專利名稱：一種促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)方法，特別是涉及一種促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的日趨短缺，儲(chǔ)量豐富的天然氣的開發(fā)利用越來越受到人們的重視。甲烷是天然氣的主要組分，也可以再生資源為原料通過發(fā)酵獲得廉價(jià)的甲烷，甲烷的資源化利用技術(shù)的研發(fā)具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。甲醇是天然氣主要的化工產(chǎn)品之一，它既是一種清潔的能源，又是重要的基礎(chǔ)化工原料，將氣態(tài)的甲烷轉(zhuǎn)化成液態(tài)的甲醇，不僅可以降低輸送成本，而且通過甲醇可以實(shí)現(xiàn)甲烷的更廣泛應(yīng)用。
傳統(tǒng)的兩步法甲烷轉(zhuǎn)化制備甲醇，設(shè)備投資高、工藝復(fù)雜、能耗大、單程轉(zhuǎn)化率低，將甲烷直接轉(zhuǎn)化生成甲醇則是最理想的方式，一直受到國際上的關(guān)注。但甲烷分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，C-H鍵能很高，活化甲烷需要較高的溫度，在高溫下甲醇又極易深度氧化，很難找到一種化學(xué)催化劑既能高效轉(zhuǎn)化甲烷，又具有高的甲醇選擇性。如果能在溫和條件下將甲烷直接轉(zhuǎn)化為含氧化合物，特別是甲醇，就可大大提高甲烷作為原材料的利用率。因此，找尋適宜的轉(zhuǎn)化方法已成為多年來學(xué)術(shù)界、工業(yè)上以及各政府部門全面展開的全球性研究課題。
自然界中分布廣泛的甲烷氧化菌以甲烷作為唯一的生長碳源和能源，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌能利用多碳化合物作為碳源。甲烷氧化菌利用甲烷的第一步是在甲烷單加氧酶(Methane monooxgenase，MMO)的作用下將甲烷直接轉(zhuǎn)化為甲醇，再在其它酶的作用下氧化甲醇為甲醛，甲酸及二氧化碳和水，其代謝途徑如圖1所示。甲烷單加氧酶是生物體系中唯一能夠在常溫常壓下選擇性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有轉(zhuǎn)化效率高，選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，并且能在常溫常壓下進(jìn)行，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，生物催化甲烷制甲醇是實(shí)現(xiàn)天然氣生產(chǎn)甲醇的一種理想的工業(yè)化生產(chǎn)方式。
甲烷單加氧酶是甲烷氧化菌利用甲烷的關(guān)鍵酶，能夠利用空氣作為氧化劑將甲烷直接氧化為甲醇。MMO不僅可以催化甲烷部分氧化合成甲醇，也可以催化C1～C20烷烴化合物羥基化和C2～C10烯烴化合物的環(huán)氧化。生物催化甲烷制甲醇可以采用純酶MMO或用含酶細(xì)胞兩種形式進(jìn)行催化。由于甲烷單加氧酶氧化甲烷成甲醇的過程需要NADH，其價(jià)格昂貴，體外再生技術(shù)不成熟，并且，MMO酶的純化過程復(fù)雜，純酶穩(wěn)定性極差，而利用含酶細(xì)胞催化反應(yīng)可以避免純酶MMO體系穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，并且容易實(shí)現(xiàn)輔因子NADH在胞內(nèi)的再生循環(huán)。在甲烷氧化菌中，MMO以兩種形式存在，一種是以可溶性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，稱為可溶性甲烷單加氧酶(Solublemethane monooxgenase，sMMO)；另一種是以顆粒形式存在于細(xì)胞膜上，稱為顆粒性甲烷單加氧酶(Particle methane monooxygenase，pMMO)。其中，在所有的甲烷氧化菌中都存在pMMO基因，少數(shù)菌如Methylosinus trichosporium OB3b，Methylococcuscapsulatus Bath等中pMMO和sMMO基因都存在。銅離子濃度是調(diào)控pMMO和sMMO基因的表達(dá)的開關(guān)，高銅離子濃度條件下，pMMO基因表達(dá)；低銅離子濃度下sMMO基因表達(dá)。
甲烷氧化菌氧化甲烷合成甲醇是一個(gè)非常復(fù)雜的微生物代謝過程，而且生成的甲醇會(huì)被甲烷氧化菌中的甲醇脫氫酶(Methanol dehydrogenase，MDH)進(jìn)一步氧化為甲醛，再在其它酶系的作用下最終轉(zhuǎn)化為CO2和H2O。研究表明，EDTA、環(huán)丙醇、高濃度磷酸鹽等能抑制甲醇脫氫酶的活性，甲酸鈉可作為外源電子給體，又可作為產(chǎn)物反饋抑制甲醇的繼續(xù)氧化，通過以上物質(zhì)的添加可以實(shí)現(xiàn)甲醇的胞外積累。
