se)和折 疊酶(foldase)活性。例如，支持酶活性是指具有W下作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露在脅迫(氧化脅 迫、熱脅迫）中時(shí)，會(huì)發(fā)生變性而使得處于折疊狀態(tài)的3元結(jié)構(gòu)被部分打開，使疏水性氨基酸 殘基暴露出來(lái)，而運(yùn)種過(guò)程加重會(huì)使得變性的蛋白質(zhì)不規(guī)則地凝聚在一起而變成結(jié)合體 (aggregates)而被蛋白質(zhì)分解酶(protease)分解而消失，在此時(shí)，分子伴侶蛋白質(zhì)（S服Ps， DnaJ)會(huì)與因脅迫而被部分打開的蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸進(jìn)行結(jié)合，從而防止結(jié)合體的生 成，并起到使其重新恢復(fù)到原來(lái)的3元結(jié)構(gòu)的環(huán)境的作用，折疊酶活性是指具有W下功能， 當(dāng)WmRNA作為模板通過(guò)核糖體(r化osome)而合成為新的蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)將W原定的3元 結(jié)構(gòu)形成折疊，此時(shí)，分子伴侶蛋白質(zhì)(Gro化/ES JnaK/J/E)與新伸長(zhǎng)的氨基酸鏈或變形的 蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合而形成能夠使其折疊成正確的=元結(jié)構(gòu)的環(huán)境，起到幫助的作用。
[0025] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式設(shè)及一種所述綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的高分子性結(jié)合體 及低分子性結(jié)合體。本發(fā)明的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)呈具有多種分子量的人-低聚物復(fù)合 體的結(jié)構(gòu)化omo-oligomeric complex)，在高分子性結(jié)合體中分子伴侶功能占優(yōu)勢(shì)。尤其是 確認(rèn)了分子伴侶的活性得到了增加。在本發(fā)明的一實(shí)施例中確認(rèn)了施加熱沖擊時(shí)，將變成 高分子性結(jié)合體結(jié)構(gòu)，分子伴侶功能中的支持酶活性得到了增加(參見圖8及圖10)。另外， 確認(rèn)了本發(fā)明的AhpF在低分子性結(jié)合體化OW molecular wei曲t，LMW)中過(guò)氧化物酶活性 占優(yōu)勢(shì)。所述AhpF蛋白質(zhì)的高分子性結(jié)合體的特征為，其分子量至少為500-2000kDa。即，表 明了所述高分子性結(jié)合體的AhpF蛋白質(zhì)的單體具有至少大于四聚體(tetramer)的結(jié)構(gòu)。優(yōu) 選地，所述高分子性結(jié)合體的分子量最小可W為500-2000kDa。
[0026] 另外，所述AhpF蛋白質(zhì)的低分子性結(jié)合體的特征為，其分子量至少為100-250W)a (二聚體-四聚體）。本發(fā)明中為了分析AhpF蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)而實(shí)施的一實(shí)施例中，當(dāng)沒(méi)有施加 高溫脅迫時(shí)，最為普通的結(jié)構(gòu)為四聚體。
[0027]本發(fā)明的又一實(shí)施方式設(shè)及一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的變異體。所述AhpF蛋白 質(zhì)的變異體可W為在SEQ ID N0:1的氨基酸序列中第342位的氨基酸半脫氨酸被絲氨酸或 丙氨酸取代的變異體，但并不限定于此。本發(fā)明的AhpF蛋白質(zhì)中，在氨基酸末端包含有化X 結(jié)構(gòu)域，在簇基末端包含有TR結(jié)構(gòu)域(參見圖11)。所述第342位的半脫氨酸包含在TR結(jié)構(gòu)域 中。本發(fā)明的一實(shí)施例中示出了所述AhpF蛋白質(zhì)的變異體的硫氧還蛋白還原酶活性與野生 型相比約高出2倍W上。另外，當(dāng)TR結(jié)構(gòu)域中其它半脫氨酸，即第344位或第347位的半脫氨 酸被絲氨酸取代時(shí)，反而幾乎沒(méi)有顯示出TR活性。
