少上迷局限性。另外，這樣的融合蛋白可以與相對(duì)大量的 白蛋白組合，可進(jìn)一步減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)直接注射GF進(jìn)入體內(nèi)，所引起 的強(qiáng)烈可預(yù)見(jiàn)的反應(yīng)。 已知，貯存"棵露"的細(xì)胞因子是相當(dāng)不穩(wěn)定的，并且在儲(chǔ)存中壽命 極短。十分清楚地是，細(xì)胞因子具有的如此脆弱的穩(wěn)定性在體外是相當(dāng)不 便的，對(duì)使用者來(lái)講是十分昂貴和不便的。事實(shí)上白蛋白也常作為添加劑 與細(xì)胞因子在一起，來(lái)保證含有細(xì)胞因子的產(chǎn)品具有較長(zhǎng)的貨架儲(chǔ)存壽命、 和運(yùn)輸保藏中的產(chǎn)品穩(wěn)定，以此達(dá)到細(xì)胞因子的有效作用強(qiáng)度。本發(fā)明使得HSA/GF融合蛋白在血液中半衰期延長(zhǎng)，穩(wěn)定性增加。復(fù)合 型的HSA/GFs即HSA與hEGF、 hKGF、 hIGF和hPDGF可共同刺激皮膚中多種 細(xì)胞的修復(fù)和分化。具體地，HSA/hEGF融合蛋白可以和HSA/hKGF融合蛋白形成復(fù)合藥劑 以作用于創(chuàng)傷患者，其結(jié)果患者的表皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞等分化增生，結(jié)果 使創(chuàng)傷快速修復(fù)?？商娲模鶕?jù)使用者的需要， 一種HSA/GF可以與另一種或多種 HSA/GF以同時(shí)或先后的方式給藥。這種組合使用的劑量是達(dá)到治療或明顯 具有美容目的劑量，并且效果是具有協(xié)同增效作用的有效劑量。本發(fā)明提供了成套的使用HSA/GF組合治療的描述與實(shí)踐，成套組合包 括第一個(gè)HSA/GF和與第一個(gè)GF相同或不同的第二個(gè)HSA/GF。例如，第一 個(gè)HSA/GF中GF可以是KGF，第二個(gè)GF是EGF;或第一個(gè)GF是KGF-2，第 二個(gè)GF是PDGF;或第一個(gè)GF是IGF-1,第二個(gè)GF可以是FGF等。HSA單 體也可以作為第 一個(gè)或第二個(gè)蛋白組分構(gòu)成制劑，用于組合制劑。本發(fā)明中的HSF/GF融合蛋白單獨(dú)或它們的組合可用于治療各種疾病， 包括但不局限于，燒傷、燙傷、灼傷(淺n度、深I(lǐng)I度、肉芽創(chuàng)面)、 新鮮創(chuàng)面(包括各種刀傷、外傷、手術(shù)傷口、美容整形創(chuàng)面)、糖尿病 或靜脈曲張等所致的頑固性潰瘍和壞疽、潰瘍創(chuàng)面(包括口腔及各種皮 膚潰瘍等)、瘡癰類疾病(如褥瘡、痤瘡、癤腫等)、角膜外傷、潰瘍、 電光性眼炎、供皮區(qū)創(chuàng)面、放射性損傷創(chuàng)面以及組織器官移植等。優(yōu)選 地，融合蛋白應(yīng)不含有能引起人類免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明還提供了對(duì)需要GF患者的一種使用方法，這種方法是將HSA與 GF基因融合而形成融合蛋白并按一定的配比組合而成有效的復(fù)合制劑。這 種藥學(xué)制劑可使用藥劑學(xué)上接受的賦形劑和劑型以達(dá)到增加HSA/GF的穩(wěn) 定性。當(dāng)然醫(yī)學(xué)上能接受的劑型，也包括天然和重組的HSA以及或另外一 種或多種HSA/GF融合蛋白。4)除此之外，本發(fā)明也提供了利用酵母菌來(lái)更有效地及節(jié)省費(fèi)用地生 產(chǎn)制造重組融合的HSA/GF蛋白。本發(fā)明也提供了發(fā)酵液處理的方法，可用 于融合蛋白的分離、純化或?qū)⒑?jiǎn)單程序處理的發(fā)酵液直接用于美容護(hù)膚、 化妝品的制作和應(yīng)用。


表達(dá)載體質(zhì)粒。附圖3. A)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量(a)、無(wú)質(zhì)粒插入的畢氏酵母菌(b)、 酵母菌表達(dá)的HSA/hEGF融合蛋白(c )、和大腸桿菌表達(dá)的hEGF蛋白(d); B )酵母菌表達(dá)的HSA/hKGF-2融合蛋白(e) 、 HSA/haFGF融合蛋白(f)和HSA (g); C)以鼠抗人血清白蛋白單克隆抗體(Signm公司)所做的蛋白質(zhì)免 疫印跡實(shí)驗(yàn)。酵母菌表達(dá)的HSA/hEGF (73kd) (h)融合蛋白；酵母菌表 達(dá)的人血清白蛋白(65kd) (i)。附圖4.含有不同量的HSA/PDGF-B的發(fā)酵液對(duì)BalBC3T3細(xì)胞的生物活 性測(cè)定的3次結(jié)果的平均值，表明HSA/PDGF-B具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。附圖5.生物活性測(cè)定結(jié)果顯示在37°C (A)或5(TC (B)下這些融合 蛋白在不同溫度下的存活期。系列l(wèi)為hEGF單體；系列2為HSA/hEGF融 合蛋白；系列3為HSA/hKGF-2融合蛋白；系列4為HSA/hlGF和HSA/hEGF 的組合(各5000IU)。所有的樣品均是IOOOOIU。 HSA/hEGF、 HSA/hlGF-1 融合蛋白刺激BalB/C3T3細(xì)胞增生的生物活性測(cè)定。測(cè)定培養(yǎng)液中含有GF 單體或融合蛋白或組合應(yīng)用時(shí)的細(xì)胞增生數(shù)量和協(xié)同增效作用。附圖6.動(dòng)物體內(nèi)體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)觀察HSA/GF融合蛋白在血液中半衰期。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:分子克隆技術(shù)簡(jiǎn)述常規(guī)分子克隆技術(shù)包括DNA、 RNA的提取，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝 膠電泳，DNA片段的連接，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)均參照文獻(xiàn)(Maniatis， etal.,"分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)"冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約，1982 )。 質(zhì)粒DNA的純化，DNA片段的回收等均采用商品純化柱制備。DNA聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)(參照文獻(xiàn)Saikiet al.，科學(xué)，230:1 350, 1985 )所用的酶 及反應(yīng)所需的PCR儀均為Perkin Elmer產(chǎn)品。并參照廠家操作程序。DNA 測(cè)序和DNA擴(kuò)增所需用的寡聚核苷酸引物由專門機(jī)構(gòu)完成。轉(zhuǎn)受態(tài)大腸桿 菌由GIBC0/BRL公司購(gòu)得。本發(fā)明所使用的酵母菌菌種均購(gòu)自Invitrogen 公司。轉(zhuǎn)化酵母菌是由電脈沖方式進(jìn)行，并參照廠家(Bio-Rad)的操作程 序。實(shí)施例2:人血清白蛋白(HSA)基因表達(dá)及載體質(zhì)粒的構(gòu)建 使用發(fā)明人在其發(fā)明專利ZL02142881. 6 、 ZL200410042814. 8和 CN20041005731 3. 7中所描述的HSA克隆方法和試驗(yàn)結(jié)果。GenBank檢索編 號(hào)AY728024的HSA序列，用于本發(fā)明中的HSA基因序列與細(xì)胞生長(zhǎng)因子基 因序列發(fā)生基因重組融合蛋白的。