在甲烷氧化菌的生長繁殖過程中，一方面由于生成的甲醇會(huì)被甲醇脫氫酶進(jìn)一步氧化為甲醛，而且高濃度的甲醇會(huì)對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用；另一方面，如果在細(xì)胞生長過程中加入環(huán)丙醇或高濃度的磷酸鹽抑制甲醇脫氫酶活性，合成細(xì)胞物質(zhì)包括甲烷單加氧酶的途徑被阻斷，酶量有限，不能得到大量的甲醇。因此，甲烷生物轉(zhuǎn)化制甲醇一般需要兩步進(jìn)行首先進(jìn)行甲烷氧化菌的高密度培養(yǎng)，然后在培養(yǎng)液中加入環(huán)丙醇或高濃度的磷酸鹽抑制甲醇脫氫酶的活性，使甲烷氧化成的甲醇得到最大限度的積累，從而實(shí)現(xiàn)甲烷的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甲醇。
甲烷氧化菌生長速率慢、所得細(xì)胞濃度低是限制甲烷氧化菌工業(yè)化使用的主要因素，實(shí)現(xiàn)甲烷氧化菌的大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)是甲烷生物催化制甲醇的前提，其重要性在于1)可以采用整細(xì)胞快速進(jìn)行甲烷、烷烴及烯烴的部分氧化生產(chǎn)醇和環(huán)氧化物；2)利用天然氣快速生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白；3)生產(chǎn)高表達(dá)MMO用于結(jié)構(gòu)與功能的研究(ParkS.，Shah N.N.，Taylor R.T.，and Droege M.W.，Biotechnol.Bioeng.1992，40151-157)。
研究表明，增加鐵離子、減少銅離子和改變培養(yǎng)氣體(甲烷/空氣)的比例能促進(jìn)甲烷氧化菌的比生長速率；添加維生素類外源生長因子可較大地提高M(jìn)MO酶活性和sMMO的生成量。其中，Shah等采用間歇式和連續(xù)式的細(xì)胞培養(yǎng)方式在5L普通發(fā)酵罐中對II型甲烷氧化菌(M.trichosporium OB3b)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)sMMO或pMMO，對生長溫度、pH，及磷酸鹽、硝酸鹽和亞鐵離子濃度等培養(yǎng)成分條件進(jìn)行了優(yōu)化，最大細(xì)胞濃度可以達(dá)到18g干細(xì)胞/L發(fā)酵液，最大比生長速率為0.08h-1(Park S.，HannaM.L.，Taylor R.T.，Droege M.L.，Biotechnol.Bioeng.，1991，38423-433；Shah N.N.，Hanna M.L.，Taylor R.T.，Biotechnol.Bioeng.，1996，49161-171)。尉遲力等(尉遲力，沈潤南，夏春谷，李樹本，外源生長因子對甲烷單加氧酶活性和穩(wěn)定性的影響，分子催化，1997，11(2)89-93)研究了添加維生素B12等不同外源生長因子后，甲烷氧化細(xì)菌M.trichosporium 3011的MMO活性和穩(wěn)定性的變化，以及sMMO生成量的影響。另外，Park等研究表明，在氣相中加入少量的二氧化碳(CO2)或在液相中加入碳酸氫鈉(NaHCO3)可以縮短甲烷氧化菌M.trichosporium OB3b的生長遲滯期，提高細(xì)胞濃度(Park S.，Hanna M.L.，Taylor R.T.，Droege M.L.，Batch cultivation ofMethylosinus trichosporium OB3b.IProduction of soluble methane monooxygenase.Biotechnol.Bioeng.，1991，38423-433)。這些方法雖然在一定程度上能提高細(xì)胞生長的比生長速率和培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，但是細(xì)胞濃度仍然較低，一般在10g細(xì)胞/L發(fā)酵液以下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法。
本發(fā)明所提供的促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法，是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲烷氧化菌，其中，所述培養(yǎng)基中添加有有機(jī)酸。
所述有機(jī)酸通常為三羧酸循環(huán)中的有機(jī)酸，如蘋果酸、檸檬酸、丁二酸、順丁烯二酸、草酰乙酸、丙酮酸或異檸檬酸等中的一種或幾種。有機(jī)酸在培養(yǎng)基中濃度一般為5-400mmol/L，優(yōu)選為10-130mmol/L。
有機(jī)酸可以先直接加入到培養(yǎng)基中然后培養(yǎng)細(xì)胞，也可以在甲烷氧化菌的培養(yǎng)過程中添加到培養(yǎng)液中，其添加方式有一次添加到初始培養(yǎng)基、補(bǔ)料分批添加或連續(xù)添加等。
