專利名稱：中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備抗腫瘤和抗衰老的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
文昌魚，魚肉紅色，晶瑩、半透明狀。身體細(xì)長象一把外科手術(shù)刀，所以西歐人叫它兩尖魚或海茅。文昌魚共有29個(gè)種。分布在熱帶、亞熱帶的8～16米的淺水海域中，特別在北緯48°至南緯40°之間的環(huán)形地區(qū)。雖然文昌魚不屬于脊椎動(dòng)物，但它胚胎發(fā)生出現(xiàn)的脊索、神經(jīng)管及咽鰓裂表現(xiàn)了脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生的共性，因而在動(dòng)物進(jìn)化樹上占據(jù)著及其重要的地位。因此，時(shí)至今日，當(dāng)代胚胎學(xué)仍把文昌魚的胚胎發(fā)生作為脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生的基本模式。
過氧化物還原酶(Peroxiredoxins Prx)是生物體內(nèi)一類抗氧化蛋白酶。自從1988年K·Kim在釀酒酵母里發(fā)現(xiàn)過氧化物還原酶至今的十余年中，過氧化物還原酶越來越受到人們的廣泛關(guān)注。過氧化物還原酶在體內(nèi)主要是通過還原過氧化氫和一些過氧化氫物()來實(shí)現(xiàn)自己的抗氧化作用。過氧化物還原酶屬于過氧化物酶家族。過氧化物酶的氫供體(hydrogen donor)目前發(fā)現(xiàn)的主要有谷胱甘肽、硫氧還蛋白、NADH、NADPH。過氧化物還原酶與其他過氧化物酶比較最明顯的特征就是絕大部分的過氧化物還原酶在體內(nèi)是以硫氧還蛋白作為唯一的氫供體。正因?yàn)槿绱?，過氧化物還原酶也被稱為硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxin Peroxidase，TPx)。但是并不是所有的過氧化物還原酶都是以硫氧還蛋白作為唯一氫供體。
過氧化物還原酶普遍存在于多數(shù)生物體內(nèi)。研究已經(jīng)證明酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲甚至真細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)都含有該酶，說明過氧化物還原酶是一個(gè)非常重要的基因。過氧化物還原酶主要位于細(xì)胞溶質(zhì)中，在線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和細(xì)胞核內(nèi)也均有少量分布。實(shí)驗(yàn)證明過氧化物還原酶在生物體內(nèi)大量表達(dá)。許多生物體含有不止一種過氧化物還原酶的同型異構(gòu)體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞里至少已有六種過氧化物還原酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。
過氧化物還原酶在生物體內(nèi)的主要功能包括兩個(gè)方面一是細(xì)胞脫毒能力和抵抗氧化壓力；二是調(diào)節(jié)由過氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。根據(jù)過氧化物還原酶所具有的活性半胱氨酸殘基的數(shù)目可以把其分為兩大類1-Cys和2-Cys過氧化物還原酶。從結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制的進(jìn)一步研究得出的結(jié)果我們還可以把2-Cys過氧化物還原酶分為兩類典型和非典型的2-Cys過氧化物還原酶。典型的2-Cys過氧化物還原酶，由于這一類酶在體內(nèi)只依靠硫氧還蛋白作為它的唯一的氫供體，所以我們又將它稱作硫氧還蛋白過氧化物酶(TPx)。
研究表明，寄生蟲的過氧化物還原酶在寄生蟲抵抗宿主的免疫反應(yīng)和氧化壓力起著重要的作用；而在哺乳動(dòng)物特別是人，該蛋白與疾病，信號(hào)傳導(dǎo)和免疫反應(yīng)有著緊密聯(lián)系。隨著對(duì)過氧化物還原酶研究的不斷深入，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到它在生物體內(nèi)的重要性。在寄生蟲的防治和抗腫瘤抗衰老藥物的研究中，該蛋白有著良好的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其編碼的蛋白Bbt-TPx。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因的蛋白在制備抗腫瘤和抗衰老的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明用RT-PCR的方法，從中國青島文昌魚卵巢總RNA中分離得到的硫氧還蛋白過氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本發(fā)明基因編碼的蛋白(重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶Bbt-TPx)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；該蛋白等電點(diǎn)為7.30，分子量為22150道爾頓。
該蛋白Bbt-TPx是通過表達(dá)載體pET-32a(+)M-TPx在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)的。
所述表達(dá)載體pET-32a(+)M-TPx是在質(zhì)粒pET-32a(+)M(購自Nobogen公司)的多克隆位點(diǎn)中間插入His的親和標(biāo)記位點(diǎn)和TPX基因序列的高效表達(dá)載體，該系統(tǒng)使TPx基因在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)600mg/L。
本發(fā)明所選擇的文昌魚屬于中國青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，采自中國山東省青島市沙子口水域。
