專利名稱：藍色黑鴨草的類硫氧還蛋白基因在啤酒大麥生產(chǎn)中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因大麥培育技術領域，特別涉及藍色黑鴨草(Phalariscoerulescens)的類硫氧還蛋白基因(Thioredoxin S，TrxS)在啤酒大麥生產(chǎn)中的應用。
背景技術：
大麥是釀造啤酒的主要原料，近年來，我國對釀造用啤酒大麥的年需求量都在300萬噸以上，而國內(nèi)啤酒大麥生產(chǎn)不足100萬噸，因此國內(nèi)啤酒大麥需求的60～70％依靠進口。同時，國產(chǎn)啤酒大麥的品質(zhì)較差，據(jù)連云港大麥品種改良中心等研究報道，優(yōu)級啤酒大麥的麥芽無水浸出率應大于80％，而國內(nèi)大麥品種麥芽浸出率平均只有76.57％，國外為80.5～82.5％；國內(nèi)大麥糖化力平均為280.28WK°，國外平均為295.81WK°；國內(nèi)大麥品種的平均蛋白質(zhì)溶解度(庫爾巴哈值)為39.74％，國外為44～47％。在影響啤酒大麥品質(zhì)的指標中，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、麥芽浸出率、糖化力、蛋白質(zhì)溶解度(庫爾巴哈值)、α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性等均與大麥中的類硫氧還蛋白基因(Thioredoxin h，Trx-h)活性有關。大麥種子中的Trx-h通過催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原能促進α-淀粉酶、β-淀粉酶和脫支淀粉酶的活性，提高蛋白酶的活性和種子貯藏蛋白的可溶性，促進淀粉和貯藏蛋白降解，加速種子的碳氮代謝，進而促進籽粒發(fā)芽，縮短糖化時間，提高麥芽浸出率、糖化力、蛋白質(zhì)溶解度(庫爾巴哈值)等，同時可提高啤酒大麥原料的啤酒產(chǎn)出率。因此，提高大麥種子中的Trx-h的活性，可能會提高啤酒大麥的麥芽浸出率、糖化力、蛋白質(zhì)溶解度和啤酒產(chǎn)出率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供藍色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白基因(TrxS)在啤酒大麥生產(chǎn)中的應用，包括轉(zhuǎn)基因大麥新材料和以轉(zhuǎn)基因大麥為親本的大麥品種培育。
為達上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案藍色黑鴨草的類硫氧還蛋白基因在啤酒大麥生產(chǎn)中的應用，把藍色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白基因(Thioredoxin S，TrxS)轉(zhuǎn)至普通大麥中得到大麥新材料。
利用所述大麥新材料培育大麥新品種。
具體應用方法包括(1)受體材料準備、(2)目的基因重組質(zhì)粒構建與繁殖、(3)微彈制備與轟擊、(4)愈傷組織的誘導、篩選與植株再生培養(yǎng)。
在受體材料準備階段，以晉引6號(JY6)、豫啤1號(YP1)、豫啤2號(YP2)、來色依(LSY)和Franklin、Harrington等大麥品種作為TrxS基因轉(zhuǎn)化的受體來源材料，所用受體為大麥的幼胚。大麥開花14-16天后，剝?nèi)∮啄鄯N子，用70％的乙醇表面消毒1分鐘，無菌水沖洗3次后用0.1％升汞(HgCl2)溶液消毒6分鐘，無菌水沖洗3-4次。在超凈工作臺上用解剖鑷剝出未成熟籽粒的幼胚(長度1-1.5毫米)；幼胚盾片朝上接種于誘導培養(yǎng)基上，每皿放40粒幼胚，Parafilm封口，25±1℃暗培養(yǎng)，作為基因槍轟擊的靶材料。
