專利名稱：人乳頭瘤病毒hpv基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片，特別是涉及人乳頭瘤病毒HPV基因芯片。
背景技術(shù)：
眾所周知，婦女占全人類的一半，婦女健康不僅關(guān)系到婦女自身切身利益，同時(shí)也關(guān)系到人類后代的繁衍生殖。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus HPV)作為婦女致病微生物，可感染婦女的皮膚與黏膜上皮細(xì)胞，引起婦女生殖器官多種良性、惡性腫瘤病變，嚴(yán)重威脅婦女健康。各國(guó)的許多婦產(chǎn)科專家普遍認(rèn)為，人乳頭瘤病毒HPV感染，已被流行病學(xué)和生物學(xué)證明是引起婦女宮頸癌及其癌前病變的重要因素。在全世界范圍內(nèi)幾乎所有宮頸癌組織中均可檢測(cè)到HPV-DNA，同時(shí)HPV型別與它不同部位的組織的親嗜性密切相關(guān)，所導(dǎo)致的疾病不盡相同?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少有58種不同型別的HPV與其特殊解剖部位有關(guān)。所以HPV-DNA的檢測(cè)及分型在對(duì)其相關(guān)疾病的診斷、防治、判斷預(yù)后，深入研究HPV致癌機(jī)理等方面具有重要意義。
1、HPV病毒形態(tài)。HPV病毒是一類雙鏈環(huán)狀小分子DNA病毒，屬乳多空病毒科乳頭瘤病毒屬。毒粒直徑約45～55nm，呈二十面對(duì)稱體，有72個(gè)殼體，毒粒有含有DNA和蛋白質(zhì)，無包膜。
2、HPV-DNA結(jié)構(gòu)。HPV-DNA約7.9kbp，所有開放讀碼框架由一條DNA鏈編碼，并有基因重疊。按功能分為三個(gè)區(qū)E區(qū)為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)，L區(qū)為晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)，URR區(qū)為上游調(diào)節(jié)區(qū)。E區(qū)約占4kbp，編碼8個(gè)開放讀碼框架，依次為E6，E7，E1，E8，E2，E4，E3，E5。E區(qū)的功能涉及DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化；L區(qū)長(zhǎng)約3kbp，有兩個(gè)開放讀碼框架L1，L2，分別編碼病毒的主要和次要衣殼蛋白；URR區(qū)位于L1和E6之間，長(zhǎng)約1kbp，為非編碼區(qū)，在基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯中起調(diào)節(jié)作用。
由于HPV體外增殖非常困難，到目前為止尚無可靠的血清學(xué)分型方法。對(duì)HPV感染的診斷，傳統(tǒng)的方法是通過形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，如巴氏涂片法，液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，陰道鏡檢查，組織病理學(xué)檢查，電鏡直接觀察HPV病毒顆粒，放射免疫沉淀法檢測(cè)患者血清中HPV16抗體水平，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)患者血清中HPV-E6，E7特異性抗體等。這些傳統(tǒng)的HPV檢測(cè)方法靈敏度和特異性均不夠理想，存在較高的假陽(yáng)性率和假陰性率，并且不能對(duì)HPV進(jìn)行分型。
最近十幾年來，許多科學(xué)工作者為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)方法對(duì)HPV進(jìn)行檢測(cè)，這些方法主要包括核酸雜交法，聚合酶鏈反應(yīng)PCR法。這些方法有的靈敏度不高，有的特異性差，有的比較費(fèi)時(shí)間，有的易發(fā)生交叉感染，假陽(yáng)性率高，有的操作繁瑣且不能分型。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，上世紀(jì)九十年代出現(xiàn)了基因芯片技術(shù)，美國(guó)Affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代末至九十年代初，率先開展基因芯片研究。1992年該公司運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在1cm2左右的玻璃片上原位合成寡核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片?；蛐酒钤缡怯捎诟咄浚笠?guī)模研究基因功能的需求而產(chǎn)生，但隨著基因芯片技術(shù)上的日漸成熟，人們驚喜的發(fā)現(xiàn)基因芯片在傳染病和遺傳病的診斷上有獨(dú)特的應(yīng)用前景和巨大商業(yè)市場(chǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服已知技術(shù)的缺陷，運(yùn)用分子生物學(xué)的前沿技術(shù)，生產(chǎn)出人乳頭瘤病毒檢測(cè)及分型基因芯片。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種人乳頭瘤病毒(HPV)基因芯片，含有固相載體基片，在芯片上固化有監(jiān)控顯示點(diǎn)樣，HPV檢測(cè)探針點(diǎn)樣，監(jiān)控顯示點(diǎn)樣含有陽(yáng)性對(duì)照顯示點(diǎn)樣，陰性對(duì)照顯示點(diǎn)樣，空白對(duì)照顯示點(diǎn)樣，HPV檢測(cè)探針包括HPV通用性探針和HPV各類型特異性探針。
