專利名稱：生理狀態(tài)下外周血中γ干擾素基因表達的熒光定量PCR檢測的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體育訓練和運動醫(yī)學領域。具體地說，本發(fā)明涉及對外周血中與免疫相關的細胞因子進行定量檢測的方法。該方法可以直接從2ml外周血中特異性地檢出細胞因子(IFN-γ)基因表達，并且在檢測前無需任何刺激，可直接在生理狀態(tài)下檢測上述細胞因子基因的表達，從而用于判定早期疲勞，避免過度運動負荷訓練所造成的機體免疫功能下降。
背景技術：
人類輔助性T細胞(Th)含有介導細胞免疫和體液免疫的兩個亞群，即Th1與Th2。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α，調(diào)節(jié)細胞免疫功能；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-10，調(diào)節(jié)體液免疫功能。TH1型細胞因子(INF-γ、IL-2、TNF-β)介導遲發(fā)型過敏反應(DTH)、細胞毒T細胞(CTL)分化與激活等。TH2型細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)促進B細胞分化與激活，介導體液免疫反應，是IgG和IgE類抗體生成的轉換因子。
TH1和TH2型細胞因子的平衡，是機體處于生理狀態(tài)的保證。二者失衡，是感染、自身免疫病、變態(tài)反應、器官移植排斥反應、腫瘤的發(fā)生與惡化的重要促發(fā)因素。
近來，在運動醫(yī)學界過度運動負荷訓練后機體免疫功能下降、感染機會窗出現(xiàn)以及對病原體的抵抗力降低等理論上人們已達成共識。如果在機體免疫系統(tǒng)機能尚未完全恢復正常時又重復下一周期高強度的運動，則會加深對它的抑制。如此反復，則會深度抑制免疫機能。反之，短時間高強度運動則提高機體免疫機能，反復多次短時間高強度運動則誘導免疫系統(tǒng)機能的“超量恢復”。所以發(fā)現(xiàn)判定早期疲勞的免疫指標對合理的制定訓練計劃和運動處方是很有益的。
目前，對運動疲勞的判斷主要從代謝角度入手，主要指標有血乳酸濃度、血糖、血尿素氮等；至多再測試血中睪酮、皮質醇濃度，從主導合成代謝激素(睪酮)和分解代謝激素(皮質醇)的比值評判機體代謝狀態(tài)、推斷疲勞程度，但是這些指標出現(xiàn)異常與生理機能、運動能力的下降是同步的，缺乏前瞻性。總之，目前運動醫(yī)學界尚缺乏判定早期疲勞的敏感指標。
此外，測定上述這些指標測定所需的血液樣品數(shù)量較多，通常為4-5ml。目前在檢測細胞因子(如測量IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12)時是通過刺激相應細胞并從蛋白水平觀察細胞因子。但這種檢測反映的是細胞對刺激的反應能力而不是其在體內(nèi)的真實狀況，所以要客觀真實地反映體內(nèi)細胞免疫機能，必須在無任何刺激狀態(tài)下檢測細胞因子的表達水平。但目前尚缺乏此類檢測手段。
綜上所述，目前缺乏對生理狀態(tài)下免疫力水平的測定缺乏準確、有效的檢測方法，導致在體育訓練中無法有效避免過度運動負荷訓練所造成的機體免疫功能下降。因此，本領域迫切需要開發(fā)能準確、有效地判定早期疲勞，從而有效調(diào)控運動訓練強度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種準確、有效地判定早期疲勞，從而有效調(diào)控運動訓練強度的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測細胞因子基因表達的試劑盒，它包括以下擴增和檢測γ干擾素的引物對和探針(a)具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對；(b)具有SEQ ID NO5所示序列的Taqman探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有以下試劑(c)γ干擾素的DNA標準品。
更佳地，所述的DNA標準品是用SEQ ID NO1和2所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有擴增和檢測GAPDH的引物對和探針(d)具有SEQ ID NO28和29所示序列的引物對；(e)具有SEQ ID NO30所示序列的Taqman探針；(f)GAPDH的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO26和27所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有1-4套選自下組的引物對和探針(1)白細胞介素2的引物對和探針(a1)具有SEQ ID NO8和9所示序列的引物對(b1)具有SEQ ID NO10所示序列的Taqman探針；(c1)白細胞介素2的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO6和7所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物；(2)白細胞介素4的引物對和探針(a2)具有SEQ ID NO13和14所示序列的引物對(b2)具有SEQ ID NO15所示序列的Taqman探針；(c2)白細胞介素4的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO11和12所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物；(3)白細胞介素10的引物對和探針(a3)具有SEQ ID NO18和19所示序列的引物對；(b3)具有SEQ ID NO20所示序列的Taqman探針；(c3)白細胞介素10的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO16和17所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物；(4)穿孔素的引物對和探針(a4)具有SEQ ID NO23和24所示序列的引物對；(b4)具有SEQ ID NO25所示序列的Taqman探針(c4)穿孔素的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO21和22所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物。
