專利名稱：?jiǎn)伟费趸冈\斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧化酶
活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測(cè)定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化 學(xué)分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測(cè)單胺氧化酶，其依據(jù)是e-苯乙胺 在10 lOOmg時(shí)反應(yīng)速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應(yīng)速度。免疫學(xué)方法則利用單 胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應(yīng)用較 多的單克隆抗體有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。
相對(duì)而言，化學(xué)分光光度法應(yīng)有更為普遍。可以用單胺氧化酶催化胺類釋放 出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲?；?3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪 (MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測(cè)定，也可以應(yīng)用芐胺(Benzylamine)、對(duì)苯甲胺-l3-偶氮萘酚、 丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪 胺(tyr咖ine，又稱"3-對(duì)羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine)等作為反應(yīng)底物來測(cè)定單胺氧化酶的活性。其中，應(yīng)用苯甲胺類型 底物測(cè)得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測(cè) 得的活性約為3-對(duì)羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測(cè)定多用芐胺和對(duì)苯甲 胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在 強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙，這在生化儀上測(cè)定較困難；對(duì)苯 甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實(shí)用性，且不能應(yīng)用全自動(dòng) 生化儀分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法 (CoupleReaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光 度的變化，得以測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的 單胺氧化酶診斷試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自 動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到 切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫
氨+肌苷單磷酸+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸+還原性輔酶
過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶 (偶)聯(lián)鳥苷單磷酸還原酶(GMP reductase ;EC 1. 7. 1. 7) 、 NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase ;EC 1. 6. 3. 1)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生氨及過 氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶的作用，最終二次將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型 輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算單胺氧 化酶的活性濃度大小。 本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以 下物質(zhì)之一芐胺、對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺 或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 鳥苷單磷酸還原酶 6000U/L NAD(P)H氧化酶 8000U/L 節(jié)胺 5mmol/L 肌苷單磷酸 9mmol/L 本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶。 輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑1或試 劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、NAD (P) H氧化酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶。
輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一 本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定齊[J 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 鳥苷單磷酸還原酶 6000U/L NAD (P) H氧化酶 8000U/L 節(jié)胺 5mmol/L 肌苷單磷酸 9mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 節(jié)胺 5mmol/L 肌苷單磷酸 9mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 鳥苷單磷酸還原酶 6000U/L NAD (P) H氧化酶 8000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
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在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實(shí)施例三 本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
節(jié)胺 5mmol/L
肌苷單磷酸 9mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
NAD (P) H氧化酶 8000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 鳥苷單磷酸還原酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定單胺氧化酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間
10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與
試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間
大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)400U/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏
差不超過±4% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可
達(dá)0. 0002±0. 0001 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫氨+肌苷單磷酸+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸+還原件輔酶過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶鳥苷單磷酸還原酶 NAD (P)H氧化酶 胺類化合物 肌苷單磷酸20-500,1/L1-4000mmol/L1-6mmol/L1000-80000U/L1000-80000U/L1-50mmol/L1-50mmol/L本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者 這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸組成；試劑2，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶組成。輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H 氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸組成；試劑2，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、NAD(P)H氧化酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶組成。輔 酶、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑1、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸、鳥苷單磷酸還原酶、NAD(P)H氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101750312SQ20081023564
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司