專利名稱：感染性克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備DNA或RNA的方法、應(yīng)用該方法獲得的核酸及其用作疫苗和用于基因治療的用途。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)的進步使生物之間的基因轉(zhuǎn)移獲得發(fā)展。目前，為了應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)生產(chǎn)具有經(jīng)濟和工業(yè)價值的化學(xué)品、藥物和生物制品，進行了巨大努力。
對原核細胞和真核細胞進行基因操作的一個重要步驟是研制載體和載體-宿主系統(tǒng)。一般來說，載體是能夠在宿主細胞中復(fù)制或表達的核酸分子。載體-宿主系統(tǒng)可定義為攜帶載體而且允許其包含的基因信息復(fù)制和表達的宿主細胞。
已經(jīng)應(yīng)用DNA病毒基因組和RNA病毒基因組研制載體。從DNA病毒獲得能夠在宿主細胞核復(fù)制的病毒載體的缺點是能夠整合入所述細胞的基因組，因此這樣的病毒載體一般不是非常安全。相反，從RNA病毒獲得的病毒載體在宿主細胞細胞質(zhì)中復(fù)制，它們比基于DNA病毒的載體更安全，因為復(fù)制是通過細胞核外的RNA進行的。因而這樣的載體整合入宿主細胞基因組的可能性非常小。
已經(jīng)從以下正極性單鏈RNA病毒[ssRNA(+)]獲得了cDNA克隆例如微小RNA病毒(Racaniello & Baltimore，1981)、雀麥花葉病毒(Ahlquist等，1984)、甲病毒屬(包括新培斯病毒、無名森林病毒(SemlikiForest Virus)(SFV)和委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEE)(Rice等，1987；Liljestrm和Garoff，1991；Frolov等，1996；Smerdou和Liljestrom，1999)、黃病毒和瘟病毒(pestivirus)(Rice和Strauss，1981；Lai等，1991；Rice等，1989)以及星狀病毒科病毒(Geigenmuller等，1997)。同樣，已經(jīng)用與ssRNA(+)病毒基因組互補的DNA克隆研制獲得表達異源基因的載體，所述ssRNA(+)病毒例如甲病毒屬，包括新培斯病毒、無名森林病毒(SFV)和委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)病毒(Frolov等，1996；Liljestrm，1994；Pushko等，1997)。然而，應(yīng)用RNA病毒制備重組病毒的所有方法仍然非常復(fù)雜，因為大多數(shù)RNA病毒含有細菌毒性序列。所以，制備病毒RNA的cDNA，然后使cDNA亞克隆入細菌，常常導(dǎo)致細菌宿主DNA序列缺失或重排。為此，大多數(shù)常用亞克隆及表達載體不能用來制備重組RNA病毒來源的DNA大片段。但是，研制藥物、尤其是疫苗在許多方面需要獲得可攜帶外源長DNA序列的載體。
冠形病毒是RNA病毒中具有最大已知基因組的ssRNA(+)病毒，其長度為約25-31千堿基對(kb)(Siddell，1995；Lai & Cavanagh，1997；Enjuanes等，1998)。在冠形病毒感染期間，其基因組RNA(gRNA)復(fù)制，而且合成一套正極性和負極性亞基因組RNA(sgRNA)(Sethna等，1989；Sawicki和Sawicki，1990；van der Most & Spaan，1995)。合成sgRNA是在感染細胞細胞質(zhì)中進行的RNA依賴性過程，然而其準確機制仍然不完全清楚。
關(guān)于構(gòu)建編碼某些冠形病毒(例如小鼠肝炎病毒(MHV)、傳染性氣管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BCV)(Chang等，1994)和豬胃腸炎病毒(TGEV)(西班牙專利申請P9600620；Méndez等，1996；Izeta等，1999；Sanchez等，1999))的干擾缺損(DI)病毒基因組(其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需要存在互補病毒的缺失突變體)的cDNA已有介紹。但是仍然不能構(gòu)建編碼冠形病毒完整基因組的cDNA克隆，其原因是冠形病毒基因組太大以及存在毒性序列。
總而言之，盡管已經(jīng)研制成功了大量在宿主細胞復(fù)制和表達異源核酸的病毒載體，但是大多數(shù)表達異源基因的已知載體不是非常適合亞克隆RNA病毒。此外，如此獲得的病毒載體因為缺乏種特異性和靶器官或靶組織限制以及其克隆能力有限而存在若干缺點，限制其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中應(yīng)用的可能性。
所以，需要開發(fā)能夠克服上述缺點、表達異源基因的新型載體的方法。具體來說，最好獲得表達異源基因的安全性和克隆能力高的大載體，可以進行設(shè)計使其種特異性和向性受到控制。
發(fā)明概述按照本發(fā)明應(yīng)用一種制備DNA的方法解決上述問題，該方法包括多個步驟，其中將一種如下DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)(a)包含RNA病毒的全長拷貝基因組RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含一個或若干個RNA病毒gRNA片段的DNA，所述片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白；或者(c)與(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。
意想不到的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用BAC作克隆載體可克服使用現(xiàn)有技術(shù)方法亞克隆和表達得自病毒gRNA的長DNA序列遇到的問題。使用BAC的特別好處是這些載體在細菌中以每個細胞一個或多個拷貝存在，大大限制了毒性而且減小質(zhì)粒間重組的可能性。
本發(fā)明進一步提供制備病毒RNA或病毒體的多步驟方法，其中按照一種上述方法制備DNA，表達所述DNA，分離病毒RNA或病毒體。進一步公開了包括上述制備DNA方法的步驟的制備藥物、尤其是疫苗的方法。
另一方面，本發(fā)明提供包含得自冠形病毒基因組RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列與冠形病毒天然序列的同源性至少為60％，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，其中所述DNA的一個片段能夠轉(zhuǎn)錄為RNA，該RNA能夠裝配為病毒體。本發(fā)明還包括制備相應(yīng)DNA的方法。
本發(fā)明還提供載體，更準確地說是包含相應(yīng)核酸的細菌人工染色體(BAC)。按照一個進一步的實施方案，本發(fā)明涉及宿主細胞和包含本發(fā)明DNA或RNA的感染性減毒或失活病毒。
本發(fā)明還提供藥用制劑，例如包含本發(fā)明核酸、載體、宿主細胞或病毒體的單價或多價疫苗。
最后，本發(fā)明提供生產(chǎn)病毒體或病毒RNA的方法以及應(yīng)用該方法獲得的病毒RNA，所述方法包括多個步驟，其中轉(zhuǎn)錄按照本發(fā)明的DNA，然后回收病毒體或病毒RNA。
附圖簡述
圖1圖示構(gòu)建編碼TGEV感染性RNA的cDNA克隆。圖1A圖示TGEV的遺傳結(jié)構(gòu)，以字母和數(shù)字(1a、1b、S、3a、3b、E、M、N和7)標示基因名稱。圖1B圖示cDNA克隆策略，該策略在于完成了DI-C基因組。標示出了為了重建全長cDNA而完成的缺失Δ1、Δ2和Δ3。DI-C基因組結(jié)構(gòu)下面的數(shù)字指示所述DI-C基因組各缺失兩側(cè)的核苷酸。圖1C圖示構(gòu)建完成缺失Δ1的4個cDNA片段和連接時使用的主要限制性位點位置。插入片段Δ1使cDNA毒性增加。
圖2圖示用于克隆TGEV感染性cDNA的質(zhì)粒pBeloBAC(Wang等，1997)的結(jié)構(gòu)。pBeloBAC質(zhì)粒由H.Shizuya和M.Simon(CaliforniaInstitute of Technology)提供，包含7,507個堿基對(bp)，它包含大腸桿菌F因子復(fù)制起點(oriS)、保持一個細胞一個拷貝質(zhì)粒需要的基因(parA、parB、parC和repE)以及氯霉素抗性基因(CMr)。指出了T7和SP6啟動子和獨特的限制性位點的位置。CosN有助于構(gòu)建pBAC質(zhì)粒的λcosN部位；lac Zβ-半乳糖苷酶基因。還指出了制備質(zhì)粒時使用的序列l(wèi)xoP。
圖3圖示構(gòu)建TGEV cDNA時使用的基礎(chǔ)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。pBAC-TcDNAΔClaI質(zhì)粒包含除了一個5,198bp的ClaI-ClaI片段之外的所有TGEV RNA信息。在巨細胞病毒(CMV)立即早期表達(IE)啟動子控制下克隆cDNA，3’末端側(cè)為24個A殘基的多聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)的核酶和牛生長激素(BGH)終止序列和聚腺苷酸化序列。pBAC-B+C+D5’質(zhì)粒包含完成pBAC-TcDNAΔClaI直至所述cDNA為全長所需要的ClaI-ClaI片段。pBAC-TcDNAFL質(zhì)粒含有TGEV全長cDNA。SAP蝦堿性磷酸酶。
圖4圖示TGEV PUR46-MAD(MAD)和C11克隆的S基因核苷酸序列的差異。數(shù)字指示取代核苷酸的位置，每個基因的第一個核苷酸為起始密碼子的A。條圖中的字母指示所示位置的相應(yīng)核苷酸。條圖下面的字母指示指示位置周圍的核苷酸編碼的取代氨基酸(aa)。Δ6nt指示6個核苷酸的缺失。箭頭指示S基因終止密碼子的位置。
圖5圖示從全長TGEV cDNA拯救感染性TGEV遵循的策略。使pBAC-TcDNAFL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細胞(豬睪丸細胞)，轉(zhuǎn)染后48小時用上清液感染新的ST細胞。按照所示時間傳代病毒。每次傳代時，分別收集等份上清液和單層細胞進行病毒滴定以及分離RNA進行RT-PCR分析。vgRNA全長病毒RNA。
圖6圖示TGEV cDNA在轉(zhuǎn)染ST細胞產(chǎn)生的致細胞病變作用(CPE)。非感染(對照)ST細胞沒有CPE(圖6A)，pBAC-TcDNAFL轉(zhuǎn)染ST細胞后14小時和20小時觀測到CPE(分別為圖6B和6C)。
圖7圖示病毒滴度隨傳代的變化。所示圖為pBAC-TcDNAFL轉(zhuǎn)染后不同傳代數(shù)的2個系列單層細胞(1和2)上清液的病毒滴度。模擬物1和2是指非轉(zhuǎn)染ST細胞。TcDNA1和2是指pBAC-TcDNAFL轉(zhuǎn)染ST細胞。
圖8圖示對pBAC-TcDNAFL轉(zhuǎn)染ST細胞后回收的病毒進行序列分析的結(jié)果。上圖顯示TGEV基因組的結(jié)構(gòu)。同樣，指出了從pBAC-TcDNAFL(TcDNA)質(zhì)?；厥盏牟《九cTGEV克隆C8和C11之間的核苷酸序列差異(遺傳標記)。條圖上的數(shù)字指示所述核苷酸之間不同的位置。通過對RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應(yīng))獲得的片段進行測序，確定TcDNA病毒和C11克隆的cDNA序列。C8克隆的序列正待公開(Penzes等，1999)，它列在該專利的后面。以通過RT-PCR獲得的片段的ClaI和DraIII顯示限制圖譜，所述片段包含TcDNA和C8病毒的核苷酸18,997和20,990。限制圖譜顯示這些病毒的cDNA中是否存在ClaI和DraIII位點。該分析結(jié)果表明，回收的TcDNA病毒存在預(yù)期的分離克隆C11的S基因序列。MWM分子量標記。
圖9顯示回收病毒的RT-PCR分析結(jié)果。在細胞聚合酶pol II識別的CMV啟動子控制下表達病毒RNA。通常該RNA在轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)的過程中進行剪接。為了研究情況是否如此，使用預(yù)測人DNA序列剪接位點的程序確定高剪接概率的RNA位點(2.1.5.94版，Department of Cell Biology，Baylor College of Medicine)(Solovyev等，1994)。最高剪接概率的潛在剪接位點是nt 7,243的剪接供體位點和nt7,570的剪接受體位點(圖9A)。為了研究該結(jié)構(gòu)域是否進行剪接，從第零代和第二代非轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的RNA(對照)或者具有反向ClaI片段的TcDNA(TcDNAFL(-ΔClaI)RS)轉(zhuǎn)染的ST細胞或者具有正向ClaI片段的TcDNA(TcDNAFL)轉(zhuǎn)染的ST細胞制備nt 7,078和nt 7,802之間的RT-PCR片段(圖9B)，以瓊脂糖凝膠分析RT-PCR獲得的產(chǎn)物。圖9C(第0代)和9D(第二代)顯示所獲得的結(jié)果。
圖10圖示對TcDNA轉(zhuǎn)染的ST細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的病毒的免疫熒光分析結(jié)果。用TGEV PUR46-MAD分離株特異性抗體和pBAC-TcDNAFL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后回收的病毒特異性抗體進行免疫熒光染色。為此，使用結(jié)合兩種分離株或者只結(jié)合PUR46-MAD的TGEV特異性單克隆抗體(Sanchez等，1990)。結(jié)果證實所述TcDNA病毒具有預(yù)期抗原性。TGEV特異性多克隆抗血清結(jié)合兩種病毒，但是不結(jié)合非感染培養(yǎng)物，只有預(yù)期的S(ID.B12和6A.C3)、M(3B.B3)和N(3B.D8)蛋白特異性單克隆抗體結(jié)合所述TcDNA病毒(Sanchez等，1999)。
圖11圖示在基因間(IG)序列的5’側(cè)翼區(qū)不同的不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS)之下表達GUS。在CMV啟動子控制下克隆小基因組M39。在該小基因組中插入多克隆序列(PL1，5’-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3’；SEQ ID NO2)和轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位的組成是選定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS)、另一個多克隆序列(PL2，5’-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3’；SEQ ID NO3；或者PL3，5’-GTCGAC-3’；SEQ ID NO4)、具有Kozak(Kz)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的序列、β-半乳糖苷酶(GUS)基因和再一個多克隆位點(PL4，5’-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3’，SEQ ID NO5)。這些序列的3’末端側(cè)1為小基因組M39的3’序列、HDV核酶和BGH的終止序列和聚腺苷酸化序列。TRS在IG序列(CUAAAC)1的5’末端具有不同數(shù)量(0、-3、-8和-88)核苷酸，如圖所示，它們來自N、S或M基因。用不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細胞，用互補病毒(PUR46-MAD)感染，傳代上清液6次。利用Izeta介紹的方案(Izeta等，1999)測定感染細胞的GUS活性。根據(jù)GUS表達與傳代數(shù)關(guān)系獲得的結(jié)果總結(jié)在圖12B中。
圖12圖示在IG序列的3’側(cè)翼區(qū)改變的不同TRS之下表達GUS(見圖11A)。應(yīng)用相當于TGEV N基因的-88核苷酸和IG序列(CUAAAC)的5’-側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄單位，修飾3’-側(cè)翼序列。如圖12A所示，這些序列相當于不同TGEV基因(S、3a、3b、E、M、N和7)的序列。在兩種情況下，3’-序列被包含限制性位點(SalI)和優(yōu)化Kozak序列(Kz)的其它序列代替或者被與第一個IG序列之后的序列相同的序列代替，第一個IG序列之前為病毒基因組的前導(dǎo)序列。應(yīng)用上述方案(Izeta等，1999)測定感染細胞的GUS活性。cL12指示與TGEV基因組“前導(dǎo)”序列3’末端序列相同的12個核苷酸序列(參見最后標示的病毒序列)。根據(jù)GUS表達與傳代數(shù)關(guān)系獲得的結(jié)果總結(jié)在圖12B中。
圖13圖示小基因組中表達模塊的插入位點對GUS表達水平的影響。在小基因組M39的4個限制性位點(圖13A)中插入包含IG序————————————————————————————————1需要指出的是，CTAAAC和CUAAAC對于本專利具有相同含義。第一種為DNA序列，第二種為相應(yīng)的RNA。
列(CUAAAC)5’末端側(cè)的N基因的-88nt和3’末端側(cè)的Kz序列(參見圖12A)的GUS轉(zhuǎn)錄單位，以確定是否所有這些位點都同樣允許表達異源基因。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細胞，并用互補病毒(PUR46-MAD)感染。按照上述方案(Izeta等，1999)測定沒有傳代(P0)時感染細胞的GUS活性。獲得的結(jié)果總結(jié)于圖13B。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明提供制備DNA的方法，該方法包括多個步驟，其中將一種下列DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)中(a)包含RNA病毒全長拷貝的基因組RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一個或若干個gRNA片段的DNA，所述片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白；或者(c)與(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。
按照所述應(yīng)用，“細菌人工染色體”是包含F(xiàn)因子序列的DNA序列。包含該序列的質(zhì)粒(所謂的F質(zhì)粒)能夠穩(wěn)定維持低拷貝數(shù)(每個細胞一個或兩個拷貝)的300Kb以上的異源序列。相應(yīng)的BAC是本領(lǐng)域已知的(Shizuya等，1992)。
按照本發(fā)明，克隆入BAC的DNA與RNA病毒天然序列的同源性為至少60％、優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％或95％。最好使用可從歐洲生物信息學(xué)研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)獲得的Clustal計算機程序確定序列同源性。
按照本發(fā)明所述方法，克隆入BAC的DNA還可包含所述病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白以外的若干種或全部蛋白的編碼序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，克隆入BAC的DNA還包含編碼一個或若干個異源基因的序列。按照本發(fā)明應(yīng)用，如果一種基因不是來源于用作編碼所述RNA依賴性RNA聚合酶和所述結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因來源的病毒，則所述基因稱為“異源基因”。因此，“異源基因”也指來源于一種病毒而且以包含來源于另一種病毒的序列的載體表達的基因。任何目的異源基因均可以插入本發(fā)明的核酸中。特別優(yōu)選插入的基因編碼被哺乳動物免疫系統(tǒng)識別為感染性因子抗原的一種或若干種肽或蛋白。另一方面，可以應(yīng)用編碼至少一種干擾感染因子復(fù)制的分子或者針對感染因子提供保護的抗體的異源基因，實施本發(fā)明的方法。異源序列可以包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白、細胞因子、免疫增強物和/或抗炎化合物的序列。
可以使用任何大小的DNA克隆入BAC來實施本發(fā)明方法。然而，如果使用大序列，相對于從病毒制備亞克隆DNA的已知方法，本發(fā)明方法具有特別突出的優(yōu)勢。所以，克隆入BAC的DNA長度至少為5Kb，其中特別優(yōu)選至少15、25或30Kb大小的DNA。
按照特別優(yōu)選的本發(fā)明實施方案，提供這樣的方法其中所述BAC包含控制克隆入BAC中的DNA轉(zhuǎn)錄的序列。這使得允許轉(zhuǎn)錄病毒RNA，由此能夠表達所述病毒。為此可使用本領(lǐng)域已知的控制轉(zhuǎn)錄的任何序列，包括驅(qū)動來自DNA基因組或RNA基因組的基因表達的序列。優(yōu)選應(yīng)用巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)啟動子。
克隆入BAC的DNA的3’-末端側(cè)也可以為聚腺苷酸尾。該核酸可以包括牛生長激素(BGH)的終止序列和/或聚腺苷酸化序列。此外/或者，所述核酸可以包含編碼核酶(例如丁型肝炎病毒(HDV)的核酶)的序列。
