專利名稱：：硫氧還蛋白還原酶抑制劑化合物及其制備方法和其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新型的有機硒化合物，特別涉及一種硫氧還蛋白還原酶抑制劑化合物及其制備方法和其應用。
背景技術：
：硫氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxinreductase,TrxR)、硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)禾口煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedi薦leotidephosphate，NADPH)。研究已表明，硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)與癌癥的關系密切l(wèi))Trx和TrxR為癌癥的標志性物TrxR在腫瘤細胞中表達量是正常組織的10倍。Turunen等通過免疫組化的方法研究了Trx和TrxR在乳腺癌患者體內的表達情況，結果是Trx和TrxR在患者細胞質中的陽性率分別為67%和59%，在細胞核中的陽性率為55%和6%。并且，Trx在細胞核和細胞質中均為陽性的乳腺癌患者的癌細胞增殖很快，病程很短丄incoln等采用免疫細胞化學法測定TrxR在人原發(fā)乳腺癌、甲狀腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌及惡性黑色素瘤中的定位與表達，結果顯示，侵襲力強的腫瘤過度表達TrxR，且增殖力強、凋亡率低、轉移力高。YooMH等人完成的腫瘤細胞TrxRl基因敲除實驗證明，TrxRl在腫瘤細胞中是必不可少的；2)Trx系統(tǒng)參與腫瘤發(fā)展的不同階段，并表現(xiàn)出在腫瘤細胞中過量表達、促進腫瘤增殖、表達促存活信號和啟動促存活過程等特點。因此，抑制TrxR的表達對抑制腫瘤生長和轉移等環(huán)節(jié)具有非常重要的作用。CN1166651C、CN1281593C、CN1242999C、CN1280279A、CN1704408A、CN1704409A、CN1704410A、CN1853627A和CN1990475A分別公開了"具有抗炎和抗腫瘤作用R-雙或糖苯丙異硒唑取代化合物"、"苯并異硒唑衍生物的免疫調節(jié)和生物治療作用"、"苯并異硒唑衍生物及其應用"、"雙苯并異唑酮類化合物及其合成和應用"、"異硒唑酮類化合物和其配合物及其應用"、"具有抗纖維化及抑制明膠酶活性的化合物及其應用"、"苯并異硒唑酮衍生物及其制備方法與應用"、"雙苯并異硒唑乙烷環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物及其制備方法和其用途"、"取代苯并異硒唑酮類化合物及其用途"。這些申請或專利所公開的內容均作為本申請的參考。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種硫氧還蛋白還原酶抑制劑化合物，所述化合物具有下述I-X結構4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抑制硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性的藥物組合物，由化合物i-x的任一種或其組合與藥物上可接受的載體組成。本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的藥物組合物，由化合物I-X的任一種或其組合與藥物上可接受的載體組成。進一步，組合物中化合物I-X:輔料的重量比為0.001-99:1-99，優(yōu)選為0.001-90:1-95，更優(yōu)選為0.001-80:1-90，最優(yōu)選為0.001-70:1-85。進一步，組合物中化合物I-X的重量百分含量為1-99%，優(yōu)選為5-95%，還優(yōu)選為10-90%，更優(yōu)選為15-85%，最優(yōu)選為20-80%。本發(fā)明的組合物可為本領域熟知的各種劑型。