綠膿桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的新活性及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及一種來源于綠脈桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的AhpF蛋白質(zhì)及其 應(yīng)用，所述AhpF蛋白質(zhì)具有硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase;TR)、硫氧還蛋白 (thioredxo in; Trx )、過氧化物酶（peroxidase; Prx)及分子伴侶（chaperone)活性。更具體 地，本發(fā)明設(shè)及一種具有環(huán)境脅迫耐性的生物體及其制備方法。所述具有環(huán)境脅迫耐性的 生物體是通過重新確認(rèn)了綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)除了具有已知的硫氧還蛋白還原酶功能 W外，還具有過氧化物酶及分子伴侶活性的基礎(chǔ)上，并利用該新的活性將編碼所述AhpF蛋 白質(zhì)的基因?qū)氲缴矬w中而制備的。
【背景技術(shù)】
[0002] 在有氧代謝過程或生物個(gè)體暴露在多種脅迫條件下產(chǎn)生活性氧（ROS) (Finkel T .，Curr. Opin. Cel 1 Biol. 15:247-254，2003)。運(yùn)種活性氧會(huì)對(duì)生物性巨分子（蛋白質(zhì)、月旨 質(zhì)、核酸等)帶來阻礙氧化功能或結(jié)構(gòu)變化等的嚴(yán)重危害，并成為諸多疾病的原因 (Neumann et al .，化ture，424:561-565，2003)。所有的有氧生物體為了使自身免受因氧化脅迫或活 性氧而引起的蛋白質(zhì)的變性(denaturation)，W及為了使自身免受由上述變性誘導(dǎo)的蛋白 質(zhì)的聚集(aggregation)的影響而具有多種抗氧化蛋白質(zhì)和熱沖擊蛋白質(zhì)等多種形態(tài)的分 子性分子伴侶。其中，具代表性的是革蘭陰性菌，然而通過院內(nèi)感染（nosocomial infections)被發(fā)現(xiàn)的、作為人類的伺機(jī)性致病菌（opportunistic human pathogen)的綠 脈桿菌對(duì)活性氧具有強(qiáng)力的防御機(jī)制。作為具體的防御機(jī)制，可W舉例如，具有2個(gè)超氧化 物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)、3個(gè)過氧化氨酶（catalase，CAT)及4個(gè)Ahp還原酶 (reductase)。
[0003] 另外，據(jù)報(bào)道，所述Ahp還原酶系統(tǒng)在除了綠脈桿菌的多種微生物中起到對(duì)氧化脅 迫的防御系統(tǒng)的作用。Ahp還原酶系統(tǒng)通過催化有機(jī)過氧化物或氨過氧化物的NAD(P化的依 賴性還原而在生物體中起到去除有害的活性氧的功能。據(jù)報(bào)道，Ahp還原酶系統(tǒng)通常由 AhpF-AhpC構(gòu)成，其中，AhpF(烷基過氧化氨還原酶亞基F，a化yl hy化operoxide reductase subunit巧由1566bp的多核巧酸、521個(gè)氨基酸組成，其分子量為56kDa。
[0004] 如下圖所示，已知在現(xiàn)有的大腸桿菌化.CO 1 i )或鼠傷寒沙口氏菌（Salmone 1 Ia typh imur i皿)等中被報(bào)道過的Ahp還原酶系統(tǒng)中的Ahp C和AhpF分別起到了分離的作用。
[0006]旨P，大腸桿菌或鼠傷寒沙口氏菌等的一般的AhpF起到從NAD(P)H接受電子并向 AhpC傳遞電子的還原酶的作用，AhpC起到去除過氧化氨的過氧化物酶的作用。因此，一直認(rèn) 為為了有效地去除活性氧，AhpF和AhpC都是必需的。
[0007] 然而，本發(fā)明人第一次確認(rèn)了綠脈桿菌的AhpF不僅具有已知為現(xiàn)有微生物的一般 AhpF功能-還原酶活性，而且還同時(shí)具有已知為AhpC的活性的過氧化物酶活性及分子伴侶 活性等，即，最先確認(rèn)了一個(gè)AhpF蛋白質(zhì)具有多種功能，并且確認(rèn)了運(yùn)種AhpF蛋白質(zhì)的活性 依賴于結(jié)構(gòu)，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 要解決的技術(shù)問題
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種具有硫氧還蛋白還原酶、過氧化物酶及分子伴 侶活性的AhpF蛋白質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于，提供一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的硫氧還蛋白還原酶活 性得到增加的變異體、分子伴侶活性得到增加的所述AhpF的高分子性結(jié)合體、W及過氧化 物酶活性得到增加的AhpF的低分子性結(jié)合體。
[0011] 本發(fā)明的又一目的在于，提供一種包含編碼所述綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的多核巧 酸的用于增強(qiáng)生物體環(huán)境脅迫抵抗性的組合物及轉(zhuǎn)化了所述多核巧酸的具有環(huán)境脅迫抵 抗性的植物體。
[0012]技術(shù)方案
[0013] 為了解決本發(fā)明的一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)，所述蛋白 質(zhì)同時(shí)具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白、過氧化物酶及分子伴侶活性。
[0014] 本發(fā)明的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)優(yōu)選具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列，但并不限 定于此。