如果至少一種所述病毒基因通過取代、缺失或加入核苷酸進行了修飾，則還可以實現(xiàn)其它優(yōu)勢。例如修飾控制病毒向性的基因可以獲得向性不同的病毒?；蛘呖梢杂昧硪环N病毒的相應(yīng)基因取代控制所述病毒向性的基因。優(yōu)選在所述病毒的S、M和/或N基因中進行修飾。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，提供如下一種方法其中克隆入BAC的DNA能夠轉(zhuǎn)錄為RNA，該RNA可以裝配為病毒體。所裝配的病毒體可以為感染性、減毒性、復(fù)制缺陷型或失活病毒。
在本發(fā)明方法中可以使用任何RNA病毒。所述病毒可以是例如微小RNA病毒、黃病毒、披膜病毒、冠形病毒、toroviruses、arterivurses、calcivirus、彈狀病毒、副粘病毒、線狀病毒、博爾納病毒(bornavirus)、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒或呼腸孤病毒。優(yōu)選使用天然存在正鏈基因組的病毒。
此外，本發(fā)明提供制備病毒RNA或病毒體的方法，該方法包括多個步驟，其中按照一種上述方法制備DNA，在合適的宿主細胞中表達所述DNA，從所述宿主細胞分離病毒RNA或病毒體。可以使用本領(lǐng)域已知的從細胞培養(yǎng)物分離病毒的任何方法。本發(fā)明公開了制備病毒RNA或病毒體的替代方法，其中使用化學(xué)品、生物試劑和/或細胞提取物轉(zhuǎn)錄或翻譯本發(fā)明DNA，然后分離所述病毒RNA或病毒體。對于某些實施方案，所述病毒隨后被滅活或殺死。
本發(fā)明還提供制備藥用組合物的方法，該方法包括多個步驟，其中按照一種上述方法制備DNA、病毒RNA或病毒體，然后使其與藥學(xué)上可接受的佐劑和/或載體混合。大量佐劑和載體以及稀釋劑是先有技術(shù)中已知的，而且可以用于本發(fā)明。所述藥物優(yōu)選為保護人類或動物抵抗傳染性疾病的疫苗。所述藥物也可以有益地用于基因治療。
本發(fā)明進一步首次提供包含得自冠形病毒基因組RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列與冠形病毒天然序列具有至少60％同源性，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，其中一種所述DNA片段能夠轉(zhuǎn)錄為可裝配為病毒體的RNA。
按照本發(fā)明，術(shù)語“得自冠形病毒的序列”用以指與冠形病毒天然序列具有至少60％、優(yōu)選75％、更優(yōu)選85或95％同源性的核酸序列。可使用歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)提供的Clustal計算機程序測定序列同源性。
術(shù)語“冠形病毒”按照本發(fā)明用以指一組這樣的病毒具有25-33Kb的線性、正義、ssRNA單個分子。這些病毒通常含有7-10個結(jié)構(gòu)基因，即編碼決定病毒結(jié)構(gòu)的蛋白的基因。這些基因在病毒基因組中的排列順序通常為5’復(fù)制酶-(血凝素-酯酶)-刺突-包膜-膜-核蛋白-3’。此外，所述病毒基因組可以含有無數(shù)編碼具有共同3’末端的一個嵌套組mRNA而且大部分是非必需的非結(jié)構(gòu)基因。
術(shù)語“能夠轉(zhuǎn)錄為可裝配為病毒體的RNA”用以特征性描述這樣的DNA序列它一旦引入合適宿主細胞，就可以轉(zhuǎn)錄為RNA而且產(chǎn)生病毒體。所述病毒體最好為感染性病毒，但是也可以為包含所述RNA的失活病毒、減毒病毒或復(fù)制缺陷型病毒。最好是表達所述病毒體必需的所有信息都由本發(fā)明的DNA序列編碼。
本發(fā)明核酸可以進一步包含編碼一個或若干個目的異源基因的序列。按照本發(fā)明，如果一種基因不是來源于用作編碼所述RNA依賴性RNA聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的所述基因的源病毒的冠形病毒時，則所述基因稱為“異源基因”。因此，“異源基因”也指得自一種冠形病毒而且在包含得自另一種冠形病毒的序列的載體中表達的基因。在本發(fā)明核酸中可以插入任何目的異源基因。特別優(yōu)選插入的基因編碼被哺乳動物免疫系統(tǒng)識別為感染性因子抗原的肽或蛋白。因此，異源基因可以編碼至少一種適合誘導(dǎo)抗感染因子的免疫應(yīng)答的抗原、至少一種干擾感染因子復(fù)制的分子或者針對感染因子提供保護的抗體?；蛘?此外，異源基因可以編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白、細胞因子、免疫增強物和/或抗炎化合物。
轉(zhuǎn)錄為RNA的本發(fā)明DNA片段的大小最好為至少25Kb。特別優(yōu)選至少30Kb大小的片段。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述DNA進一步包含得自冠形病毒的序列，所述序列編碼除了一種冠形病毒結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白以外的若干或所有蛋白。另一方面，本發(fā)明的DNA進一步包含編碼冠形病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的序列。
按照再一個實施方案，本發(fā)明核酸包含控制來源于冠形病毒gRNA的序列轉(zhuǎn)錄的序列。為此可以使用本領(lǐng)域已知的控制轉(zhuǎn)錄的任何序列，包括驅(qū)動來自DNA或RNA基因組的基因表達的序列。優(yōu)選使用巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)啟動子。
按照本發(fā)明的核酸的3’末端側(cè)也可以為聚腺苷酸尾。所述核酸可以包含牛生長激素(BGH)的終止序列和/或聚腺苷酸化序列。此外/或者，所述核酸可以包含編碼核酶如丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列。
本發(fā)明核酸可以包含得自任何冠形病毒的序列，例如得自以下病毒分離株的序列豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、傳染性氣管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BoCV)、犬冠形病毒(CCoV)、貓冠形病毒(FcoV)或人冠形病毒。按照一個優(yōu)選實施方案，所述核酸得自傳染性胃腸炎病毒。
按照本發(fā)明的再一個實施方案，本發(fā)明DNA為質(zhì)粒的組成部分、優(yōu)選為細菌人工染色體(BAC)的組成部分。
本發(fā)明進一步提供包含相應(yīng)核酸或載體的宿主細胞。該宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。另一方面，本發(fā)明提供包含按照本發(fā)明的核酸的病毒體。相應(yīng)的病毒體例如可以從本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)染或感染的細胞培養(yǎng)物中分離獲得。
按照又一實施方案，本發(fā)明提供制備病毒體或病毒RNA的方法，該方法包括多個步驟，其中將本發(fā)明DNA導(dǎo)入宿主細胞中，在允許所述DNA表達的情況下培養(yǎng)含有所述DNA的宿主細胞，回收病毒體或病毒RNA。此外，提供這樣的制備病毒體或病毒RNA的方法其中使本發(fā)明DNA與化學(xué)品、生物試劑和/或細胞提取物在允許表達所述DNA的條件下體外混合，回收病毒體或病毒RNA。本發(fā)明還包括通過以上兩種方法中任何一種方法獲得的病毒體和病毒RNA。優(yōu)選攜帶異源基因的RNA和病毒體。如此獲得的病毒可以為傳染性、減毒、復(fù)制缺陷型或失活病毒形式。
所述病毒可以含有修飾基因，例如修飾的S、N或M基因。在本發(fā)明的一個特別實施方案中，對S、N或M基因的修飾產(chǎn)生減毒病毒或向性不同的病毒。
按照再一個實施方案，本發(fā)明提供包含按照本發(fā)明的核酸、宿主細胞或病毒體的藥用制劑。按照一個優(yōu)選實施方案，所述藥用制劑為能夠保護動物抗感染性因子引起的疾病的疫苗。疫苗可以包含例如至少一種適合誘導(dǎo)抗感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原的序列或者包含對所述感染性因子提供保護的抗體的序列。疫苗可以包含表達至少一種干擾所述感染性因子復(fù)制的分子的DNA?；蛘撸鲆呙缈梢园磉_至少一種抗原的載體，所述抗原能夠誘導(dǎo)抵抗在呼吸道或腸道粘膜或其它組織中繁殖的不同感染性因子的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和/或粘膜免疫應(yīng)答。所述疫苗也可以為能夠保護動物抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，該多價疫苗包含一種以上的本發(fā)明核酸，其中每種核酸表達能夠誘導(dǎo)抗各所述感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原，或表達針對各所述感染性因子提供保護的抗體，或者表達干擾任何一種感染性因子復(fù)制的其它分子。
本發(fā)明疫苗還可以包含技術(shù)水平已知的藥學(xué)上可接受的任何載體或稀釋劑。
本發(fā)明還提供如下的制備本發(fā)明DNA的方法，該方法包括多個步驟，其中將在啟動子表達之下的冠形病毒來源的干擾缺陷型基因組克隆入BAC載體，重新插入所述缺陷型基因組中的缺失。該方法還包括多個步驟，其中在重新插入其它基因組DNA之前鑒定所述病毒基因組中的毒性序列。所述病毒基因組中的毒性序列最好是在完善所述基因組之前最后重新插入的序列。按照本發(fā)明，這種方法適合產(chǎn)生冠形病毒感染性克隆，該冠形病毒感染性克隆在細菌中穩(wěn)定至少80代，因而提供非常有效的克隆載體。
本發(fā)明提供對得自冠形病毒的cDNA感染性克隆的研制(Almazan等，2000)以及從還包含插入所述克隆的異源核酸序列的所述感染性克隆構(gòu)建的載體。本發(fā)明提供的感染性克隆和載體在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中均具有無數(shù)用途，而且克隆能力高，可以對其進行設(shè)計使得其種特異性和向性容易控制。
本專利介紹這樣的研制方法這種方法使得在冠形病毒歷史上首次可獲得編碼冠形病毒基因組的全長感染性cDNA克隆(Almazan等，2000)。
研制了以用編碼冠形病毒基因組RNA(gRNA)的感染性cDNA克隆制備的冠形病毒為基礎(chǔ)的表達異源核酸的新型載體或系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述冠形病毒是豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)。
所述新型表達系統(tǒng)可用于基礎(chǔ)研究或應(yīng)用研究，以便例如獲得作為疫苗載體的目的產(chǎn)物(蛋白、酶、抗體等)，或者可用于人類和動物的基因治療?？梢杂贸Ｒ?guī)遺傳工程技術(shù)操作得自感染性cDNA克隆的感染性冠形病毒，這樣可以將新的基因?qū)胨龉谛尾《净蚪M，因而這些基因可以組織特異性和種特異性方式表達，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或用于基因治療。此外。通過選擇可以增加百倍以上表達水平的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS)而優(yōu)化所述表達。
得自冠形病毒、尤其是TGEV的載體相對于不在粘膜中復(fù)制的其它表達系統(tǒng)存在以下多個誘導(dǎo)粘膜免疫的優(yōu)點(i)TGEV感染腸道粘膜和呼吸道粘膜(Enjuanes和Van der Zeijst，1995)，也就是說，感染誘導(dǎo)分泌型免疫的最佳部位；(ii)其向性可以通過修飾S(刺突)基因進行控制(Ballesteros等，1997)；(iii)存在開發(fā)依賴于互補病毒的表達系統(tǒng)的非致病株(Sanchaz等，1992)；(iv)冠形病毒是胞質(zhì)RNA病毒，它可以復(fù)制但是不通過中間DNA期傳代(Lai和Cavanagh，1997)，使其幾乎不可能整合入細胞染色體。
能夠從編碼冠形病毒gRNA的cDNA回收感染性冠形病毒的方法包括以下策略(i)在合適啟動子控制下表達所述冠形病毒的RNA；
(ii)以細菌人工染色體(BAC)克隆所述冠形病毒基因組；(iii)鑒定對細菌具有直接或間接毒性的冠形病毒cDNA序列；(iii)鑒定編碼冠形病毒感染性RNA的cDNA組分(啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、聚腺苷酸化序列、核酶等)連接的準確順序；(iv)鑒定一組綜合允許有效拯救cDNA的感染性冠形病毒的技術(shù)和方法(BAC的生長條件、對BAC DNA純化方法的改進、轉(zhuǎn)化技術(shù)等)。
啟動子對于增強病毒RNA在細胞核內(nèi)表達起重要作用，病毒RNA在細胞核內(nèi)合成，然后轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。
BAC的應(yīng)用構(gòu)成本發(fā)明方法的一個關(guān)鍵點。眾所周知，克隆細菌質(zhì)粒中的真核細胞序列常常因為所述外源性序列對細菌的毒性而失敗。在這樣的情況下，所述細菌通常通過修飾所導(dǎo)入的序列而消除毒性。然而，隨之而產(chǎn)生的策略是，為了避免這些病毒序列的可能毒性，進行必要的克隆以便獲得在BAC中的完整冠形病毒cDNA。這些質(zhì)粒在每個細胞中僅有一個拷貝，最多一個細胞兩個拷貝，這樣明顯限制其毒性以及降低質(zhì)粒間重組的可能性。
通過鑒定冠形病毒的細菌毒性cDNA序列，可以完成編碼冠形病毒完整基因組cDNA的構(gòu)建，而不包括所述毒性序列，毒性序列在構(gòu)建完整基因組的最后一步中加入，即恰好在轉(zhuǎn)染真核細胞之前，這樣可以避免細菌對其進行修飾。
所以，本發(fā)明的一個目的在于編碼冠形病毒gRNA的感染性雙鏈cDNA克隆以及獲得它的方法。
本發(fā)明的再一個目的在于一組重組病毒載體，該組病毒載體包含所述感染性克隆和插入其中的異源核酸序列。
本發(fā)明又一個目的在于制備重組冠形病毒的方法，該方法包括將所述感染性克隆導(dǎo)入宿主細胞中，在允許所述感染性克隆復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，產(chǎn)生重組冠形病毒，從所述培養(yǎng)物回收重組冠形病毒。
本發(fā)明另一個目的在于制備修飾重組冠形病毒的方法，該方法包括將所述重組病毒載體導(dǎo)入宿主細胞中，在允許病毒載體復(fù)制和修飾重組冠形病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，從所述培養(yǎng)物回收修飾的重組冠形病毒。
本發(fā)明另一個目的在于制備目的產(chǎn)物的方法，該方法包括在允許表達異源DNA序列的條件下培養(yǎng)包含所述重組病毒載體的宿主細胞。
包含上述感染性克隆或重組病毒載體的細胞構(gòu)成本發(fā)明再一個目的。
本發(fā)明又一個目的在于一組疫苗，所述疫苗保護動物抗感染性因子引起的感染。所述疫苗包含感染性載體和藥學(xué)上可接受的賦形劑，所述感染性載體表達至少一種適于誘導(dǎo)抗各感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原或者至少一種對所述感染性因子提供保護的抗體。根據(jù)所述載體是表達一種還是多種能夠針對一種或多種感染性因子誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原或者是表達一種還是多種針對一種或多種感染性因子提供保護的抗體，所述疫苗可以為單價疫苗或多價疫苗。
本發(fā)明提供的另一個目的包括免疫動物的方法，該方法在于給予所述疫苗。
本發(fā)明提供編碼冠形病毒感染性RNA的cDNA克隆，然后，本發(fā)明的感染性克隆包括(1)一個拷貝的冠形病毒感染性基因組RNA(gRNA)的互補DNA(cDNA)或者病毒RNA本身；(2)另一個基因的表達模塊，該表達模塊包含優(yōu)化轉(zhuǎn)錄增強序列。
在本發(fā)明的一個特別實施方案中，所述冠形病毒為TGEV分離株、尤其是PUR46-MAD分離株(Sanchaz等，1990)，PUR46-MAD中存在的修飾是該病毒的S基因被C11克隆TGEV分離株的S基因代替或者被犬或人冠形病毒的S基因代替。
轉(zhuǎn)錄增強序列或啟動子為位于冠形病毒各信使RNA(mRNA)5’末端的RNA序列，病毒聚合酶RNA與其結(jié)合以開始轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，應(yīng)用CMV的IE啟動子由cDNA表達所述病毒基因組，因為使用該啟動子獲得高水平表達(Dubensky等，1996)，而且我們實驗室以前獲得的結(jié)果表明，得自TGEV冠形病毒的大的缺陷型基因組(9.7kb和15kb)表達的RNA在從其合成的細胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)的過程中不會發(fā)生剪接。
本發(fā)明的感染性克隆還包含轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸信號，例如來自BGH基因的序列。這些終止序列必須位于聚腺苷酸尾的3’末端。在一個特別實施方案中，本發(fā)明的感染性克隆包含24個A殘基的聚腺苷酸尾以及BGH終止序列和聚腺苷酸化序列，它們之間間隔有HDV核酶序列。
所述病毒感染性cDNA已經(jīng)插入其中的質(zhì)粒為具有復(fù)制起點的DNA分子，因此，所述質(zhì)粒有可能在合適細胞中復(fù)制。所使用的質(zhì)粒是適合在合適宿主細胞例如細菌(例如大腸桿菌)中維持和擴增本發(fā)明感染性克隆的復(fù)制子。所述復(fù)制子一般帶有抗生素抗性基因(例如cat)，使得可以對攜帶它的細胞進行選擇。
在實施例1中介紹了在CMV的IE啟動子控制下構(gòu)建TGEV感染性克隆。所述cDNA的3-末端側(cè)為24nt聚腺苷酸化序列、HDV核酶和BGH轉(zhuǎn)錄終止序列。
獲得本發(fā)明感染性克隆的程序是由冠形病毒gRNA構(gòu)建全長cDNA，然后連接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。
為了提高cDNA的穩(wěn)定性，由以BAC在合適啟動子控制下克隆為cDNA的冠形病毒產(chǎn)生的DI基因組獲得編碼冠形病毒感染性gRNA的cDNA。然后鑒定細菌毒性序列，為了消除其毒性，去除所述毒性序列，在構(gòu)建完成完整基因組之時、恰好在轉(zhuǎn)染真核細胞之前插入所述毒性序列。通過包含所述冠形病毒基因組的BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染支持病毒復(fù)制的真核細胞，可以重新構(gòu)建病毒子代。
利用常規(guī)技術(shù)(Maniatis等，1989)連接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。
可以應(yīng)用常規(guī)遺傳工程技術(shù)操作本發(fā)明的感染性克隆，以便插入至少一種編碼確定活性的異源核酸序列，該序列處于所述感染性克隆中存在的啟動子以及獲得的表達載體包含的調(diào)節(jié)序列的控制之下。
本發(fā)明的感染性克隆具有許多用途，例如它既可以在基礎(chǔ)研究中使用，例如用于研究冠形病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機制，也可以在應(yīng)用研究中使用，例如用于開發(fā)表達目的產(chǎn)物(蛋白、酶、抗體等)的有效系統(tǒng)。
可以用本發(fā)明感染性cDNA克隆轉(zhuǎn)化合適細胞，并可以回收獲得的包含所述冠形病毒完整基因組的病毒體。因此，本發(fā)明還提供制備重組冠形病毒的方法，該方法包括將本發(fā)明的感染性cDNA導(dǎo)入宿主細胞中；在允許表達和復(fù)制所述感染性克隆的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；回收由所述重組冠形病毒獲得的病毒體，該病毒體包含所述冠形病毒的感染性基因組。可以用各種方法將本發(fā)明的感染性克隆導(dǎo)入宿主細胞中，例如用由本發(fā)明感染性克隆體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染所述宿主細胞，或者用本發(fā)明感染性cDNA克隆感染所述宿主細胞。包含本發(fā)明感染性克隆的所述宿主細胞構(gòu)成本發(fā)明的又一個目的。
本發(fā)明還提供一組得自本發(fā)明感染性克隆的重組病毒載體，此后稱為本發(fā)明病毒載體。本發(fā)明病毒載體包括修飾后包含異源核酸的本發(fā)明感染性cDNA克隆，所述異源核酸在允許其表達的條件下插入所述感染性克隆中。
在本說明書中使用的術(shù)語“核酸”包括基因或基因片段，而且一般包括任何DNA或RNA分子。
在本發(fā)明使用的意義上，用于核酸的術(shù)語“異源”是指用以將所述異源核酸導(dǎo)入宿主細胞的載體中通常不存在的核酸序列。
可以包含在本發(fā)明病毒載體中的異源核酸可以是編碼蛋白、肽、表位或任何目的基因產(chǎn)物(例如抗體、酶等)的基因或片段。所述異源核酸可以利用常規(guī)基因工程技術(shù)插入到本發(fā)明感染性克隆cDNA的任何合適區(qū)段中，例如在ORF1b之后或者基因N和7之間、起始密碼子(AUG)之后以及所述基因的讀框內(nèi)；或者，在相當于其它ORF的區(qū)段中進行插入。構(gòu)建本發(fā)明病毒載體時，插入異源核酸必須不能干擾任何基本病毒功能。
本發(fā)明病毒載體可以表達一種或多種活性。在表達多種活性的情況下，所述病毒載體包括與所要表達的活性同樣多的異源核酸序列，異源核酸序列之前存在一個或多個啟動子、或者一個啟動子和不同核糖體識別位點(IRES，內(nèi)部核糖體進入位點)或者不同啟動子和一個核糖體識別位點。
因此，本發(fā)明提供生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法，該方法包括在允許所述異源核酸表達和允許目的產(chǎn)物回收的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明病毒載體的宿主細胞。包含本發(fā)明病毒載體的所述宿主細胞構(gòu)成又一個本發(fā)明目的。