使用AY728024序列編碼HSA，可使得融 合蛋白獲得在酵母菌中的意想不到的高效表達(dá)。表達(dá)質(zhì)粒(見(jiàn)中國(guó)專利 ZL021428816附圖2)也用于本發(fā)明的實(shí)施例中。實(shí)施例3:人KGF-2、 EGF、 IGF1、 PDGF - B和bFGF的基因的融合及 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hKGF2 )、血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子-B( hPDGF )、 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hbFGF)應(yīng)用相似于實(shí)施例1中所表述的RT-PCR 方法，從不同來(lái)源的總RNA制備物中擴(kuò)增。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hEGF)和 胰島素樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1 (hIGF-1)的分子克隆采用DNA序列(PCR法) 全合成法。PCR產(chǎn)物均克隆于pCRII載體質(zhì)粒中，并經(jīng)DNA測(cè)序分析。利用RT-PCR技術(shù)，從體外培養(yǎng)的人胚胎成纖維細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增 出人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hKGF-2)的基因序列，并將其克隆入PCR產(chǎn)物載 體質(zhì)粒中。PCR合成寡聚核苷酸引物分別為Seq. ID NO. 13: 5，-GCCTTAGGCTTAGCCCTTGGTCAGGACATGG-3，,和Seq. ID NO.14: 5，-CTCGAGTCATGAGTGGACCACCATTGG-3，引物的設(shè)計(jì)是根據(jù)BenBank檢索編號(hào)麗_004465而設(shè)計(jì)。PCR產(chǎn)物只 包括hKGF-2的成熟蛋白多肽編碼區(qū)域。并在5，端引入HSA的3 '末端序列， 包括Bsu361限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。在融合蛋白的3'端引入Xho1位點(diǎn)。便于 將hKGF-2基因插入pZY - HSA載體，形成HSA/hKGF-2融合基因在酵母表達(dá) 載體的構(gòu)建。HSA與hKGF-2基因融合的DNA序列(Seq ID NO. 1 )列于序 列表A,融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO. 2 )列于序列表B。hEGF全長(zhǎng)序列是根據(jù)GenBank檢索編號(hào)X04571來(lái)設(shè)計(jì)，并采用酵母 菌喜好氨基酸編碼堿基，由人工合成PCR擴(kuò)增而來(lái)。hEGF寡聚核苷酸引物 的DNA序列分別為Seq. ID NO. 15: 5，-GCCTTAGGCTTAaacagcgactctgaatgtcc-3，,Seq. ID NO. 16:5， -GGCAGTAACCGTCGTGGGACAGCGGACATTCAGAGTCGCTGTT-3， Seq. ID NO. 17:Seq, ID NO. 18:Seq. ID NO. 19:和Seq. ID NO, 20:DNA人工合成路線和方法見(jiàn)圖2所示。PCR的產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后克隆入 pCRII載體質(zhì)粒中，經(jīng)DNA序列分析，證明其與文獻(xiàn)才艮道相同。內(nèi)切酶Bsu361 和Notl識(shí)別位點(diǎn)已分別加在hEGF基因的兩端(下劃線)。將合成的基因 序列插入pZY - HSA載體中。HSA/hEGF融合基因的DNA序列(Seq ID NO. 3 ) 列于序列ic,融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO. 4 )列于序列表D。這一 DNA核苷酸序列和能表達(dá)這一融合蛋白的重組畢氏酵母菌特意保藏在中國(guó) 微生物所菌種保藏委員會(huì)，獲得保藏號(hào)2072,作為本發(fā)明中的HSA/GF融 合蛋白的一個(gè)代表。hbFGF基因全長(zhǎng)序列是從人成纖維細(xì)胞總RNA中，用RT-PCR的方法擴(kuò)
增、克隆擴(kuò)增而得。PCR所需的引物DNA序列是根據(jù)GenBank檢索編碼S81809 )來(lái)設(shè)計(jì)的。寡聚核香酸引物序列為Seq. ID NO. 21: 5，-GCCTTAGGCTTActgggggacc gcgggcgcgg-3'，和 Seq. ID NO. 22: 5，-AGCGGCCGCTCAgTGAGGGTCGCTCTTCTCCC-3， Bsu361和Notl識(shí)別位點(diǎn)人為加i克隆的hbFGF基因的兩端，經(jīng)擴(kuò)增的hbFGF基因DNA序列插入在pZY-HSA表達(dá)載體中。融合蛋白/hbFGF核苷酸序列(SeQ ID NO. 5 )列于序列表E,融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO. 6 )列于序列表F。hIGF-l基因全長(zhǎng)以圖1方式，人工全合成。設(shè)計(jì)的PCR寡聚核芬酸 引物序列是基于GenBank檢索編碼畫(huà)_000618來(lái)設(shè)計(jì)的 Seq. ID NO. 23:5，-ACCTTAGGCTTAggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcUc-3，； Seq. ID NO. 24:5，一cttgttgaaa taaaagcccctgtctccacacacgaactgaagagca tccaccagc-3，； Seq. ID NO. 25:5，-ggcttUat ttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcag-3，；Seq. ID NO. 26:5，-acagctccggaagcagcactcatccacgatgcctgtctgaggcgccctccgactgc-3'; Seq. ID NO. 27:5，-gctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtat tgcgcacccctca-3，； Seq. ID NO. 28:5，-AGCGGCCGCtcaagctgacttggcaggcttgaggggtgcgcaataca-3，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，克隆于pCRII載體，并經(jīng)DNA 序列分析鑒定后插入pZY - HSA酵母菌表達(dá)載體的Bsu36I和Notl位點(diǎn)。獲 得pZY - HSA/hlGF-l質(zhì)粒。融合基因的DNA核苷酸序列(Seq ID NO. 7 )列 于序列表G,融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO. 8 )列于序列表H。haFGF基因全長(zhǎng)序列是從人腦總RNA中，用RT-PCR的方法擴(kuò)增、克隆 擴(kuò)增而得。PCR所需的引物DNA序列是根據(jù)GenBank檢索編碼S67291來(lái) 設(shè)計(jì)的。寡聚核苷酸引物序列為Seq ID No. 29: 5，-GCCTTAGGCTTAgctgaaggggaaatcacc-3，和 Seq ID No. 30: 5，-AGCGGCCGCTCAGAAGAGACTGGCAGG-3' RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，克隆于pCRII載體，并經(jīng)DNA 序列分析鑒定后插入pZY - HSA酵母菌表達(dá)載體的Bsu36I和Notl位點(diǎn)。