陽(yáng)性對(duì)照顯示點(diǎn)樣是一任選的與HPV不同源的寡核苷酸片段，其序列為5’-NH2-T10-CGAGTCCAGTGCATGGACAG-3’，陰性對(duì)照顯示點(diǎn)樣為與HPV沒有同源性的一任選寡核苷酸片段，其序列為5’-NH2-TTAATTATTACAAGCGCAACAG-3’，空白對(duì)照顯示為不含任何基因的點(diǎn)樣，HPV通用探針是人工合成的一寡核苷酸片段，與HPV L1區(qū)內(nèi)一段保守基因段完全互補(bǔ)，其序列為5’-NH2-T8-GTRYTNCGDGTDGTATCHACHACNGT-3’，各類型HPV特異性探針為人工合成的多條寡核苷酸片段，分別與該類型HPV L1區(qū)內(nèi)特異性較高的一段基因片段互補(bǔ)。
HPV特異性探針為

HPV特異性探針為

HPV特異性探針為

HPV特異性探針為

HPV特異性探針為

HPV特異性探針為

HPV特異性探針為


固相載體基片可為玻璃片，或硅片，或尼龍膜，或硝酸纖維膜，或凝膠，或雜交膜，陽(yáng)性顯示點(diǎn)樣為每一排的第一列點(diǎn)樣，陰性顯示和空白顯示為最后兩排點(diǎn)樣，另外各排點(diǎn)樣依次為HPV通用探針，HPV特異性探針。
本發(fā)明的有益積極效果基因芯片技術(shù)是二十世紀(jì)九十年代初期發(fā)展起來的一門由分子生物學(xué)、微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多門學(xué)科交叉融合而成的高新技術(shù)，它是將大量探針固化于固相支持物上，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，得出樣品的遺傳信息。該技術(shù)具有高通量，大規(guī)模，高度并行性，快速高效，高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以節(jié)約試劑和樣品，而且將節(jié)省大量的人力、物力和時(shí)間，使基因檢測(cè)更為快速、敏感和精確?；蛐酒夹g(shù)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)中，并發(fā)揮著巨大的作用。
人乳頭瘤病毒作為人類致病微生物嚴(yán)重威脅著人類的健康，目前已有100多種不同型別的HPV被鑒定，不同型別的HPV可導(dǎo)致不同的疾病。HPV感染已被流行病學(xué)和生物學(xué)證明是引起宮頸癌及其癌前病變的首要原因，對(duì)HPV進(jìn)行檢測(cè)及分型是一種有效的、可靠的宮頸癌篩查手段。然而，傳統(tǒng)的HPV檢測(cè)方法主要是通過形態(tài)學(xué)和免疫組化法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，這些檢測(cè)方法的靈敏度和特異性均不夠理想，存在較高的假陽(yáng)性率和假陰性率，且不能對(duì)HPV進(jìn)行分型。常用的分型方法有PCR、原位雜交、線樣探針分析、等，它們存在易污染、假陽(yáng)性率高、靈敏度不高、操作繁瑣、對(duì)混合感染難以判斷、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，難以推廣應(yīng)用。
目前尚無有關(guān)HPV檢測(cè)分型芯片的研究，我們將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于HPV的檢測(cè)及分型。本研究制備的HPV檢測(cè)及分型基因芯片是采用點(diǎn)樣法制作的低密度芯片，可以根據(jù)實(shí)際需要設(shè)計(jì)芯片探針數(shù)量。
1、人乳頭瘤病毒基因芯片，能一次檢測(cè)多種常見類型HPV，大大提高了HPV的檢測(cè)效率，縮短檢測(cè)時(shí)間。
2、HPV基因芯片檢測(cè)分型操作簡(jiǎn)單，通過一次雜交檢測(cè)不僅可以判斷樣品中是否存在HPV感染，而且可以鑒別出屬于哪種型別的感染，便于臨床推廣應(yīng)用。
3、HPV基因芯片針對(duì)性強(qiáng)，對(duì)樣品中的HPV-DNA直接進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)出HPV的潛伏期感染，克服了血清學(xué)和免疫組化檢測(cè)法對(duì)潛伏感染會(huì)產(chǎn)生漏檢的缺陷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV疾病的早期快速診斷。
4、HPV基因芯片，敏感性高，特異性強(qiáng)。通過基因序列比對(duì)設(shè)計(jì)了HPV特異性寡核苷酸探針，同時(shí)在芯片上設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，對(duì)芯片的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，排除假陽(yáng)性、假陰性，使檢測(cè)結(jié)果更加可靠。