在目的基因與標記基因質(zhì)粒構建與繁殖階段，采用質(zhì)粒載體為pBluescript SK+，目的基因為來源于藍色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白基因(TrxS)。將TrxS正向連接在大麥醇溶蛋白啟動子(Pro-Gli)的下游，插入載體pBluescript SK+的多克隆位點，得到含TrxS基因的重組質(zhì)粒I(圖1)。將抗篩選劑PPT的Bar基因連接在CaMV 35S啟動子下游，插入另一pBluescript SK+的多克隆位點，得到重組質(zhì)粒Z，作為共轉(zhuǎn)化植株篩選標記。質(zhì)粒DNA繁殖的受體菌株采用E.coli-DH5a工程菌。用CaCl2法制備感受態(tài)細胞，即接種一個“DH5a”菌或用接種針蘸取少許菌株在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)16-20小時。菌落長到1-2毫米時，挑取單菌落至50毫升含10毫升LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜(轉(zhuǎn)速≤200轉(zhuǎn)/分鐘)，取1％的菌液轉(zhuǎn)入500毫升含100毫升LB培養(yǎng)基的三角瓶中，強烈震蕩3-4小時，使OD650＝0.45-0.50。將100毫升LB培養(yǎng)基倒入兩個冰預冷的50毫升離心管中，冰浴10分鐘，4℃下8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，此時稀釋1M的CaCl2儲存液至0.1M，用0.22微米的網(wǎng)篩過濾滅菌，倒盡上清液，吸干殘液，用10毫升冰預冷的0.1M CaCl2重懸沉淀(此時兩管合一管)，冰上放置30分鐘，4℃下6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清液，吸干殘液，再用2毫升冰預冷的0.1M CaCl2溶液懸浮，冰浴30小時，以200微升分裝。轉(zhuǎn)化時取1微升重組質(zhì)粒到9微升TE緩沖液中混勻作為A液，再取1微升A液到9微升TE緩沖液(10毫摩爾/升tris-HCl，1毫摩爾/升EDTA，PH＝8.0)中混勻為B液，取1微升B液到無菌的1.5毫升離心管中，再加入200微升的感受態(tài)細菌液，上下顛倒混勻，冰上放置30分鐘，立刻轉(zhuǎn)移到42℃水浴中準確放置90秒，然后冰上放置90秒，加入800微升SOC培養(yǎng)基，37℃下水浴15分鐘，在37℃搖床上輕搖45分鐘(轉(zhuǎn)速≤85轉(zhuǎn)/分鐘)，用無菌涂布器將50微升培養(yǎng)液涂到含有氨芐青霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-GAL)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。篩選白色菌落，經(jīng)繁殖擴增后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA，溶于含RNase的TE緩沖液中并使終濃度達1微克/微升，37℃放置30分鐘后，-20℃保存。
在微彈制備與轟擊階段，微彈載體選用(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))顆粒大小為1微米的金粉，取40毫克金粉放入1.5毫升離心管中，加入1毫升96％乙醇充分振蕩30秒時金粉充分散開，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，除去上清液，再加入1毫升96％乙醇重懸金粉，重復上述步驟3次。用1毫升無菌蒸餾水按上述步驟清洗金粉3次，最后將金粉懸于1毫升無菌蒸餾水中，以50微升等分液分裝金粉懸浮液。取50微升等分液，依次加入兩種質(zhì)粒DNA(TrxS、Bar)各5微升(微克/微升)，振蕩混勻，再依次加入50微升2.5M的CaCl2和20微升0.1M的亞精胺(Spermidine)溶液混勻，冰浴15分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，除去上清液，用250微升無水乙醇旋渦振蕩1分鐘，離心棄上清液。最后將金粉-DNA重懸于240微升無水乙醇中備用。每槍取5微升轟擊。在轟擊前6小時、轟擊后18小時對受體材料進行0.4摩爾/升甘露醇高滲處理，用壓縮氦氣為動力用基因槍進行轟擊。本發(fā)明實驗中采用美國Bio-Rad公司產(chǎn)PDS-100O/He型基因槍，基因槍轟擊參數(shù)為裂膜與載片間距2.5厘米，載片與阻擋網(wǎng)間距1.1厘米，阻擋網(wǎng)與轟擊材料間距5.5厘米，轟擊氣體壓力1100/900inch Hg，真空度27psi，每槍金粉-DNA量為4.2-0.21微克。