獲 得pZY-HSA/haFGF質(zhì)粒。融合基因的DNA核苷酸序列(SeQ ID NO."列 于序列表I，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO. 10)列于序列表J。hPDGF-B基因全長(zhǎng)序列是從發(fā)明人擁有的含該基因全長(zhǎng)的DNA質(zhì)粒 中，用PCR的方法擴(kuò)增、克隆擴(kuò)增而得。PCR所需的引物DNA序列是根據(jù) GenBank檢索編碼:AH002986來(lái)設(shè)計(jì)的。寡聚核苷酸引物序列為Seq ID No. 31: 5，-GCCTTAGGCTTAaatcgctgctgggcgctc-3'和 Seq ID No. 32: 5，-AGCGGCCGCTAGGCTCCAAGGGTCTCC-3, PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，克隆于pCRII載體，并經(jīng)DNA序 列分析鑒定后插入pZY _ HSA酵母菌表達(dá)載體的Bsu36I和NotI位點(diǎn)。獲得 pZY - HSA/hPDGF-B質(zhì)粒。融合基因的DNA核普酸序列(Seq ID NO. 11 )列 于序列表K，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO. 12)列于序列表L。 實(shí)施例4.帶有連接肽的HSA/GF融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 在HSA的C-末端含有一個(gè)限制性內(nèi)切酶Bsu36I識(shí)別位點(diǎn)，細(xì)胞生長(zhǎng) 因子hKGF-2， hEGF， hbFGF、 hIGF-1、 aFGF和hPDGF - B等均可通過(guò)基 因工程方式將連接肽序列3(GGGGS)與HSA C-末端蛋白質(zhì)序列相連,而形 成pZYHSA - L表達(dá)載體質(zhì)粒。做法是首先將在pZY - HSA載體質(zhì)粒上存在的 BamHI位點(diǎn)利用BamHI酶切，然后酶處理為平頭末端，再連接后轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌， 達(dá)到BamHI位點(diǎn)的消失。將人工合成的特異寡聚核苷酸序列 Seq ID No. 33: 5，-ttaggcttaggaggaggaggatcaggaggaggaggatcaggaggaggaggatccgc-3，和 Seq ID No. 34: 5,-ggccgcggatcctcctcctcctgatcctcctcctcctcctgatcctcctcctcctcctaagcc-3，。將Seq ID No. 33和34兩個(gè)寡聚核苷酸鏈等摩爾混和，加熱，然后緩慢 冷卻至室溫。含連接肽的寡聚核苷酸與經(jīng)Bsu36I和Notl酶切的pZYHSA載 體線性質(zhì)粒在連接酶的作用下重組。這樣就構(gòu)建了 pZYHSA - L表達(dá)載體質(zhì) 粒(附圖1)。在對(duì)各種細(xì)胞增生刺激因子基因，用PCR方法分別修飾各 種細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的5，末端為BamHI酶切位點(diǎn)。再直接克隆到經(jīng) Bsu36I/BamHI雙酶切取pYZ-HSA載體質(zhì)粒中。新插入的各蛋白質(zhì)因子的序 列與編碼HSA C-末端蛋白質(zhì)的序列順序相連接，這樣所有基因均可進(jìn)入同 一閱讀框形成基因間的融合而形成新HSA/L/GFDNA分子序列。其可表達(dá)帶 連接肽的HSA融合蛋白，并具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生物功能。 實(shí)施例5 酵母菌的轉(zhuǎn)化將畢氏酵母菌菌抹GS115或X33菌落接種于含5ml YPD培養(yǎng)液的50ml 培養(yǎng)基中，以250轉(zhuǎn)/分的速度于30。C下培養(yǎng)過(guò)夜。次日取Q. 2ml過(guò)夜培 養(yǎng)物再轉(zhuǎn)接入500ml YPD的培養(yǎng)液中，置于2升的三角培養(yǎng)瓶中。在30°C 下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-3小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到OD600-1. 3-1. 5。酵母菌經(jīng)離心方 法收集，再重懸于500ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水中洗滌兩次。然后酵母菌懸于20ml 冰預(yù)冷的1M Sortbitol ;容液洗滌一次。在實(shí)例3和實(shí)施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pZY-HSA/hKGF - 2、 pZY_HSA/hEGF、 pZY-HSA/hlGF、 pZY-HSA/hbGF、 pZY - HSA/aFGF或pZY - HSA/PDGF-B均經(jīng) Pme I限制性內(nèi)切酶處理后，形成線性質(zhì)粒分子。耳又5ug線性質(zhì)粒DNA與 80ul處理后的酵母菌相混合并置于0. 2厘米厚的電極杯內(nèi)，置于點(diǎn)脈沖儀 上。電脈沖條件為電壓7500V/CM,電極間隔時(shí)間為5-10 (ms )。電擊處理
后，立即加入lml冰預(yù)冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后轉(zhuǎn)入15ml 試管中。轉(zhuǎn)化的酵母菌置于30。C培養(yǎng)箱中放置2小時(shí)，然后接種涂布在含 Zeocin抗生素的YPD平板培養(yǎng)基上。經(jīng)抗性選擇而生長(zhǎng)出的克隆，再用分 子生物學(xué)方法鑒定其基因的插入。蛋白質(zhì)的表達(dá)與分泌則以SDS-PAGE或用 特異抗體做蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。不同的畢氏酵母菌菌抹，如X-33, KM71 以及蛋白酶缺陷型酵母菌抹，如SMD1168均可用來(lái)表達(dá)和分泌重組的 HSA/GF融合蛋白。實(shí)施例6 酵母菌表達(dá)及分泌的HSA和HSA/GF融合蛋白的特性 將數(shù)個(gè)含有待表達(dá)基因的酵母菌落分別在含有Zeocin抗生素，具有 緩沖能力及甘油的基本培養(yǎng)液中培養(yǎng)。以300轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)至菌體密度 達(dá)到006。。=2-6。培養(yǎng)物經(jīng)1500轉(zhuǎn)/分，15分鐘條件下離心收集菌體，菌體 再重懸于同種基本培養(yǎng)液但不含甘油，改含O. 5%曱醇，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密 度達(dá)到OD6。Q=1.0。酵母菌在曱醇的誘導(dǎo)下，外源蛋白在啟動(dòng)子的作用下開(kāi) 始表達(dá)。其后，每24小時(shí)加入100%曱醇至最終濃度為0.5%。在不同的時(shí) 間點(diǎn)分別收集培養(yǎng)上清液。使用SDS-PAGE變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或蛋 白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定HSA/GF融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，HSA/GF融合蛋白均由酵母菌表達(dá)，并被分泌到培養(yǎng)液中。 