5、HPV基因芯片能同時(shí)檢測(cè)多種HPV型別，對(duì)多重HPV感染的判斷一目了然，克服了其它HPV檢測(cè)方法難以判斷混合感染或操作繁瑣的缺點(diǎn)。
6、檢測(cè)結(jié)果客觀性強(qiáng)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行掃描分析和數(shù)據(jù)處理，大大降低了分析結(jié)果判斷過程中人為的主觀因素。
四、說明書附圖

圖1HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之一圖2HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之二圖3HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之三圖4HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之四圖5HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之五圖6HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之六圖7HPV基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖之七圖8HPV6感染陽(yáng)性顯示掃描9HPV11感染陽(yáng)性顯示掃描10HPV16感染陽(yáng)性顯示掃描11HPV18感染陽(yáng)性顯示掃描12HPV6，16混合感染陽(yáng)性顯示掃描13HPV6，11混合感染陽(yáng)性顯示掃描14HPV6，18混合感染陽(yáng)性顯示掃描15HPV陰性顯示掃描圖五具體實(shí)施例方式實(shí)施例一參見圖3，圖中1為陽(yáng)性顯示點(diǎn)樣，2為陰性顯示點(diǎn)樣，3為空白對(duì)照點(diǎn)樣，4為HPV通用性探針，5為HPV特異性探針，6為固相載體基片采用玻璃片，在本實(shí)施例中，有4條HPV特異性探針，分別是HPV6，HPV11，HPV16，HPV18。
一.HPV的基因芯片的制作方法如下1.將有關(guān)陽(yáng)性、陰性對(duì)照顯示和人工合成的HPV通用探針和HPV特異性探針(TAKARA公司合成)溶于點(diǎn)樣液(上海博星基因芯片有限公司配制)，濃度為50μMMOL/L，取適量轉(zhuǎn)移至96孔板。
2.開機(jī)打開Prosys 5510A點(diǎn)樣儀(Cartesian Technologie公司)，真空泵與計(jì)算機(jī)電源連接。
3.準(zhǔn)備將微孔板以及預(yù)處理玻片放入點(diǎn)樣儀的工作平臺(tái)，裝上點(diǎn)樣針，將真空裝置上不用的孔密封上。
4.打開軟件，點(diǎn)樣儀與電腦聯(lián)機(jī)。選擇編制好的程序，按“GO”開始打印。
1).清洗打印針，并干燥3次。
2).點(diǎn)樣針移到微孔板，浸入待打印的探針液中上樣。
3).點(diǎn)樣針移到預(yù)點(diǎn)樣玻片上，打印數(shù)個(gè)樣品點(diǎn)，直到打印的樣品點(diǎn)的大小均勻。
4).點(diǎn)樣針移到待點(diǎn)樣玻片上，根據(jù)所編制的微陣列設(shè)計(jì)，打印樣品點(diǎn)。
5).點(diǎn)樣針移到同一批待點(diǎn)玻片，繼續(xù)打印6).點(diǎn)樣針回到洗滌槽中清洗，抽真空吸去洗滌液7).載下一個(gè)樣品重復(fù)上述過程，直到打印完所有探針5.退出軟件，關(guān)機(jī)，超聲波清洗點(diǎn)樣針
6.將打印好的芯片水合30分鐘7.室溫干燥8.0.2％SDS洗10分鐘9.ddH2O洗10分鐘10.室溫干燥11.4℃度保存或立即使用。
二.芯片的使用操作(一)提取待檢組織標(biāo)本DNA1.取新鮮組織標(biāo)本約30mg，液氮研碎2.加DNA抽提液0.3ml(配制方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》98版)，混勻；加蛋白酶K7.6ul，混勻3.60℃過夜4.95℃10min5.離心13000rpm 5min6.取上清，加0.3ml酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻7.離心13000rpm 5min8.重復(fù)6.7步兩次9.取上清，加0.3ml氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻10.離心13000rpm 1min11.取上清，加1/10體積的PH5.2，3mmol/l的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻12.20℃ 30min13.離心13000rpm 15min14.棄上清，用70％乙醇1ml洗1次15.干燥，用50ul MilliQ水溶解16.4℃保存(二)待檢樣品的擴(kuò)增與標(biāo)記(避光操作)