更佳地，所述的試劑盒共含有5套引物和探針。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量的方法，包括步驟(1)抽提白細胞的mRNA；(2)對mRNA進行反轉錄，獲得反轉錄產(chǎn)物cDNA；(3)以步驟(2)的反轉錄產(chǎn)物為模板，用具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對進行PCR擴增，并且用具有SEQ ID NO5所示序列的Taqman探針進行熒光定量檢測，從而測得熒光信號；(4)根據(jù)測得的熒光信號確定白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中通過與標準曲線比較而得出γ干擾素的mRNA數(shù)量，并且與管家基因的mRNA數(shù)量相比較，計算出經(jīng)校正后的γ干擾素mRNA相對數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，所述的白細胞是通過以下方法制備的從待測對象抽取1-3毫升血液，溶解血液中紅細胞，然后離心獲得白細胞沉淀；并且步驟(3)的PCR擴增條件是50℃預熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種調(diào)控運動員訓練運動量的方法，包括步驟(i)用本發(fā)明上述的方法測定運動員的白細胞中γ干擾素mRNA數(shù)量，計為N1；(ii)按2-10天的時間間隔，用本發(fā)明上述方法測定運動員的白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量，依次計為N2....Nn，其中n表示2-10000(更佳地2-1000)的正整數(shù)；(iii)在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1，且(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％，其中n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值，否則維持或加大運動量。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)中所述的條件還包括(c)當IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12這4個細胞因子有至少一個滿足免疫力下降指標；(d)Th1/Th2比值T出現(xiàn)下降幅度為5-10％；或(e)Th1/Th2比值T的下降幅度為10％-50％。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明所述試劑盒的用途，它用于測定運動員的白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量，從而作為調(diào)控運動量的指標。


圖1顯示了用本發(fā)明引物對擴增IFN-γ(A)、IL-2(B)、IL-4(C)、IL-10(D)和穿孔素(E)的檢測結果。其中泳道1為各對應的細胞因子；泳道2為GAPDH；泳道3為分子量標準物(Marker)。
圖2顯示了對IFN-γ進行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關系圖(B)。
圖3顯示了對IL-2進行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關系圖(B)。
圖4顯示了對IL-4進行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關系圖(B)。
圖5顯示了對IL-10進行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關系圖(B)。
圖6顯示了對穿孔素進行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關系圖(B)。
圖7顯示了生理狀態(tài)下和病例狀態(tài)下細胞因子陽性率表達比較。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，為了有效準確地判定早期疲勞，可以采用改進的高度敏感和特異的熒光定量PCR技術，通過直接檢測外周血白細胞中細胞因子的自發(fā)性基因表達水平而實現(xiàn)。