[00%]本發(fā)明通過(guò)確認(rèn)出所述源自綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)除了起到已知的還原酶功能 W外，還能夠起到過(guò)氧化物酶及分子伴侶功能的新的事實(shí)，設(shè)及一種上述運(yùn)種綠脈桿菌的 AhpF蛋白質(zhì)的特性的應(yīng)用。
[0029] 與所述AhpF蛋白質(zhì)的特性的應(yīng)用相關(guān)的本發(fā)明的另一實(shí)施方式為，設(shè)及一種用于 增強(qiáng)生物體的環(huán)境脅迫抵抗性的組合物，所述組合物包含一種載體，所述載體導(dǎo)入有編碼 綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的多核巧酸。在所述組合物中，作為用于導(dǎo)入編碼所述AhpF蛋白質(zhì) 的多核巧酸的載體，可W使用本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的載體，優(yōu)選使用pCAMBIA載體。另外， 所述載體可W包含與導(dǎo)入的AhpF的多核巧酸W可操作的方式連接的啟動(dòng)子及選擇標(biāo)記基 因（社増盈句胥對(duì)坤）。所述與AhpF的多核巧酸W可操作的方式連接的啟動(dòng)子能夠使 AhpF進(jìn)行表達(dá)，或增強(qiáng)AhpF的表達(dá)。導(dǎo)入到所述載體中的編碼綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的多 核巧酸優(yōu)選為對(duì)由SEQ ID NO: 1構(gòu)成的AhpF蛋白質(zhì)或本發(fā)明的SEQ ID NO: 1的第342位的半 脫氨酸變異為絲氨酸或丙氨酸的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核巧酸，但并不限定 于此。本發(fā)明的由SEQ ID N0:1構(gòu)成的AhpF蛋白質(zhì)同時(shí)具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋 白、過(guò)氧化物酶及分子伴侶活性，從而能夠?qū)ι矬w的環(huán)境脅迫顯示出優(yōu)異的抵抗性。另 夕hSEQ ID NO: 1的第342位的半脫氨酸變異為絲氨酸或丙氨酸的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的 硫氧還蛋白還原酶活性比野生型增加2倍W上，使得生物體能夠具有更強(qiáng)的對(duì)環(huán)境脅迫的 抵抗性。另外，由于本發(fā)明的另一綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的高分子性結(jié)合體中分子伴侶功 能占優(yōu)勢(shì)，因此能夠利用運(yùn)種特性來(lái)將其有效地用于增加生物體對(duì)多種環(huán)境脅迫(熱沖擊、 氧化脅迫、病原菌等)的抵抗性方面。
[0030] 另外，本發(fā)明設(shè)及一種農(nóng)桿菌屬微生物，所述農(nóng)桿菌屬微生物是轉(zhuǎn)化了表達(dá)所述 綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的重組載體。將導(dǎo)入有所述AhpF基因的重組載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌屬微 生物中，從而轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌屬微生物，W使其能夠表達(dá)AhpF蛋白質(zhì)。所述綠脈桿菌的AhpF蛋白 質(zhì)優(yōu)選為由SEQ ID N0:1構(gòu)成的AhpF蛋白質(zhì)，或本發(fā)明的SEQ ID N0:1的第342位的半脫氨 酸變異為絲氨酸或丙氨酸的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)。所述農(nóng)桿菌屬微生物優(yōu)選為根癌±壤 桿菌(Agrobacterium tumerfaciens)，但并不限定于此。此外，不僅可W使用農(nóng)桿菌屬微生 物，還包括能夠轉(zhuǎn)化植物體的所有微生物。