中國青島文昌魚卵巢cDNA文庫的構(gòu)建首先分離文昌魚卵巢，提取總RNA。取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈產(chǎn)物。再取cDNA用于連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液分別涂板，其余用于搖總庫菌落。從平板中挑取單克隆保種本發(fā)明通過對(duì)以上重組克隆大規(guī)模序列測(cè)定，從中得到了1個(gè)新的編碼中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶的克隆，命名為TPx(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因編碼198個(gè)氨基酸的成熟肽(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等電點(diǎn)為7.30，分子量為22，150道爾頓，具有典型的硫氧還蛋白過氧化物酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征，分子內(nèi)具有兩個(gè)活性半胱氨酸功能域。
本發(fā)明通過設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，將編碼中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶的新基因TPx用PCR方法從T載體上擴(kuò)增出來，克隆到原核融合表達(dá)載體pET-32a(+)M上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)M-TPx，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS。此表達(dá)載體(pET-32a(+)M-TPx)以T7為啟動(dòng)子，以可溶的形式表達(dá)，其N端具有6×His結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。通過對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，重組Bbt-TPx蛋白的表達(dá)量可達(dá)到600mg/L，并且基本上處于可溶狀態(tài)。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組Bbt-TPx蛋白的純化條件，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到純度較高的目的蛋白，目的蛋白經(jīng)進(jìn)一步的SP-Sepharose陽離子交換層析，可得到純度在95％以上的重組Bbt-TPx蛋白。
試驗(yàn)證明，本發(fā)明獲得的重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶具有生物活性。該重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶具有抗氧化作用。重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶具有還原H2O2的活性。當(dāng)超螺旋DNA或?qū)α虼蓟舾械牡鞍自獾酵饨绲难趸饔闷茐臅r(shí)，重組的Bbt-TPx蛋白對(duì)其具有明顯的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的重組硫氧還蛋白過氧化物酶可用于制備抗腫瘤和抗衰老的藥物。
由本發(fā)明的含有文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)M-TPx經(jīng)BaM HI/Xho I雙酶切，可得到610bp的片段，即為文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶TPx編碼序列。
本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)/pLysS菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。


圖1為本發(fā)明的文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶和其他物種的該蛋白的比較結(jié)果，其中加粗和陰影表示相同；加邊框表示為該蛋白的功能域。
圖2為青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因TPx的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。1TPx基因PCR產(chǎn)物；2沒加模板的空白對(duì)照；M1Kb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3為pET32a(+)M-TPx重組表達(dá)載體的酶切和PCR鑒定。M1Kb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1PET32a(+)M-TPx重組表達(dá)載體的Bam HI和Xho I雙酶切；2PET32a(+)M-TPx重組表達(dá)載體的PCR鑒定。
圖4為重組Bbt-TPx蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析電泳圖。M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1重組Bbt-TPx蛋白在總菌中蛋白表達(dá)量；2重組Bbt-TPx蛋白在上清中蛋白表達(dá)量；3重組Bbt-TPx蛋白的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl洗脫峰；4重組Bbt-TPx蛋白的50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl，100mmol/L咪唑洗脫峰；5重組Bbt-TPx蛋白的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl，150mmol/L咪唑洗脫峰；6重組Bbt-TPx蛋白的50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl，300mmol/L咪唑洗脫峰。