眾所周知，免疫機能狀態(tài)直接影響機體工作能力，而免疫機能狀態(tài)的維持有賴于Th1和Th2細胞機能的相互平衡，通過觀察它們各自特異的細胞因子(IL-2，INF-γ、IL-4，IL-10)可反映Th1細胞(IL-2，INF-γ)和Th2細胞(IL-4，IL-10)，可能會比較客觀地反映機體細胞免疫機能，并且這種變化會先于其他生理學代謝學指標甚至常規(guī)免疫指標(如淋巴細胞增殖機能)的改變。所以檢測細胞因子不僅是基礎免疫研究的有效手段，亦是臨床上探索疾病發(fā)病機制、判斷預后和考核療效的指標，更是評判早期運動疲勞的指標。而且免疫細胞之間存在錯綜復雜的調(diào)節(jié)關系，細胞因子又是傳遞這種調(diào)節(jié)信號必不可少的信息分子。通過研究細胞因子的免疫網(wǎng)絡調(diào)節(jié)，可以更好地理解完整的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制，了解運動過程中機體生理機能狀態(tài)，并且在臨床醫(yī)學方面有助于指導細胞因子作為生物應答調(diào)節(jié)劑應用于臨床治療免疫性疾病。
白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)最初被認為是一種T細胞生長因子。分子量為15.5KDa。IL-2對B細胞的生長及分化均有一定的促進作用。另外，單核-巨噬細胞受到IL-2的持續(xù)作用后，其抗原遞呈能力、殺菌力、細胞毒性均明顯增強，分泌某些細胞因子的能力也得到加強。IL-2可以誘導CTL、NK和LAK等多種殺傷細胞的分化和效應功能，并誘導殺傷細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α等細胞因子。IL-2還可增強CTL細胞穿孔素(perforin)基因的表達。
IL-4是一種分子量為18-20KDa的糖蛋白。在小鼠由Th2亞群產(chǎn)生。IL-4可以促使抗原或絲裂原活化的B細胞分裂增殖，但其作用遠弱于IL-2；IL-4也是CD4+T細胞的自分泌性生長因子；此外，IL-4還能促進Tc細胞的活性。IL-4不能刺激巨噬細胞增殖，但可增強巨噬細胞的功能；巨噬細胞受刺激后類抗原和FcγR的表達量均明顯增加；同時巨噬細胞遞呈抗原的能力及對腫瘤細胞的細胞毒素作用也顯著增強。IL-4與IL-3協(xié)同可維持和促進肥大細胞的增殖，在某些起敏反應性疾病發(fā)生中具有一定的意義；可與CSF協(xié)同作用，促進骨髓造血前體細胞的增殖，誘導髓樣細胞定向分化；誘導內(nèi)皮細胞表達血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)，對淋巴細胞的遷移具有一定意義。
白細胞介素10(IL-10)分子量為35～40kD，通常為二聚體；主要由TH2細胞產(chǎn)生，也可由單核細胞、角質細胞及活化的B細胞產(chǎn)生。IL-10能夠抑制活化的T細胞產(chǎn)生細胞因子，因此曾稱為細胞因子合成抑制因子(CSIF)，特別是抑制TH1細胞產(chǎn)生IL-2、IFNγ和LT等細胞因子，從而抑制細胞免疫應答。IL-10可降低單核-巨噬細胞表面MHC類分子的表達水平，損害了APC的抗原遞呈能力，實際上這可能是其抑制細胞介導免疫的原因。此外，IL-10還能抑制NK細胞活性，干擾NK細胞和巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子；但可刺激B細胞分化增殖，促進抗體生成。
γ干擾素(IFN-γ)是分子量為20-25Kda的糖蛋白。IFN-γ可以誘導MHCII類抗原的表達，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。IFN-γ可上調(diào)內(nèi)皮細胞ICAM-1(CD54)表達，促進巨噬細胞FcγR表達，協(xié)同誘導TNF并促進巨噬細胞殺傷病原微生物，此外，還可協(xié)同IL-2誘導LAK活性，促進T細胞IL-2R表達；誘導急性期蛋白合成，誘導髓樣細胞分化。IFN-γ亦具有增強NK細胞活性等作用。
上述細胞因子(IL-2、INF-γ、IL-4和IL-10)不僅在免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要的作用，而且通過觀察他們的分泌量可以反映TH1(IL-2和INF-γ)和TH2型細胞(IL-4和IL-10)的平衡，而TH1型細胞和TH2型細胞的平衡是機體處于生理狀態(tài)的保證。近來的研究表明TH2型淋巴細胞上調(diào)的同時會抑制TH1型淋巴細胞的數(shù)量。TH1型淋巴細胞和細胞免疫相關，所以細胞免疫的抑制將會促使機體對感染性疾病的易感性增加。目前，確定體液免疫(TH2)或細胞免疫(TH1)狀態(tài)最準確的方法就是檢測相應的細胞因子。運動醫(yī)學界以前的研究表明運動后與TH2相關的細胞因子上調(diào)，特別是IL-10明顯升高，這表明細胞免疫受到抑制。而以往的檢測手段多使用流式細胞儀、ELISA和RT-PCR半定量等，所以目前尚缺乏高度敏感性、高度特異性的早期診斷方法。
穿孔素(PFR)是一種蛋白毒素，存在于CTL和NK細胞的溶酶體內(nèi)。成熟CTL識別抗原和MHC1類分子復合物并被激活后，迅速向靶細胞貼近、兩者細胞膜發(fā)生接觸，CTL胞漿中的殺傷顆粒借助微管作用被集中在靠靶細胞的一側，然后顆粒中的大分子內(nèi)容物被釋放至CTL和靶細胞的空隙中，其中的穿孔素在膜外鈣離子的作用下，與靶細胞膜結合、聚合，最終在細胞膜上形成不同孔徑(50～160納米)的跨膜孔道，從而導致靶細胞膜去極化，使細胞外水分進入胞內(nèi)，一些電解質和大分子物質流出胞外，最終引起靶細胞滲透性壞死。所以PFR在保護機體抗胞內(nèi)病原體如細菌、病毒、寄生蟲感染、抗腫瘤和同種排斥應答中起重要作用，是免疫系統(tǒng)重要的效應分子。從理論上講，當運動疲勞出現(xiàn)后，機體的免疫力下降，感染機會窗出現(xiàn)，所以機體對病毒的殺傷力也會不同程度的減弱。R.Staats等人的研究表明，訓練有素的運動員外周血中PFR的百分比較高，但是在耐力運動(過度疲勞)后PFR出現(xiàn)暫時性的下降。在R.Staats等人的研究中使用流式細胞儀，因此，不能用于早期精確地診斷機體免疫力的改變。