[0031] 另外，本發(fā)明的另一實(shí)施方式設(shè)及一種轉(zhuǎn)化植物體，所述轉(zhuǎn)化植物體通過(guò)過(guò)量表 達(dá)AhpF蛋白質(zhì)而具有環(huán)境脅迫抵抗性。所述植物體可W為雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選 為擬南芥（Arabidopsis thaliana)、白菜（Brassica rapa)或稻（0;ryza sativa)。但并不限 定于此，能夠使本發(fā)明的AhpF蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的可轉(zhuǎn)化的植物體均包括在本發(fā)明中。在所 述植物體中能夠過(guò)量表達(dá)的綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)優(yōu)選為由SEQ ID NO: 1構(gòu)成的AhpF蛋白 質(zhì)，或本發(fā)明的在SEQ ID NO: I的第％2位半脫氨酸變異為絲氨酸或丙氨酸的綠脈桿菌的 AhpF蛋白質(zhì)。
[0032] 另外，優(yōu)選通過(guò)將表達(dá)本發(fā)明的AhpF蛋白質(zhì)的農(nóng)桿菌屬微生物導(dǎo)入到植物細(xì)胞系 中而生成所述可轉(zhuǎn)化植物體，但并不限定于此。
[0033] 另外，本發(fā)明設(shè)及一種制備具有環(huán)境脅迫抵抗性的植物體的方法，其特征為，所述 方法是將包含有編碼本發(fā)明的所述AhpF蛋白質(zhì)的多核巧酸的重組載體轉(zhuǎn)化到植物體中。包 含在所述重組載體中的編碼綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的多核巧酸優(yōu)選為對(duì)由SEQ ID N0:1構(gòu) 成的AhpF蛋白質(zhì)或本發(fā)明的SEQ ID NO: 1的第342位的半脫氨酸變異為絲氨酸或丙氨酸的 綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核巧酸，但并不限定于此。
[0034] 可W利用±壤桿菌素-介質(zhì)轉(zhuǎn)化法來(lái)實(shí)現(xiàn)所述植物體的轉(zhuǎn)化，可W使用文獻(xiàn) 化orsch et al. ,Science 227:1229-1231,1985)中例示的方法。在所述制備方法中，優(yōu)選 將所述重組載體導(dǎo)入到根癌±壤桿菌中，并將其轉(zhuǎn)化到植物體，但并不限定于此。除了可W 使用根癌±壤桿菌W外，能夠轉(zhuǎn)化植物體的優(yōu)選微生物均可W使用，例如可W使用發(fā)根± 壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)等。
[0(X3日]有益效果
[0036] 在本發(fā)明中，利用綠脈桿菌的AhpF蛋白質(zhì)的新的活性能夠制備對(duì)氧化脅迫或熱脅 迫等多種環(huán)境脅迫具有強(qiáng)的耐性的植物體，從而能夠在增加農(nóng)作物的生產(chǎn)性及大量生產(chǎn)有 用成分方面做出貢獻(xiàn)。另外，對(duì)于開發(fā)能夠適應(yīng)因地球溫室效應(yīng)所導(dǎo)致的干旱、干燥等嚴(yán)重 的氣象環(huán)境變化的植物體方面，也能夠有效地被利用。由此，通過(guò)開發(fā)出高溫及干燥抵抗性 轉(zhuǎn)化植物體，不僅能夠防止沙漠化和環(huán)境污染，而且通過(guò)將其導(dǎo)入到有用農(nóng)作物中，還能夠 幫助解決人類的糧食短缺問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為將本發(fā)明的綠脈桿菌的AhpF(PaAhpF)活性與現(xiàn)有的大腸桿菌或鼠傷寒沙口 氏菌中已知的AhpF和AhpC活性進(jìn)行比較而顯示的模擬圖。
[0038] 圖2是示出了根據(jù)本發(fā)明的AhpF的濃度的過(guò)氧化物酶活性的圖。
[0039] 圖3是示出了綠脈桿菌的AhpF和AhpC的過(guò)氧化物酶活性的影響力的圖。
[0040] 圖4是示出了根據(jù)