適合于本發(fā)明的劑型可以為口服制劑、外用制劑或注射劑，優(yōu)選為口服制劑或注射劑。所述口服制劑選自包合制劑、分散劑、口服液、片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸、丸劑、散劑、糖漿劑、合劑、露劑、懸浮劑、泡騰劑、糊劑、混懸液、乳劑或茶劑；優(yōu)選為包合制劑、或分散劑；優(yōu)選所述懸浮劑選自干懸劑或懸浮液；所述外用制劑選自凝膠齊U、膏齊U、貼膏齊iJ、膏藥、霜齊iJ、軟膏齊iJ、搽齊iJ、洗齊iJ、栓齊iJ、涂抹劑或凝膏劑；所述注射劑選自針劑(注射液)、輸液或凍干粉針等?？刹捎帽绢I域熟知的制劑技術手段制備得到本發(fā)明的組合物。所述的藥學上可接受的載體為本領域熟知用于制備上述制劑的常用賦形劑或輔料，口服制劑或外用制劑常用的賦形劑或輔料包括但不僅限于填充劑(又稱稀釋劑)、潤滑劑(又稱助流劑或抗粘著劑)、分散劑、濕潤劑、粘合劑、調節(jié)劑、增溶劑、抗氧劑、抑菌劑、乳化劑、矯味劑或賦香劑等。粘合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、纖維素及其衍生物、明膠漿、糖漿、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選的纖維素衍生物為微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素或羥丙甲基纖維素；填充劑，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纖維素及其衍生物、無機鈣鹽、山梨醇或甘氨酸，優(yōu)選無機鈣鹽為硫酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣或沉降碳酸鈣；潤滑劑，例如微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、氫氧化鋁、硼酸、氫化植物油或聚乙二醇；崩解劑，例如淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮或微晶纖維素，優(yōu)選的淀粉衍生物為羧甲基淀粉鈉、淀粉乙醇酸鈉、預膠化淀粉、改良淀粉、羥丙基淀粉或玉米淀粉；濕潤劑，例如十二烷基硫酸鈉、水或醇等。所述注射劑常用的賦形劑或輔料包括但不僅限于抗氧劑，例如亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉；抑菌劑，例如0.5%苯酚、0.3%甲酚、0.5%三氯叔丁醇；酸堿調節(jié)劑，例如鹽酸、枸櫞酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、枸櫞酸鈉及緩沖劑磷酸鹽及其緩沖液；乳化劑，例如聚山梨酯_80、沒酸山梨坦、普羅尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂；增溶劑，例如吐溫_80、膽汁、甘油等。另外，還可將活性成分與藥學上可接受的緩控釋載體按其制備要求加以混合，再按照本領域熟知的緩控釋制劑的制備方法，如加入阻滯劑包衣或將活性成分微囊化后再制成微丸，如緩釋微丸或控釋微丸；所述的緩控釋載體包括但不僅限于油脂性摻入劑、親水膠體或包衣阻滯劑等，所述的油脂性摻入劑選自單硬脂酸甘油酯、氫化蓖麻油、礦油、聚硅氧烷或二甲基硅氧烷的任一種或其組合；所述的親水膠體選自羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、PVP、阿拉伯膠、西黃耆膠或卡波普的任一種或其組合；所述的包衣阻滯劑選自乙基纖維素(EC)、羥丙甲基纖維素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、丙烯酸類樹脂的任一種或其組合。