在愈傷組織的篩選、誘導、分化與植株再生培養(yǎng)階段，選用培養(yǎng)基包括(1)篩選培養(yǎng)基MS+6毫克/升PPT；(2)愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+1.0毫克/升ABA(脫落酸)(2周后去掉)+1.5毫克/升2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0.7％瓊脂+30克/升麥芽糖；高滲培養(yǎng)基為誘導培養(yǎng)基加0.4摩爾/升甘露醇；(3)分化培養(yǎng)基MS+1.0毫克/升ZT(Zeatin玉米素)+0.1毫克/升IAA(吲哚乙酸)+40克/升麥芽糖；(4)生根培養(yǎng)基1/2MS+0.2毫克/升IAA+15克/升麥芽糖。轟擊前4-6小時轉(zhuǎn)入高滲培養(yǎng)基，轟擊后8小時將幼胚從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至正常MS誘導培養(yǎng)基上，26℃暗恢復培養(yǎng)5天后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，15天繼代1次。經(jīng)2-3次繼代培養(yǎng)后，選擇直徑約5毫米、色澤淡黃、結構緊湊的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，在16小時/天光照(3000Lx)26℃下進行愈傷組織再分化培養(yǎng)。新分化出的小芽長至2-3毫米時轉(zhuǎn)移至三角瓶中生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。小植株的主根長至2-5厘米時，去掉封口膜，置于20℃光照培養(yǎng)箱中，經(jīng)2-3天后用鑷子小心取出幼苗，再用清水洗掉根上的瓊脂，移栽于花盆，用容器罩住小植株保持高濕度，3-6天后移去容器，將再生苗置于20℃生長。
利用本發(fā)明將藍色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白基因TrxS導入普通大麥，獲得穩(wěn)定遺傳、正常表達，籽粒中Trx-h活性、淀粉酶活性和種子發(fā)芽勢明顯增強的轉(zhuǎn)基因大麥新材料，有利于提高啤酒大麥的品質(zhì)和大麥的啤酒產(chǎn)出率。


圖1為pBluescript SK+中插入TrxS基因的重組質(zhì)粒構建圖；圖2為T0代植株的PCR檢測電泳圖(M-DL2000，1～9-T0代再生植株，ck-陰性對照，P-陽性對照)；圖3-1為用引物PI和PII對出現(xiàn)明顯陽性片段植株的PCR產(chǎn)物進行嵌套的嵌套方案和酶切片段模式；圖3-2為轉(zhuǎn)基因植株的嵌套PCR及酶切檢測電泳圖(M-DL2000，1～3-引物PI+PIII擴增產(chǎn)物，4～6-引物PI+PII嵌套PCR產(chǎn)物7～9-嵌套PCR產(chǎn)物酶切片段)；圖4為T1代轉(zhuǎn)基因植株的嵌套PCR(引物PI+PII)及酶切檢測電泳圖(M-DL2000，1～3-嵌套PCR產(chǎn)物，4～6-PCR產(chǎn)物酶切片段)；圖5為T2代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測電泳圖(引物PI+PIII→PI+PII；M-DL2000，P-質(zhì)粒，ck-陰性對照1～29-T2代轉(zhuǎn)基因株系)；圖6為T2代轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