所述甲烷氧化菌以II型甲烷氧化菌為佳，如甲烷氧化菌(Methylosinustrichosporium)OB3b等。
應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)甲烷氧化菌可以采用分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)等方式，均可以提高培養(yǎng)液中甲烷氧化菌的細(xì)胞密度。
本發(fā)明采用向培養(yǎng)基中添加三羧酸循環(huán)中有機(jī)酸的方式，巧妙地通過對甲烷氧化菌生長代謝流的調(diào)控，強(qiáng)化其三羧酸循環(huán)過程，促進(jìn)甲烷氧化菌的生長代謝，從而提高細(xì)胞的比生長速率和培養(yǎng)液中細(xì)胞密度，細(xì)胞密度一般可以達(dá)到相同條件下不加有機(jī)酸的3～4倍。本發(fā)明方法簡單，適于進(jìn)行甲烷氧化菌大規(guī)模高密度培養(yǎng)，能達(dá)到甲烷生物轉(zhuǎn)化制甲醇的要求，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1為甲烷氧化菌的甲烷代謝圖；
圖2為不同有機(jī)酸的加入對M.trichosporium OB3b細(xì)胞濃度的影響；圖3為檸檬酸和蘋果酸的添加對M.trichosporium OB3b生長的影響；圖4為檸檬酸添加時(shí)間對M.trichosporium OB3b生長的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明進(jìn)行甲烷氧化菌細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為NMS培養(yǎng)基，其組成如下(g/L)KH2PO40.58；Na2HPO4·12H2O 2.17；NaNO30.85；K2SO40.17；MgSO4·7H2O 0.037；FeSO4·7H2O 0.012；微量元素溶液2ml，pH7.0。
微量元素溶液組成如下(mg/L)ZnSO4·7H2O 0.287；MnSO4·7H2O 0.223；H3BO30.062；Na2MoO4·2H2O 0.048；CoCl2·6H2O 0.048；KI 0.083；CaCl2·2H2O 3.5，pH7.0。
實(shí)施例1、在初始培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸對M.trichosporium OB3b細(xì)胞濃度的影響在70ml的玻璃培養(yǎng)瓶分裝10ml NMS培養(yǎng)基，分別加入濃度為130mmol/L的順丁烯二酸，丁二酸，檸檬酸和蘋果酸，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，接入M.trichosporium OB3b種子培養(yǎng)液，接種量為10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)。以相同條件下不加有機(jī)酸培養(yǎng)作為對照。接種4d后測定細(xì)胞濃度，細(xì)胞濃度以660nm波長下的光吸收表示(OD660)，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，加入順丁烯二酸，琥珀酸，檸檬酸和蘋果酸對于M.trichosporium OB3b的細(xì)胞生長具有明顯的促進(jìn)作用，其中以添加檸檬酸效果最好，其OD660為0.523，是對照(OD660為0.207)的2.5倍。
實(shí)施例2、在初始培養(yǎng)基中添加檸檬酸和蘋果酸對M.trichosporium OB3b生長的影響在70ml的玻璃培養(yǎng)瓶分裝10ml NMS培養(yǎng)基，分別加入130mmol/L檸檬酸和0.13mol/L蘋果酸，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，接入M.trichosporium OB3b種子培養(yǎng)液，接種量為10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)。以相同條件下不加有機(jī)酸培養(yǎng)作為對照。測定細(xì)胞濃度隨時(shí)間的變化曲線，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加檸檬酸和蘋果酸可以顯著促進(jìn)M.trichosporium OB3b的細(xì)胞生長，當(dāng)添加檸檬酸時(shí)，最大比生長速率和細(xì)胞濃度(OD660)分別為0.24h-1和0.698，為對照的3倍。
實(shí)施例3、在初始培養(yǎng)基中添加不同濃度檸檬酸對M.trichosporium OB3b生長的影響在70ml的玻璃培養(yǎng)瓶分裝10ml NMS培養(yǎng)基，分別加入0、5和400mmol/L檸檬酸，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，接入M.trichosporium OB3b種子培養(yǎng)液，接種量為10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后測定細(xì)胞濃度，其OD660分別為0.207、0.567和0.54，結(jié)果表明，檸檬酸濃度在5-400mmol/L均可以促進(jìn)甲烷氧化菌的生長。