鼠抗人血清白蛋白的單克隆抗體(Sigma公司)，用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 確定被表達(dá)的蛋白質(zhì)為HSA或HSA/GF融合蛋白。典型的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)是將變性(SDS)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)， 經(jīng)電泳儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍或醋酸纖維膜上，再以特異抗體(第一抗體) 識(shí)別相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。然后帶有焚光功能基因的第二抗體，識(shí)別并結(jié)合于 第一抗體，經(jīng)熒光顯色整個(gè)特異性結(jié)合的復(fù)合物，即特異蛋白質(zhì)在X光片 上留下印記。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量用于決定未知蛋白的分子量。對(duì)經(jīng)酵母菌表 達(dá)分泌的HSA .及HSA/hKGF-1 、 HSA/hEGF、 HSA/hlGF-1 、 HSA/bFGF和 HSA/hPDGF-B,可分別與市售重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(中檢所)的抗原性比較。以 抗人EGF的單克隆抗體所做的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，融合蛋白HSA/EGF 與純品hEGF (R&DSystem公司)具有相同的抗原性，并顯示二者之間在免 疫反應(yīng)強(qiáng)度與分子大小上具有相同的比率。同理，以抗人GF抗體進(jìn)行檢測(cè)， 相同結(jié)果也得到證實(shí)。附圖3為所表達(dá)的融合蛋白發(fā)酵液電泳結(jié)果和使用 人血清白蛋白特異抗體(Sigma)與人血清白蛋白/人表皮生長(zhǎng)因子 (HSA/hEGF)和人血清白蛋白(HSA)單體，所作的Western blot結(jié)果。在 二者的分子量上，十分明顯地表現(xiàn)出HSA的65Kd和HSA/hEGF的73Kd兩個(gè) 分子的遷移率。實(shí)施例7 分泌型HSA/GF的純化與特性重組的酵母菌細(xì)胞(ZY-HSA/GF)或CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的培養(yǎng)上清 液中含有分泌出的血清白蛋白的融合蛋白HSA/GF。離心分離菌體后，上清 液經(jīng)2-10%活性炭處理，收集、濃縮并降低鹽濃度后，調(diào)整PH至7.5左 右，濃縮液通過(guò)Bio-Rad公司制造的Affi-Gel Blue-Gel層析柱。HSA或HSA/GF則與層析柱上的功能集團(tuán)結(jié)合而掛在柱體上。經(jīng)過(guò)洗滌，HSA或 HSA/GF則可經(jīng)由1-5MNaCl梯度洗脫,得到具有75-85%純的蛋白制劑。如 有需要?jiǎng)t進(jìn)一步通過(guò)分子篩層析柱，可得純度提高至95-99。/?；蚋兊牡鞍?制劑。用于動(dòng)物試驗(yàn)的樣品則將可能的熱源如內(nèi)毒素，借助Affi-Prep polymyxin S叩port層析柱(Bio-Rad )來(lái)去除，以符合體內(nèi)試-驗(yàn)需要。利 用常規(guī)方法來(lái)決定蛋白質(zhì)的濃度，如Bio-Rad生產(chǎn)的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑 盒。最后純化的蛋白質(zhì)通過(guò)0. 2uM濾膜以達(dá)無(wú)菌要求。 實(shí)施例8 人HSA/GF的細(xì)胞生物活性測(cè)定試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞抹是BalB/C3T3細(xì)胞抹。EGF標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)生物 制品檢定所，活性為6800IU。 RPMI-1640培養(yǎng)基(粉劑)Gibco-BRL完 全培養(yǎng)基含10%胎牛血清(標(biāo)準(zhǔn)HyCloneSH)的R-1640培養(yǎng)基，4'C冰 箱保存，維持培養(yǎng)基含O. 5%胎牛血清(標(biāo)準(zhǔn)HyCloneSH)的R-1640培 養(yǎng)基，4。C冰箱保存。MTT溶液(Sigraa):用磷酸鹽緩沖液配成5. Omg/ml 的溶液，0. 22um濾膜過(guò)濾除菌，4。C冰箱保存；傳代后24-48小時(shí)用于 效價(jià)測(cè)定96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底，Costar)， DMSO (Sigma)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期的BalB/C3T3細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成5. 0 x 1()4個(gè)細(xì)胞/ml的單細(xì)胞 懸液，加入96孔板中，每孔100ul，培養(yǎng)24小時(shí)。棄去完全培養(yǎng)基， 換成維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稀釋用維持培 養(yǎng)基分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行4倍倍比稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品從100倍開(kāi)始做8 個(gè)稀釋度；樣品做6個(gè)稀釋度，稀釋倍數(shù)根據(jù)以往測(cè)活情況做相應(yīng)調(diào)整。 棄去維持培養(yǎng)基，將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液加入96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中，每孔100ul，每個(gè)稀釋度做2個(gè)重復(fù)，空白對(duì)照只加維持培養(yǎng) 基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。加入MTT溶液，每孔20ul ,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。 棄去培養(yǎng)基，每孔加入100ulDMSO裂解液。于顯色后5分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀 上測(cè)定吸收值，測(cè)定波長(zhǎng)490腿。用直線回歸法計(jì)算，分別計(jì)算各樣品 的半效稀釋倍數(shù)(即能引起標(biāo)準(zhǔn)品50%最大效應(yīng)的樣品稀釋倍數(shù))，并 按下面公式計(jì)算結(jié)果樣品效價(jià)=標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)x樣品的半效稀釋倍數(shù)/ 標(biāo)準(zhǔn)品的半效稀釋倍數(shù)。將發(fā)酵液經(jīng)活性炭處理、脫鹽、除菌后可直接進(jìn)行HSA/GF融合蛋白的生 物活性測(cè)定。附圖4為含有不同量的HSA/PDGF-B的發(fā)酵液對(duì)BalBC3T3細(xì) 胞的生物活性測(cè)定的3次結(jié)果的平均值，表明HSA/PDGF-B具有刺激細(xì)胞生 長(zhǎng)的功能。附圖5顯示了各種樣品(發(fā)酵液或純化的融合蛋白)在不同處 理?xiàng)l件下(如加熱)前后，對(duì)細(xì)胞分化的刺激生物活性。