1.取0.2mlEP管一只，在冰浴條件下向管中依次加入ddH2O17.1ul，10×Buffer2.5ul，dNTP2ul(2.5ummol/l)，帶熒光標(biāo)記(CY5)的上游引物5’-CY5-GCHCARGGHCAHAAYAATGG-3’和下游引物5’-CY5-RCGWCCMARRGGRWAYTGATG-3’各1ul(10ummol/l)，(引物由上海生工生物工程公司合成，要求純度為PAGE級(jí))，模板DNA1ul，Taq酶0.4ul(5U/ul)2.混勻后，放入PCREXPRESS 2400PCR儀(德HYBAID)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為a)94℃3mini.94℃30secii.53℃30sec 35循環(huán)iii.72℃60secb)72℃5minc)4℃避光保存(三)雜交(避光操作)1.取0.2mlEP管，依次加入雜交液6ul，陽(yáng)性對(duì)照5’-CY5-CTGTCCATGCACTGGACTCG-3’(10uM)1ul，標(biāo)記產(chǎn)物5ul，混勻2.放入PCREXPRESS 2400PCR儀中于94℃下變性2.5min后，立即放入冰盒內(nèi)防止復(fù)性，至少1分鐘3.將變性后的產(chǎn)物12ul點(diǎn)于芯片點(diǎn)樣區(qū)，蓋上蓋玻片，趕走氣泡，置于濕雜交盒內(nèi)，在47℃下雜交60min4.用ddH2O沖掉蓋玻片，將芯片放入02.％SDS液中洗脫5分鐘后，用ddH2O沖洗干凈5.室溫干燥(四)掃描檢測(cè)將雜交后干燥的芯片插入GMS418 Array Scanner掃描儀(美AFFYMETRIX)中進(jìn)行掃描，掃描圖片以Tiff格式保存利用實(shí)施例一生產(chǎn)的HPV基因芯片，對(duì)有關(guān)病人進(jìn)行臨床檢測(cè)，獲得圖8至圖14的各種類型HPV感染與混合型感染的陽(yáng)性顯示掃描圖。
圖8-圖14為HPV芯片檢測(cè)幾種HPV感染陽(yáng)性顯示掃描圖，其中，圖8-圖11分別為HPV6，HPV11，HPV16，HPV18單純感染的檢測(cè)結(jié)果，而圖12-圖14分別為HPV6+HPV16，HPV6+HPV11，HPV6+HPV18混合感染的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于上述通過HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果病例，我又用DNA序列測(cè)定法對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，兩者是吻合的。
圖8為HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果HPV6感染陽(yáng)性顯示掃描圖。為驗(yàn)證HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們又采用HPV通用引物對(duì)圖8所對(duì)應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物在3700測(cè)序儀(PE公司)上進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果為ACTGGGGGACCTCACGCAGTACAAATATGACATAATGTGCTGCCATATTTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCATGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTTCAGCACCTAAAGGAAGATCCTTTAAAAAAATACACCTTTTTGGGGAAGTAAATTAAGGGAAAGGGTTTTTGCCACCTAGATCAAATTNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNTNNNNNNNCNTNNNNNNNNNNNNAGTGGNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNTNNNATTTANGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTNNTTTTGTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNAN，經(jīng)過檢索GeneBank，也證實(shí)該樣品為HPV6感染，說明我們研制的HPV基因芯片是成功的。
圖9為HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果HPV11感染陽(yáng)性顯示掃描圖。為驗(yàn)證HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們又采用HPV通用引物對(duì)圖9所對(duì)應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物在3700測(cè)序儀(PE公司)上進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果為CCACACGCAGTACCCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCCAGATCCCTATAAAAACCCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGGTTTCTAGTGATTGGGGTCANTTNCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTTTNNNNNNNNNNNNNN，經(jīng)過檢索GeneBank，也證實(shí)該樣品為HPV11感染，說明我們研制的HPV基因芯片是成功的。