交檢測圖(λDNA-HindIII酶切片段，P-陽性對照，ck-陰性對照，1～18-部分轉(zhuǎn)基因植株(T2)Southern印跡)；圖7為轉(zhuǎn)基因大麥種子Trx-h催化活性比較(A-轉(zhuǎn)基因種子；CK-非轉(zhuǎn)基因種子；blank-不含Trx-h提取物)；圖8為水溶、醇溶蛋白質(zhì)組份中巰基含量比率圖(OD412/OD280)(A-轉(zhuǎn)基因種子；CK-非轉(zhuǎn)基因種子)；圖9為轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)化大麥子粒淀粉酶同工酶電泳圖(CK0-未發(fā)芽非轉(zhuǎn)基因種子，CK2-發(fā)芽2d非轉(zhuǎn)基因種子，A-發(fā)芽2d轉(zhuǎn)基因種子)；圖10轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大麥種子發(fā)芽勢比較圖(CK非轉(zhuǎn)基因種子，A-轉(zhuǎn)基因種子)。
具體實施例方式
按前述方法以晉引6號(JY6)、豫啤1號(YP1)、豫啤2號(YP2)、來色依(LSY)和Franklin、Harrington等大麥品種的幼胚作為受體材料進行受體材料準備，通過目的基因重組質(zhì)粒構建與繁殖、微彈制備與轟擊、愈傷組織的誘導、篩選與植株再生培養(yǎng)，獲得T0代再生植株49株。其中晉引6號13株，豫啤1號11株，豫啤2號2株，來色依3株，F(xiàn)ranklin 16株，Harrington 4株。
1、轉(zhuǎn)基因大麥再生植株與后代材料的分子檢測為確定目的基因的轉(zhuǎn)化情況，用PCR檢測和Southern雜交檢測方法對T0代再生植株進行了系統(tǒng)檢測，PCR和Southern雜交檢測方法參照《分子克隆實驗指南》(J.Sambrook等編寫，科學出版社1996)。對T0代植株的PCR檢測提取T0代再生苗和對照植株葉片基因組DNA，以含TrxS基因的質(zhì)粒DNA作為陽性對照，未轉(zhuǎn)化株的基因組DNA為陰性對照，用特異引物PI5’CAG CTC TGGATC CAG CAC AGG TTC 3’和PIII5’AGT GCC ACC GAA CAC AAC ATA CC 3’進行PCR擴增，電泳檢測結果見圖2。圖2表明在被檢測的T0代再生苗中，有35株在約886bp處有一條與質(zhì)粒DNA擴增產(chǎn)物一致的特異帶，陰性對照植株未能擴出目的片段。
為進一步檢驗擴增產(chǎn)物的特異性，用引物PI和PII5’GCA GAA GCA AACAAG GAT GGG 3’對出現(xiàn)明顯陽性片段植株的PCR產(chǎn)物進行嵌套PCR檢測(圖3)，得到約為478bp的單一目的片段，PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶CsP6I(5’-G↓CTA-3’)酶切后出現(xiàn)了稍大于250bp和約為100bp的兩個片段，這與預期酶切結果107bp+109bp+262bp相吻合。
同樣方法對T1代和T2代材料進行檢測(圖4，5)，證明轉(zhuǎn)基因植株中外源基因結構完整性。從瓊脂糖凝膠中回收目的片段做Southern雜交檢測(圖6)，經(jīng)雜交后都有陽性信號，證明PCR產(chǎn)物是TrxS基因的擴增產(chǎn)物。通過上述檢測試驗，進一步表明外源基因已遺傳到T2代植株中且完整性良好。
2、轉(zhuǎn)基因大麥材料的生理生化特性種子中Trx-h能促進淀粉酶和蛋白質(zhì)酶的活性提高、增加貯藏蛋白的可溶性，使種子中貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)更易于水解，啟動胚乳中的碳氮代謝。源于Phalaris coerulescens的TrxS基因與Trx-h基因同屬于硫氧還蛋白基因家族，二者的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物有相似的生物活性。將TrxS基因?qū)氪篼満?，將影響Trx-h活性蛋白質(zhì)的表達水平，進而影響淀粉酶活性、貯藏蛋白的相對還原狀態(tài)以及發(fā)芽勢等。