試驗(yàn)顯示融合蛋 白與純品hEGF的生物活性在數(shù)值上有著相同摩爾濃度活性。在比活與其分 子量大小相一致的比例，這一結(jié)果表明HSA/hEGF融合蛋白與純品hEGF具 有相同的生物活性。相類似的測(cè)定方法用于HSA/hKGF-2、 HSA/bFGF、 HSA/aFGF、 HSA/PDGF - B測(cè)定。細(xì)胞系可用BalB/C3T3或BalB/MK。 實(shí)施例9 測(cè)定融合蛋白(HSA/GF)在體外生物活性的穩(wěn)定性 以HSA/FGF為例，對(duì)HSA/GF融合蛋白在37。C和50。C條件下，在不同 停留時(shí)間內(nèi)，對(duì)HSA/GF的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定。取10000單位由細(xì)菌表達(dá)的 人EGF (系列1 )和10000單位HSA/hEGF (系列2 )或10000單位HSA/hKGF - 2 (系列3)或兩個(gè)融合蛋白HSA/hEGF和HSA/hlGF-1的二者組合(系列4 )樣品各5000單位，置于含有200微升不含血清及其它組分的RPM1培養(yǎng) 液的200微升薄壁試管中，每溫度共有10次重復(fù)。其中一組置于37。C條 件下保溫，另一組置于50。C水溶中保溫。每7天從各組中取出一支，立即 放在-8(TC冰箱中保存。待全部樣品收集后，以這些樣品對(duì)BalBC3T3細(xì)胞 進(jìn)行生物活性測(cè)定。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。結(jié)果顯示GF單體與HSA形成 融合分子后，在不同保藏條件下生物活性不同。在37。C下7周后HSA/GF 仍保存其原有的大部生物活性(附圖5A)。而EGF單體在1周內(nèi)即完全喪 失生物活性。5(TC下4周時(shí)生物活性接近半衰期(附圖5B)。結(jié)果顯示細(xì) 胞生長(zhǎng)因子(GF)與血清白蛋白融合后，使之保存，儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)。對(duì)環(huán) 境有更強(qiáng)的抗性及生物穩(wěn)定性。HSA/hKGF、 HSA/hEGF或HSA/PDGF獲得類 似的試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例10 HSA/GF的組合使用具有協(xié)同增效作用當(dāng)HSA/hEGF和HSA/hlGF組合使用時(shí)，進(jìn)行如實(shí)施例8的細(xì)胞活性測(cè) 定，結(jié)果顯示組合使用HSA/hEGF的生物活性大于同量單體的HSA/hEGF(等 摩爾數(shù))的對(duì)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)活性?？梢?jiàn)組合使用時(shí)(附圖5 )在IGF - 1細(xì) 胞生長(zhǎng)因子的存在下，對(duì)EGF的細(xì)胞生長(zhǎng)刺激生物活性有增效作用(兩個(gè)5 000IU合并組合^吏用時(shí)，細(xì)胞生物活性大于10000IU)。對(duì)照中有HSA、 hEGF、 hIGF、 HSA/hEGF和HSA/hlGF等量細(xì)胞分別的細(xì)胞生長(zhǎng)刺激試驗(yàn)。實(shí)施例11 HSA/GF的動(dòng)物毒性試驗(yàn)家兔急性眼刺激試驗(yàn)按中國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》進(jìn)行。家兔2-3kg， 健康雌雄均有。0. lml供試樣品，其中含有80%純度的融合蛋白150微克， 直接滴入家兔左眼結(jié)膜嚢，輕輕閉合。右眼滴入無(wú)菌生理鹽水0. lml。分 別在l、 24、 48、 72、 96小時(shí)和1周時(shí)分別檢查左右眼，進(jìn)行急性毒性和 眼刺激強(qiáng)度等級(jí)評(píng)定，以4為最嚴(yán)重，以O(shè)為無(wú)刺激。則結(jié)果顯示試驗(yàn)動(dòng) 物的眼結(jié)膜、虹膜和角膜在供試樣品或生理鹽水作用下，對(duì)眼的刺激強(qiáng)度 比較值均在0 - 0. 5之間。結(jié)果證明HSA/hGF融合蛋白對(duì)動(dòng)物的無(wú)刺激性和 無(wú)毒性。用活性炭、脫鹽和除菌的含有HSA/GF的發(fā)酵液進(jìn)行的眼刺激的初 步實(shí)驗(yàn)，也未見(jiàn)明顯的刺激毒性。實(shí)施例12 HSA/GF在動(dòng)物血液中的殘留時(shí)間(半衰期測(cè)定) 選用2. 3-2. 6公斤兔子，分別在第一天，注射0. 5ml融合蛋白注射液。 兔A注射100萬(wàn)單位hEGF (大約IO微克蛋白量)；兔B注射100萬(wàn)單位重 組HSA/hEGF融合蛋白；兔C注射100萬(wàn)單位的HSA/haFGF;兔D注射100 微克人HSA。注射后，每天收集血樣一次，然后用BalBC3T3細(xì)胞按實(shí)施例8的方法 進(jìn)行測(cè)活。初步測(cè)定結(jié)果列于附圖6。 EGF單體在第l周時(shí)，生物活性就下 降到基點(diǎn)。而HSA和GF的融合蛋白則半衰期大大延長(zhǎng)
這些結(jié)果表明HSA/GF融合蛋白在體內(nèi)比棵露的GF有更長(zhǎng)的半衰期。據(jù) 此表明，本發(fā)明在保護(hù)"棵露"的GF上有明顯的作用。尤其是，aFGF在 已有的臨床II期試驗(yàn)中效果不明顯，可能的原因被認(rèn)為aFGF半衰期太短， 需要多次注射才可(Stegmann等，Cardiac Vascular Regeneration, 1: 5 - 10, 2000 ) 。 GF具有4交長(zhǎng)的半衰期，這在臨床上和制作化妝品時(shí)應(yīng)具 有極大的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例11 應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模表達(dá)制備HSA/GF融合蛋白 實(shí)驗(yàn)中表明應(yīng)用畢氏酵母表達(dá)和規(guī)模化生產(chǎn)重組融合蛋白比起其它 任何系統(tǒng)都要容易的多。重組抹分離到后，重組蛋白表達(dá)株可有Mut +和 Muts兩種形式。從小規(guī)模培養(yǎng)開(kāi)始，曱醇誘導(dǎo)，在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè) 試蛋白的表達(dá)。對(duì)于分泌型蛋白在細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中的含量均用SDS-PAGE 方法進(jìn)行分析，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，表達(dá)水平和純度在每一步中均進(jìn) 行監(jiān)測(cè)。結(jié)果展示不同發(fā)酵液中的各種HSA/GFs融合蛋白的表達(dá)水平分別 在50 - 300mg/L。