本發(fā)明的另一目的在于提供化合物I-X或其組合物在制備具有抑制硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性藥物中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供化合物I-X或其組合物在制備具有抗腫瘤活性藥物中的應用，所述腫瘤包括實體瘤或白血病，優(yōu)選為實體瘤，所述實體瘤選自甲狀腺癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、結腸癌、胃癌、頜下腺癌、鼻咽癌或乳腺癌，優(yōu)選為結腸癌、胃癌、頜下腺癌。本發(fā)明的化合物I和II用于治療腫瘤的給藥劑量約為0.05-250mg/Kg體重，優(yōu)選為0.5-200mg/Kg體重，更優(yōu)選為2-100mg/Kg體重，最優(yōu)選為5-80mg/Kg體重?；衔颕和II的實際給藥劑量可根據患者的病情、體質、體重、年齡、性別等因素進行適當調整。具體實施例方式以下將結合實施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術方案，并非限定本發(fā)明的實質。實施例1化合物VI的制備合成路線<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>合成步驟1)將0.lmmol的2_羥基_1，3_丙二胺溶解于20ml的二氯甲烷中，滴加0.2mmo1的三乙胺，攪拌；2)將0.lmmol的硒氯溶解于10ml的二氯甲烷中，然后在常溫下將其滴加到1)步所得的反應液中，直至析出固體。MS-FAB(m/z):453。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>中間體6合成步驟2.1雙硒二(5-羥基)苯甲酸(下稱"中間體4")的合成2.1.l雙硒化鈉制備同CN1166651C中公開方法。2.1.25-羥基-2氨基苯甲酸重氮鹽的制備1)在冰鹽浴條件下，在燒杯中加入2.8克雙硒化鈉，再加入6ml鹽酸和24ml水；2)取1.6克亞硝酸鈉放入燒杯中，再加入6ml水和少量冰塊；3)將2)步所得反應液滴加到1)步所得反應液中，充分反應，即得。2.1.3中間體4的制備1)在冰浴和ra>9條件下，將2.1.2制得重氮鹽滴加到2.1.1制得的雙硒化鈉，室溫條件下反應2h;2)將鹽酸水=i:i滴加到i)步所得反應液中，滴至ra=2為止，抽濾，干燥，得固體；3)在煮沸條件下，將2)步所得固體倒入濃度為11.67%的碳酸鈉水溶液中，溶解后抽濾，得濾液；4)將鹽酸水=1:1滴加到3)步所得濾液中，滴至其PH=2為止，抽濾，干燥，即得。2.2中間體5的合成1)取20ml甲醇和2ml水置于燒瓶中，放入0.8g氫氧化鉀，使其熔化，得熔化液；2)在油浴(80°C)條件下，在1)步所得熔化液中加入0.8g中間體4，反應0.5h，加入1.2ml.碘甲烷，反應回流16h后，加鹽酸酸化和加水，加入乙酸乙酯萃取，取上層有機相；3)在2)步所得有機相中加入無水硫酸鈉干燥，旋干得油狀物質，經直空干燥，得固體。2.35-甲氧基-2硒氯苯甲酰氯(下稱"中間體6")的合成取0.6g中間體5于燒瓶中，加入1滴DMF和5ml二氯亞砜，回流反應3h后，減壓蒸餾回收二氯亞砜，加入30ml石油醚，再回流0.5h，取石油醚層，旋干石油醚層后，加入二8氯甲烷備用。2.4化合物VII的合成取適量中間體6置于圓底燒瓶中，滴入乙二胺的二氯甲烷溶液，再滴加與乙二胺等量的三乙胺，常溫下攪拌2h，抽濾，得固體。MS-FAB(m/z):483。實施例3化合物VI11的制備合成路線目標產物3.12-(2-羥基)-苯并異硒唑-3-(2H)-酮(下稱"中間體l")的合成取lg硒氯苯甲酰氯溶于10ml二氯甲烷中，慢慢滴加于溶有乙醇胺的二氯甲烷溶液中，滴加完全后室溫反應2h，抽濾，干燥，即得。3.22-(2-氯)-苯并異硒唑-3-(2H)-酮(下稱"中間體2")的合成9方法1:取lg中間體1于圓底燒瓶中，加入7ml二氯亞砜，回流8h后，減壓蒸餾回收二氯亞砜，再加入乙醇旋干，盡量回收二氯亞砜。然后，注入水和乙醚萃取，取醚層；旋干醚層，干燥，即得。方法2:取0.6g二氯乙胺鹽酸鹽和0.6g氫氧化鈉，將其溶于二氯甲烷和水的混合溶液中；將硒氯苯甲酰氯二氯甲烷溶液(lg/10ml)緩慢滴加于前述混合溶液中，室溫反應3h，回流24h，即得產物。