(1)Trx-h催化活性的變化參照Myeong的方法(Holmgren A.Thioredoxin[J].Ann.Rev.Biochem.1985，54237-271)制備TRX-h待測樣品。將轉(zhuǎn)基因籽粒的胚切去，研磨粉碎后按V/W＝5毫升/克加入提取液(50mM Tris-HCl buffer，pH8.0，1mM EDTA，0.5mM PMSF)振蕩浸提2小時，25000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收上清。重復一次、合并上清。用HCl調(diào)到中性，加入(NH4)2SO4鹽析，離心去除蛋白質(zhì)，收上清液。上清液經(jīng)透析除鹽后，將透析袋埋在干燥的交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50(Sephadex G-50)中吸水濃縮(4℃)，定期更換Sephadex G-50。對濃縮后的提取液進行65℃水浴熱處理15分鐘，離心、收集上清液作為TRX h待測樣品，-20℃保存。用二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)還原牛胰島素的反應來檢測Trx-h的催化活性(Xinmin Li，Jan D，David Hayman，et al.Thioredoxin activity in the C terminus of Phalaris coerulescens[J].ThePlant Journal，1995，8(1)133-138)。牛胰島素(insulin)被還原后，分子中兩個亞基間的二硫鍵斷裂，產(chǎn)生難溶的自由態(tài)B亞基，呈白色沉淀狀，并在650nm處有最大吸光值。Trx-h能催化這一還原反應，白色沉淀的產(chǎn)生速度反應了Trx-h的催化活性的高低。
設非轉(zhuǎn)基因種子的Trx-h提取物為陽性對照(CK)，未處理過樣品的Trx-h提取液為陰性對照(blank)。設R＝OD650/反應時間(分鐘)，R表示單位時間內(nèi)OD值的平均增長量，R值的高低反映了Trx-h的催化活性之高低。
對轉(zhuǎn)基因大麥種子和對照中的Trx-h活性測定結果見圖7。Trx-h能催化DTT還原牛胰島素的反應，OD650值與還原產(chǎn)物量呈正相關；相同的反應時間內(nèi)OD650上升越快，表明Trx-h催化活性越高。圖7中陽性對照(CK)在反應體系中OD650值上升明顯，而陰性對照(blank)的OD650值增長緩慢，這表明大麥Trx-h提取物對DTT還原牛胰島素的反應有明顯的催化作用。轉(zhuǎn)基因種子(A)的Trx-h催化活性又明顯高于CK，表明TrxS基因的導入增強了Trx-h的催化活性。從時間上看，反應進行12分鐘后，在轉(zhuǎn)基因種子Trx-h參與的反應中檢測到有還原產(chǎn)物出現(xiàn)；而CK的反應進行了25分鐘才檢測到有還原產(chǎn)物出現(xiàn)，明顯晚于前者。從還原產(chǎn)物增長率上看，在31分鐘的反應時間內(nèi)A、CK和blank的OD650值增長率分別為RA＝3.8×10-3/分鐘，RCK＝1.3×10-3/分鐘，Rblank＝0.22×10-3/分鐘。由(RA-Rblank)/(RCK-Rblank)＝3.3可知轉(zhuǎn)基因大麥中Trx-h的活性是CK的3.3倍。
(2)水溶蛋白和醇溶蛋白組分巰基的還原狀態(tài)變化種子中Trx-h/NADPH還原系統(tǒng)能提高胚乳的還原狀態(tài)，催化S-S還原形成還原態(tài)的巰基，因此巰基含量反映著蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)。按陳毓荃的方法(陳毓荃主編，生物化學研究技術[M].北京中國農(nóng)業(yè)出版社.1994)提取轉(zhuǎn)基因種子水溶蛋白和醇溶蛋白組分。取等體積的待測樣兩份，一份用于測定反映巰基含量的OD412(黃惠華，郭乾初，梁漢華等.豆奶蛋白組份和胰蛋白酶抑制劑活性的熱變化[J].營養(yǎng)學報.2001，23(2)140-144)，另一份用于測定反映該樣品蛋白質(zhì)含量的OD280(李建武，余瑞元，袁明秀等.生物化學實驗原理和方法[M].北京北京大學出版社.1994)。設K＝OD412/OD280，比值K反映了待測樣品中巰基含量與蛋白質(zhì)含量間的比率。