圖5為重組Bbt-TPx蛋白的SP-Sepharose陽離子交換層析的SDS-PAGE分析。M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1重組Bbt-TPx蛋白的Ni2+螯和層析的300mmol/L咪唑洗脫峰更換緩沖液50mM PB(pH6.3)；2重組Bbt-TPx蛋白的50mM PB(pH6.3)，500mM NaCl洗脫峰。
圖6為pET32a(+)M-TPx重組表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。
圖7為重組Bbt-TPx蛋白還原H2O2活性的測(cè)定圖。系列1重組Bbt-TPx蛋白濃度為0ug/ml；系列2重組Bbt-TPx蛋白濃度為100ug/ml；系列3重組Bbt-TPx蛋白濃度為50ug/ml；系列4重組Bbt-TPx蛋白濃度為20ug/ml。圖8為重組Bbt-TPx蛋白保護(hù)超螺旋DNA實(shí)驗(yàn)的瓊脂糖電泳結(jié)果圖。1空白對(duì)照的supercoil DNA；2只加DTT；3只加Fe3+；4只加DTT和Fe3+；5～9DTT+Fe3++500、200、100、50、25ug/ml TPx。SFSupercoiled Formof Plasmid；NFNicked Form ofPlasmid.。質(zhì)粒為pGAPZαA。
圖9為重組Bbt-TPx蛋白保護(hù)GS蛋白活性圖。系列1反應(yīng)體系無DTT、Fe3+和TPx；系列2反應(yīng)體系含100ug/ml TPx；系列3反應(yīng)體系含20ug/ml TPx；系列4反應(yīng)體系含DTT和Fe3+，無TPx。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一中國青島文昌魚卵巢cDNA文庫的構(gòu)建及EST分析總RNA的提取和cDNA合成分離中國青島文昌魚卵巢,采用異硫氰酸胍法提取卵巢總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)獲得100μg卵巢總RNA。取1ug總RNA以SMARTIII olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到10μlcDNA第一鏈產(chǎn)物。
文昌魚卵巢cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定取cDNA 1μl用于連接反應(yīng)，反應(yīng)體系5μl，轉(zhuǎn)化其中1μl，取1/200、1/100和2/100體積轉(zhuǎn)化液分別涂板，其余用于搖總庫菌落。從平板中挑取單克隆保種并隨機(jī)挑取一定數(shù)目的單克隆進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。
實(shí)施例二重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因序列的測(cè)定和分析青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因的質(zhì)粒和序列來自實(shí)施例一中國青島文昌魚卵巢cDNA文庫中編號(hào)為bbelo2001的基因簇。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示其cDNA序列長度為1108bp。利用工具軟件DNAtools 6.0對(duì)其堿基序列進(jìn)行分析，并獲得其最大讀碼框，長度597bp，編碼198個(gè)氨基酸殘基的蛋白。通過BLASTX發(fā)現(xiàn)它與人類(Homo sapiens)的過氧化物還原酶1(hPRx1)(登錄號(hào)為gi|4505591|ref|NP_002565.1|)具有明顯的同源性(Identities＝155/198(78％)，Positives＝176/198(88％))。進(jìn)一步分析顯示，青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因編碼198個(gè)氨基酸的成熟蛋白，蛋白的分子量為22.15KD，等電點(diǎn)為7.30。該基因不含有信號(hào)肽，不含有跨膜區(qū)，也不含有糖基化位點(diǎn)。該蛋白亞細(xì)胞定位分析表明它是一個(gè)細(xì)胞溶質(zhì)蛋白。Blast同源檢索分析表明，青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶與具有兩個(gè)活性半胱氨酸功能域的過氧化物還原酶的同源性相當(dāng)高。它與第一類和第二類過氧化物還原酶都具有80％以上的同源性(圖1)。
實(shí)施例三重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)TPx基因的兩端序列合成一對(duì)引物，上游引物含BamH I切割位點(diǎn)，下游引物含Xho I切割位點(diǎn)。
上游引物5’-CGCGGA TCCTCT GCT GGA AAT GCC AAG-3’BaM HI下游引物5’-CCGCTC GAGTCA TTACTG CTT GGA GAA ATA TTC TTT G-3’；Xho I Stop codon用PCR的方法，從實(shí)施例二中的青島文昌魚文庫擴(kuò)增得到硫氧還蛋白過氧化物酶TPx基因片斷(含酶切位點(diǎn))，長度為610bp左右，與預(yù)期大小一致(圖2)。將回收純化的TPx基因PCR產(chǎn)物，用Bam HI和Xho I酶切后，插入到同樣用Bam HI和Xho I切開的載體pETTRX的窗口，構(gòu)成含TPx基因片段的表達(dá)載體pET-32a(+)M-TPx，其構(gòu)建過程如圖6。用Bam HI和Xho I酶切重組質(zhì)粒，可切出與PCR產(chǎn)物大小一致的片段，以及與線性載體pET-32a(+)M(5.9kb)大小一致的片段。用TPx上下游特異引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒，也能獲得一條與TPx預(yù)期大小一致的特征片段(圖3)。這都表明TPx基因已插入質(zhì)粒載體pET-32a(+)M中。純化后的pET-32a(+)M-TPx重組質(zhì)粒，以T7 terminator(上海博亞生物工程公司合成)為測(cè)序引物進(jìn)行反向測(cè)序，其序列與青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶TPx基因的測(cè)序結(jié)果完全一致，說明合成的引物與PCR擴(kuò)增無誤，讀碼框正確。