如本文所用，術語“Taqman探針”是一種在其5′端帶有報告基團并且在3′端帶有猝滅基團的寡核苷酸，所述的猝滅基團會抑制報告基團產(chǎn)生可檢測的信號(例如熒光)。Taqman探針設計是現(xiàn)有技術，并且可以從公開途徑獲得有關信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996 Oct.；6(10)986-94)。
在本發(fā)明的一個實例中，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的IL-2(v00564)、IL-4(M13982)、IL-10(M57627)、IFN-γ(X13274)、PFR(NM_005041)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國賽百盛公司提供的引物設計軟件，分別設計和篩選出了5組引物(見表1)，PCR擴增后獲得了相應的條帶。對擴增產(chǎn)物進行核苷酸序列測定，證實擴增產(chǎn)物序列與文獻報道完全一致，說明上述引物對選定的基因具有高度特異性。
用表1中所示的特異性引物，通過熒光實時PCR檢測方法，能對細胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR)基因表達水平進行絕對定量分析。具體而言，先采用引物1(序列見表1)進行PCR擴增得到雙鏈DNA片段，經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標準品。以引物2及探針組合對此標準品進行定量PCR檢測，經(jīng)過條件優(yōu)化，獲得了線性結果。
實驗證明，采用該項技術對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因表達進行檢測，標準曲線的相關系數(shù)(R)均大于0.99。上述試劑保存于-20℃在6個月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實驗間的誤差小于5％。
對25例肺部疾病患者以及25例健康人進行定量PCR分析。結果顯示25例健康人中IL-2、IFN-γ、IL-4、PFR和IL-10基因表達陽性率分別為100％、92％、88％、80％和12％。25例病人中均可檢測到IFN-γ、IL-2基因和PFR基因表達，陽性率為100％；IL-4和IL-10表達陽性率分別為96％和72％；實驗結果證明應用本方法能夠高靈敏度地直接檢測出外周血白細胞中細胞因子基因的自發(fā)性表達，并且在生理和病理狀態(tài)下上述因子的基因表達有明顯差異。
本發(fā)明在生理狀態(tài)下的熒光定量PCR檢測技術在運動醫(yī)學上廣泛的應用價值。可以比較運動前后IFN-γ數(shù)量的改變從而對運動員的免疫機能狀態(tài)進行評估，調(diào)控運動員訓練量。通過檢測一定間隔(如2-14天，較佳地3-10天，更佳地5-7天)內(nèi)運動員體內(nèi)IFN-γ數(shù)量的變化，可以及時反映出運動員免疫機能的變化，從而作為科學調(diào)控運動量的指標之一。
一種優(yōu)選的訓練方法是通過維持一定百分比的最大攝氧量來進行一定運動量的訓練，并通過監(jiān)測IFN-γ等細胞因子的變化水平來調(diào)控訓練量。
人體需氧量取決于生理機能狀態(tài)，運動強度增大時，需氧量相應改變。例如，安靜每分鐘需氧量為200-300ml，劇烈運動是每分鐘需氧量可增加200倍以上。人的攝氧能力有一定局限性，但需氧量卻隨運動強度的加大而上升。當人體進行長時間的劇烈運動時，每分攝氧量達到最高水平，稱為最大攝氧量。這是反映心肺功能的重要指標，也是有氧工作能力的重要指標。最大攝氧量的測定有許多方法，比如試驗方法受試者戴好呼吸口罩，使呼出氣體與氣體分析儀相連。然后在功率跑臺或功率自行車上進行遞增負荷運動，分析儀每分鐘自動記錄心率、通氣量和吸氧量。此時，吸氧量隨負荷的遞增而遞增。當心率達到180次/分以上，呼吸商超過1，吸氧量不再升高(或比兩次測量數(shù)值相差少于2毫升/分)，或者受試著極度疲勞不能再繼續(xù)運動下去，這時的吸氧量即最大吸氧量。得到最大吸氧量后，可計算出60％的最大攝氧量，然后可從氣體分析儀上得到60％最大攝氧量對應的心率，運動過程中通過控制心率而控制60％最大攝氧量的運動強度。
例如，當間隔時間為7天時(當然，每個間隔可以相同也可以不相同)，第一周以一定強度進行運動，本周最后一次運動結束即刻抽血，然后進行定量PCR測得的結果為N1；接著第二周的運動負荷加大，仍連續(xù)運一周，再次進行IFN-γ的定量PCR檢測，其結果為N2，如果N2小于N1，且相對下降幅度大于一定數(shù)值(如大于5％，較佳地大于10％)，則說明運動負荷過大，運動員免疫機能下降，應該減少運動量；否則說明運動員免疫機能沒有下降，可以維持運動量或加大運動量。
第3周，比較第3周的IFN-γ數(shù)量與第二周的IFN-γ數(shù)量，如果N3小于N2，且相對下降幅度大于一定數(shù)值(如大于5％，較佳地大于10％)，則說明運動負荷過大，運動員免疫機能下降，應該減少運動量；否則說明運動員免疫機能沒有下降，可以維持運動量或加大運動量。
第4周至第n周，如果Nn小于Nn-1，且相對下降幅度大于一定數(shù)值(如大于5％，較佳地大于10％)，則說明運動負荷過大，運動員免疫機能下降，應該減少運動量；否則說明運動員免疫機能沒有下降，可以維持運動量或加大運動量。
綜上所述，對于IFN-γ，通常其表達量多少與細胞免疫狀況成正相關。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIFN-γ=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
此外，在以IFN-γ數(shù)據(jù)為主的情況下，還可以參考一個或多個其他免疫相關的細胞因子的數(shù)量。