實(shí)施例4、在不同對數(shù)生長期添加檸檬酸對M.trichosporium OB3b生長的影響在70ml的玻璃培養(yǎng)瓶分裝10ml NMS培養(yǎng)基，接入M.trichosporium OB3b種子培養(yǎng)液，接種量為10％，在30℃、130rpm水浴旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)。在不同對數(shù)生長期向培養(yǎng)液中加入檸檬酸(30mmol/L)，考察檸檬酸的加入時(shí)間對M.trichosporium OB3b生長的影響。以不加檸檬酸作為對照。測定細(xì)胞濃度，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，在對數(shù)生長期添加檸檬酸對該菌生長的促進(jìn)作用均優(yōu)于在初始培養(yǎng)基中添加。
實(shí)施例5、添加草酰乙酸和異檸檬酸對M.trichosporium OB3b的影響在70ml的玻璃培養(yǎng)瓶分裝10ml NMS培養(yǎng)基，分別加入濃度為133mmol/L的草酰乙酸和異檸檬酸，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，接入M.trichosporium OB3b種子培養(yǎng)液，接種量為10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)。以相同條件下不加有機(jī)酸培養(yǎng)作為對照。接種4d后測定細(xì)胞濃度，OD660值分別為0.365和0.420，對照OD660值為0.207，結(jié)果表明，草酰乙酸和異檸檬酸的添加能促進(jìn)該菌的生長。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法，是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲烷氧化菌，其特征在于所述培養(yǎng)基中添加有有機(jī)酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述有機(jī)酸為蘋果酸、檸檬酸、丁二酸、順丁烯二酸、草酰乙酸或異檸檬酸中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機(jī)酸在所述培養(yǎng)基中濃度為5-400mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述有機(jī)酸在所述培養(yǎng)基中濃度為10-130mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機(jī)酸的添加方式為一次添加到初始培養(yǎng)基、補(bǔ)料分批添加或連續(xù)添加。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述有機(jī)酸的添加方式為一次添加到初始培養(yǎng)基、補(bǔ)料分批添加或連續(xù)添加。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述甲烷氧化菌為II型甲烷氧化菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述II型甲烷氧化菌為甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法，涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的促進(jìn)甲烷氧化菌生長的方法，是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲烷氧化菌，其中，所述培養(yǎng)基中添加有有機(jī)酸。本發(fā)明采用向培養(yǎng)基中添加三羧酸循環(huán)中有機(jī)酸的方式，巧妙地通過對甲烷氧化菌生長代謝流的調(diào)控，強(qiáng)化其三羧酸循環(huán)過程，促進(jìn)甲烷氧化菌的生長代謝，從而提高細(xì)胞的比生長速率和培養(yǎng)液中細(xì)胞密度，細(xì)胞密度一般可以達(dá)到相同條件下不加有機(jī)酸的3～4倍。本發(fā)明方法簡單，適于進(jìn)行甲烷氧化菌大規(guī)模高密度培養(yǎng)，能達(dá)到甲烷生物轉(zhuǎn)化制甲醇的要求，也可用于催化C
文檔編號(hào)C12N1/38GK1587382SQ20041007798
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者羅明芳, 吳昊, 邢新會(huì) 申請人:清華大學(xué)