實(shí)施例四重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶的表達(dá)將pET-32a(+)M-TPx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與用軟件DNATOOL5.1預(yù)測(cè)的理論值24.46kD相符(圖4)。
經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的摸索菌體擴(kuò)大培養(yǎng)不同時(shí)間后誘導(dǎo)表達(dá)比較，基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm/min培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm/min培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴(kuò)大培養(yǎng)約2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為0.1mM和0.2％，25℃，250rpm/min誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后離心收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，在此條件下重組的Bbt-TPx蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20％以上，基本上處于可溶狀態(tài)(圖4)。
實(shí)施例五重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶的純化將誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液在4℃，6,000rpm/min離心5分鐘，菌體先用TE緩沖液(pH8.0)重懸，離心，再用預(yù)冷的50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl溶液洗滌菌體，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析一步純化，經(jīng)SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明融合蛋白的純度達(dá)到80％(圖4)。以1L基因工程菌培養(yǎng)物為材料，最終獲得約600mg純化的重組蛋白。
為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短對(duì)重組蛋白的處理時(shí)間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時(shí)，我們采用一步法進(jìn)行純化。根據(jù)載體質(zhì)粒pET-32a(+)M所表達(dá)的外源蛋白與Ni2+親和柱的結(jié)合能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，我們選用了較簡化的洗脫條件50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(A液)；100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(B液)；150mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(C液)；300mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重組TPx蛋白在D液被洗脫下來(圖4)。從SDS-PAGE結(jié)果來判斷分離效果最好的部分。
利用SP-Sepharose陽離子交換層析進(jìn)一步純化重組蛋白(洗脫液為PBS)，便得到純度在95％以上的重組文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶Bbt-TPx蛋白(圖5)。
實(shí)施例六重組Bbt-TPx蛋白還原H2O2活性實(shí)驗(yàn)該活性實(shí)驗(yàn)參照Lim·YS et al(Biochem Biophys Res Commun，1994，199(1)199-206.)的方法。反應(yīng)體系為1ml，包括5mmol/L DTT，50mmol/L HEPES-HCl(pH7.0)緩沖液和重組Bbt-TPx蛋白(0，20ug/ml，50ug/ml，100ug/ml)。室溫放置10分鐘后，加入H2O2(200ummol/L)。分別室溫放置反應(yīng)0，2.5分鐘，5分鐘，7.5分鐘，10分鐘后加入100ul 100％(w/v)TCA，混勻后立即加入200ul 10mmol/L Fe(NH4)2SO4和100ul 2.5mol/L KSCN，測(cè)定O.D.475。另做一不加H2O2的體系作為空白對(duì)照(圖7)。從圖7可以看到，在加有重組Bbt-TPx蛋白的系列中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，O.D.475吸收值逐步降低，說明H2O2被重組Bbt-TPx蛋白還原了。而且隨著重組Bbt-TPx蛋白濃度的升高，O.D.475吸收值下降的越快，說明被還原的H2O2量越多。而沒有加入Bbt-TPx的系列1，吸收值基本沒有變化。該實(shí)驗(yàn)證明了重組的Bbt-TPx蛋白具有還原H2O2的能力，且還原能力與重組Bbt-TPx蛋白濃度成正比。