例如，對于IL-2，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIL-2=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
對于IL-4，通常其表達量多少與細胞免疫狀況成反相關。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＞Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIL-4=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
對于IL-10，通常其表達量多少與細胞免疫狀況成反相關。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＞Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIL-10=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
對于穿孔素，通常其表達量多少與細胞免疫狀況成正相關。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化 n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
此外，還可以同時參考Th1/Th2比值T。該比值T可用下式計算T＝(NIFN-γ+NIL-2)/(NIL-4+NIL-10) (I-1)由于，IL-2的表達量遠高于其他因子，通常其拷貝數(shù)高于其他因子10-50倍，因此，為了更準確地計算T值，也可用下式計算T＝(NIFN-γ+NIL-2/20)/(NIL-4+NIL-10)(I-2)例如，對于第n周，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Tn＜Tn-1(b)Tn與Tn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中T值相對變化 此外，本發(fā)明在生理狀態(tài)下的熒光定量PCR檢測技術還可用于多種疾病如感染、過敏、某些炎癥、某些自身免疫病的診斷或輔助診斷，用于預后和療效判定以及對某些免疫調(diào)節(jié)性治療進行指導。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)檢測靈敏度高，可以直接從2ml外周血中特異性地檢出細胞因子(IFN-γ)基因表達，比現(xiàn)有的RT-PCR方法提高了100倍。
(2)在檢測前無需任何刺激，可直接在生理狀態(tài)下檢測上述細胞因子基因的表達。
(3)快速，可以在數(shù)小時內(nèi)獲得檢測結果。
(4)引物設計極其合理，反應條件均一性好。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1引物設計及定量PCR產(chǎn)物檢測方法1.1 材料淋巴細胞來自健康人體。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液均為GIBCO公司產(chǎn)品。經(jīng)典法RNA抽提試劑盒由上海申能博采生物科技有限公司提供。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司。各PCR引物及熒光素標記探針由上海申友生物技術有限責任公司合成。10mM dNTP、Pfu高保真DNA聚合酶(5Unit/μl)購自上海申能博采公司。PCR產(chǎn)物測序由上海申友公司完成。
1.2 方法根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的IL-2(v00564)、IL-4(M13982)、IL-10(M57627)、IFN-γ(X13274)、PFR(NM_005041)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國賽百盛公司提供的引物設計軟件，分別設計了6組引物(表1)。由上海申友公司合成各引物及熒光素標記探針。
表1

其中，各探針在兩端分別具有報告基團6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)，和猝滅基團6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端)。
抽提RNA應用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，加入1000U/ml IL-2培養(yǎng)1周，選擇活躍增殖期細胞，按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度計(Biophotometer，德國Eppendorf公司)測定A260及A280。
標準品制備取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應體積為20μl。
PCR反應混合液為2μl cDNA，上游及下游引物1(50μM)各1μl，dNTP 1μl，Pfu酶1μl，buffer 5μl，加DEPC-H2O至50μl，石臘油30μl覆蓋。
IL-2、IL-4、IL-10和PFR的PCR反應條件為95℃變性5min；95℃ 1min，57℃1min，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。
IFN-γ的PCR反應條件為95℃變性5min；95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。