對發(fā)芽3天的轉(zhuǎn)基因種子和CK種子中水溶蛋白質(zhì)和醇溶蛋白質(zhì)組份中巰基含量比率(OD412/OD280)進行測定(圖8)。在兩種蛋白組份中，轉(zhuǎn)基因材料的巰基含量比率均高于對照，其中水溶蛋白質(zhì)中巰基含量比率是CK的1.5倍，醇溶蛋白質(zhì)中巰基含量比率是CK的2倍。說明發(fā)芽3天的轉(zhuǎn)基因種子的貯藏蛋白質(zhì)比對照有更高的還原狀態(tài)，也表明TrxS基因的導入，增強了Trx-h的表達量，從而使更多的貯藏蛋白質(zhì)，包括水溶蛋白質(zhì)和醇溶液蛋白質(zhì)中的二硫鍵(S-S)被還原成巰基(SH)。
(3)α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的變化以浸種后1天未發(fā)芽的籽粒和發(fā)芽3天的籽粒為材料測定淀粉酶活性。取0.5克不同處理的種子(去除根、芽)置于研缽中，加少量蒸餾水和石英砂，研磨成勻漿后按V/W＝5毫升/克加蒸餾水繼續(xù)研磨5分鐘，靜置60分鐘后15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收上清作為總淀粉酶提取物。用DNS法測定α-淀粉酶活性(K.Cui，S.Peng，Y.Xing，et al.Molecular dissection ofseedling-vigor and associated physiological traits in rice.Theoretical and Applied genetics.2002，105745-753)，取20微升總淀粉酶提取物于70℃加熱15分鐘后與80微升1％的淀粉溶液混合，37℃下反應5分鐘后迅速加入3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液于沸水中水浴5分鐘顯色，用水稀釋后在520nm下比色求出還原糖含量并計算出α-淀粉酶活力?；钚詥挝话?克植物材料1分鐘內(nèi)水解淀粉產(chǎn)生的麥芽糖量(毫克)計算。另取20微升總淀粉酶提取物加入2微升0.5摩爾/升的EDTA溶液混勻使α-淀粉酶失活，其它步驟同α-淀粉酶活性的測定，求出β-淀粉酶活性。設不加酶提取物的反應為對照，測定結果見表1。
表1淀粉酶活力比較(units/g·min)樣品 α-淀粉酶活力 β-淀粉酶活力未發(fā)芽種子 CK 5.1a 31aA4.5a 34a發(fā)芽種子CK 10.3a77.6aA11.9a88.7b注顯著性在0.05水平上。A-轉(zhuǎn)基因種子；CK-非轉(zhuǎn)基因種子。
表1表明未發(fā)芽轉(zhuǎn)基因種子與對照在淀粉酶活性上的差異不明顯；同未發(fā)芽的種子相比，發(fā)芽3天的種子中α-淀粉酶活力和β-淀粉酶活力有明顯的上升，其中α-淀粉酶活性在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因種子中分別上升1.64和1.01倍；β-淀粉酶活性變化極為明顯，發(fā)芽后轉(zhuǎn)基因種子的β-淀粉酶活性比非轉(zhuǎn)基因種子的β-淀粉酶活性高出11.1u。