實(shí)施例七重組Bbt-TPx蛋白保護(hù)超螺旋DNA實(shí)驗(yàn)該活性實(shí)驗(yàn)參照Lim·YS et al的方法。反應(yīng)體系為50ul，包括10mmol/L DTT，3ummol/LFeCl3，50mmol/L HEPES-HCl(pH7.0)緩沖液，1ug由PEG法提取的超螺旋DNA(pGAPZαA)和重組Bbt-TPx蛋白(500ug/ml，200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml)37℃溫育2小時(shí)。另做一體系不加DTT和重組蛋白；一體系不加FeCl3和重組蛋白；一體系不加重組蛋白作為對(duì)照。反應(yīng)完后分別取10ul跑瓊脂糖電泳檢測(cè)(膠濃度為0.8％)，并通過紫外分光成像系統(tǒng)分析結(jié)果(圖8)。結(jié)果顯示，作為對(duì)照的質(zhì)粒DNA只以超螺旋(supercoil form)一種構(gòu)象存在(lane 1)，而當(dāng)同時(shí)加入了DTT和Fe3+時(shí)，質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象幾乎被破壞，形成另一種構(gòu)象(nick form)(lane 4)。往反應(yīng)體系中加入重組Bbt-TPx蛋白后，可以看到隨著重組Bbt-TPx蛋白濃度的不同，質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象受到了不同程度的保護(hù)(lane 5-9)，而且質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象受到的保護(hù)程度與重組Bbt-TPx蛋白的濃度成正比。該實(shí)驗(yàn)證明了在一些自由基對(duì)DNA造成傷害時(shí)，重組的Bbt-TPx蛋白對(duì)超螺旋DNA具有一定的保護(hù)作用。
實(shí)施例八重組Bbt-TPx蛋白保護(hù)GS蛋白活性實(shí)驗(yàn)該活性實(shí)驗(yàn)參照Kim·K et al的方法。反應(yīng)體系為50ul，包括10ug/ml GS，10mmol/LDTT，3umol/L FeCl3，50mmol/L咪唑-HCl(PH7.0)和不同濃度的重組Bbt-TPx蛋白(20ug/ml和100ug/ml)。該體系包括兩部分，一部分為30ul，含有GS，咪唑和Bbt-TPx；另一部分20ul，含有DTT和FeCl3。將兩部分混和后30℃溫育不同時(shí)間(0，2min，8min，15min，25min)，然后加入2mlγ-Glutamyltransferase Assay Mixture，30℃溫育5min后加入1ml Stop Mixture，測(cè)定O.D.540。另做一體系不加重組Bbt-TPx蛋白、DTT和FeCl3；一體系不加重組Bbt-TPx蛋白作為對(duì)照。根據(jù)反應(yīng)剩余的GS蛋白轉(zhuǎn)移谷酰氨和鐵離子形成的γ-Glutamyl-hydroxamate-Fe3+化合物的O.D.540吸收值來判斷重組Bbt-TPx蛋白保護(hù)GS蛋白活性的能力。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，O.D.540吸收值為縱坐標(biāo)作曲線，觀察重組Bbt-TPx蛋白保護(hù)GS蛋白的活性(圖9)。從圖9可以看到，在反應(yīng)體系含DTT和Fe3+、無重組Bbt-TPx蛋白的時(shí)候，GS蛋白的活性隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而迅速降低，當(dāng)反應(yīng)體系中加入了不同濃度的重組Bbt-TPx蛋白的時(shí)候，GS蛋白的活性得到了不同程度的保護(hù)。當(dāng)重組Bbt-TPx蛋白的濃度為100ug/ml的時(shí)候，GS蛋白的活性幾乎沒有下降。該實(shí)驗(yàn)證明了重組Bbt-TPx蛋白對(duì)生物體內(nèi)一些對(duì)ROS非常敏感的蛋白如GS等具有保護(hù)作用。
序列表<110>中山大學(xué)<120>中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>597<212>DNA<213>中國青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(597)<400>1atg tct gct gga aat gcc aag ctc caa cac ccc gct cca aac ttc gag48Met Ser Ala Gly Asn Ala Lys Leu Gln His Pro Ala Pro Asn Phe Glu1 5 10 15agc acg gct gta cta ccc tct ggg gag ttc aag acc ata aaa ctc tcg96Ser Thr Aln Val Leu Pro Ser Gly Glu Phe Lys Thr Ile Lys Leu Ser20 25 30
gac tat aaa gga aag tac ttg gtc atc ttc ttc tac cct ctg gat ttc 144Asp Tyr Lys Gly Lys Tyr Leu Val Ile Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe35 40 45aca ttt gtg tgc ccg aca gaa atc atc gcc ttc agc gat cgc gtg gag 192Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Val Glu50 55 60gag ttt cgt aag atc aac tgc gag gtg gtg gcg tgt tca aca gac tcc 240Glu Phe Arg Lys Ile Asn Cys Glu Val Val Ala Cys Ser Thr Asp Ser65 70 75 80caa ttc tcc cac ttg gcc tgg acg aac acc ccc aga aag cag ggt gga 288Gln Phe Ser His Leu Ala Trp Thr Asn Thr Pro Arg Lys Gln Gly Gly85 90 95ctg ggc cag atg aag atc cca atc ctg gcc gac aaa gcg atg acc ata 336Leu Gly Gln Met Lys Ile Pro Ile Leu Ala Asp Lys Ala Met Thr Ile100 105 