3.32-(2-氨基)-苯并異硒唑-3-(2H)-酮(下稱"中間體3")的合成1)取O.21g四氮六甲圜，將其加入到10倍重量的95%的熱乙醇中，再加入0.25g碘化鈉，緩慢加入0.40g中間體2，反應4h，抽濾，得固體；2)用稀鹽酸溶解1)步所得固體，抽濾，得水溶液；3)在2)步所得水溶液中加入氫氧化鈉飽和溶液，抽濾，即得。中間體4-6的合成同實施例3。3.4化合物VIII的制備1)將0.lmmol的中間體3溶解于20ml的二氯甲烷中，滴加入0.2mmo1三乙胺，攪拌；2)將0.lmmol的中間體6溶解于10ml的二氯甲烷中，常溫下將其滴加到1)步所得的反應液中，直至析出固體，即得。MS-FAB(m/z):453。實施例4化合物IX的制備合成路線<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>合成步驟1)在二氯甲烷中，加入等摩爾量的硒氯苯甲酰氯與對氨基苯甲酸，以及二倍量的三乙胺，反應3h，抽濾，干燥，得白色固體；2)在20ml乙酸酐中，加入l)步所得固體O.lmol，回流12h，減壓回收乙酸酐，得到油狀固體，加入異丙基醚回流萃取三次后，合并萃取液，于4t:保存，次日析出固體；3)在二氯甲烷中，加入等量的2'-脫氧_2'2'_二氟胞嘧啶鹽酸鹽與三乙胺，常溫攪拌3h，收集析出的不溶白色固體，得2'-脫氧_2'2'-二氟胞嘧啶；4)在DMF中，加入等量的2'_脫氧_2'2'_二氟胞嘧啶鹽酸鹽與2)步反應所得固體，常溫攪拌，24h后旋干DMF，加水，析出固體產物，即得。MS-FAB(m/z):564。實施例5化合物X的制備合成路線<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>合成步驟1)在適量二氯甲烷中，加入等量的2'-脫氧_2'2'-二氟胞嘧啶鹽酸鹽與三乙胺，常溫攪拌3h，收集析出的固體，即得去鹽酸化的2'-脫氧_2'2'-二氟胞嘧啶；2)在20ml二氯甲烷中，加入等摩爾量(0.lmmol)的2'_脫氧_2'2'_二氟胞嘧啶與硒氯苯甲酰氯，反應3h，旋干溶劑，再加入50ml水，攪拌，析出固體，即得。MS-FAB(m/z):445。實施例6化合物I-X體外對硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的抑制活性采用DTNB還原法研究化合物I-VI體外對硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的抑制活性。6.1實驗材料DTNB，純化提取的TrxR(0.34mg/mL儲備液)，NADPH購自Sigma公司。6.2試驗原理<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>DTNB的還原產物TNB呈黃色，在412nm有紫外吸收，可用于監(jiān)測酶促反應速度，以反映TrxR的酶活力。6.3試驗工作溶液配制6.3.1TrxR工作液的配制精密量取175yL濃度為0.34mg/mL的TrxR儲備液，將其稀釋到500iiL，將其配制成濃度為0.119mg/mLTrxR工作液；6.3.2NADPH工作液的配制精密稱取5mgNADPH，將其溶于12mL磷酸鉀緩沖液中，將其配制成濃度為0.5mM的工作液；6.3.3DTNB工作液的配制精密稱取25mgDTNB，將其溶于63mL的DMSO中，將其配制成濃度為lmM工作液；6.3.4磷酸鉀緩沖體系的配制將0.2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和lmM的EDTA加入到4的磷酸鉀緩沖液中(磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀)，即得。6.4試驗步驟硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)在NADffl的參與下，催化胰島素的二硫鍵還原反應，使胰島素的二硫鍵被打開，胰島素裂解為兩條單鏈，其催化反應如下Trx-S2+NADPH+H+__Trx-(SH)2+NADP+Trx-(SH)2+胰島素一Trx_S2+胰島素_H2NADra在340nm下有敏感的吸光度峰，且NADffl的消耗代表了酶促反應的速度，可通過檢測340nm吸光度下降的速度來反映酶活力。