專(zhuān)利名稱(chēng)：一種cik細(xì)胞體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
CIK細(xì)胞在骨髓凈化和腫瘤過(guò)繼治療中的作用已在動(dòng)物模型中得到證實(shí)，并開(kāi)始進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。據(jù)文獻(xiàn)Schmidt-wolfIGH，Negro RS，Weissman IL，et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent anti-tumor cell activity[J].J Exp Med，1991，174(1)139-149.報(bào)導(dǎo)，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心骨髓移植研究實(shí)驗(yàn)室采用抗CD3 mAb、IL-2、IFN-γ、IL-1培養(yǎng)正常人外周血淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞的抗腫瘤活性比CD3激活的殺傷細(xì)胞(CD3 monoclonal antibody activedkiller，CD3AK)明顯增加，稱(chēng)為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine inducedkiller，CIK)。CIK細(xì)胞能大量地?cái)U(kuò)增，而且具有比LAK細(xì)胞更強(qiáng)的腫瘤殺傷活性。CIK細(xì)胞應(yīng)用于臨床，治療一個(gè)病人的用量一般在109-1011之間，因此獲得足夠數(shù)量具有高腫瘤殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞是決定CIK細(xì)胞能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。
傳統(tǒng)的CIK細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)法采用靜態(tài)和間歇換液的方式，常會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物耗竭和有毒副產(chǎn)物積累而限制細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)如溶氧、pH、代謝物濃度等得不到控制，無(wú)法保證細(xì)胞生長(zhǎng)所需的環(huán)境要求；而間歇換液往往會(huì)使培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生較大波動(dòng)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)間歇換液需使用較高濃度的細(xì)胞因子，由于這些細(xì)胞因子的半衰期很短，難以發(fā)揮應(yīng)有的作用，造成成本增長(zhǎng)和資源浪費(fèi)。更為重要的是，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式為了獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，治療一個(gè)病人往往需要處理上百個(gè)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋，易引起污染，影響細(xì)胞質(zhì)量和穩(wěn)定性，而且細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效檢測(cè)和控制，培養(yǎng)過(guò)程難以?xún)?yōu)化，因此離產(chǎn)業(yè)化和臨床要求甚遠(yuǎn)。為實(shí)現(xiàn)CIK細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，華東理工大學(xué)動(dòng)物細(xì)胞與組織工程研究室的康自珍等人提出攪拌懸浮體系培養(yǎng)CIK細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)證明，由懸浮攪拌體系培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞具有與靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞相同的細(xì)胞毒活性，而其擴(kuò)增能力有所提高。
CIK細(xì)胞是通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化而來(lái)的，而植物血球凝集素(phytohemagglutinin，PHA)和抗CD3mAb都具有激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的作用，兩者作用于細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑不同。CD3分子的主要功能是參與TCR/CD3復(fù)合體的裝配和穩(wěn)定以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD3分子亞單位的胞漿內(nèi)部分含有一個(gè)共同的序列，即D/EX2YX2L/IX8YX2L/I，其中含有兩個(gè)YXXL/I結(jié)構(gòu)，該序列同淋巴細(xì)胞抗原識(shí)別后激活淋巴細(xì)胞。PHA能激活小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，繼而分裂增殖，釋放淋巴因子。
原有技術(shù)的不足攪拌懸浮體系中，由單個(gè)核細(xì)胞(MNC)起始培養(yǎng)CIK細(xì)胞的原有方法是首先用完全RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮新分離好的臍血MNC，將細(xì)胞懸液加入6孔板中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行靜態(tài)激活。激活時(shí)，先加入1000U/mL的IFN-γ，24小時(shí)后加入50ng/mL抗CD3mAb、300U/mL IL-2和100U/mLIL-1β，刺激3天；第4天，將細(xì)胞接種于攪拌式生物反應(yīng)器中，用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
利用原有技術(shù)培養(yǎng)CIK細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞激活是在靜態(tài)培養(yǎng)方式下進(jìn)行的，只加入小鼠抗人CD3單克隆抗體一種有絲分裂原，激活環(huán)境不均一，不利于有絲分裂原與細(xì)胞充分作用，激活效率不高；并且在激活過(guò)程結(jié)束后，攪拌式生物反應(yīng)器不對(duì)有絲分裂原進(jìn)行洗脫，容易造成細(xì)胞受到過(guò)度刺激而產(chǎn)生凋亡， 從而影響CIK細(xì)胞的擴(kuò)增能力和細(xì)胞毒活性不能滿(mǎn)足臨床需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種CIK細(xì)胞的激活方法以及體外培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿(mǎn)足臨床需要。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的由于以上兩種有絲分裂原都具有激活T細(xì)胞、誘導(dǎo)其大量增殖的功能，因此兩者在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞時(shí)可以互相取代，但兩者又各具特點(diǎn)，因此發(fā)明人認(rèn)為，兩者聯(lián)合應(yīng)用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，并采用如下的方法，可以提高CIK細(xì)胞的擴(kuò)增能力(1)在懸浮狀態(tài)下，激活細(xì)胞；(2)同時(shí)采用兩種有絲分裂原植物血球凝集素(phytohemagglutinin，PHA)和抗CD3 mAb激活細(xì)胞；(3)細(xì)胞被激活之后，對(duì)有絲分裂原進(jìn)行洗脫。