人血清白蛋白(HSA)與細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GF)形成融合蛋白的DNA核苷酸和蛋白質(zhì)序列表A. Seq ID No. 1 HSA/hKGF-2融合蛋白核苷酸序列:cggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacgtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgct二3c3gttgc33ctcttcgtg jagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgaat3a3gctgctttt3cagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgcc3a3gctcgatgaacttcgggatgggc3gtagctcgcctg3gcc3g3g3tttccc3a3gctg3gtttgcag33gtttcc33gttagtg3c3g3tcttacca aagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtga aa3tca3gattcg3tctccagta3actg33ggaatgctgtg33aa3cctctgttgg3a3a3tcccactgcattgccgaa gtgga3a3tgatgagatgcctgctgacttgccttcatt3gctgctgattttgttga3agt33ggatgtttgc3a3aact 3tgctg3ggca33gg3tgtcttcctgggcatgtttttgt3tga3t3tgcaag33ggc3tcctgatt3ctctgtcgtgct gctgctgagscttgcc33gacat3t 333gtgttcg3tg3attta33cctcttgtgg3ag31;agaggtctcaagsaacctaggasaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctstccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagasaacgccagtaagtgscagsgtcsccaaatgctasagctgttatggatgstttcgcagcttttgtag aga3gtgctgc33ggctgacg3t3agg3gacctgctttgccgagg3gggta3a33acttgttgctgca3gtcaagctgc cttsggctt3C3￡ tcc3gcgc;agt3ctttctc3ag3ttgagaag3acggga3ggtcagcgggaccaaga3ggaga3ctgcccgtac3gcatcctggagat aacatcagtagasatcggsgttgttgccgtcasagccattsacagcasctattacttagccatgsacsagaaggggsaa ctctatggctcaassgsatttascastgactgtaagctgaaggagaggatsgaggaaastggatacaatacctatgcatB.Seq ID No. 2 HSA/hKGF-2融合蛋白氨基酸序列(756AA，MW: 85. 8Kd)
TYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS.C. Seq ID No. 3 HSA-hEGF融合蛋白核苷酸序列g(shù)tatcttc3gc3gtgtccatttgasg3tceitgtai333tt3gtg33tg33gtei3Ctgwtttgc33333ceitgtgttgct3a3cctatggtg33atggctg3ctgctgtgcaaaac3ag33cctg3g3gaa3tg33tgcttcttgcaacac3a3g3tgaJcactgcttttc3tg3c33tg3ag3g3c3ttt::ctgttgcca33gctcg3tga3cttcgggat tgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcs二3gtg3c3g3tcttacc3aaatcaagattcgatctccagtasactgssggsatgctgtgassascctctgttggssawtcccactgcattgccgaa gtgg33aatgatg3gatgcctgctg3cttgccttc3ttagctgctg3ttttgttg3aagtaaggatgtttgc33aaactgctgctgag3cttgcc33gac3t3tg3a3ccactctagag33gtgctgtgccgctgc3g3tcctc3tg33tgct3tgcc33￡agaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa g3ct3tct3tccgtggtcctgaacc3gtt3tgtgtgttgc3tg3g33aacgccagt33gtg3c3g3gtc3cc333tgct gcscagaatccttggtgaacEiggcgacceitgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaagagtttaagttgagcttgtgaaacacsagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgatttcgcagcttttgtag agaagtgctgcaaggctgacgatsaggagacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgc Cttaggctt33ac3gcg3ctctg3atgtccgctgtcccacg3cggttactgcctgcacgacggtgtttgc3tgtac3tc gssgctctggacsagtstgcatgcaactgtgttgttggctscatcggtgsacgttgtcsgtaccgtgscctgaaatggt gggaactgcgttgaD. Scq ID No. 4 HSA-hEGF融合蛋白氨基酸序列 (638AA; MW: 72. 7KD)KWWELR.E. Seq ID No. 5, HSA/hlGF-1融合蛋白核苷酸序列atgaagtgggtaacctttstttcccttctttttctctttagctcggcttsttccaggggtgtgtttcgtcgagatgcac acaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaastttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcag3tg3gtc3gctg33a3ttgtg3c333tc3cttc3taccctttttgg3g3c333ttatgc3c3gttgc33ctcttcgtg aaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatga Ca3ccc3aacctcccccg3ttggtgag3cc3gaggttg3tgtgatgtgcactgcttttcatg3ca3tg3ag3g3catttataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcggga tgasgggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggsgaaagagctttcaaagca tgggcagt3gctcgcctg3gcc3g3gatttccc33agctg3gtttgc3g33gtttcca3gttagtgac3gatcttacca aagtccacacggsatgctgccatggsgstctgcttgaatgtgctgatgscagggcggaccttgccssgtstatctgtgagtggaa3atgatg3g3tgcctgctg3cttgccttc3tt3gctgctgattttgttg3a3gt33ggatgtttgcaaa33ct 3tgctg3ggca3aggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat3tgcaagaaggcatcctg3ttactctgtcgtgct gctgctg3gacttgcca3g3c3tatg333cc3ctct3g3ga3gtgctgtgccgctgcag3tcctc3tga3tgct3tgccttggag3gt3C33attcc3g3Stgcgct3"t 3g3ggtctc33ga3acct3gg3333gtgggcagcaa3tgttgtaa3c3tcctg33gc33333g33tgccctgtgc3g3a g3ctatctatccgtggtcctg33cc3gtt3tgtgtgttgc3tg3g3333cgcc3gt3agtg3c3g3gtc3cca3atgctja3gtcgatgaaac3tacgttccc3a3gagttta3i3gctgttstggstg3tttcgcagcttttgt3g