110tcc cgg gac tac ggc gtg ttg atg gag cct gag ggc atc gcg ttc cgt 384Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Met Glu Pro Glu Gly Ile Ala Phe Arg115 120 125ggt ttg ttc atc att gac gac aag ggt acc ctg cgc caa atc acg atc 432Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile130 135 140aac gac ctg cct gtc ggg cgt tcg gtc gac gag acg ctg cgt ctg gtt 480Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val145 150 155 160cag gcc ttc cag ttc aca gac aaa cac ggg gaa gtg tgt cct gct ggc 528Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly165 170 175tgg aag ccc ggt gca gac acc ate aaa ccc gac gtt aag aac agc aaa 576Trp Lys Pro Gly Ala Asp Thr Ile Lys Pro Asp Val Lys Asn Ser Lys180 185 190gaa tat ttc tcc aag cag 595Glu Tyr Phe Ser Lys Gln195<210>2<211>198<212>PRT<213>中國青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(198)
<400>2Met Ser Ala Gly Asn Ala Lys Leu Gln His Pro Ala Pro Asn Phe Glu1 5 10 15Ser Thr Aln Val Leu Pro Ser Gly Glu Phe Lys Thr Ile Lys Leu Ser20 25 30Asp Tyr Lys Gly Lys Tyr Leu Val Ile Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe35 40 45Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Val Glu50 55 60Glu Phe Arg Lys Ile Asn Cys Glu Val Val Ala Cys Ser Thr Asp Ser65 70 75 80Gln Phe Ser His Leu Ala Trp Thr Asn Thr Pro Arg Lys Gln Gly Gly85 90 95Leu Gly Gln Met Lys Ile Pro Ile Leu Ala Asp Lys Ala Met Thr Ile100 105 110Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Met Glu Pro Glu Gly Ile Ala Phe Arg115 120 125Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile130 135 140Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val145 150 155 160Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly165 170 175Trp Lys Pro Gly Ala Asp Thr Ile Lys Pro Asp Val Lys Asn Ser Lys180 185 190Glu Tyr Phe Ser Lys Gln19權(quán)利要求
1.用RT-PCR的方法，從中國青島文昌魚卵巢總RNA中分離得到的硫氧還蛋白過氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；該蛋白等電點(diǎn)為7.30，分子量為22150道爾頓。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白，其特征在于該蛋白是通過表達(dá)載體pET-32a(+)M-TPx在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)的。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于所述表達(dá)載體pET-32a(+)M-TPx是在質(zhì)粒pET-32a(+)M的多克隆位點(diǎn)中間插入His的親和標(biāo)記位點(diǎn)和TPX基因序列的高效表達(dá)載體，該系統(tǒng)使TPx基因在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)600mg/L。
5.權(quán)利要求2，3或4所述的蛋白在制備抗腫瘤和抗衰老的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國青島文昌魚硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備抗腫瘤和抗衰老的藥物中的作用。本發(fā)明用RT－PCR的方法，從中國青島文昌魚卵巢總RNA中分離得到的硫氧還蛋白過氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。該基因編碼的蛋白(重組硫氧還蛋白過氧化物酶Bbt－TPx)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本發(fā)明的重組硫氧還蛋白過氧化物酶具有抗氧化作用，可用于制備抗腫瘤和抗衰老的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1644697SQ20041007754
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者徐安龍, 廖劍, 孫孜孜, 王磊, 董美玲 申請(qǐng)人:中山大學(xué)