本發(fā)明的方法包括如下步驟先采用常規(guī)的方法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞，采用懸浮培養(yǎng)方式使用抗CD3mAb和PHA兩種有絲分裂原聯(lián)合刺激，激活細(xì)胞，然后用培養(yǎng)基洗滌激活后的細(xì)胞，除去其中的有絲分裂原及細(xì)胞因子，再對(duì)洗滌后的激活后的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，即可獲得CIK細(xì)胞。
所說(shuō)的分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞指的是采用密度梯度離心法，用密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離新鮮臍血，得到的單個(gè)核細(xì)胞。具體方法是在50mL塑料離心管(NUNC)中，將30mL用磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffersolution，PBS)1∶1稀釋后的新鮮臍血小心平鋪到15mL比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液上，用水平式離心機(jī)400g下離心20-30分鐘。收集界面層(或稱(chēng)單個(gè)核細(xì)胞層)細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2-3次，除去淋巴細(xì)胞分離液和大量的血小板后得到的細(xì)胞。
所說(shuō)的培養(yǎng)基為據(jù)文獻(xiàn)Hoyle C，Bangs CD，Chang P，et al.Expansion ofPhiladelphia chromosome-negative CD3(+)CD56(+)cytotoxic cells from chronicmyeloid leukemia patientsin vitro and in vivo efficacy in severe combinedimmunodeficiency disease mice.Blood.1998 Nov 1；92(9)3318-27報(bào)道的RPMI-1640培養(yǎng)基或添加了10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和50μmol/L二巰基乙醇的IMDM培養(yǎng)基或AIM-V培養(yǎng)基中的一種；優(yōu)選的洗滌次數(shù)為2～5次；優(yōu)選的對(duì)分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行激活的方法包括如下步驟用完全RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮新分離好的臍血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入攪拌式生物反應(yīng)器中，接種密度1×105cells/mL至2×106cells/mL，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激活。先加入200-1500U/mL的IFN-γ，24小時(shí)后加入5-70ng/mL抗CD3mAb、0.25-1μg/mL PHA、50-500U/mL IL-2和50-300U/mL IL-1β，刺激2～5天，優(yōu)選3天；所述及的PHA英文全稱(chēng)phytohemagglutinin，中文名為植物血球凝集素，是低聚糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，屬于高分子糖蛋白類(lèi)，存在于一些豆類(lèi)種子中，對(duì)紅細(xì)胞有一定凝集作用，故名。PHA能激活小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，繼而分裂增殖，釋放淋巴因子，因此在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中，可以用PHA作為有絲分裂原，其具有與抗CD3mAb相似的功能，但兩者又各具特點(diǎn)，提示將兩者聯(lián)合使用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，可以提高CIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力。
優(yōu)選的對(duì)洗滌后的激活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括如下步驟將細(xì)胞以(1×105cells/mL至1×106cells/mL)接種于攪拌式生物反應(yīng)器中，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，換液時(shí)補(bǔ)加300U/mLIL-2，培養(yǎng)21天。
本發(fā)明將PHA和抗CD3單克隆抗體兩種有絲分裂原混合加入，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的刺激強(qiáng)度，從而提高細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力，在細(xì)胞被激活后對(duì)有絲分裂原及細(xì)胞因子進(jìn)行洗脫，避免由于有絲分裂原與細(xì)胞長(zhǎng)期接觸導(dǎo)致細(xì)胞受到過(guò)度刺激而發(fā)生凋亡。凋亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體外擴(kuò)增能力的降低，因此本技術(shù)從抑制凋亡的角度達(dá)到了增大細(xì)胞總擴(kuò)增倍數(shù)的目的。


圖1為培養(yǎng)14天后CIK細(xì)胞的純度分析。
圖2為培養(yǎng)21天后CIK細(xì)胞的純度分析。
圖3為CIK細(xì)胞擴(kuò)增情況。
圖4為CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性分析。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
用Ficoll密度梯度分離人臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以1×106細(xì)胞/mL接種于攪拌式生物反應(yīng)器，體積為100mL中進(jìn)行激活。其中完全培養(yǎng)基為RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和50μmol/L二巰基乙醇。激活CIK細(xì)胞時(shí)，先加1000U/mL的IFN-γ，24小時(shí)后加入300U/mL IL-2、100U/mL IL-1β以及50ng/mL抗CD3 mAb、0.5μg/mL PHA，刺激3天。
第4天，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌激活后的細(xì)胞2-3次，除去其中的有絲分裂原及細(xì)胞因子，然后將細(xì)胞以2×105細(xì)胞/mL的密度接種于攪拌式生物反應(yīng)器中，體積為500mL，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，攪拌速率為20rpm，隔天換液，換液時(shí)補(bǔ)加300U/mL IL-2，培養(yǎng)21天。