(4)淀粉同工酶電泳分析用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳分析總淀粉酶的同工酶譜(胡能書，萬國賢.同工酶技術及應用[M].湖南科學技術出版社，1985)。電泳分離膠濃度為7％，分離膠緩沖液為0.12摩爾/升Tris-檸檬酸(PH8.9)；濃縮膠濃度為4％，濃縮膠緩沖液為0.12摩爾/升Tris-檸檬酸(PH6.8)；電極緩沖液為Tris-檸檬酸(PH8.9)。穩(wěn)壓80伏進行電泳，電泳時間約6小時。電泳畢，將膠板置于用0.15摩爾/升醋酸緩沖液(PH5.0)配制的1％的淀粉溶液中，在37℃保溫45分鐘。取出漂洗后用酸化的I2-KI液顯色15-30分鐘；照相觀察。相對遷移率表示為Rf＝分離膠上沿到淀粉酶帶中心距離(厘米)/分離膠上沿到溴酚蘭區(qū)帶中心距離(厘米)。以發(fā)芽2天的轉(zhuǎn)基因材料(A)和非轉(zhuǎn)基因材料(CK2)與未發(fā)芽對照(CK0)的淀粉同工酶譜電泳分析結果見圖9。從圖9可以看出，3條泳道中各有7條酶帶，且分布模式相同，相對遷移率(Rf)從上到下依次為0.23、0.32、0.39、0.46、0.54、0.59、0.64，但遷移率相同的酶帶在亮度上不盡相同，表明酶活性存在差異。酶活性強的地方淀粉水解得較為徹底，相應的酶帶亮度也較強，反之則酶帶亮度暗弱。在3條泳道中，Rf＝0.23的酶帶亮度基本相同，由CK2和CK0的比較可知發(fā)芽處理對其活性影響不大，說明該處的淀粉同工酶活性較穩(wěn)定；而Rf＝0.32和Rf＝0.39兩處的酶帶活性受發(fā)芽影響較大，未發(fā)芽的CK0的泳道中這兩條酶帶很弱，發(fā)芽2天的CK2和A的泳道中均有明顯的增強，A泳道中尤為突出；Rf＝0.64處的酶帶活性也有相似情況。轉(zhuǎn)基因材料A與CK2的差異主要表現(xiàn)為在Rf＝0.39-0.64這個區(qū)間A中淀粉酶條帶亮度均強于CK2，表明轉(zhuǎn)基因材料A的淀粉酶活性明顯大于CK2。
(3)種子發(fā)芽勢的變化對種子進行表面消毒，用70％的酒精浸泡1分鐘后用無菌水沖洗3次，再用0.1％的HgCl2浸泡5分鐘，無菌水沖洗3次。經(jīng)表面消毒和浸種處理后的種子置于24℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，進行3天的觀察記錄。
對轉(zhuǎn)基因種子(A)和對照(CK)的發(fā)芽勢進行比較(圖10)，由圖10可以看出，在3天的發(fā)芽勢比較試驗中，轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽勢始終高于對照，且種子發(fā)芽啟動快、比率高。在發(fā)芽的第1天、2天、3天發(fā)芽率就分別達到15％、40％、70％，分別是對照的3倍、2.6倍和1.4倍。這可能是因為目的基因?qū)牒螅岣吡伺c種子發(fā)芽相關的酶活性、增強種子的碳氮代謝，從而提高了種子的發(fā)芽勢。
權利要求
1.藍色黑鴨草的類硫氧還蛋白基因在啤酒大麥生產(chǎn)中的應用，把藍色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白基因(ThioredoxinS，TrxS)轉(zhuǎn)至普通大麥中得到大麥新材料。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，利用所述大麥新材料培育大麥新品種。
全文摘要
藍色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白基因(TrxS)在啤酒大麥生產(chǎn)中的應用，屬于轉(zhuǎn)基因大麥培育技術領域。應用方法包括(1)受體材料準備、(2)目的基因重組質(zhì)粒構建與繁殖、(3)微彈制備與轟擊、(4)愈傷組織的誘導、篩選與植株再生培養(yǎng)。利用本發(fā)明將藍色黑鴨草(Phalariscoerulescens)的類硫氧還蛋白基因TrxS導入啤酒大麥，可獲得穩(wěn)定遺傳、正常表達的轉(zhuǎn)基因大麥新材料。轉(zhuǎn)基因大麥籽粒中Trx－h(huán)活性、胚乳中蛋白質(zhì)還原狀態(tài)和籽粒中淀粉酶活性明顯提高，種子發(fā)芽勢明顯增強，有利于提高啤酒大麥的加工品質(zhì)、提高大麥的啤酒產(chǎn)出率。
文檔編號C12N15/29GK1626658SQ20031011021
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權日2003年12月12日
發(fā)明者尹鈞, 衛(wèi)麗, 劉雷, 王新國 申請人:國家小麥工程技術研究中心