可以設(shè)計本發(fā)明病毒載體使得其種特異性和向性能夠容易地受到控制。因為所述特性，本發(fā)明病毒載體的一個非常有趣的應(yīng)用是作為目的基因載體或疫苗載體用于基因治療，以便誘導(dǎo)針對不同病原體的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供能夠保護動物抗感染性因子引起的感染的疫苗，該疫苗包含(i)至少一種本發(fā)明病毒載體，該載體表達至少一種適合誘導(dǎo)針對所述感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原，或者表達抗所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
在本發(fā)明使用的意義上，“誘導(dǎo)保護”應(yīng)該理解為本發(fā)明病毒載體通過適當機制在接受生物(所免疫的動物)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述適當機制例如增強細胞應(yīng)答的物質(zhì)(白介素、干擾素等)、細胞壞死因子和保護動物抗感染性因子引起的感染的相似物質(zhì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的機制。
術(shù)語“動物”包括任何物種、優(yōu)選哺乳動物(包括人類)的所有動物。
在本發(fā)明使用的意義上，術(shù)語“感染性因子”包括可以感染動物并且使動物致病的任何病毒、細菌、真菌、寄生蟲或其他感染性因子。
在一個特別實施方案中，本發(fā)明提供的疫苗包含至少一種這樣的本發(fā)明病毒載體該載體表達至少一種能夠誘導(dǎo)針對在呼吸道粘膜或腸道粘膜內(nèi)繁殖的不同感染性因子的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和/或粘膜免疫應(yīng)答的抗原。本發(fā)明載體特別適合誘導(dǎo)粘膜免疫以及乳性免疫，乳性免疫對保護新生動物抗腸道感染具有特別的意義。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供的疫苗包含至少一種這樣的本發(fā)明病毒載體它表達至少一種編碼任何同種型抗體(例如IgG1、IgA等)的輕鏈和重鏈的基因，所述抗體保護性抗感染性因子。
可以控制種特異性，使得所述病毒載體可表達感染各種目標動物(人、狗、貓、豬等)的冠形病毒包膜的S蛋白，該S蛋白適合被相應(yīng)動物種細胞受體識別。
本發(fā)明提供的疫苗可以是單價或多價疫苗，是單價還是多價疫苗取決于本發(fā)明病毒載體是表達一種還是多種能夠誘導(dǎo)針對一種或多種感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原或者是表達一種還是多種抗一種或多種感染性因子的保護抗體。
在本發(fā)明的一個特別實施方案中，本發(fā)明提供的單價疫苗能夠保護人、豬、狗和貓抵抗不同的人、豬、犬和貓感染性因子，而且通過表達具有需要種特異性的冠形病毒S糖蛋白控制向性。
針對豬感染性因子的單價疫苗可以包含表達一種抗原的載體，所述抗原選自基本上由以下豬病原體抗原組成的抗原組大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis)、豬細小病毒、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、大腸桿菌、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelotrixrhusiopathiae)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、梭菌屬菌(Clostridium sp.)、豬痢疾小蛇菌(Serpulina hydiosenteriae)、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬呼吸道冠形病毒、輪狀病毒，或者引起以下疾病的病原體豬呼吸及生殖綜合征、Aujeszky氏病(假性狂犬病)、豬流感、或傳染性胃腸炎；以及萎縮性鼻炎和增生性回腸炎的致病因子。針對犬感染性因子的單價疫苗可以包含表達一種抗原子的表達載體，所述抗原選自基本上由以下犬病原體抗原組成的抗原組犬皰疹病毒、1型和2型犬腺病毒、1型和2型犬細小病毒、犬呼吸道腸道病毒、犬輪狀病毒、犬冠形病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬瘟病毒、狂犬病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和犬杯狀病毒。
針對貓感染性因子的單價疫苗可以包含表達一種抗原的表達載體，所述抗原選自基本上由以下貓病原體抗原組成的抗原組貓杯狀病毒、貓免疫缺陷病毒、貓皰疹病毒、貓全白細胞減少癥病毒、貓呼吸道腸道病毒、貓輪狀病毒、貓冠形病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、狂犬病毒、貓鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)和貓白血病病毒。
所述載體可表達抗感染性因子的保護抗體，所述感染性因子例如豬、犬或貓感染性因子，例如以上列舉的感染性因子。在一個具體實施方案中，所述載體表達中和TGEV的重組單克隆抗體(稱為6A.C3)，該重組單克隆抗體表達為同種型IgG1或IgA，其中所述免疫球蛋白恒定部分為豬來源；或者所述載體表達中和人輪狀病毒和豬輪狀病毒的抗體。
關(guān)于所述賦形劑，可以使用諸如生理鹽水或其它相似鹽溶液的稀釋劑。同樣，所述疫苗也可以含有通常用于水型疫苗制劑和油型疫苗制劑的佐劑，水型疫苗制劑使用的佐劑有例如氫氧化鋁、QuilA、鋁凝膠懸浮液等，所述油型疫苗以礦物油、甘油酯、脂肪酸衍生物及其混合物為基質(zhì)。
本發(fā)明疫苗也可以含有增強細胞應(yīng)答(CRP)的物質(zhì)，即增強輔助T細胞亞群(TH1和TH2)的物質(zhì)，例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、γ-IFN(γ干擾素)、細胞壞死因子和理論上可以刺激接種動物的細胞免疫的相似物質(zhì)。這些CRP物質(zhì)可用于水型佐劑或油型佐劑的疫苗制劑。也可以使用另一種類型調(diào)節(jié)和免疫刺激細胞應(yīng)答的佐劑，例如MDP(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)或脂質(zhì)體。
本發(fā)明提供能夠預(yù)防和保護動物抗不同感染性因子引起的感染的多價疫苗。所述多價疫苗可以由編碼相應(yīng)抗原的不同序列插入同一重組載體中的本發(fā)明病毒載體制得，或者通過構(gòu)建獨立的重組載體，然后將其混合在一起以聯(lián)合接種，從而制得所述多價疫苗。因此，所述多價疫苗包含含一種以上異源核酸序列的病毒載體，所述異源核酸編碼一種以上抗原；或者所述多價疫苗包含不同病毒載體，其中每種病毒載體表達至少一種不同抗原。
同樣，可以使用編碼抗感染性因子的保護抗體的序列代替編碼所述抗原的序列，制備包含多價載體的多價疫苗。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供能夠分別免疫人、豬、犬和貓抵抗不同的人、豬、犬和貓感染性因子的疫苗。為此，所述疫苗中包含的病毒載體必須表達以上列舉的人、豬、犬或貓病原體的不同抗原或者其他抗原。
本發(fā)明疫苗可以以液體形式或凍干形式提供，而且可通過使所述重組系統(tǒng)懸浮在所述賦形劑中而制得。如果所述系統(tǒng)為凍干形式，則所述賦形劑本身可以為復(fù)制物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供的疫苗可以與其他常規(guī)疫苗聯(lián)合使用，本發(fā)明疫苗或者構(gòu)成其中的一部分或者為用其他常規(guī)疫苗或重組疫苗稀釋的稀釋部分或凍干部分。
本發(fā)明提供的疫苗可以通過口服、經(jīng)鼻、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或以氣霧劑給予動物。
本發(fā)明還提供免疫動物、尤其是豬、犬和貓抵抗一種感染性因子或者同時抵抗不同感染性因子的方法，該方法包括口服、經(jīng)鼻、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或氣霧劑(或其組合方式)給予包含免疫有效量的本發(fā)明提供的重組系統(tǒng)的疫苗。
另外，本發(fā)明還提供保護新生動物抵抗感染所述動物的感染性因子的方法，該方法在于在妊娠期間或之前將本發(fā)明提供的疫苗口服、經(jīng)鼻、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或者氣霧劑給予(或者其組合給予)雌性動物，或者給予其子代。
下面借助實施例闡明本發(fā)明，實施例詳細介紹了如何獲得感染性克隆以及如何構(gòu)建本發(fā)明病毒載體。不應(yīng)該認為這些實施例限制本發(fā)明范圍，而只是為了舉例說明本發(fā)明。在所述實施例中，按照下面介紹的方法學(xué)進行細菌轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)、DNA純化、序列分析和評價質(zhì)粒穩(wěn)定性的測定。
細菌轉(zhuǎn)化全部質(zhì)粒均通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌DH10B菌株(Gibco BRL)，只是對以前介紹的方法(Shizuya等，1992)進行了略微改進。對于每次轉(zhuǎn)化，在0.2-cm培養(yǎng)皿(BioRad)中混合2μL連接混合物和50μL感受態(tài)細菌，以200Ω、2.5kV和25μF進行電穿孔。然后，在每各轉(zhuǎn)化物中加入1mL SOC培養(yǎng)基(Maniatis等，1989)，于37℃溫育細胞45分鐘，最后，在含12.5μg/mL氯霉素的LB SOC培養(yǎng)基(Maniatis等，1989)平板上檢測重組菌落。
細菌的生長條件原初質(zhì)粒中克隆有TGEV不完整基因組(圖3)，于37℃培養(yǎng)含有原初質(zhì)粒的細菌，該細菌顯示正常生長動力學(xué)。另一方面，于30℃培養(yǎng)含有完整cDNA的BAC，目的是盡可能使穩(wěn)定性最大化。盡管如此，菌落仍然變小，為了獲得正常大小的菌落，必須使培養(yǎng)時間延長至24小時。
純化DNA按照Woo介紹的方法(Woo等，1994)進行，只進行略微的改進。將單一菌落接種到4L含有氯霉素(12.5μg/ml)的LB中。于30℃培養(yǎng)18小時后，以6,000G離心收集細菌，采用Qiagen PlasmidMaxipreparations試劑盒按照生產(chǎn)商的建議純化質(zhì)粒。利用這種方法觀測到，獲得的質(zhì)粒DNA污染了細菌DNA。為了消除污染的細菌DNA，利用在氯化銫梯度上以55,000rpm離心16小時純化質(zhì)粒DNA。根據(jù)質(zhì)粒的大小，獲得產(chǎn)率為15-30μg/L。
序列分析應(yīng)用熒光染料標記的雙脫氧核苷酸和溫度抗性聚合酶(PerkinElmer)在自動測序儀(373 DNA測序儀，Applied Biosystems)上對DNA進行測序。所述試劑通過Applied Biosystems公司的試劑盒(ABIPRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)獲得。用以進行測序反應(yīng)的熱循環(huán)儀為“GeneAmpPCR System 9600”(PerkinElmer)。
分別采用SeqMan II和Align(DNASTAR)程序連接序列以及進行其與TGEV共有序列的比較。檢測發(fā)現(xiàn)與共有序列沒有差異。
質(zhì)粒穩(wěn)定性在20mL含氯霉素(12.5μg/mL)的LB培養(yǎng)基中于30℃和37℃培養(yǎng)得自original glycerolates的含有重組pBeloBAC11質(zhì)粒的細菌。該培養(yǎng)細菌被認為是第0代細菌。將細菌稀釋106倍，然后于30℃和37℃培養(yǎng)16小時。連續(xù)8天進行連續(xù)傳代(每次培養(yǎng)傳代相當于約20個世代細菌)。在第0代和第8代(160個世代)應(yīng)用Miniprep純化質(zhì)粒DNA，并應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶進行分析。含有部分TGEV基因組的2種質(zhì)粒非常穩(wěn)定，而含有TGEV完整基因組的質(zhì)粒在40個世代后呈現(xiàn)一定的不穩(wěn)定性(此時約80％DNA呈現(xiàn)正確的限制圖譜)。
實施例1構(gòu)建基于得自TGEV的感染性cDNA克隆的重組載體1.1制備TGEV感染性cDNA為了獲得編碼完整TGEV基因組的cDNA，我們以編碼缺陷型DI-C基因組的cDNA為最初的基礎(chǔ)材料(Méndez等，1996)。該cDNA長度大約為TGEV基因組的三分之一，以低拷貝pACNR1180質(zhì)粒對其進行克隆(Ruggli等，1996)并測序。借助于互補病毒有效拯救(復(fù)制和包裝)編碼缺陷型基因組的cDNA(Méndez等，1996；Izeta等，1999)。
DI-C基因組在ORF 1a、1b以及S基因和7之間分別存在約10、1和8千堿基(kb)的3個(Δ1、Δ2和Δ3)缺失(參見圖1)。
完成編碼感染性TGEV基因組的cDNA序列遵循的策略是逐步摻入DI-C基因組缺失的序列，分析新制備的構(gòu)建物的細菌毒性。該方面是非常重要的，因為科學(xué)文獻充分證明，提供RNA病毒的cDNA的重組質(zhì)粒一般生長差而且不穩(wěn)定(Boyer和Haenni，1994；Rice等，1989；Mandl等，1997)。
要完成的第一個缺失是ORF 1b的缺失Δ2(1kb)，獲得穩(wěn)定的重組質(zhì)粒。通過克隆cDNA片段A、B、C和D導(dǎo)入缺乏ORF 1a的序列(圖1)(Almazan等，2000)，使得復(fù)制酶基因需要的所有信息是完整的。獲得的重組質(zhì)粒在細菌中是不穩(wěn)定的，產(chǎn)生在片段B中導(dǎo)入添加和缺失的新質(zhì)粒(Almazan等，2000)。有趣的是，消除包含核苷酸4,417和9,615之間含有的基因組區(qū)段的5,198bp ClaI-ClaI限制性片段(Penzes等，1999)獲得在大腸桿菌DH10B菌株中相對穩(wěn)定的質(zhì)粒。然后通過克隆TGEV基因組3’末端的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白遺傳信息加入缺失Δ3序列(圖1)。
為了增強TGEV cDNA的穩(wěn)定性，決定采用pBeloBAC11質(zhì)粒(Kim等，1992)以BAC亞克隆TGEV cDNA(見圖2)。pBeloBAC11質(zhì)粒由H Shizuya和M.Simon(California Institute of Technology)惠贈。該質(zhì)粒7,507bp大小，包括來自parB、parC、大腸桿菌F因子的復(fù)制起點(oriS)和保持每個細胞一個拷貝質(zhì)粒必需的基因(parA和repE)。該質(zhì)粒還提供作為選擇標記的氯霉素抗性基因(cat)。在CMV的IE啟動子控制下克隆所述cDNA，因為采用這種啟動子獲得高水平表達(Dubensky等，1996)，而且我們實驗室以前獲得結(jié)果表明，大的(9.7kb和15kb)TGEV來源缺陷型基因組表達的RNA在從細胞核內(nèi)(RNA在細胞核內(nèi)合成)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)時不會被剪接(Izeta等，1999；Penzes等，1999；Almazan等，2000)。產(chǎn)生的TGEV cDNA(pBAC-TcDNA-ΔClaI)包含復(fù)制酶基因信息(缺失的5,198bp ClaI片段除外)和所有的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因信息。該cDNA的3’末端側(cè)為24nt聚腺苷酸化序列、HDV核酶和BGH轉(zhuǎn)錄終止序列(Izeta等，1999)。另一方面，制備TGEV完整基因組必需的ClaI片段以BAC克隆，獲得包含4,310和9,758之間的TGEV基因組區(qū)的質(zhì)粒pBAC-B+C+D5’(見圖3)。兩種質(zhì)粒均在大腸桿菌DH10B菌株中生長而且測定其整個序列。獲得的序列與本文獻結(jié)尾提供的TGEV的PUR46-MAD分離株的共有序列(SEQ ID NO1)相同，例外的是在核苷酸6,752(AG，沉默突變)和18,997(TC，沉默突變)位置存在兩個取代，以及分離株C11的D基因取代PUR46-MAD的S基因的變化(這些變化在圖4中標示出)。
此外，為了制備編碼毒性TGEV的cDNA，用TGEV克隆11(此后稱為C11)的S基因完全取代PUR46-MAD分離株的S基因，前者在呼吸道(＜106PFU/mL)和腸道(＜106PFU/mL)二者中的復(fù)制滴度均高，后者在呼吸道的復(fù)制水平高(＞106PFU/g組織)而在腸道的復(fù)制水平低(＜103PFU/mL)(Sanchaz等，1999)。C11的S基因的14個核苷酸不同于PUR46-MAD分離株的S基因，而且在C11的S基因的5’末端插入了6個核苷酸(見圖4)(Sanchaz等，1999)。我們實驗室以前的結(jié)果(Sanchaz等，1999)表明，直接重組獲得、C11腸道分離株的S基因取代TGEV的PUR46-MAD分離株S基因的突變體獲得腸道向性而且毒力增強，而不同于在感染豬的腸道復(fù)制非常低或者根本沒有的TGEV的天然PUR46-MAD分離株。
通過以pBAC-TcDNA-ΔClaI質(zhì)?？寺膒BAC-B+C+D5’質(zhì)粒獲得的5,198bp ClaI-ClaI片段，由含有腸道分離株C11S基因的TGEVPUR46-MAD分離株構(gòu)建cDNA，獲得含有編碼完整TGEV基因組的cDNA的pBAC-TcDNAFL質(zhì)粒(圖3)。
通過在大腸桿菌中生長160代后，分析構(gòu)建感染性cDNA克隆使用的質(zhì)粒(pBAC-TcDNA-ΔClaI和pBAC-ClaIF)以及含有完整cDNA的質(zhì)粒(pBAC-TcDNAFL)在細菌中的穩(wěn)定性。借助于限制性酶消化純化DNA分析穩(wěn)定性。沒有檢測到缺失或插入，但是不能排除所使用的分析技術(shù)不能檢測出pBAC-TcDNA-ΔClaI質(zhì)粒和pBAC-B+C+D5’質(zhì)粒中存在的微小變化。在含有TGEV完整基因組的pBAC-TcDNA質(zhì)粒的情況下，40代后檢測到一定的不穩(wěn)定性(此時約80％DNA呈現(xiàn)正確的限制圖譜)。然而，這種略微的不穩(wěn)定性并不妨礙拯救感染性病毒，因為細菌生長20代(4L培養(yǎng)物)足以產(chǎn)生允許拯救所述病毒的質(zhì)粒DNA量。
1.2由編碼完整基因組的cDNA拯救感染性TGEV用pBAC-TcDNAFL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，收集培養(yǎng)物上清液，傳代入ST細胞6次(見圖5)。從第二代開始，感染后14小時細胞病變明顯，之后在感染后20小時擴展至幾乎所有形成單層的細胞均呈現(xiàn)細胞病變(見圖6)。另一方面，拯救病毒的滴度隨傳代迅速增高，從第三代起滴度達到約108PFU/mL(見圖7)。重復(fù)實驗5次，在所有5次情況都回收到相似滴度的感染性病毒，而在非轉(zhuǎn)染ST細胞或用相似質(zhì)粒(ClaI-ClaI片段的存在方向相反)轉(zhuǎn)染的ST細胞情況下，從未回收到病毒。
為了消除所獲得的病毒為污染產(chǎn)物的可能性，對使用拯救病毒基因組RNA作為模板通過RT-PCR擴增的cDNA片段進行測序，測定位置6,752和18,997的序列。序列分析確定位置6,752和18,997的核苷酸是所述cDNA中存在的核苷酸。而且，在S基因的cDNA序列中，拯救病毒于位置20,990存在限制性位點DraIII，同對C11的S基因的預(yù)料相同(圖8)。這3個遺傳標記的存在證實所述分離病毒來自所述cDNA。
在更深入表征所制備的病毒時，通過對用pBAC-TcDNAFL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后回收到的病毒(TcDNA)感染細胞或者TGEV的PUR46-MAD分離株感染細胞進行免疫熒光檢測，從而進行比較分析。為此，使用識別C11分離株和PUR46-MAD分離株二者或者只識別后者的特異性多克隆抗體和單克隆抗體(見圖10)。所獲得的結(jié)果證實新TcDNA病毒的預(yù)期抗原性。TGEV特異性多克隆抗體、預(yù)期的S蛋白特異性單克隆抗體(ID.B12和6A.C3)以及M(3B.B3)和N(3B.D8)蛋白特異性單克隆抗體均識別TcDNA和PUR46-MAD二者。所獲得的數(shù)據(jù)說明，所制備的病毒存在PUR46-MAD分離株的M和N蛋白以及C11分離株的S蛋白，正如用原初cDNA所設(shè)計的一樣。
1.3體內(nèi)感染性和毒力為了分析TcDNA病毒的體內(nèi)感染性，用從第六代克隆的病毒接種一組新生小豬(5只)，分析其死亡率。接種的5只小豬在接種后3-4天死亡，說明TcDNA病毒是毒性病毒。相反，僅用稀釋的TcDNA病毒接種而且維持在相同條件下的2只小豬沒有任何變化。
1.4通過修飾轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列優(yōu)化表達水平冠形病毒通過RNA依賴性過程合成RNA，其中mRNA從負極性模板轉(zhuǎn)錄。在TGEV中，出現(xiàn)的保守共有序列CUAAAC恰好位于大多數(shù)基因之前。這些序列是亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄的信號。根據(jù)冠形病毒和宿主的類型，冠形病毒中存在6-8種大小不同的mRNA。最大的mRNA對應(yīng)于基因組RNA，它再用作ORF 1a和1b的mRNA。其余mRNA對應(yīng)于各亞基因組mRNA。這些RNA從大到小命名為mRNA 1-7。另一方面，在最初描述的mRNA組之后發(fā)現(xiàn)的某些mRNA的命名為相應(yīng)的mRNA名稱-數(shù)字，例如mRNA 2-1。所述各種mRNA相對于基因組RNA結(jié)構(gòu)存在共同末端結(jié)構(gòu)。除了最小的mRNA之外，其余mRNA在結(jié)構(gòu)上為多順反子mRNA，盡管一般來說僅最靠近5’的ORF被翻譯。