圖10為HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果HPV16感染陽(yáng)性顯示掃描圖。為驗(yàn)證HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們又采用HPV通用引物對(duì)圖10所對(duì)應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物在3700測(cè)序儀(PE公司)上進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果為ATTTACTTCCCAAAAAGTGTATTTTTTAAGGGGATCTTCTTTAGGTGCTGGAGGTGTATGTTTTTGACAAGCAATTGCCTGGGATGTTACAAACCTATAAGTATCTTCTAGTGTGCCTCCTGGGGGAGGTTGTAGACCAAAATTCCAGTCCTCCAAAATAGTGGAATTCATAGAATGTATGTATGTCATAACGTCTGCAGTTAAGGTTATTTTGCACAGTTGAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTCCCCATGTCGTAGGTACTCCTTAAAGTTAGTATTTTTATATGTAGTTTCTGAAGTAGGATATGGCAGCACATAATGACATATTTTGTACTGCGTGTAGTATCAACAACAGTAACAAATAGTTGGTTACCCCAACAAATGCCATTNTTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNTNNATNNNNGGATTGNNNNNNNNNNNTTNNCCTNNNTNTTTNTNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNTNNN，經(jīng)過檢索GeneBank，也證實(shí)該樣品為HPV16感染，說明我們研制的HPV基因芯片是成功的。
圖11為HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果HPV18感染陽(yáng)性顯示掃描圖。為驗(yàn)證HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們又采用HPV通用引物對(duì)圖11所對(duì)應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物在3700測(cè)序儀(PE公司)上進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果為ACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTTTGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATTCCCTCTTGGTCGTAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，經(jīng)過檢索GeneBank，也證實(shí)該樣品為HPV18感染，說明我們研制的HPV基因芯片是成功的。
圖14為HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果HPV6和HPV18混合感染陽(yáng)性顯示掃描圖。為驗(yàn)證HPV基因芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們又采用HPV通用引物對(duì)圖14所對(duì)應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物在3700測(cè)序儀(PE公司)上進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果為ACTGGGGGACCTCACGCAGTACAAATATGACATAATGTGCTGCCATATTTACTTCAGAA
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對(duì)照檢測(cè)結(jié)果表明，本實(shí)施例的HPV基因芯片的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，檢測(cè)快速敏捷。
實(shí)施例二參見圖1，圖中編號(hào)與實(shí)施例一相同的代表意義相同，芯片的制作方法同實(shí)施例一相同，不重述。不同之處在于本實(shí)施例亞型特異性探針只有兩條，HPV16，HPV18。
實(shí)施例三參見圖2，圖中編號(hào)與實(shí)施例一相同的代表意義相同，芯片的制作方法同實(shí)施例一相同，不重述。不同之處在于本實(shí)施例亞型特異性探針只有兩條，HPV6，HPV11。
實(shí)施例四參見圖4，圖中編號(hào)與實(shí)施例一相同的代表意義相同，芯片的制作方法同實(shí)施例一相同，不重述。不同之處在于本實(shí)施例亞型特異性探針有8條，HPV6，HPV11，HPV31，HPV33，HPV35，HPV45，HPV16，HPV18。
