甜菜m14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其編碼的蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甜菜基因及其編碼的蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜菜是我國北方主要的制糖原料，而甜菜M14品系是郭德棟教授將二倍體栽培甜 菜（Beta vulgaris L.)與四倍體野生型白花甜菜（B. corollifiora Zoss.)進(jìn)行種間雜交 及回交獲得的，在栽培甜菜第18條染色體上附加有野生白花甜菜第9號染色體的單體附 加系。甜菜M14品系在轉(zhuǎn)錄組水平、基因組水平以及蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了廣泛的研宄，并將 數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。其中，主要研宄的基因以及蛋白質(zhì)有：半胱氨酸蛋白酶抑制劑（BvM14-Cys tatin)基因、咖啡酰輔酶A-0-甲基轉(zhuǎn)移酶（BvM14-CCoA0MT)基因、乙二醛酶I (BvM14-Gly oxAla se I )基因等。分析表明，這些基因均對甜菜M14品系在高鹽、干旱以及氧化脅迫 起到重要作用?？梢妳⑴c甜菜M14品系抵抗非生物脅迫的過程是一個(gè)多基因參與的過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其編碼的蛋白，可 進(jìn)一步深入研宄甜菜M14品系耐鹽、耐旱的機(jī)制，為之后的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和研宄奠定基礎(chǔ)。
[0004] 硫氧還蛋白過氧化物酶（Thioredoxin peroxidase, Tpx)，是過氧化物酶 (Peroxiredoxin，Prx)家族的一員。植物中的硫氧還蛋白過氧化物酶能夠按照氨基酸序列 分為四個(gè)不同的亞家族，它們區(qū)別于保守半胱氨酸殘基的數(shù)量及位置；分別是2-Cys Prx、 Prx II、PrxQ 及 l_Cys Prx。
[0005] 本發(fā)明甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO :1中核 苷酸序列所示。
[0006] 本發(fā)明甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示。
[0007] 本發(fā)明甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因（BvM14_Tpx) cDNA全長為 1044bp。甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基包含的最大開放閱讀框（0RF)由489bp組 成如SEQ ID NO :3中核苷酸序列所示，編碼162aa，該開放閱讀框編碼的氨基酸序列含有兩 個(gè)半胱氨酸殘基，三個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，一個(gè)?；稽c(diǎn)，四個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位 點(diǎn)。
[0008] 熒光定量分析結(jié)果顯示甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因在甜菜M14品系 根、莖、葉、花中廣泛表達(dá)，且根中表達(dá)量最高。
[0009] 構(gòu)建甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因（BvM14_Tpx)植物表達(dá)載體，對 擬南芥突變株（tpx)進(jìn)行恢復(fù)。對轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性恢復(fù)植株幼苗進(jìn)行5mmol/L H202和 100mm〇l/L NaCl脅迫處理，以野生型擬南芥（WT)及擬南芥突變株（tpx)幼苗為對照，觀察 及測定擬南芥的生長及根長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性恢復(fù)植株幼苗生長狀況、根 長情況與野生型擬南芥幾乎一致，并好于擬南芥突變株（tpx)，證明甜菜M14品系硫氧還蛋 白過氧化物酶基因在擬南芥（tpx)突變恢復(fù)植株中的能夠恢復(fù)擬南芥對氧化及高鹽化脅 迫的抵御能力，能夠與擬南芥中的Tpx基因行使相同的功能。以野生型擬南芥（WT)為對照， 對轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性恢復(fù)植株進(jìn)行熒光定量PCR測定BvM14-Tpx在轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植 株中的表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株中BvM14-Tpx的表達(dá)量高于野生型擬南芥 (WT)中擬南芥Tpx基因的表達(dá)量，說明BvM14-Tpx在轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株中成功表達(dá)， 且表達(dá)量高于野生型植株（WT)，能夠提高擬南芥對氧化以及鹽化脅迫的耐受性；氧自由基 含量測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株中氧自由基與野生型擬南芥（WT)基本一致，低 于擬南芥突變株（tpx);同時(shí)K+離子含量的測定結(jié)果顯示5mmol/L H202及100mmol/L NaCl 脅迫處理前后K+離子含量沒有明顯變化，說明H 202及NaCl并不影響K +的積累和運(yùn)輸；而 Na+離子含量的測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株中Na+離子含量與野生型擬南芥（WT) 基本一致，均低于擬南芥突變株（tpx)中的Na+離子含量，說明BvM14-Tpx在轉(zhuǎn)基因擬南芥 恢復(fù)株中能夠與擬南芥Tpx基因行使相同的功能，能夠降低氧自由基以Na+離子在葉片中 的積累。
[0010] 本發(fā)明甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因能夠應(yīng)答氧化、高鹽化脅迫，能 夠通過應(yīng)答氧化脅迫進(jìn)而抵御鹽化脅迫，可提高植物抗非生物脅迫能力，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物 的抗氧化及抗高鹽化脅迫的能力。
[0011] 甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因所編碼蛋白的氨基酸序列的親水性/疏 水性預(yù)測結(jié)果如圖1所示。
【附圖說明】
[0012] 圖1是甜采M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因所編碼蛋白的氣基酸序列的親水 性/疏水性預(yù)測結(jié)果圖。
[0013] 圖2是甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因在花、葉、莖和根組織中表達(dá)量測 試結(jié)果圖。
[0014] 圖3是實(shí)施例1中5mmol/L H202脅迫下植株的根長對比測試結(jié)果圖。
[0015] 圖4是實(shí)施例1中100mmol/L NaCl脅迫下植株的根長對比測試結(jié)果圖。
[0016] 圖5是實(shí)施例1中氧化脅迫下氧自由基含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0017] 圖6是實(shí)施例1中鹽化脅迫下氧自由基含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0018] 圖7為5mmol/LH202脅迫下植物體內(nèi)鉀、鈉離子含量的測定結(jié)果圖。
[0019] 圖8為100mmol/L NaCl脅迫下植物體內(nèi)鉀、鈉離子含量的測定結(jié)果圖。
[0020] 圖9是氧化脅迫下BvM14_Tpx基因表達(dá)量測試結(jié)果圖。
[0021] 圖10是鹽化脅迫下BvM14-Tpx基因表達(dá)量測試結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0023] 一：本實(shí)施方式甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因核苷酸序 列如SEQ ID NO :1中核苷酸序列所示。
[0024]
【具體實(shí)施方式】二：本實(shí)施方式甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因編碼蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] ①cDNA第一鏈的合成：
[0027] 利用TaKaRa RNA PCR Kit，以甜菜M14品系花、葉、莖、根總RNA為模板，按表1組 成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：
[0028] 表 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1中核苷酸序列所示。
2. 權(quán)利要求1所述甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因編碼的蛋白，其特征在于 該蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
【專利摘要】甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因及其編碼的蛋白。它涉及一種甜菜基因及其編碼的蛋白。本發(fā)明提供的基因及編碼的蛋白，可進(jìn)一步深入研究甜菜M14品系耐鹽、耐旱的機(jī)制，為之后的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和研究奠定基礎(chǔ)。甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中核苷酸序列所示。編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本發(fā)明甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因cDNA全長為1044bp。
【IPC分類】C12N15-53, C12N9-08
【公開號】CN104789577
【申請?zhí)枴緾N201510243374
【發(fā)明人】馬春泉, 趙晨曦, 于冰, 李海英, 陳思學(xué), 南景東, 王琳, 姜帥
【申請人】黑龍江大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月13日