細(xì)胞培養(yǎng)第14天和第21天時(shí)，用流式細(xì)胞儀對(duì)其表型進(jìn)行分析，細(xì)胞純度分別為34.77％和43.42％，見(jiàn)圖1和圖2。
培養(yǎng)至21天，細(xì)胞的總擴(kuò)增倍數(shù)為108倍，見(jiàn)圖3。在21天時(shí)進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比分別為10∶1、2∶1和1∶1時(shí)，CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性分別為62.5％、33.1％和12.4％，見(jiàn)圖4。
實(shí)施例2用Ficoll密度梯度分離人臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用IMDM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和50μmol/L二巰基乙醇。細(xì)胞以5×105細(xì)胞/mL接種于攪拌式生物反應(yīng)器中，體積為70mL，進(jìn)行激活。激活CIK細(xì)胞時(shí)，先加200U/mL的IFN-γ，24小時(shí)后加入50U/mL IL-2、50U/mL IL-1β以及5ng/mL抗CD3 mAb、0.25μg/mL PHA，刺激3天。
第4天，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌激活后的細(xì)胞2-3次，除去其中的有絲分裂原及細(xì)胞因子，然后將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/mL的密度接種于攪拌式生物反應(yīng)器中，初始加液量350mL，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，攪拌速率為20rpm，隔天換液，換液時(shí)補(bǔ)加300U/mL IL-2，培養(yǎng)21天。
細(xì)胞培養(yǎng)第14天和第21天時(shí)，用流式細(xì)胞儀對(duì)其表型進(jìn)行分析，細(xì)胞純度分別為20.75％和33.52％。
培養(yǎng)至21天，細(xì)胞的總擴(kuò)增倍數(shù)為51倍。在21天時(shí)進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比分別為l0∶1、2∶1和1∶1時(shí)，CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性分別為52.5％、23.1％和10.4％。
權(quán)利要求
1.一種CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟1)將從新鮮臍血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞，接種到攪拌式生物反應(yīng)器中，接種密度為1×105cells/mL至2×106cells/mL，加入IFN-γ，20～30小時(shí)后加入IL-2和IL-1β，同時(shí)加入抗CD3 mAb、PHA、刺激2～5天；2)將激活后的細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌，然后將細(xì)胞以1×105cells/mL至1×106cells/mL的密度接種進(jìn)攪拌式生物反應(yīng)器中，進(jìn)行懸浮攪拌培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的培養(yǎng)基為完全RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基或AIM-V培養(yǎng)基中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基為完全RPMI-1640。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入中攪拌式生物反應(yīng)器中，加入1000U/mL的IFN-γ，20～30小時(shí)后加入50ng/mL抗CD3 mAb、0.5μg/mL PHA、300U/mL IL-2和100U/mL IL-1β。
5.一種CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟先采用權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的方法對(duì)分離好的臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行激活，然后用培養(yǎng)基洗滌激活后的細(xì)胞，除去其中的有絲分裂原及細(xì)胞因子，然后再對(duì)洗滌后的激活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，即可獲得CIK細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的培養(yǎng)基為完全RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、或AIM-V培養(yǎng)基中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基為完全RPMI-1640培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，洗滌次數(shù)為2～5次。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對(duì)洗滌后的激活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括如下步驟將細(xì)胞以一定的密度接種于轉(zhuǎn)瓶中，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，換液時(shí)補(bǔ)加IL-2，培養(yǎng)21天。
10.含有PHA和抗CD3mAb的混合溶液在CIK細(xì)胞激活中的應(yīng)用及在細(xì)胞被激活后的洗脫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明在懸浮培養(yǎng)條件下，采用PHA和抗CD3單克隆抗體兩種有絲分裂原聯(lián)合激活細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的刺激強(qiáng)度，從而提高細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力，在細(xì)胞被激活后對(duì)有絲分裂原及細(xì)胞因子進(jìn)行洗脫，避免由于有絲分裂原與細(xì)胞長(zhǎng)期接觸導(dǎo)致細(xì)胞受到過(guò)度刺激而發(fā)生凋亡。本發(fā)明在攪拌式生物反應(yīng)器中體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的擴(kuò)增，可提供穩(wěn)定均一的培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)過(guò)程中的重要參數(shù)(如溶氧、pH、代謝物濃度等)易于控制、操作簡(jiǎn)便、易于放大等優(yōu)點(diǎn)。因而可提高CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，細(xì)胞毒活性。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1552848SQ20031010956
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者譚文松, 秦曉亮, 蔡海波 申請(qǐng)人:上海伯瑞生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 華東理工大學(xué)