采用最小基因間(IG)序列CUAAAC 5’末端側(cè)不同序列(圖11)、IG序列3’末端側(cè)不同序列(圖12)和不同插入位點(圖13)研究了標記基因(GUS)的表達效率。獲得的結(jié)果(圖11-13)表明，以下組成的TRS實現(xiàn)最佳表達(i)TGEV N基因共有序列側(cè)的-88核苷酸；(ii)IG序列；(iii)S基因的IG序列3’側(cè)序列。此外，與有關(guān)異源基因插入點獲得的結(jié)果一致，當異源基因位于基因組3’末端時表達水平最高。諸如已經(jīng)介紹的TRS可使GUS的表達水平為2-8μg/106細胞。
1.5表達系統(tǒng)的組織特異性許多病原體通過粘膜進入宿主。為了防止這種感染，重要的是開發(fā)可誘導(dǎo)高水平分泌型免疫的表達系統(tǒng)。通過給予呼吸道和腸道相關(guān)性淋巴結(jié)抗原，基本可達到此目的。為了達到此目的，而且一般來說為了使基因表達控制在目的組織，研究了TGEV向性的分子基礎(chǔ)。這些研究表明，通過構(gòu)建含有需要向性的冠形病毒S基因的重組病毒，可以改進TGEV組織特異性(Ballesteros等，1997；Sanchez等，1999)。該信息使得可以構(gòu)建以具有呼吸道或腸道向性的冠形病毒cDNA基因組為基礎(chǔ)的表達系統(tǒng)。
1.6使用感染性cDNA表達PRRSV ORF5編碼的病毒抗原為了優(yōu)化異源基因表達水平，構(gòu)建物的組成為可交換模塊式載體，其兩側(cè)為促進TRS和載體中的異源基因交換的克隆序列。以下結(jié)構(gòu)獲得最佳表達(約10μg/106細胞)PRRSV(豬呼吸及生殖綜合征病毒)的ORF 5，其5’末端側(cè)為最小IGS共有序列(CUAAAC)，共有序列之前為病毒核衣殼基因(N)側(cè)翼-88個核苷酸；其3’末端側(cè)為限制性位點SalI(GTCGAC)和類似于Kozak(AC)GACC的序列。原則上，這樣的異源基因表達水平高于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答需要的水平。異源基因插入先前由病毒非必需基因3a和3b占據(jù)的位置。
1.7在豬體內(nèi)誘導(dǎo)對所述cDNA源性病毒載體表達的抗原的免疫應(yīng)答使用得自上述cDNA和TRS的相同類型的病毒載體，高水平表達編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因(20μg蛋白/106豬睪丸細胞、ST細胞)。在細胞培養(yǎng)物中表達水平穩(wěn)定20代以上。此外，經(jīng)口、鼻內(nèi)和胃內(nèi)途徑給予活病毒載體免疫一組豬，檢測到對所述病毒載體和GFP二者的強體液免疫應(yīng)答。有趣的是，給予3劑所述病毒載體后，沒有在接種的豬觀測到繼發(fā)效應(yīng)。
1.8構(gòu)建表達外源基因而不產(chǎn)生感染性病毒的安全病毒載體對于人類載體設(shè)計，生物安全性是優(yōu)先考慮的因素。為了達到此目的，需要在載體內(nèi)工程操作3種類型的安全保證措施。其中2種操作的基礎(chǔ)是缺失病毒復(fù)制必需的2種病毒組分，這2種病毒組分作圖在病毒基因組的不同位置。包裝細胞系反式提供這些組分。這種細胞(幼蒼鼠腎臟，BHK)表達缺失的編碼所述病毒必需的結(jié)構(gòu)蛋白(包膜E蛋白和膜M蛋白)的基因。第三種安全保證是使病毒基因組的包裝信號改變位置，這樣防止重組恢復(fù)產(chǎn)生感染性病毒，從而產(chǎn)生有效表達異源基因但是甚至不能感染最近的相鄰細胞的自殺載體。
關(guān)于設(shè)計用于人類的新型載體，我們還不能生產(chǎn)可在人類繁殖的新型病毒，因為這種載體不能在人體內(nèi)細胞之間傳遞。所述載體基于復(fù)制缺陷型病毒。它通過利用互補所述病毒缺失的包裝細胞而僅在疫苗工廠內(nèi)生長。這些安全保證是工程冠形病毒的新措施。具有新的向性的重組病毒至少可在貓細胞中復(fù)制，因為貓細胞可復(fù)制人、豬、犬和貓冠形病毒。
微生物保藏攜帶含有本發(fā)明感染性克隆的質(zhì)粒的大腸桿菌鑒定為大腸桿菌pBAC-TcDNAFL，已經(jīng)于1999年11月24日保藏于西班牙典型保藏物中心(CECT)(Burjassot(Valencia)，其保藏號為CECT 5265。
文獻目錄Ahlquist，P.，R. French，M.Janda和L.S.Loesch-Fries.(1984)，源于克隆病毒cDNA的多組分RNA植物病毒的感染，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.817066-7070。
Almazan，F(xiàn).，J.M.Gonzalez，Z.Penzes，A.Izeta，E.Calvo，J.Plana-Duran和L.Enjuanes.(2000)，最大RNA病毒基因組工程為感染性細菌人工染色體，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.975516-5521。
Ballesteros，M.L.，C.M.Sanchez和L.Enjuanes.(1997)，傳染性胃腸炎冠形病毒刺突蛋白N末端兩個氨基酸改變導(dǎo)致腸向性喪失，Virology.227378-388。
Baron，M.D.和T.Barrett.(1997)，從克隆cDNA拯救牛瘟病毒，J.Virol.711265-1271。
Boyer，J.C.，A.L.和Haenni.(1994)，RNA病毒的感染性轉(zhuǎn)錄物和cDNA克隆，Virology.198415-426。
Chang，R.Y.，M.A.Hofmann，P.B.Sethna和D.A.Brian.(1994)，冠形病毒前導(dǎo)序列在干擾缺損性RNA復(fù)制中的順式作用，J.Virol.688223-8231。
Collins，P.L.，M.G.Hill，E.Camargo，H.Grosfeld，R.M.Chanock和B.R.Murphy.(1995)，用克隆dCNA產(chǎn)生感染性人呼吸道合胞病毒證實M2mRNA 5’近端可讀框的轉(zhuǎn)錄延長因子在基因表達中的基本作用而且提供了開發(fā)疫苗的可能性，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9211563-11567。
Davis，N.L.，L.V.Willis，J.F.Smith和R.E.Johnston.(1989)，由cDNA克隆體外合成感染性委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒RNA分析存活缺失突變體，Virology.171189-204。
Dubensky，J.，T.W.，D.A.Driver，J.M.Polo，B.A.Belli，E.M.Latham，C.E.Ibanez，S.Chada，D.Brumm，T.A.Banks，S.J.Mento，D.J.Jolly和S.M.W.Chang.(1996)，新培斯病毒DNA型病毒載體體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用，J.Virol.70508-519。
Durbin，A.P.，S.L.Hall，J.W.Siew，S.S.whitehead，P.L.Collins和B.R.Murphy.(1997)，用cDNA回收感染性人3型副流感病毒，Virology.235323-332。
Enjuanes，L.，S.G.Siddell和W.J.Spaan.1998.Coronaviruses andArteriviruses.Plenum Press，New York。
Enjuanes，L.和B.A.M.Van der Zeijst.1995，傳染性胃腸炎冠形病毒流行病學(xué)的分子基礎(chǔ)，載于Coronaviridae，S.G.Siddell編著，PlenumPress，New York。
Frolov，I.，T.A.Hoffman，B.M.Pragai，S.A.Dryga，H.V.Huang，S.Schlesinger和C.M.Rice.(1996)，甲病毒型表達載體策略與應(yīng)用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9311371-11377。
Garcin，D.，T.Pelet，P.Calain，L.Roux，J.Curran和D.Kolakofsky.(1995)，用于由cDNA回收感染性仙臺副粘病毒的高度重組系統(tǒng)新一代重組系統(tǒng)，EMBO J.146087-6094。
Geigenmuller，U.，N.H.Ginzton和S.M.Matsui.(1997)，構(gòu)建人1血清型星狀病毒的基因組長度cDNA克隆以及合成感染性RNA轉(zhuǎn)錄物，J.Virol 711713-1717。
Izeta，A.，C.Smerdou，S.Alonso，Z.Penzes，A.Mendez，J.Plana-Durna和L.Enjuanes.(1999)，傳染性胃腸炎冠形病毒來源的合成微小基因組的復(fù)制和包裝，J.Virol.731535-1545。
Kim，U.-J.，H.Shizuya，P.de Jong，B.W.Birren和M.I.Simon.(1992)，在F因子型載體中穩(wěn)定繁殖粘粒大小的人DNA插入物，Nucleic AcidsRes.201083-1085。
Lai，C.-J.，B.Zhao，H.Hori和M.Bray.(1991)，從4型登革病毒穩(wěn)定克隆的全長cDNA轉(zhuǎn)錄感染性RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.885139-5143。
Lai，M.M.C.和D.Cavanagh.(1997)，冠形病毒的分子生物學(xué)，Adv.VirusRes.481-100。
Lai，M.M.C.，C.-L.Liao，Y.-J.Lin和X.Zhang.(1994)，冠形病毒大RNA病毒基因組如何復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，Infect.Agents Dis.398-105。
Liljestrom，P.(1994)，甲病毒表達系統(tǒng)，Curr.Opin.Biotech.5495-500。
Liljestrom，P.和H.Garoff.(1991)，基于無名森林病毒復(fù)制子的新一代動物細胞表達載體，Bio/Technology.91356-1361。
Luytjes，W.，M.Krystal，M.Enami，J.D.Parvin和P.Palese.(1989)，流感病毒對外源基因的擴增、表達和包裝，Cell.591107-1113。
Mandl，C.W.，M.Ecker，H.Holzmann，C.Kunz，F(xiàn).X.Heinz.(1997)，蜱傳腦炎病毒歐洲亞型原型株Neudoerfl和高毒力株Hypr的感染性cDNA克隆，J.Gen.Virol.781049-1057。
Maniatis，T.，E.F.Fritsh和J.Sambrook，(1989)，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York。
Mendez，A.，C.Smerdou，A.Izeta，F(xiàn).Gebauer和L.Enjuanes.(1996)，傳染性胃腸炎冠形病毒缺陷干擾基因組的分子特征包裝和異質(zhì)性，Virology.217495-507。
Penzes，Z.，A.Izeta，C.Smerdou，A.Mendez，M.L.Ballesteros和L.Enjuanes.(1999)，傳染性胃腸炎冠形病毒株P(guān)UR46-MAD的完整核苷酸序列，提交出版中。
Pushko，P.，M.Parker，G.V.Ludwing，N.L.Davis，R.E.Johnston和J.F.Smith.(1997)，減毒委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的復(fù)制輔助系統(tǒng)異源基因的體外表達和體內(nèi)抗異源病原體的免疫，Virology，239389-410。
Racaniello，V.R.和D.Baltimore.(1981)，克隆的脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA在哺乳動物細胞中是感染性的，Science.214916-919。
Radecke，F(xiàn).，P.Spielhofer，H.Schneider，K.Kaelin，M.Huber，C.Dotsch，G.Christiansen和M.A.Billeter.(1995)，用克隆DNA拯救麻疹病毒，EMBO J.145773-5784。
Rice，C.M.，A.Grakoui，R.Galler和T.J.Chambers.(1989)，用體外連接制備的全長cDNA模板轉(zhuǎn)錄感染性黃熱RNA，New Biologist.1285-296。
Rice，C.M.，R.Levis，J.H.Strauss和HV.Huang.(1987)，應(yīng)用新培斯病毒cDNA克隆產(chǎn)生感染性RNA轉(zhuǎn)錄物作圖致死突變、拯救溫度敏感型標記和體外誘變產(chǎn)生限定突變體，J.Virol.613809-3819。
Rice，C.M.和J.H.Strauss.(1981)，合成、切割和序列分析與新培斯病毒26S信使RNA互補的DNA，J.Mol.Biol.150315-340。
Ruggli，N.，J.D.Tratschin，C.Mittelholzer，M.A.Hofmann.(1996)，典型豬熱病毒株Alfort/187的核苷酸序列以及由穩(wěn)定克隆的全長cDNA轉(zhuǎn)錄感染性RNA，J.Virol.703479-3487。
Sanchez，C.M.，G.Jimenez，M.D.Laviada，I.Correa，C.Sune，M.J.Bullido，F(xiàn).Gebauer，C.Smerdou，P.Callebaut，J.M.Escribano和L.Enjuanes.(1990)，與傳染性胃腸炎病毒有關(guān)的冠形病毒之間的抗原同源性，Virology.174410-417。
Sanchez，C.M.，F(xiàn).Gebauer，C.Suen，A.Mendez，J.Dopazo和L.Enjuanes.(1992)，傳染性胃腸炎冠形病毒的遺傳進化和向性，Virology.19092-105。
Sanchez，C.M.，A.Izeta，J.M.Sanchez-Morgado，S.Alonso，I.Sola，M.Balasch，J.Plana-Duran和L.Enjuanes.(1999)，定向重組證實傳染性胃腸炎冠形病毒的刺突基因是其腸向性和毒力的決定因素，J.Virol.737607-7618。
Sawicki，S.G.和D.L.Sawicki(1990)，冠形病毒轉(zhuǎn)錄亞基因組小鼠肝炎病毒復(fù)制中間體在RNA合成中的作用，J.Virol.641050-1056。
Schnell，M.J.，T.Mebatsion和K.-K.Conzelmann.(1994)，得自克隆cDNA的感染性狂犬病毒，EMBO J.134195-4203。
Sethna，P.B.，S.-L.Hung和D.A.Brian.(1989)，冠形病毒亞基因組負鏈RNA和mRNA復(fù)制子的潛在作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.865626-5630。
Shizuya，H.，B.Birren，U.-J.Kim，V.Mancino，T.Slepak，Y.Tachiiri和M.Simon.(1992)，使用F因子型載體在大腸桿菌中克隆和穩(wěn)定維持300kbp人DNA片段，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.898794-8797。
Siddell，S.G.1995，The Coronaviridae.Plenum Press，New York，第418頁。
Smerdou，C.和P.Liljestrom.(1999)，用于基因轉(zhuǎn)移的非病毒擴增系統(tǒng)基于甲病毒的載體，Curr.Opin.Mol.Therap.1244-251。
Taniguchi，M.和F.A.P.Miller.(1978)，用富集抑制T細胞和AT淋巴瘤細胞系融合物獲得的雜交瘤產(chǎn)生特異性抑制因子，J.Exp.Med.148373-382。
van der Most，R.G.和W.J.M.Spaan.1995，冠形病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和RNA重組，載于The Coronaviridae.S.G.Siddell編著，Plenum Press，NewYork.11-31。
Wang，K.，C.Boysen，H.Shizuya，M.I.Simon和L.Hood.(1997)，兩代細菌人工染色體克隆載體的完整核苷酸序列，BioTechniques.23992-994。
Woo，S.-S.，J.Jiang，B.S.Gill，A.H.Paterson和R.A.Wing.(1994)，構(gòu)建和表征Sorghum bicolor的細菌人二染色體文庫，Nucleic Acids Res.224922-4931。
Zhang，X.，C.L.Liao和M.M.C.Lai.(1994)，冠形病毒前導(dǎo)RNA反式和順式調(diào)節(jié)和起始亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄，J.Virol.684738-4746。
CPCH0462629D 說明書的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>康斯喬最高科學(xué)研究公司(Consejo Superior de Investigaciones Cientificas)<120>
<130>
<150>ES 9902673<151>1999-12-03<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>28588<212>DNA<213>豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissable Gastroentertitis V)<400>1acttttaaag taaagtgagt gtagcgtggc tatatctctt cttttacttt aactagcctt 60gtgctagatt ttgtcttcgg acaccaactc gaactaaacg aaatatttgt ctttctatga 120aatcatagag gacaagcgtt gattatttcc attcagtttg gcaatcactc cttggaacgg 180ggttgagcga acggtgcagt agggttccgt ccctatttcg taagtcgcct agtagtagcg 240agtgcggttc cgcccgtaca acgttgggta gaccgggttc cgtcctgtga tctccctcgc 300cggccgccag gagaatgagt tccaaacaat tcaagatcct tgttaatgag gactatcaag 360tcaacgtgcc tagtcttcct attcgtgacg tgttacagga aattaagtac tgctaccgta 420atggatttga gggctatgtt ttcgtaccag aatactgtcg tgacctagtt gattgcgatc 480gtaaggatca ctacgtcatt ggtgttcttg gtaacggagt aagtgatctt aaacctgttc 540ttcttaccga accctccgtc atgttgcaag gctttattgt tagagctaac tgcaatggcg 600ttcttgagga ctttgacctt aaaattgctc gcactggcag aggtgccata tatgttgatc 660aatacatgtg tggtgctgat ggaaaaccag tcattgaagg cgattttaag gactacttcg 720gtgatgaaga catcattgaa tttgaaggag aggagtacca ttgcgcttgg acaactgtgc 780gcgatgagaa accgctgaat cagcaaactc tctttaccat tcaggaaatc caatacaatc 840tggacattcc tcataaattg ccaaactgtg ctactagaca tgtagcacca ccagtcaaaa 900agaactctaa aatagttctg tctgaagatt acaagaagct ttatgatatc ttcggatcac 960cctttatggg aaatggtgac tgtcttagca aatgctttga cactcttcat tttatcgctg 1020ctactcttag atgcccgtgt ggttctgaaa gtagcggcgt tggagattgg actggtttta 1080agactgcctg ttgtggtctt tctggcaaag ttaagggtgt cactttgggt gatattaagc 1140ctggtgatgc tgttgtcact agtatgagcg caggtaaggg agttaagttc tttgccaatt 1200gtgttcttca atatgctggt gatgttgaag gtgtctccat ctggaaagtt attaaaactt 1260ttacagttga tgagactgta tgcacccctg gttttgaagg cgaattgaac gacttcatca 1320aacctgagag caaatcacta gttgcatgca gcgttaaaag agcattcatt actggtgata 1380ttgatgatgc tgtacatgat tgtatcatta caggaaaatt ggatcttagt accaaccttt 1440ttggtaatgt tggtctatta ttcaagaaga ctccatggtt tgtacaaaag tgtggtgcac 1500