[0015] 為了解決本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明提供一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的變異體， 所述綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的變異體是SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中的第342位的氨基酸 半脫氨酸(cysteine)被絲氨酸(serine)或丙氨酸(alanine)取代的變異體。
[0016] 另外，本發(fā)明提供一種所述AhpF蛋白質(zhì)的高分子性結(jié)合體及低分子性結(jié)合體。所 述AhpF蛋白質(zhì)的高分子性結(jié)合體的特征為，其分子伴侶活性得到增加，分子量至少為500-2000kDa。另外，所述AhpF蛋白質(zhì)的低分子性結(jié)合體的特征為，其過氧化物酶活性得到增加， 分子量至少為l〇〇-250kDa。
[0017] 為了解決本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種用于增強(qiáng)生物體的環(huán)境脅迫抵抗性 的組合物，所述組合物包含一種載體，所述載體導(dǎo)入有編碼綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的多核 巧酸。
[0018] 另外，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化了表達(dá)綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的重組載體的農(nóng)桿菌屬 (Agrobacterium)微生物。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化植物體，所述轉(zhuǎn)化植物體過量表達(dá)本發(fā)明 所述的AhpF蛋白質(zhì)，從而具有環(huán)境脅迫抵抗性。
[0019] 另外，本發(fā)明提供一種制備具有環(huán)境脅迫抵抗性的植物體的方法，其特征為，所述 方法是將包含有編碼所述AhpF蛋白質(zhì)的多核巧酸的重組載體轉(zhuǎn)化到植物體中。
[0020] 下面，將詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明中所使用的術(shù)語、技術(shù)等在沒有被具體限定的情 況下，W本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的意思來定義。另外，將對(duì)重復(fù)的說明進(jìn)行省略。
[0021] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式設(shè)及一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)，所述綠脈桿菌的AhpF蛋 白質(zhì)同時(shí)具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白、過氧化物酶及分子伴侶活性。所述綠脈桿菌 的AhpF蛋白質(zhì)優(yōu)選具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列，但并不限定于此。即使所述AhpF蛋白質(zhì) 的氨基酸的一部分發(fā)生變形或受到損失，如果如本發(fā)明一樣同時(shí)具有硫氧還蛋白還原酶、 過氧化物酶及分子伴侶活性，并且是普通的技術(shù)人員能夠容易地導(dǎo)出的、具有90% W上的 同源性的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)，則均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0022] 已知現(xiàn)有的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)只具有硫氧還蛋白還原酶(TR)及硫氧還蛋白 (化X)活性，本發(fā)明第一次確認(rèn)了綠脈桿菌的AhpF不僅具有TR及化X活性，還具有已知為作 為區(qū)別功能的AhpC的過氧化物酶及分子伴侶活性(參照?qǐng)D1)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中確認(rèn) 了綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)同時(shí)具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白、過氧化物酶及分子伴 侶的支持酶化oldase)及折疊酶(Foldase)功能(參照?qǐng)D2~圖5)。
[0023] 過氧化物酶活性(Peroxidase activity)是指下述過程:還原型煙酷胺腺嚷嶺二 核巧酸憐酸(NADPH)轉(zhuǎn)化為NADP+的同時(shí)，將電子化+)傳遞給硫氧還蛋白還原酶，所述TR再次 將電子傳遞給硫氧還蛋白的同時(shí)被氧化，接受到TR傳遞的電子而被還原的Trx將電子傳遞 給Prx，而Trx被氧化，被還原的Prx將出化分解為化及出0。
[0024] 另外，分子伴侶是與蛋白質(zhì)的折疊 (folding)有關(guān)的蛋白質(zhì)，例如是指，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) 受到熱沖擊化eat shock)等脅迫時(shí)，蛋白質(zhì)處于完整折疊狀態(tài)的3元結(jié)構(gòu)會(huì)被打開，從而無 法正常起到自身的作用，運(yùn)時(shí)被命名為分子伴侶的組群的蛋白質(zhì)識(shí)別出上述被打開的蛋白 質(zhì)并與其結(jié)合，從而起到防止蛋白質(zhì)的變性，或者為其制造能夠重新再進(jìn)行折疊的良好環(huán) 境的蛋白質(zhì)。分子伴侶活性(molecular chaperone activity)分為支持酶(Holda