實(shí)施例五參見圖5，圖中編號(hào)與實(shí)施例一相同的代表意義相同，芯片的制作方法同實(shí)施例一相同，不重述。不同之處在于本實(shí)施例亞型特異性探針有10條，HPV6，HPV11，HPV40，HPV42，HPV44，HPV31，HPV33，HPV45，HPV16，HPV18。
實(shí)施例六參見圖6，圖中編號(hào)與實(shí)施例一相同的代表意義相同，芯片的制作方法同實(shí)施例一相同，不重述。不同之處在于本實(shí)施例亞型特異性探針有11條，HPV39，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV31，HPV33，HPV35，HPV45，HPV16，HPV18。
實(shí)施例七參見圖7，圖中編號(hào)與實(shí)施例一相同的代表意義相同，芯片的制作方法同實(shí)施例一相同，不重述。不同之處在于本實(shí)施例亞型特異性探針有28條，HPV6，HPV11，HPV13，HPV32，HPV34，HPV40，HPV41，HPV42，HPV44，HPV53，HPV54，HPV55，HPV74，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV38，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV69。
權(quán)利要求
1.一種人乳頭瘤病毒(HPV)基因芯片，含有固相載體基片，在芯片上固化有監(jiān)控顯示點(diǎn)樣，HPV檢測(cè)探針點(diǎn)樣，其特征是監(jiān)控顯示點(diǎn)樣含有陽(yáng)性對(duì)照顯示點(diǎn)樣，陰性對(duì)照顯示點(diǎn)樣，空白對(duì)照顯示點(diǎn)樣，HPV檢測(cè)探針包括HPV通用性探針和HPV各類型特異性探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是陽(yáng)性對(duì)照顯示點(diǎn)樣是一任選的與HPV不同源的寡核苷酸片段，其序列為5’-NH2-T10-CGAGTCCAGTGCATGGACAG-3’，陰性對(duì)照顯示點(diǎn)樣為與HPV沒有同源性的一任選寡核苷酸片段，其序列為5’-NH2-TTAATTATTACAAGCGCAACAG-3’，空白對(duì)照顯示為不含任何基因的點(diǎn)樣，HPV通用探針是人工合成的一寡核苷酸片段，與HPV L1區(qū)內(nèi)一段保守基因段完全互補(bǔ)，其序列為5’-NH2-T8-GTRYTNCGDGTDGTATCHACHACNGT-3’，各類型HPV特異性探針為人工合成的多條寡核苷酸片段，分別與該類型HPV L1區(qū)內(nèi)特異性較高的一段基因片段互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是HPV特異性探針為
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是HPV特異性探針為
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因探針，其特征是HPV特異性探針為
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是HPV特異性探針為
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是HPV特異性探針為
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是HPV特異性探針為
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因芯片，其特征是HPV特異性探針為
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9任一所述的HPV基因芯片，其特征是固相載體基片可為玻璃片，或硅片，或尼龍膜，或硝酸纖維膜，或凝膠，或雜交膜，陽(yáng)性顯示點(diǎn)樣為每一排的第一列點(diǎn)樣，陰性顯示和空白顯示為最后兩排點(diǎn)樣，另外各排點(diǎn)樣依次為HPV通用探針，HPV特異性探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因芯片，特別是涉及人乳頭瘤病毒HPV基因芯片。含有固相載體基片，監(jiān)控顯示，檢測(cè)探針，監(jiān)控顯示含有陽(yáng)性對(duì)照顯示，陰性對(duì)照顯示，空白對(duì)照顯示，檢測(cè)探針包括人乳頭瘤病毒HPV通用性探針和HPV各類型特異性探針。該基因芯片具有高通量、高速高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，通過一次檢測(cè)即可判斷出待檢樣品中各種常見HPV類型的感染，可節(jié)約大量的人力、物力和時(shí)間，將廣泛應(yīng)用于HPV病原微生物的檢測(cè)，為保證婦女的健康發(fā)揮巨大的作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1544654SQ20031011018
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月27日
發(fā)明者劉玉玲, 鄭英, 張振香, 趙虎, 譚麗 申請(qǐng)人:劉玉玲