tttttgtaga cgcttggaaa gtagtagagg agctttgtgg ttcactcaca cttacataca 1560agcaaattta tgaagttgta gcatcacttt gcacttctgc ttttacgatt gtaaactaca 1620agccaacatt tgtggttcca gacaatcgtg ttaaagatct tgtagacaag tgtgtgaaag 1680ttcttgtaaa agcatttgat gtttttacgc agattatcac aatagctggt attgaggcca 1740aatgctttgt gcttggtgct aaatacctgt tgttcaataa tgcacttgtc aaacttgtca 1800gtgttaaaat ccttggcaag aagcaaaagg gtcttgaatg tgcattcttt gctactagct 1860tggttggtgc aactgttaat gtgacaccta aaagaacaga gactgccact atcagcttga 1920acaaggttga tgatgttgta gcaccaggag agggttatat cgtcattgtt ggtgatatgg 1980ctttctacaa gagtggtgaa tattatttca tgatgtctag tcctaatttt gttcttacta 2040acaatgtttt taaagcagtt aaagttccat cttatgacat cgtttatgat gttgataatg 2100ataccaaaag caaaatgatt gcaaaacttg gttcatcatt tgaatatgat ggtgatattg 2160atgctgctat tgtaaaagtc aatgaactac tcattgaatt taggcagcaa agcttgtgct 2220tcagagcttt taaggacgac aaaagcattt ttgttgaagc ctattttaaa aagtataaaa 2280tgccagcatg ccttgcaaaa catattggtt tgtggaacat cataaagaaa gattcatgta 2340agaggggttt tcttaatctc ttcaatcact tgaatgaatt ggaagatatc aaagaaacta 2400atattcaggc tattaaaaac attctttgcc ctgatcctct tcttgatctg gattatggtg 2460ccatttggta caattgcatg ccaggttgct ctgatccttc agttttgggg agtgttcaac 2520ttttgatcgg taatggtgtg aaagtagttt gtgatggctg caaaggtttt gctaaccaac 2580tttcaaaagg ttacaacaag ctctgtaatg cggctcgcaa tgatattgag atcggtggta 2640taccattttc cacttttaaa acacctacaa atacttttat tgaaatgaca gatgctatct 2700attcagttat tgaacaaggt aaggcattat cctttagaga tgctgatgtg ccagttgtag 2760acaatggtac catttctact gctgattggt ctgaacccat tctgcttgaa cctgctgaat 2820atgtaaaacc aaagaacaat ggtaatgtca ttgttattgc aggttataca ttttataaag 2880atgaggatga acatttttat ccttatggtt ttggtaaaat tgtgcagaga atgtataata 2940aaatgggtgg tggtgacaaa actgtctcat tttcagaaga agtagatgtt caagaaattg 3000cacctgttac acgtgttaaa cttgaattcg aatttgacaa tgaaattgta actggtgttc 3060ttgaacgggc tattggtact agatacaaat ttactggtac aacttgggaa gaatttgaag 3120agtctatttc tgaagaactc gatgcaatct ttgatactct agcaaaccaa ggtgtcgaac 3180ttgaaggtta cttcatttat gacacttgtg gtggctttga tataaaaaat ccagatggta 3240ttatgatctc tcagtatgat atcaatatta ctgctgatga aaaatcagaa gttagtgcat 3300caagtgaaga agaagaagtt gaatctgttg aagaagatcc tgagaatgaa attgtagaag 3360catctgaagg tgctgaaggg acttcttctc aagaagaggt tgaaacagta gaagttgcag 3420atattacttc tacagaagaa gatgttgaca ttgttgaagt atctgctaaa gatgaccctt 3480gggctgcagc tgttgatgta caagaagctg aacaatttaa tccttctcta ccacctttca 3540agacaacgaa tctcaacgga aaaattatcc ttaagcaagg ggataataat tgttggataa 3600atgcttgttg ctatcagctt caggcctttg attttttcaa caatgaagct tgggagaaat 3660ttaagaaagg tgatgtcatg gactttgtaa acctttgtta tgcagcaaca acactagcaa 3720gaggtcattc tggtgatgca gagtatcttc ttgaacttat gctcaatgat tatagcacag 3780ccaagatagt acttgcagct aagtgtggtt gtggtgaaaa agaaattgtt ttggaaagag 3840ctgtttttaa actcacccca cttaaggaga gttttaatta tggtgtttgt ggtgactgca 3900tgcaagttaa cacctgtaga tttttaagtg ttgaaggctc tggtgttttt gttcatgaca 3960tattaagcaa gcaaacgcca gaagctatgt ttgttgtcaa acctgttatg catgcagttt 4020acactggcac aactcaaaat ggccattaca tggttgatga tattgaacac ggttattgtg 4080tagatggtat gggtattaaa ccacttaaga aacggtgtta tacatccaca ttgttcatta 4140atgccaatgt aatgactaga gctgaaaaac caaaacaaga gtttaaagtt gaaaaagtag 4200aacagcaacc gatagtggag gaaaacaaat cctctattga aaaagaggaa attcaaagtc 4260ctaaaaacga tgaccttata cttccatttt acaaagctgg taaactttcc ttttatcagg 4320gtgctttgga tgttttgatc aatttcttgg aacctgatgt tattgttaat gctgctaatg 4380
gtgatcttaa acacatgggt ggtgtcgcaa gagccatcga tgttttcact ggtggcaaat 4440taacagaacg ttctaaggat tatcttaaaa agaacaaatc tattgctcct ggtaatgctg 4500ttttctttga aaatgtcatt gagcatctta gtgttttgaa tgcagttgga ccacgtaatg 4560gtgacagccg agttgaagcc aaactttgta atgtttacaa agcaattgca aagtgtgaag 4620gaaaaatatt aacaccactt attagtgttg gtatctttaa tgttagactt gaaacatcat 4680tgcagtgctt acttaagact gtgaatgaca ggggattgaa tgtcttcgta tacactgacc 4740aggagaggca aactattgag aatttcttct cttgttctat ccctgtcaat gttactgagg 4800ataatgttaa ccatgaacgt gtgtctgttt cttttgacaa aacatacggt gaacagctta 4860agggcaccgt tgtcatcaaa gacaaagatg ttacaaacca gttgcctagc gcttttgatg 4920ttggtcaaaa agttattaag gctattgata tagattggca agctcattat ggtttccgtg 4980atgctgctgc ttttagcgct agtagtcatg atgcttataa atttgaagtt gttacacata 5040gcaatttcat tgtgcataag cagactgaca acaactgttg gattaatgca atttgtcttg 5100cattacagag actcaagcca cagtggaaat ttcctggtgt tagaggtctc tggaatgaat 5160ttcttgagcg taaaacacaa ggttttgtac atatgttgta tcacatttct ggagtaaaga 5220aaggtgagcc aggtgatgct gaattaatgc tgcataaact tggtgacttg atggacaatg 5280attgtgaaat cattgtcaca cacactacag catgtgacaa gtgcgcaaaa gtagaaaagt 5340ttgttggacc agtggtagca gcacctcttg caattcatgg cactgacgaa acatgtgtgc 5400atggcgttag tgtcaatgtc aaagtcaccc aaattaaggg cactgttgct attacttctt 5460tgattggtcc tattattgga gaagtactag aagcaactgg ttatatttgt tatagcggtt 5520ctaacaggaa tggtcattac acctattacg ataaccgtaa tggattagtg gttgatgcag 5580aaaaggctta ccattttaat agagacttat tacaggtcac aacagctatt gcaagtaatt 5640tcgttgtcaa gaaaccacaa gcagaggaaa gacctaagaa ttgtgctttt aacaaagttg 5700cagcatctcc taagattgta caagaacaaa aattgttggc tattgaaagt ggtgctaact 5760atgctcttac tgaatttgga agatatgctg acatgttctt tatggctgga gataaaattc 5820ttaggttgct gcttgaagtc tttaaatatt tgctggtttt atttatgtgt cttagaagta 5880ctaagatgcc taaagttaaa gtcaaaccac ctcttgcatt taaagatttt ggtgctaagg 5940tcagaacgct caattacatg agacaattga acaaaccctc tgtctggcgt tacgcaaaac 6000tagttttatt gttgatagca atatataatt tcttttattt gtttgtcagt ataccagtag 6060tgcataaatt aacatgtaac ggtgctgtac aggcatataa aaattctagt tttataaagt 6120ctgcagtctg tggcaactct attttatgca aagcctgttt ggcttcttat gatgagttgg 6180ctgattttca acatctccaa gttacttggg atttcaaatc tgacccacta tggaacagac 6240tggtacaatt gtcttacttt gcattcttgg ctgtttttgg taataactat gttaggtgtt 6300ttcttatgta ttttgtatct cagtacctca acctttggct ttcttatttt ggttatgtag 6360agtacagttg gtttttgcat gttgtcaact ttgaatccat ctcagctgag tttgtgatcg 6420tagttatagt ggttaaggca gttctcgccc ttaaacatat tgttttcgca tgctcaaacc 6480cgtcttgcaa aacgtgctct aggactgcaa ggcagacacg tattcctatt caagttgttg 6540ttaatggttc aatgaagact gtttatgttc atgctaatgg tactggtaaa ttctgcaaga 6600aacacaattt ttattgtaag aactgtgatt cttatggctt tgaaaacaca ttcatctgtg 6660acgaaattgt acgtgatctc agtaatagtg ttaaacaaac tgtttacgcc actgatagat 6720ctcatcaaga agtcacaaaa gttgaatgtt cagatggctt ttacagattt tatgttggtg 6780atgaattcac ttcatatgac tatgatgtaa aacacaagaa atacagtagt caagaggttc 6840tcaagagcat gctcttgctt gatgacttca ttgtgtacag tccatctggt tctgctcttg 6900caaatgttag aaatgcctgt gtttactttt cacaacttat tggtaagcct attaagattg 6960ttaacagtga tttgcttgaa gacctctctg tagattttaa aggggcactt tttaatgcta 7020aaaagaatgt aattaagaat tctttcaatg ttgatgtctc agaatgcaaa aatcttgacg 7080aatgttacag ggcttgcaat cttaatgttt cattttctac atttgaaatg gctgtcaaca 7140atgctcatag gtttggtatt ctgattactg atcgttcttt taacaatttc tggccatcaa 7200aagttaagcc tggttcatct ggtgtgtcgg ccatggacat tggtaagtgt atgacttctg 7260
atgctaagat tgttaatgct aaagttttaa ctcaacgtgg taaaagtgtt gtttggctta 7320gccaggattt tgctgcactt agctcaactg ctcagaaagt tttggttaaa acttttgtag 7380aagaaggtgt caacttttca ctcacattta atgctgtagg ttcagatgat gatcttcctt 7440atgaaagatt cactgaatct gtgtctccaa aaagtggttc aggctttttc gatgtaatta 7500cacagcttaa acaaattgtg attttggttt ttgtttttat ctttatttgt ggtttgtgct 7560ctgtttacag tgttgctaca cagtcctaca ttgaatctgc tgaaggctat gactacatgg 7620ttattaagaa tggaattgtt caaccttttg acgataccat ttcatgtgtt cataacactt 7680ataaaggatt cggtgactgg tttaaagcta agtatggttt tatccctact tttggtaaat 7740catgtccaat tgttgtagga actgtttttg atcttgaaaa tatgagacca attcctgacg 7800tgcctgcata tgtttctatt gtgggtagat ctcttgtttt cgctattaat gctgcttttg 7860gtgttactaa tatgtgctat gatcatactg gcaatgcagt tagtaaggac tcttactttg 7920atacttgtgt gtttaatact gcgtgcacca ctcttacagg tcttggtggt acaattgtat 7980attgtgcaaa gcaaggttta gttgaaggtg ctaagctcta tagtgatctt atgccagact 8040attattatga gcatgctagt ggtaacatgg ttaaattgcc agcaattatt agaggacttg 8100gtctacgttt tgtgaaaaca caggctacaa cttattgtag agtgggagag tgcattgata 8160gtaaagctgg tttttgcttt ggtggcgata actggtttgt ctacgacaat gagtttggca 8220atggatacat ctgtggtaat tctgtgctag gattctttaa gaatgtcttc aaactcttta 8280actctaacat gtctgtggta gctacatctg gtgcgatgct tgttaacatt attattgcat 8340gcttagctat tgcaatgtgt tatggtgttc ttaagtttaa gaagattttt ggtgattgta 8400ctttcctcat tgttatgatc attgtcaccc ttgttgtgaa caatgtgtct tattttgtca 8460ctcaaaacac gttctttatg atcatctacg ccattgttta ctattttata acaagaaaac 8520ttgcataccc aggcattctt gatgctgggt ttattattgc ttatattaat atggctccat 8580ggtacgtgat taccgcatat atcctagttt tcctctatga ctcactccct tcactgttta 8640aacttaaagt ttcaacaaat ctttttgaag gtgataaatt tgtgggtaac tttgaatctg 8700ctgctatggg tacttttgtt attgacatgc gttcatatga aactattgtt aattctactt 8760ctattgctag aattaaatca tatgctaaca gcttcaataa atataagtac tacacaggtt 8820caatgggaga agctgactac agaatggctt gctatgctca tcttggtaaa gctcttatgg 8880actattctgt taatagaaca gacatgcttt acacacctcc tactgttagt gttaattcta 8940cacttcagtc aggtttgcgg aaaatggcac agcctagtgg tcttgtagag ccttgcattg 9000taagagtttc ctatggtaac aatgtgctta atggtttatg gttaggagat gaagtcattt 9060gccctagaca tgttattgct agtgatacca cacgtgttat caactatgaa aatgaaatgt 9120ctagtgtgag acttcacaac ttttcagttt ctaagaataa tgtgtttttg ggtgttgtgt 9180ctgccagata taagggtgtg aatcttgtac ttaaagtcaa ccaggttaat cctaacacac 9240cagaacataa atttaagtct attaaagctg gtgaaagttt taacattctt gcttgttatg 9300aaggatgtcc tggcagtgtt tatggtgtca acatgagaag tcaaggtacc attaaaggat 9360cttttatagc tggtacttgt ggatcagtag gttatgtgtt agaaaatgga attctctatt 9420ttgtatacat gcatcactta gaacttggaa atggctcgca tgttggttcc aattttgaag 9480gagaaatgta cggtggttat gaagatcaac ctagcatgca attggaaggt actaatgtca 9540tgtcatcaga taatgtggtt gcattcctat atgctgcact tatcaatggt gaaaggtggt 9600ttgttacaaa cacatcgatg tcattagaat catacaatac atgggccaaa actaacagtt 9660tcacagaact ttcttcaact gatgctttta gcatgttggc tgcaaaaact ggtcaaagtg 9720ttgagaaatt actagatagc atcgtaagac tcaacaaggg ttttggaggt cgtactatac 9780tttcttatgg ctcattgtgt gacgagttca ctccaactga agtcataagg caaatgtatg 9840gtgtaaatct tcaggctggt aaagtaaaat ctttcttcta ccctattatg actgcaatga 9900caattctctt tgccttttgg cttgaattct ttatgtacac acccttcact tggattaatc 9960caacttttgt tagcattgta ttggctgtta caactttgat ctcgacggtt tttgtctctg 10020gcatcaaaca taagatgttg ttctttatgt cttttgtcct tcctagtgtt atccttgtga 10080cagcacacaa tttgttctgg gacttttctt actatgaaag tcttcagtca attgttgaga 10140