ctt3ggctt3gg3ccagtcaagctgc 3caggggcttttatttcaacasgcccacagggtstggctccagcetgtcggagggcgcctcagaicaggcatcgtggatgagtgctgcttccF. Sed ID No， 6 HSA/hlGF-1融合蛋白氨基酸序列(655AA: MW: 74KD)CFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAG. Seq ID No. 7 HSA/hbFGF融合蛋白核苦酸序列:attccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacjcaaaaacatgtgttgctaaacctstggtgasattggctgactgctgtgcaLaaacsiagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgs Caaccca3acctcccccgattggtgag3cc3gaggttg3tgtgatgtgcactgcttttcatgac33tg33g3g3cattt3t333gctgctttt3c3g33tgttgcc33gctgctg3t333gctgcctgcctgttgcc333gctcg3tg33cttcggg3 tg3aggg3aggcttcgtctgcc3a3c3gag3ctcaagtgtgccagtctccaaaa3tttggag333g3gctttc3aagca tgggcagtagctcgcctgsgccsgagaLtttcccaaagctgsgtttgceLgaagtttccasgttSLgtgeicsLgstcttacca aagtccacacggastgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgagtggaaaatgatgagatgcctgctgscttgccttcattagctgctgattttgttgsaagtasggatgtttgcaaaasct 3tgctg3ggc333ggatgtcttcctgggcatgtttttgt3tg3atatgc33ga3ggcatcctg3ttactctgtcgtgctttgg3g3gt3c333ttccag33tgcgct3ttagttcgttacacc33g333gtacccc33gtgtca3ctcca3ctcttgt 3g3ggtctcaag333cctagg33a3gtgggcagc3a3tgttgt3aacatcctg3agca3aa3g33tgccctgtgcag33 g3ct3tct3tccgtggtcctgaacc3gtt3tgtgtgttgc3tg3g33a3cgcc3gt33gtg3c3g3gtc3ccaaatgct33gtcg3tg33ac3t3cgttccca33g3gttta3
二atggatgatttcgcagcttttgtag agaagtgctgc33ggctg3cg3ta3gg3gacctgctttgccgaggagggtaaa33acttgttgctgcaagtc33gctgc Ctt3ggctt3ctggggg3ccgcgggcgcggccgcgcgctgccgggcggg3ggctggggggccggggccggggccgtgcccgggccccgcaggg3CC3tggca_gccggg3gcatcscc￡Lcgctgcccgccttgcccg3ggatggcggcagcggcgcctt cccgcccggccacttcaaggaccccasgcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgscggc cgagttgacggggtccgggagaagagcgsccctcactgaH. Seq ID No. 8 HSA/hbFGF融合蛋白氨基酸序列(699AA: MW: 78Kd)I. Seq ID NO. 9 HSA/hPDGF-B融合蛋白核苷酸序列3tg3agtgggt33cctttatttcccttctttttctcttt3gctcggcttattcc3ggggtgtgtttcgtcg3gatgcac acaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctca gtatcttcagceigtgtccatttgeiagatcatgtaaaattagtgaatgaagtasictgaatttgcaaaaacatgtgttgct33acctatggtg3a3tggctg3ctgctgtgc3aaac3ag3acctgag3gaa3tg3atgcttcttgc3ac3caa3g3tgattgasaeiaatacttatatgaaattgccageisgacatccttacttttatgccccggssctccttttctttgctaaasggt 3ta33gctgctttt3caga3tgttgcc3agctgctg3t33agctgcctgcctgttgcca33gctcg3tg33cttcggg3 tgaaggga3ggcttcgtctgcca3acag3gactcaagtgtgccagtctcc33aaatttggaga3ag3gctttcaa3gca tgggcagtagctcgcctgsgccagagatttcccaaagctgagtttgcagasgtttccaagttagtgacagatcttacca aagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgagtggsasatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgsaagtsaggatgtttgcasssact 3tgctgaggca3sgg3tgtcttcctgggc3tgtttttgt3tgaat3tgc33g3aiggc3tcctg3tt3Ctctgtcgtgct gctgctgsgacttgccas; ttggagagt3C333ttcc3g33tgactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgsgaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctaagtcgatgasacatacgttcccaaagagtttaaJaa3gctgtt3tgg3tg3tttcgcagcttttgtag agaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcattcccgaggagctttatgagatgctg3gtgacctcgtggaagaaggagcctgggttccctgacc3ttgctg3gccggccatgatcgccgagtgc33gacgcgc3ccg3ggtggctccggctgctgc33c33ccgcaacgtgc3gtgccgcccc3cccaggtgcagctgcgacctgtcc3ggtgagaa3g3t Cg3g3ttgtgcgg33g33gcca3tctttaag33ggccacggtg3cgctggaag3cc3cctggcatgcaagtgtg3gaca gtggc3gctgcacggcctgtg3cccga3gcccggggggttccc3ggagc3gcg3gcc3333cgcccc333ctcgggtga ccattcggscggtgcgagtccgccggccccccaagggcaagcaccggasattcaagcacacgcatgacaagacggcact g33ggagacccttgg3gcct3gJ. Seq ID No. 10 HSA/hPDGF-B融合蛋白氨基酸序列(825AA; MW: 93.6)RVTIRTVRVRRPPKGKHRKFKHTHDKTALKETLGA.L Seq ID No. 11 HSA/haFGF融合蛋白核苷酸序列jcttsttccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacgt3tcttca; g3tgagtC3gctg3 336 aaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacei33acatgtgttgct caacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttat33agctgcttttacaga3tgttgcc33gctgctgataa3gctgcctgcctgttgcc333gctcgatg3acttcggga二ccaagttsgtgacagatcttacca J3tg3cagggcgg3ccttgcc3agt3t3tctgtgagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactgctgctg3gacttgcc33g3c3tatg33acc3ctct3g3g33gtgctgtgccgctgc3gatcctc3tg33tgctatgcc a3agtgttcg3tg33ttta33cctcttgtgg33q ttggagagtacaaattccagaatgcgctatg3ctatctatccgtggtcctg33cc3gtt3tgtgtgttgcatgag3333cgccagta3gtgac3g3gtc3ccaaatgct二cgcagcttttgtagCttaggcttagctga3gggg3a3tc3cc3ccttcac3gccctgaccgagaagtttaatctgcctcc3gggaattac3ag3c3gg3gcgacc3gc3c3ttc3gctgc3gctc3gtgcgga3agcgtgggggaggtgt3t3t333g3gtaccg3g3ctgg Cc3gtatcttggcc3tgg3caccg3cgggcttttatacggctcacagac3cc333tgagg33tgtttgttcctgg3aagg ctggaggagsaccsttacaacacctatatatccaagaagcatgcagagaagaattggtttgttggcctcaagaagaatgL. Seq ID No. 12 HSA/aFGF融合蛋白氨基酸序列(738AA; MW: 84Kd)KNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSS
權(quán)利要求
1. 一種人血清白蛋白(HSA)和細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GF)的融合蛋白，其特 征在于，其為由人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子相連構(gòu)成的融合蛋白。2. 如權(quán)利要求l所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白，其特征 在于，該融合蛋白的蛋白質(zhì)氨基酸序列與Seq ID No. 2、 4、 6、 8、 10或12有至少90%序列同源性。3. 如權(quán)利要求l所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白，其特 征在于，所述細(xì)胞生長(zhǎng)因子選自表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，內(nèi)皮細(xì) 胞生長(zhǎng)因子(VEGF),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板源性生長(zhǎng) 因子(PDGF )、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF )和類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF )。4. 如權(quán)利要求l所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白，其特征 在于，可以通過(guò)一個(gè)連接肽與人血清白蛋白相連以構(gòu)成融合蛋白。5. 如權(quán)利要求4所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白，其特征 在于，所述連接肽的長(zhǎng)度為2-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選的連接肽是(G4S) 3-4。6. 如權(quán)利要求l所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白，其特 征在于，所述融合蛋白是分泌型的。7. 如權(quán)利要求l所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白，其特 征在于，所述融合蛋白可與特異性識(shí)別的抗人血清白蛋白的抗體相 結(jié)合。8. —種編碼權(quán)利要求l所述的人血清白蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋 白的核苷酸序列，與Seq ID No. 1、 3、 5、 7、 9或11有至少90°/。序列 同源性。
9.攜帶有編碼如權(quán)利要求l所述融合蛋白的核苷酸序列的載體，轉(zhuǎn)化、 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主系統(tǒng)，其包括脊推動(dòng)物、魚(yú)、昆蟲(chóng)、植物的細(xì)胞、 酵母菌、病毒或細(xì)菌；所述的脊推動(dòng)物細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞；所述 的酵母菌是釀酒酵母、畢氏酵母、念珠菌屬酵母、克魯維亞酵母、 孢圓母屬酵母或裂殖酵母；所述畢氏酵母為畢氏巴斯德酵母，其 CGMCC保藏號(hào)為2072。
10.—種制劑，含有至少一種如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其中所述的 至少 一種HSA/GF，或兩種不同的融合蛋白是HSA/hEGF融合蛋白和 HSA/KGF融合蛋白的組合，HSA/IGF融合蛋白和HSA/PDGF融合蛋白的 組合，或是HSA、 HSA/IGF、 HSA/FGF、 HSA/EGF、 HSA/PDGF、 HSA/KGF 的組合，用于美容護(hù)膚、創(chuàng)傷、疾病的治療和應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供能刺激皮膚相關(guān)細(xì)胞修復(fù)具持續(xù)作用的重組融合蛋白，用以改善公眾健康、美容或用于創(chuàng)傷、疾病的治療。特別是，本發(fā)明提供了人血清白蛋白(HSA)和一種細(xì)胞因子多肽(EGF、FGF、KGF、HGH、HGF、PDGF或IGFL)利用基因工程方法重組形成的融合蛋白，該融合蛋白，1)可單獨(dú)或組合使用刺激細(xì)胞的修復(fù)，特別是可使人體表皮系統(tǒng)中的各種細(xì)胞的發(fā)育、更新；2)可在體內(nèi)、體外大大延長(zhǎng)這些細(xì)胞因子的壽命，以達(dá)到含細(xì)胞因子產(chǎn)品的最大穩(wěn)定性和持續(xù)作用效果；和3)融合形式的細(xì)胞因子可以組合使用，能夠最大限度地獲得使用細(xì)胞因子所帶來(lái)的刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)、修復(fù)持續(xù)作用及增效作用。4)利用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液，經(jīng)簡(jiǎn)單的加工可直接用于以美容為目的的產(chǎn)品制作。本發(fā)明還提供了利用酵母菌來(lái)生產(chǎn)這種重組融合蛋白的高效\低成本的制造工藝和方法。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK101121753SQ20071005757
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者于在林, 巖 富 申請(qǐng)人:天津溥瀛生物技術(shù)有限公司;美國(guó)福源集團(tuán)(FortuneRock,Inc.)