反應體系在O.5ml的微量比色皿中，依次加入胰島素、NADPH、Trx和待測樣品，補充反應緩沖液(0.lmol/L磷酸鉀/2mmol/LEDTA)至總體積0.5ml，所得反應體系中各成份的濃度為胰島素130iimol/L、NADPH0.4mmol/L、Trx4ymol/L和待測樣品，將其置入紫外分光光度計中，連續(xù)檢測反應體系在340nm處的吸光度變化。按照下述計算公式計算酶活力?；钚詥挝欢x為1U=AA340nm/mir^l000，樣品中TR活性以U/L計，結果參見表1。實施例7化合物I-X的體外抗腫瘤活性研究采用MTT法研究化合物I-IX體外對乳腺癌細胞(MCF-7)的抑制活性。取處于對數(shù)生長期濃度為5X104個/ml的MCF-7細胞，接種于96孔板，180y1/孔，待貼壁后每孔加入20ii1濃度分別為0iiM/ml，5iiM/ml，10iiM/ml，20iiM/ml，50iiM/ml，100iiM/ml的藥物，分別于24h、48h、72h加入5mg/ml的MTT(20yl/孑L)，放入C02孵箱培養(yǎng)34h后，3000r/min離心，棄上清，待風干后加入酸化異丙醇，在酶標儀570nm處測OD值。細胞存活率％=(加藥細胞OD-空白組OD)/(對照細胞OD-空白組OD)X100;細胞殺傷率％=1-細胞存活率％，結果參見表1。表1化合物I-X體外對硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和腫瘤細胞(MCF_7)的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>小結除X化合物外，化合物I-IX對硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的抑制活性非常明顯，同時，化合物I-IX對MCF-7腫瘤也表現(xiàn)有效的抑制作用，由此初步推定，化合物I-IX對硫氧還蛋白還原酶的抑制作用與其抗腫瘤作用之間具有一定的相關性。權利要求一種硫氧還蛋白還原酶抑制劑化合物，所述化合物具有下述I-X結構2.—種具有抑制硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性的藥物組合物，由權利要求l所述的化合物i-x的任一種或其組合與藥物上可接受的載體組成。3.—種具有抗腫瘤活性的藥物組合物，由權利要求1所述的化合物I-X的任一種或其組合與藥物上可接受的載體組成。4.根據權利要求2或3所述的藥物組合物，組合物中化合物I-X:輔料的重量比為0.001-99:1-99。5.根據權利要求2或3所述的藥物組合物，組合物中化合物I-X的重量百分含量為1-99%。6.根據權利要求2-5任一項所述的藥物組合物，所述組合物的劑型選自口服制劑、外用制劑、注射劑或其緩控釋制劑。7.權利要求1所述的化合物I-X和/或權利要求2、4-6任一項所述的組合物在制備具有抑制硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性藥物中的應用。8.權利要求1所述的化合物I-X和/或權利要求3-6任一項所述的組合物在制備具有抗腫瘤活性藥物中的應用。9.根據權利要求8所述的應用，所述腫瘤包括實體瘤或白血病。10.根據權利要求9所述的應用，所述實體瘤選自甲狀腺癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、結腸癌、胃癌、頜下腺癌、鼻咽癌或乳腺癌。全文摘要本發(fā)明公開了一種硫氧還蛋白還原酶抑制劑化合物，該類化合物還具有抗腫瘤活性，尤其表現(xiàn)對實體瘤的生長抑制活性，所述實體瘤選自甲狀腺癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、結腸癌、胃癌、頜下腺癌、鼻咽癌或乳腺癌。文檔編號C07D421/14GK101781283SQ20091007716公開日2010年7月21日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權日2009年1月16日發(fā)明者曾慧慧申請人:曾慧慧