atactaacac tatgtttttg cctgttgaca tgcaaggtgt catgctcaca gtgttttgct 10200ttattgtctt tgttacatat agtgttagat tcttcacttg caaacaatca tggttctcac 10260ttgctgtgac aactattctt gtgatcttta acatggttaa aatctttgga acatctgatg 10320aaccatggac tgaaaaccaa attgctttct gctttgtgaa catgcttact atgattgtca 10380gtcttactac aaaggattgg atggttgtca ttgcatcata cagaattgca tattatattg 10440ttgtatgtgt aatgccatct gcttttgtat ctgactttgg gtttatgaag tgtattagca 10500ttgtttacat ggcgtgcggt tatttgtttt gttgctatta tggcattctt tattgggtta 10560acagatttac atgcatgact tgtggtgttt atcaattcac tgtgtctgca gctgaactta 10620aatacatgac cgctaacaac ctttctgcac ctaagaacgc atatgacgct atgattctta 10680gtgctaaatt gattggtgtt ggaggtaaga gaaacatcaa aatttcaact gtacagtcaa 10740aacttacaga gatgaaatgt accaatgttg tcttgcttgg tcttttatct aaaatgcatg 10800tcgagtctaa ctcaaaagag tggaactatt gtgttggact acacaatgag ataaaccttt 10860gtgacgatcc tgaaatcgtt cttgagaaac tgttagctct tattgcattc ttcttgtcca 10920aacataacac ttgtgacctt agcgaactta ttgaatcata ctttgagaac accaccatac 10980tccagagtgt ggcttcagct tatgctgcat tgcctagctg gattgcactt gaaaaagctc 11040gcgctgatct tgaagaggct aagaaaaatg atgttagccc tcaaattttg aagcagctta 11100ctaaagcatt taacattgcc aagagtgatt ttgagcgcga agcatcagtg caaaagaaac 11160tcgacaaaat ggctgagcag gctgcagcta gtatgtataa agaagcacga gctgtggaca 11220gaaagtcaaa gattgtttct gctatgcata gcctactttt tggtatgctt aagaaacttg 11280atatgtccag tgtcaacact attattgacc aggctcgtaa tggtgttcta cctttaagta 11340tcattccagc tgcatcagct acaagacttg ttgttattac acctagcctt gaagtgtttt 11400ccaagattag gcaagaaaac aatgttcatt atgctggtgc tatttggact attgttgaag 11460ttaaagatgc taatggttca catgtacatc ttaaggaagt caccgctgct aatgaattaa 11520accttacttg gccattgagc attacttgtg agagaaccac aaagcttcag aacaatgaaa 11580ttatgccagg taaacttaaa gaaagagctg tcagagcgtc agcaactctt gatggtgaag 11640ctttcggcag tggaaaggct cttatggcat ctgaaagtgg aaaaagcttt atgtatgcat 11700ttatagcctc agacaacaat cttaagtatg ttaagtggga gagcaataat gatattatac 11760ctattgaact tgaagctcca ttgcgtttct atgttgacgg cgctaatggt cctgaagtca 11820agtatttgta ttttgtcaag aatttaaaca ctcttagacg tggtgccgtt cttggttata 11880tcggtgcaac agttcgtctg caagctggta aacccactga acatccatct aacagtagtt 11940tattgacatt gtgtgctttt tcacctgatc ctgctaaagc atatgttgat gctgttaaga 12000gaggcatgca accagttaat aactgtgtaa aaatgctctc aaatggtgct ggtaatggta 12060tggctgttac aaacggtgtc gaagctaaca cacaacagga ctcttatggt ggtgcttcag 12120tttgtattta ttgcagatgc catgttgaac atcctgctat tgatggatta tgccgctaca 12180aaggtaagtt cgtgcaaata ccaactggca cacaagatcc aattcggttc tgtattgaaa 12240atgaagtttg tgttgtctgt ggttgttggc ttaacaatgg ttgcatgtgc gatcgtactt 12300ctatgcagag ttttactgtt gatcaaagtt atttaaacga gtgcggggtt ctagtgcagc 12360tcgactagaa ccctgcaatg gtactgatcc agaccatgtt agtagagctt ttgacatcta 12420caacaaagat gttgcgtgta ttggtaaatt ccttaagacg aattgttcaa gatttaggaa 12480tttggacaaa catgatgcct actacattgt caaacgttgt acaaagaccg ttatggacca 12540tgagcaagtc tgttataacg atcttaaaga ttctggtgct gttgctgagc atgacttctt 12600cacatataaa gagggtagat gtgagttcgg taatgttgca cgtaggaatc ttacaaagta 12660cacaatgatg gatctttgtt acgctatcag aaattttgat gaaaagaact gtgaagttct 12720caaagaaata ctcgtgacag taggtgcttg cactgaagaa ttctttgaaa ataaagattg 12780gtttgatcca gttgaaaatg aagccataca tgaagtttat gcaaaacttg gacccattgt 12840agccaatgct atgcttaaat gtgttgcttt ttgcgatgcg atagtggaaa aaggctatat 12900aggtgttata acacttgaca accaagatct taatggcaat ttctacgatt tcggcgattt 12960cgtgaagact gctccgggtt ttggttgcgc ttgtgttaca tcatattatt cttatatgat 13020
gcctttaatg gggatgactt catgcttaga gtctgaaaac tttgtgaaaa gtgacatcta 13080tggttctgat tataagcagt atgatttact agcttatgat tttaccgaac ataaggagta 13140ccttttccaa aaatacttta agtactggga tcgcacatat cacccaaatt gttctgattg 13200tactagtgac gagtgtatta ttcattgtgc taattttaac acattgtttt ctatgacaat 13260accaatgaca gcttttggac cacttgtccg taaagttcat attgatggtg taccagtagt 13320tgttactgca ggttaccatt tcaaacaact tggtatagta tggaatcttg atgtaaaatt 13380agacacaatg aagttgagca tgactgatct tcttagattt gtcacagatc caacacttct 13440tgtagcatca agccctgcac ttttagacca gcgtactgtc tgtttctcca ttgcagcttt 13500gagtactggt attacatatc agacagtaaa accaggtcac tttaacaaag atttctacga 13560tttcataaca gagcgtggat tctttgaaga gggatctgag ttaacattaa aacatttttt 13620ctttgcacag ggtggtgaag ctgctatgac agacttcaat tattatcgct acaatagagt 13680cacagtactt gatatttgcc aagctcaatt tgtttacaaa atagttggca agtattttga 13740atgttatgac ggtgggtgca ttaatgctcg tgaagttgtt gttacaaact atgacaagag 13800tgctggctat cctttgaaca aatttggtaa agctagactt tactacgaaa ctctttcata 13860tgaagagcag gatgcacttt ttgctttaac aaagagaaat gttttaccca caatgactca 13920aatgaatttg aaatacgcta tttctggtaa ggcaagagct cgtacagtag gaggagtttc 13980acttctttct accatgacta cgagacaata tcatcagaag catttgaagt caattgctgc 14040aacacgcaat gctactgtgg tcattggttc aaccaagttt tatggtggtt gggacaatat 14100gcttaaaaat ttaatgcgtg atgttgataa tggttgtttg atgggatggg actatcctaa 14160gtgtgaccgt gctttaccta atatgattag aatggcttct gccatgatat taggttctaa 14220gcatgttggt tgttgtacac ataatgatag gttctaccgc ctctccaatg agttagctca 14280agtactcaca gaagttgtgc attgcacagg tggtttttat tttaaacctg gtggtacaac 14340tagcggtgat ggtactacag catatgctaa ctctgctttt aacatctttc aagctgtttc 14400tgctaatgtt aataagcttt tgggggttga ttcaaacgct tgtaacaacg ttacagtaaa 14460atccatacaa cgtaaaattt acgataattg ttatcgtagt agcagcattg atgaagaatt 14520tgttgttgag tactttagtt atttgagaaa acacttttct atgatgattt tatctgatga 14580tggagttgtg tgctacaaca aagattatgc ggatttaggt tatgtagctg acattaatgc 14640ttttaaagca acactttatt accagaataa cgtctttatg tccacttcta agtgttgggt 14700agaaccagat cttagtgttg gaccacatga attttgttca cagcatacat tgcagattgt 14760tgggcctgat ggagactact atcttcccta tccagacccg tccagaattt tatcagctgg 14820tgtgtttgtt gatgacatag ttaaaacaga caatgttatt atgttagaac gttacgtgtc 14880attggctatt gacgcatacc cgctcacaaa acaccctaag cctgcttatc aaaaagtgtt 14940ttacactcta ctagattggg ttaaacatct acagaaaaat ttgaatgcag gtgttcttga 15000ttcgttttca gtgacaatgt tagaggaagg tcaagataag ttctggagtg aagagtttta 15060cgctagcctc tatgaaaagt ccactgtctt gcaagctgca ggcatgtgtg tagtatgtgg 15120ttcgcaaact gtacttcgtt gtggagactg tcttaggaga ccacttttat gcacgaaatg 15180tgcttacgac catgttatgg gaacaaagca taaattcatt atgtctatca caccatatgt 15240gtgtagtttt aatggttgta atgtcaatga tgttacaaag ttgtttttag gtggtcttag 15300ttattattgt atgaaccaca aaccacagtt gtcattccca ctctgtgcta atggcaacgt 15360ttttggtcta tataaaagta gtgcagtcgg ctcagaggct gttgaagatt tcaacaaact 15420tgcagtttct gactggacta atgtagaaga ctacaaactt gctaacaatg tcaaggaatc 15480tctgaaaatt ttcgctgctg aaactgtgaa agctaaggag gagtctgtta aatctgaata 15540tgcttatgct gtattaaagg aggttatcgg ccctaaggaa attgtactcc aatgggaagc 15600ttctaagact aagcctccac ttaacagaaa ttcagttttc acgtgttttc agataagtaa 15660ggatactaaa attcaattag gtgaatttgt gtttgagcaa tctgagtacg gtagtgattc 15720tgtttattac aagagcacga gtacttacaa attgacacca ggtatgattt ttgtgttgac 15780ttctcataat gtgagtcctc ttaaagctcc aattttagtc aaccaagaaa agtacaatac 15840catatctaag ctctatcctg tctttaatat agcggaggcc tataatacac tggttcctta 15900
ctaccaaatg ataggtaagc aaaaatttac aactatccaa ggtcctcctg gtagcggtaa 15960atctcattgt gttataggtt tgggtttgta ttaccctcag gcgagaatag tctacactgc 16020atgttctcat gcggctgtag acgctttatg tgaaaaagca gccaaaaact tcaatgttga 16080tagatgttca aggataatac ctcaaagaat cagagttgat tgttacacag gctttaagcc 16140taataacacc aatgcgcagt acttgttttg tactgttaat gctctaccag aagcaagttg 16200tgacattgtt gtagttgatg aggtctctat gtgtactaat tatgatctta gtgtcataaa 16260tagccgactg agttacaaac atattgttta tgttggagac ccacagcagc taccagctcc 16320tagaactttg attaataagg gtgtacttca accgcaggat tacaatgttg taaccaaaag 16380aatgtgcaca ctaggacctg atgtcttttt gcataaatgt tacaggtgcc cagctgaaat 16440tgttaagaca gtctctgcac ttgtttatga aaataaattt gtacctgtca acccagaatc 16500aaagcagtgc ttcaaaatgt ttgtaaaagg tcaggttcag attgagtcta actcttctat 16560aaacaacaag caactagagg ttgtcaaggc ctttttagca cataatccaa aatggcgtaa 16620agctgttttc atctcaccct ataatagtca aaattatgtt gctcggcgtc ttcttggttt 16680gcaaacgcaa actgtggatt ccgctcaggg tagtgagtat gattacgtca tctacacaca 16740gacctccgat acacagcatg ctactaatgt taacagattt aatgttgcca ttacgagagc 16800aaaggttggt atactttgta tcatgtgtga tagaactatg tatgagaatc ttgatttcta 16860tgaactcaaa gattcaaaga ttggtttaca agcaaaacct gaaacttgtg gtttatttaa 16920agattgttcg aagagcgaac aatacatacc acctgcttat gcaacgacat atatgagctt 16980atctgataat tttaagacaa gtgatggttt agctgttaac atcggtacaa aagatgttaa 17040atatgctaat gtcatctcat atatgggatt caggtttgaa gccaacatac caggctatca 17100cacactattc tgcacgcgag attttgctat gcgtaatgtt agagcatggc ttgggtttga 17160cgttgaaggt gcacatgtct gtggtgataa tgttggaact aatgtaccat tacagctggg 17220tttctcaaac ggtgtggatt ttgtagtgca aactgaagga tgtgttatta ctgaaaaagg 17280taatagcatt gaggttgtaa aagcacgagc accaccaggt gagcaatttg cacacttgat 17340tccgcttatg agaaagggtc aaccttggca cattgttaga cgccgtatag tgcagatggt 17400ctgtgactat tttgatggct tatcagacat tctgatcttt gtgctttggg ctggtggtct 17460tgaacttaca actatgagat actttgttaa aattggaaga ccacaaaaat gtgaatgcgg 17520caaaagtgca acttgttata gtagctctca atctgtttat gcttgcttca agcatgcatt 17580aggatgtgat tatttatata acccttactg cattgacata cagcaatggg gttacacagg 17640atctttgagc atgaatcatc atgaagtttg caacattcat agaaatgagc atgtagctag 17700tggtgatgct atcatgacta gatgtctcgc tatacatgac tgttttgtca aacgtgttga 17760ttggtcaatt gtgtaccctt ttattgacaa tgaagaaaag atcaataaag ctggtcgcat 17820agtgcagtca catgtcatga aagctgctct gaagattttt aatcctgctg caattcacga 17880tgtgggtaat ccaaaaggca tccgttgtgc tacaacacca ataccatggt tttgttatga 17940tcgtgatcct attaataaca atgttagatg tctggattat gactatatgg tacatggtca 18000aatgaatggt cttatgttat tttggaactg taatgtagac atgtacccag agttttcaat 18060tgtttgtaga tttgatactc gcactcgctc taaattgtct ttagaaggtt gtaatggtgg 18120tgcattgtat gttaataacc atgctttcca cacaccagct tatgatagaa gagcttttgc 18180taagcttaaa cctatgccat tcttttacta tgatgatagt aattgtgaac ttgttgatgg 18240gcaacctaat tatgtaccac ttaagtcaaa tgtttgcata acaaaatgca acattggtgg 18300tgctgtctgc aagaagcatg ctgctcttta cagagcgtat gttgaggatt acaacatttt 18360tatgcaggct ggttttacaa tatggtgtcc tcaaaacttt gacacctata tgctttggca 18420tggttttgtt aatagcaaag cacttcagag tctagaaaat gtggctttta atatcgttaa 18480gaaaggtgcc ttcaccggtt taaaaggtga cttaccaact gctgttattg ctgacaaaat 18540aatggtaaga gatggaccta ctgacaaatg tatttttaca aataagacta gtttacctac 18600aaatgtagct tttgagttat atgcaaaacg caaacttgga ctcacacctc cattaacaat 18660acttaggaat ttaggtgttg tcgcaacata taagtttgtg ttgtgggatt atgaagctga 18720acgtcctttc tcaaatttca ctaagcaagt gtgttcctac actgatcttg atagtgaagt 18780
tgtaacatgt tttgataata gtattgctgg ttcttttgag cgttttacta ctacaagaga 18840tgcagtgctt atttctaata acgctgtgaa agggcttagt gccattaaat tacaatatgg 18900ccttttgaat gatctacctg taagtactgt tggaaataaa cctgtcacat ggtatatcta 18960tgtgcgcaag aatggtgagt acgtcgaaca aatcgatagt tactatacac agggacgtac 19020ttttgaaacc ttcaaacctc gtagtacaat ggaagaagat tttcttagta tggatactac 19080actcttcatc caaaagtatg gtcttgagga ttatggtttt gaacacgttg tatttggaga 19140tgtctctaaa actaccattg gtggtatgca tcttcttata tcgcaagtgc gccttgcaaa 19200aatgggtttg ttttccgttc aagaatttat gaataattct gacagtacac tgaaaagttg 19260ttgtattaca tatgctgatg atccatcttc taagaatgtg tgcacttata tggacatact 19320cttggacgat tttgtgacta tcattaagag cttagatctt aatgttgtgt ccaaagttgt 19380ggatgtcatt gtagattgta aggcatggag atggatgttg tggtgtgaga attcacatat 19440taaaaccttc tatccacaac tccaatctgc tgaatggaat cccggctata gcatgcctac 19500actgtacaaa atccagcgta tgtgtctcga acggtgtaat ctctacaatt atggtgcaca 19560agtgaaatta cctgtaggca ttactactaa gttcgttaag tatactcagt tgtgtcaata 19620ccttaacact actacattgt gtgtaccaca caaaatgcgt gtattgcatt taggagctgc 19680tggtgcatct ggtgttgctc ctggtagtac tgtattaaga agatggttac cagatgatgc 19740catattggtt gataatgatt tgagagatta cgtttccgac gcagacttca gtgttacagg 19800tgattgtact agtctttaca tcgaagacaa gtttgatttg ctcgtctctg atttatatga 19860tggctccaca aaatcaattg acggtgaaaa cacgtcgaaa gatggtttct ttacttatat 19920taatggtttc attaaagaga aactgtcact tggtggatct gttgccatta aaatcacgga 19980atttagttgg aataaagatt tatatgaatt gattcaaaga tttgagtatt ggactgtgtt 20040ttgtacaagt gttaacacgt catcatcaga aggctttctg attggtatta actacttagg 20100accatactgt gacaaagcaa tagtagatgg aaatataatg catgccaatt atatattttg 20160gagaaactct acaattatgg ctctatcaca taactcagtc ctagacactc ctaaattcaa 20220gtgtcgttgt aacaacgcac ttattgttaa tttaaaagaa aaagaattga atgaaatggt 20280cattggatta ctaaggaagg gtaagttgct cattagaaat aatggtaagt tactaaactt 20340tggtaaccac ttcgttaaca caccatgaaa aaactatttg tggttttggt cgtaatgcca 20400ttgatttatg gagacaattt tccttgttct aaattgacta atagaactat aggcaaccag 20460tggaatctca ttgaaacctt ccttctaaac tatagtagta ggttaccacc taattcagat 20520gtggtgttag gtgattattt tcctactgta caaccttggt ttaattgcat tcgcaatgat 20580agtaatgacc tttatgttac actggaaaat cttaaagcat tgtattggga ttatgctaca 20640gaaaatatca cttggaatca cagacaacgg ttaaacgtag tcgttaatgg atacccatac 20700tccatcacag ttacaacaac ccgcaatttt aattctgctg aaggtgctat tatatgcatt 20760tgtaagggct caccacctac taccaccaca gaatctagtt tgacttgcaa ttggggtagt 20820gagtgcaggt taaaccataa gttccctata tgtccttcta attcagaggc aaattgtggt 20880aatatgctgt atggcctaca atggtttgca gatgaggttg ttgcttattt acatggtgct 20940agttaccgta ttagttttga aaatcaatgg tctggcactg tcacatttgg tgatatgcgt 21000gcgacaacat tagaagtcgc tggcacgctt gtagaccttt ggtggtttaa tcctgtttat 21060gatgtcagtt attatagggt taataataaa aatggtacta ccgtagtttc caattgcact 21120gatcaatgtg ctagttatgt ggctaatgtt tttactacac agccaggagg ttttatacca 21180tcagatttta gttttaataa ttggttcctt ctaactaata gctccacgtt ggttagtggt 21240aaattagtta ccaaacagcc gttattagtt aattgcttat ggccagtccc tagctttgaa 21300gaagcagctt ctacattttg ttttgagggt gctggctttg atcaatgtaa tggtgctgtt 21360ttaaataata ctgtagacgt cattaggttc aaccttaatt ttactacaaa tgtacaatca 21420ggtaagggtg ccacagtgtt ttcattgaac acaacgggtg gtgtcactct tgaaatttca 21480tgttatacag tgagtgactc gagctttttc agttacggtg aaattccgtt cggcgtaact 21540gatggaccac ggtactgtta cgtacactat aatggcacag ctcttaagta tttaggaaca 21600ttaccaccta gtgtcaagga gattgctatt agtaagtggg gccattttta tattaatggt 21660
tacaatttct ttagcacatt tcctattgat tgtatatctt ttaatttgac cactggtgat 21720agtgacgttt tctggacaat agcttacaca tcgtacactg aagcattagt acaagttgaa 21780aacacagcta ttacaaaggt gacgtattgt aatagtcacg ttaataacat taaatgctct 21840caaattactg ctaatttgaa taatggattt tatcctgttt cttcaagtga agttggtctt 21900gtcaataaga gtgttgtgtt actacctagc ttttacacac ataccattgt taacataact 21960attggtcttg gtatgaagcg tagtggttat ggtcaaccca tagcctcaac attaagtaac 22020atcacactac caatgcagga tcacaacacc gatgtgtact gtattcgttc tgaccaattt 22080tcagtttatg ttcattctac ttgcaaaagt gctttatggg acaatatttt taagcgaaac 22140tgcacggacg ttttagatgc cacagctgtt ataaaaactg gtacttgtcc tttctcattt 22200gataaattga acaattactt aacttttaac aagttctgtt tgtcgttgag tcctgttggt 22260gctaattgta agtttgatgt agctgcccgt acaagaacca atgagcaggt tgttagaagt 22320ttgtatgtaa tatatgaaga aggagacaac atagtgggtg taccgtctga taatagtggt 22380gtgcacgatt tgtcagtgct acacctagat tcctgcacag attacaatat atatggtaga 22440actggtgttg gtattattag acaaactaac aggacgctac ttagtggctt atattacaca 22500tcactatcag gtgatttgtt aggttttaaa aatgttagtg atggtgtcat ctactctgta 22560acgccatgtg atgtaagcgc acaagcagct gttattgatg gtaccatagt tggggctatc 22620acttccatta acagtgaact gttaggtcta acacattgga caacaacacc taatttttat 22680tactactcta tatataatta cacaaatgat aggactcgtg gcactgcaat tgacagtaat 22740gatgttgatt gtgaacctgt cataacctat tctaacatag gtgtttgtaa aaatggtgct 22800tttgttttta ttaacgtcac acattctgat ggagacgtgc aaccaattag cactggtaat 22860gtcacgatac ctacaaactt taccatatcc gtgcaagtcg aatatattca ggtttacact 22920acaccagtgt caatagactg ttcaagatat gtttgtaatg gtaaccctag gtgtaacaaa 22980ttgttaacac aatacgtttc tgcatgtcaa actattgagc aagcacttgc aatgggtgcc 23040agacttgaaa acatggaggt tgattccatg ttgtttgttt ctgaaaatgc ccttaaattg 23100gcatctgttg aagcattcaa tagttcagaa actttagacc ctatttacaa agaatggcct 23160aatataggtg gttcttggct agaaggtcta aaatacatac ttccgtccca taatagcaaa 23220cgtaagtatc gttcagctat agaggacttg ctttttgata aggttgtaac atctggttta 23280ggtacagttg atgaagatta taaacgttgt acaggtggtt atgacatagc tgacttagta 23340tgtgctcaat actataatgg catcatggtg ctacctggtg tggctaatgc tgacaaaatg 23400actatgtaca cagcatccct tgcaggtggt ataacattag gtgcacttgg tggaggcgcc 23460gtggctatac cttttgcagt agcagttcag gctagactta attatgttgc tctacaaact 23520gatgtattga acaaaaacca gcagattctg gctagtgctt tcaatcaagc tattggtaac 23580attacacagt catttggtaa ggttaatgat gctatacatc aaacatcacg aggtcttgct 23640actgttgcta aagcattggc aaaagtgcaa gatgttgtca acatacaagg gcaagcttta 23700agccacctaa cagtacaatt gcaaaataat ttccaagcca ttagtagttc tattagtgac 23760atttataata ggcttgacga attgagtgct gatgcacaag ttgacaggct gatcacagga 23820agacttacag cacttaatgc atttgtgtct cagactctaa ccagacaagc ggaggttagg 23880gctagtagac aacttgccaa agacaaggtt aatgaatgcg ttaggtctca gtctcagaga 23940ttcggattct gtggtaatgg tacacatttg ttttcactcg caaatgcagc accaaatggc 24000atgattttct ttcacacagt gctattacca acggcttatg aaactgtgac tgcttggcca 24060ggtatttgtg cttcagatgg tgatcgcact tttggacttg tcgttaaaga tgtccagttg 24120actttgtttc gtaatctaga tgacaagttc tatttgaccc ccagaactat gtatcagcct 24180agagttgcaa ctagttctga ctttgttcaa attgaagggt gcgatgtgct gtttgttaat 24240gcaactgtaa gtgatttgcc tagtattata cctgattata ttgatattaa tcagactgtt 24300caagacatat tagaaaattt tagaccaaat tggactgtac ctgagttgac atttgacatt 24360tttaacgcaa cctatttaaa cctgactggt gaaattgatg acttagaatt taggtcagaa 24420aagctacata acaccactgt agaacttgcc attctcattg acaacattaa caatacatta 24480gtcaatcttg aatggctcaa tagaattgaa acctatgtaa aatggccttg gtatgtgtgg 24540
ctactaatag gcttagtagt aatattttgc ataccattac tgctattttg ctgttgtagt 24600acaggttgct gtggatgcat aggttgttta ggaagttgtt gtcactctat atgtagtaga 24660agacaatttg aaaattacga accaattgaa aaagtgcacg tccattaaat ttaaaatgtt 24720aattctatca tctgctataa tagcagttgt ttctgctaga gaattttgtt aaggatgatg 24780aataaagtct ttaagaacta aacttacgag tcattacagg tcctgtatgg acattgtcaa 24840atccatttac acatccgtag atgctgtact tgacgaactt gattgtgcat actttgctgt 24900aactcttaaa gtagaattta agactggtaa attacttgtg tgtataggtt ttggtgacac 24960acttcttgct gctaaggata aagcatatgc taagcttggt ctctccatta ttgaagaagt 25020caatagtcat atagttgttt aatatcatta aacacacaaa acccaaagca ttaagtgtta 25080caaaacaatt aaagagagat tatagaaaaa ctgtcattct aaattccatg cgaaaatgat 25140tggtggactt tttcttagta ctctgagttt tgtaattgtt agtaaccatt ctattgttaa 25200taacacagca aatgtgcatc atatacaaca agaacgtgtt atagtacaac agcatcatgt 25260tgttagtgct agaacacaaa actattaccc agagttcagc atcgctgtac tctttgtatc 25320ttttctagct ttgtaccgta gtacaaactt taagacgtgt gtcggcatct taatgtttaa 25380gattttatca atgacacttt taggacctat gcttatagca tatggttact acattgatgg 25440cattgttaca acaactgtct tatctttaag atttgtctac ttagcatact tttggtatgt 25500taatagtagg tttgaattta ttttatacaa tacaacgaca ctcatgtttg tacatggcag 25560agctgcaccg tttatgagaa gttctcacag ctctatttat gtcacattgt atggtggcat 25620aaattatatg tttgtgaatg acctcacgtt gcattttgta gaccctatgc ttgtaagcat 25680agcaatacgt ggcttagctc atgctgatct aactgtagtt agagcagttg aacttctcaa 25740tggtgatttt atttatgtat tttcacagga gcccgtagtc ggtgtttaca atgcagcctt 25800ttctcaggcg gttctaaacg aaattgactt aaaagaagaa gaagaagacc atacctatga 25860cgtttcctag ggcattgact gtcatagatg acaatggaat ggtcattaac atcattttct 25920ggttcctgtt gataattata ttgatattac tttcaatagc attgctaaat ataattaagc 25980tatgcatggt gtgttgcaat ttaggaagga cagttattat tgttccagcg caacatgctt 26040acgatgccta taagaatttt atgcgaatta aagcatacaa ccccgatgga gcactccttg 26100cttgaactaa acaaaatgaa gattttgtta atattagcgt gtgtgattgc atgcgcatgt 26160ggagaacgct attgtgctat gaaatccgat acagatttgt catgtcgcaa tagtacagcg 26220tctgattgtg agtcatgctt caacggaggc gatcttattt ggcatcttgc aaactggaac 26280ttcagctggt ctataatatt gatcgttttt ataactgtgc tacaatatgg aagacctcaa 26340ttcagctggt tcgtgtatgg cattaaaatg cttataatgt ggctattatg gcccgttgtt 26400ttggctctta cgatttttaa tgcatactcg gaataccaag tgtccagata tgtaatgttc 26460ggctttagta ttgcaggtgc aattgttaca tttgtactct ggattatgta ttttgtaaga 26520tccattcagt tgtacagaag gactaagtct tggtggtctt tcaaccctga aactaaagca 26580attctttgcg ttagtgcatt aggaagaagc tatgtgcttc ctctcgaagg tgtgccaact 26640ggtgtcactc taactttgct ttcagggaat ttgtacgctg aagggttcaa aattgcaggt 26700ggtatgaaca tcgacaattt accaaaatac gtaatggttg cattacctag caggactatt 26760gtctacacac ttgttggcaa gaagttgaaa gcaagtagtg cgactggatg ggcttactat 26820gtaaaatcta aagctggtga ttactcaaca gaggcaagaa ctgataattt gagtgagcaa 26880gaaaaattat tacatatggt ataactaaac ttctaaatgg ccaaccaggg acaacgtgtc 26940agttggggag atgaatctac caaaacacgt ggtcgttcca attcccgtgg tcggaagaat 27000aataacatac ctctttcatt cttcaacccc ataaccctcc aacaaggttc aaaattttgg 27060aacttatgtc cgagagactt tgtacccaaa ggaataggta acagggatca acagattggt 27120tattggaata gacaaactcg ctatcgcatg gtgaagggcc aacgtaaaga gcttcctgaa 27180aggtggttct tctactactt aggtactgga cctcatgcag atgccaaatt taaagataaa 27240ttagatggag ttgtctgggt tgccaaggat ggtgccatga acaaaccaac cacgcttggt 27300agtcgtggtg ctaataatga atccaaagct ttgaaattcg atggtaaagt gccaggcgaa 27360tttcaacttg aagttaatca atcaagagac aattcaaggt cacgctctca atctagatct 27420
cggtctagaa atagatctca atctagaggc aggcaacaat tcaataacaa gaaggatgac 27480agtgtagaac aagctgttct tgccgcactt aaaaagttag gtgttgacac agaaaaacaa 27540cagcaacgct ctcgttctaa atctaaagaa cgtagtaact ctaagacaag agatactaca 27600cctaagaatg aaaacaaaca cacctggaag agaactgcag gtaaaggtga tgtgacaaga 27660ttttatggag ctagaagcag ttcagccaat tttggtgaca ctgacctcgt tgccaatggg 27720agcagtgcca agcattaccc acaactggct gaatgtgttc catctgtgtc tagcattctg 27780tttggaagct attggacttc aaaggaagat ggcgaccaga tagaagtcac gttcacacac 27840aaataccact tgccaaagga tgatcctaag actggacaat tccttcagca gattaatgcc 27900tatgctcgtc catcagaagt ggcaaaagaa cagagaaaaa gaaaatctcg ttctaaatct 27960gcagaaaggt cagagcaaga tgtggtacct gatgcattaa tagaaaatta tacagatgtg 28020tttgatgaca cacaggttga gataattgat gaggtaacga actaaacgag atgctcgtct 28080tcctccatgc tgtatttatt acagttttaa tcttactact aattggtaga ctccaattat 28140tagaaagact attacttaat cactctttca atcttaaaac tgtcaatgac tttaatatct 28200tatataggag tttagcagaa accagattac taaaagtggt gcttcgagta atctttctag 28260tcttactagg attttgctgc tacagattgt tagtcacatt aatgtaaggc aacccgatgt 28320ctaaaactgg tttttccgag gaattactgg tcatcgcgct gtctactctt gtacagaatg 28380gtaagcacgt gtaataggag gtacaagcaa ccctattgca tattaggaag tttagatttg 28440atttggcaat gctagattta gtaatttaga gaagtttaaa gatccgctac gacgagccaa 28500caatggaaga gctaacgtct ggatctagtg attgtttaaa atgtaaaatt gtttgaaaat 28560tttccttttg atagtgatac aaaaaaaa28588<210>2<211>21<212>DNA<213>豬傳染性胃腸炎病毒<400>2cctaggattt aaatcctaag g 21<210>3<211>27<212>DNA<213>豬傳染性胃腸炎病毒<400>3gcggccgcgc cggcgaggcc tgtcgac 27<210>4<211>6<212>DNA<213>豬傳染性胃腸炎病毒<400>4gtcgac6
<210>5<211>22<212>DNA<213>豬傳染性胃腸炎病毒<300>
<400>5gctagcccag gcgcgcggta cc 2權(quán)利要求
1.一種制備DNA的多步驟方法，其中將一種下列DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)中(a)包含全長拷貝RNA病毒基因組RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一個或多個gRNA片段的DNA，所述片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白；或者(c)與(a)或(b)序列的同源性至少為60％的DNA。
2.權(quán)利要求1的方法，其中克隆入BAC的DNA還包含編碼除了一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白或病毒非結(jié)構(gòu)蛋白以外的若干或所有蛋白的序列。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中克隆入BAC的DNA還包含編碼一種或若干種異源基因的序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述異源基因編碼至少一種適合誘導(dǎo)抗感染因子的免疫應(yīng)答的抗原、至少一種干擾感染因子復(fù)制的分子、抗感染因子的保護抗體、免疫調(diào)節(jié)蛋白、細胞因子、免疫增強劑或抗炎化合物。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少為5Kb。
6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少為15Kb。
7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少為25Kb。
8.權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中所述BAC包含控制克隆入BAC的DNA轉(zhuǎn)錄的序列。
9.權(quán)利要求1-8任一項的方法，其中一種所述病毒基因通過取代、缺失或加入核苷酸進行了修飾。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒向性控制基因已經(jīng)進行了修飾。
11.權(quán)利要求1-10任一項的方法，其中所述病毒向性控制基因已經(jīng)被另一種病毒的相應(yīng)基因取代。
12.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中克隆入BAC的DNA能夠轉(zhuǎn)錄為可裝配成病毒體的RNA。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述病毒體是感染性、減毒、復(fù)制缺陷型或滅活病毒。
14.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述病毒天然存在正鏈基因組。
15.權(quán)利要求1-14任一項的方法，其中所述病毒為微小RNA病毒、黃病毒、披膜病毒、冠形病毒、torovirus、arterivurs、calcivirus、彈狀病毒、副粘病毒、線狀病毒、博爾納病毒(bornavirus)、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒或呼腸孤病毒。
16.一種制備病毒RNA的多步驟方法，其中按照權(quán)利要求1-15任一項制備DNA，使制得的DNA在合適宿主細胞中表達或者使所述DNA與化學(xué)物質(zhì)、生物試劑和/或細胞提取物在允許所述DNA轉(zhuǎn)錄的條件下混合，最后分離出所述病毒RNA。
17.一種制備病毒體的多步驟方法，其中按照權(quán)利要求1-15任一項制備DNA，使制得的DNA在合適宿主細胞中表達或者使所述DNA與化學(xué)物質(zhì)、生物試劑和/或細胞提取物在允許所述DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的條件下混合，最后分離出所述病毒體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述病毒體隨后被滅活或殺死。
19.一種制備藥用組合物的多步驟方法，其中按照權(quán)利要求1-15任一項制備DNA、按照權(quán)利要求16制備病毒RNA或者按照權(quán)利要求17或18制備病毒體，然后使其與藥學(xué)上可接受的佐劑或載體混合。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述藥物為保護人類或動物抗感染性疾病的疫苗。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述藥物用于人類或動物的基因治療。
22.一種包含得自冠形病毒基因組RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列與所述冠形病毒天然序列的同源性至少為60％，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，其中所述DNA的一個片段能夠轉(zhuǎn)錄為可裝配為病毒體的RNA。
23.權(quán)利要求22的DNA，它還包含編碼異源基因的序列。
24.權(quán)利要求23的DNA，其中所述異源基因編碼至少一種適合誘導(dǎo)抗感染性因子免疫應(yīng)答的抗原、至少一種干擾感染性因子復(fù)制的分子、抗感染性因子的保護抗體、免疫調(diào)節(jié)蛋白、細胞因子、免疫增強劑或抗炎化合物。
25.權(quán)利要求22或24的DNA，其中所述片段的大小至少為25Kb
26.權(quán)利要求22-25任一項的DNA，它還包含來源于冠形病毒、編碼除了一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白或一種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白以外的若干或所有蛋白的序列。
27.權(quán)利要求22-26任一項的DNA，它還包含來源于冠形病毒、編碼冠形病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的序列。
28.權(quán)利要求22-27任一項的DNA，它還包含控制所述病毒gRNA轉(zhuǎn)錄的序列。
29.權(quán)利要求22-28任一項的DNA，其中所述控制病毒gRNA轉(zhuǎn)錄的序列是巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)啟動子。
30.權(quán)利要求22-29任一項的DNA，其中所述序列的3’末端側(cè)為聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生長激素(BGH)的終止序列和聚腺苷酸化序列。
31.權(quán)利要求22-30任一項的DNA，其中所述病毒序列得自以下病毒分離株豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BoCV)、犬冠形病毒(CCoV)、貓病毒(FCoV)、人冠形病毒(HCoV)、toroviruses或arterivurses。
32.權(quán)利要求22-31任一項的DNA，其中所述病毒體是感染性病毒、非感染性病毒或復(fù)制缺陷型病毒。
33.權(quán)利要求22-32任一項的DNA，其中來源于冠形病毒的結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)基因序列已經(jīng)通過對天然基因序列取代、缺失或添加一個或多個核苷酸進行了修飾。
34.權(quán)利要求22-33任一項的DNA，其中所述S、N或M基因序列已經(jīng)進行了修飾。
35.權(quán)利要求22-34任一項的DNA，其中已經(jīng)修飾了冠形病毒來源的S基因序列，從而獲得減毒病毒體。
36.權(quán)利要求22-35任一項的DNA，其中已經(jīng)修飾了冠形病毒來源的S基因序列，從而獲得向性不同于所述冠形病毒的病毒體。
37.一種載體，它包含權(quán)利要求22-36任一項的核酸。
38.權(quán)利要求37的載體，其中所述載體是質(zhì)?；蚣毦斯と旧w(BAC)。
39.一種宿主細胞，它包含權(quán)利要求22-38任一項的核酸。
40.一種大腸桿菌菌株，它保藏于西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CECT 5265。
41.一種制備重組病毒體或重組病毒RNA的多步驟方法，其中將權(quán)利要求22-38任一項的DNA導(dǎo)入宿主細胞中，在允許表達所述DNA的條件下培養(yǎng)包含所述DNA的宿主細胞，最后回收所述重組病毒體或重組病毒RNA。
42.一種制備重組病毒體或重組病毒RNA的方法，其中使權(quán)利要求22-38任一項的DNA與化學(xué)物質(zhì)、生物試劑和/或細胞提取物在允許所述DNA轉(zhuǎn)錄的條件下混合，最后回收所述重組病毒體或重組病毒RNA。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中所述DNA是權(quán)利要求23-38任一項的DNA。
44.一種病毒體，它是應(yīng)用權(quán)利要求41-43任一項的方法獲得的病毒體。
45.權(quán)利要求44的病毒體，其中所述病毒體是感染性、減毒、復(fù)制缺陷型或滅活病毒。
46.權(quán)利要求44或45的病毒體，其中所述病毒體包含修飾的S、M或N基因。
47.權(quán)利要求46的病毒體，其中對所述S基因修飾獲得減毒病毒
48.權(quán)利要求46的病毒體，其中對所述S基因修飾獲得向性不同的病毒體。
49.一種病毒RNA，它是應(yīng)用權(quán)利要求41-43的方法獲得的病毒RNA。
50.一種藥用制劑，它包含權(quán)利要求22-38任一項的核酸、權(quán)利要求39或40的宿主細胞、權(quán)利要求41-48任一項的病毒體或權(quán)利要求49的病毒RNA。
51.一種能夠保護動物或人類抗感染性因子引起的疾病的疫苗，該疫苗包含權(quán)利要求22-38任一項的核酸、權(quán)利要求39或40的宿主細胞、權(quán)利要求41-48任一項的病毒體或權(quán)利要求49的病毒RNA。
52.權(quán)利要求51的疫苗，其中所述核酸包含編碼至少一種適合誘導(dǎo)抗所述感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原的序列、編碼至少一種干擾所述感染性因子復(fù)制的基因的序列或者編碼抗所述感染性因子的保護抗體的序列。
53.權(quán)利要求51或52的疫苗，其中所述病毒體載體表達至少一種復(fù)制干擾分子、能夠誘導(dǎo)抗在呼吸道粘膜或腸道粘膜或其它組織中繁殖的不同感染性因子的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和/或粘膜免疫應(yīng)答的抗原。
54.一種能夠保護動物或人類抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，它包含一種以上權(quán)利要求22-38任一項的核酸、權(quán)利要求39或40的宿主細胞、權(quán)利要求41-48任一項的病毒體或者權(quán)利要求49的病毒RNA，其中每一種表達一種適合誘導(dǎo)抗各所述感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原、一種干擾分子或一種抗各所述感染性因子的保護抗體。
55.權(quán)利要求51-54任一項的疫苗，它還包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
56.一種制備權(quán)利要求22-38任一項的DNA的多步驟方法，其中在表達啟動子下將來源于冠形病毒的干擾缺陷型基因組克隆入BAC載體，然后再在所述缺陷型基因組中插入缺失的序列。
57.權(quán)利要求56制備DNA的方法，其中在重新插入所述DNA之前鑒定所述病毒基因組中的毒性序列。
58.權(quán)利要求56或57制備DNA的方法，其中所述病毒基因組中的毒性序列是完成所述基因組時重新插入的最后序列。
59.一種得自冠形病毒的感染性克隆，它包含在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列下克隆的冠形病毒基因組RNA(gRNA)的全長拷貝互補DNA(cDNA)。
60.權(quán)利要求59的感染性克隆，其中所述冠形病毒為豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的分離株。
61.權(quán)利要求59或60的感染性克隆，其中所述啟動子是巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)表達啟動子。
62.權(quán)利要求59-61任一項的感染性克隆，其中所述全長cDNA的3’末端側(cè)為聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生長激素(BGH)的終止序列和聚腺苷酸化序列。
63.權(quán)利要求59-62任一項的感染性克隆，其中用細菌人工染色體(BAC)克隆所述感染性cDNA。
64.一種獲得權(quán)利要求59-63任一項的感染性克隆的方法，該方法包括用冠形病毒gRNA構(gòu)建全長cDNA以及裝配轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。
65.權(quán)利要求64的方法，其中構(gòu)建冠形病毒gRNA的全長cDNA包括(i)用BAC在表達啟動子下克隆得自所述冠形病毒的干擾缺陷型基因組；(ii)完成缺失所述干擾缺陷型基因組，重建相對于所述感染性gRNA的缺失序列；(iii)鑒定對在其中進行克隆的細菌具有毒性的序列，取出毒性序列，恰好轉(zhuǎn)染真核細胞之前插入所述毒性序列以獲得相當于冠形病毒gRNA的cDNA克隆。
66.一種重組病毒載體，它包含權(quán)利要求59-63任一項的感染性克隆或者按照權(quán)利要求58或59任一項的方法獲得的感染性克隆，所述感染性克隆經(jīng)修飾含有一種異源核酸，所述異源核酸在允許其表達的條件下插入所述感染性克隆。
67.權(quán)利要求60的載體，其中在編碼目的基因產(chǎn)物的基因和基因片段之間選擇所述異源核酸。
68.一種制備目的產(chǎn)物的方法，該方法包括在允許所述異源核酸表達和目的產(chǎn)物回收的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求60或61任一項的病毒載體的宿主細胞。
69.一種制備修飾重組冠形病毒的方法，所述修飾重組冠形病毒在相當于冠形病毒基因組的cDNA序列中包含異源核酸，所述方法包括將權(quán)利要求60或61任一項的病毒載體導(dǎo)入宿主細胞中，在允許所述病毒載體表達和復(fù)制以及允許由所述修飾重組冠形病毒獲得的病毒體回收的條件下培養(yǎng)包含所述病毒載體的所述宿主細胞。
70.一種能夠保護動物抗感染性因子引起的感染的疫苗，它包含(i)至少一種權(quán)利要求60或61的病毒載體，該病毒載體表達至少一種適合誘導(dǎo)抗所述感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原、或者表達一種抗所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
71.權(quán)利要求64的疫苗，其中所述病毒載體表達至少一種能夠誘導(dǎo)抗不同感染性因子的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和/或粘膜免疫應(yīng)答的抗原，所述感染性因子在呼吸道粘膜或腸道粘膜中繁殖。
72.一種能夠保護動物抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，它包括(i)權(quán)利要求60或61的病毒載體，該病毒載體表達適合誘導(dǎo)抗所述感染因子的免疫應(yīng)答的抗原、或抗所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
73.一種能夠保護動物抗一種以上感染性因子引起的感染的多價疫苗，它包含(i)一種以上權(quán)利要求60或61的病毒載體，其中每種病毒載體表達適合誘導(dǎo)抗各所述感染性因子的免疫應(yīng)答的抗原或者抗各所述感染性因子的保護抗體，以及任選包含(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
74.一種制備重組冠形病毒的方法，該方法包括將權(quán)利要求59-63任一項的感染性克隆或者按照權(quán)利要求64或65任一項方法獲得的感染性克隆導(dǎo)入宿主細胞中，在允許所述感染性克隆表達和復(fù)制的條件下培養(yǎng)包含所述感染性克隆的所述宿主細胞，最后回收由包含所述冠形病毒完整基因組的重組冠形病毒獲得的病毒體。
全文摘要
本發(fā)明涉及多步驟制備DNA的方法，該方法包括將一種下列DNA克隆入細菌人工染色體(BAC)(a)包含基因組RNA (gRNA)或RNA病毒的全長拷貝的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一個或若干個gRNA片段的DNA，所述gRNA片段編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白；或者(c)與(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。此外，本發(fā)明還提供包含冠形病毒基因組RNA(gRNA)來源的序列的DNA，所述序列與冠形病毒天然序列的同源性至少為60％，而且編碼RNA依賴性RNA聚合酶和至少一個結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，其中所述DNA的一個片段能夠轉(zhuǎn)錄為可裝配為病毒體的RNA。本發(fā)明進一步公開了應(yīng)用所述核酸制備病毒RNA或病毒體以及包含所述DNA、病毒RNA或病毒體的藥用制劑。
文檔編號C12N1/21GK1616670SQ200410078978
公開日2005年5月18日 申請日期2000年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月3日
發(fā)明者桑切斯 L·恩朱爾尼斯 申請人:康斯喬最高科學(xué)研究公司