分別把IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和PFR的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖電泳100V 30min，然后，使用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon，GIS-120D)攝片。
擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后采用紫外分光光度計測定雙鏈DNA含量，純化產(chǎn)物中的基因拷貝數(shù)按下述公式計算基因拷貝數(shù)/μl＝[A260/13.2×片斷長度(kb)]×6.02×1011定量PCR檢測定量PCR反應母液為10×PCR反應緩沖液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl，50μM熒光素標記探針0.1μl，10mM dNTP 0.5μl，0.5μl Taq酶(5units/μl)，DEPC-H2O 17.7μl。上述反應母液保存于-20℃。
定量PCR反應液23μl反應母液中加入2μl DNA標準品。
定量PCR反應條件50℃預熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)，60℃檢測；37℃ 30秒。
定量PCR儀為Rotor-Gene RG 3000型(澳大利亞Corbett公司)或LightCycler(瑞士Roche公司)。
1.3 結果A、根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列以及設計的5組引物(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、和PFR)，經(jīng)PCR擴增后分別獲得了相應的單一條帶，其結果分別如圖1A-E所示。測序后證明其序列與預期相同。
B、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和PFR的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標準品，以引物2及探針組合進行定量PCR檢測，獲得了線性結果。IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、和PFR的結果分別如圖2-6所示，包括循環(huán)數(shù)-熒光值關系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關系圖(B)。
標準曲線分析結果表明，在基因拷貝數(shù)為105-108范圍內(nèi)，應用本方法能夠給出線性結果，其標準曲線的相關系數(shù)R均＞0.99，擴增效率在0.68-1.00之間。
此外，用于定量PCR的定量PCR反應母液，在保存于-20℃條件下，在6個月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實驗間誤差≤5％。將含250微升定量PCR反應母液的容器置于盒中，就構成了檢測試劑盒。
實施例2生理狀態(tài)下健康人外周血白細胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達2.1 材料25名健康志愿者來自上海市體育學院2003級入學新生。TriBlue RNA抽提試劑盒及糖原購自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司。Taq DNA聚合酶購自上海申友公司。
2.2 方法抽提RNA及反轉錄成cDNA取2ml肝素抗凝全血，溶解全血中的紅細胞，制備成白細胞沉淀保存于-20℃。按試劑盒要求抽提抽提RNA。
取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應體積為20μl。
定量PCR檢測定量PCR反應母液為10×PCR反應緩沖液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，100μM上游及下游引物2(表1)各0.1μl，50μM熒光素標記探針0.1μl，10mM dNTP 0.5μl，0.5μl Taq酶(5units/μl)，DEPC-H2O 17.7μl。上述反應母液保存于-20℃。
定量PCR反應液23μl反應母液中加入2μl cDNA。
定量PCR反應條件50℃預熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)，60℃檢測37℃ 30秒。
定量PCR儀為Rotor-Gene RG 3000型(澳大利亞Corbett公司)或LightCycler(瑞士Roche公司)。按順序對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR進行定量PCR。
2.3 結果A、25名健康人生理狀態(tài)下外周血白細胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達狀況見下表2
表2

-表示未能檢測到基因表達。
B、結果分析若以內(nèi)參照基因GAPDH拷貝數(shù)作為基準，25名健康人外周血白細胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達狀況[即靶基因拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝數(shù)]見表3。
表3

實施例3肺部疾病患者外周血白細胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達3.1 材料25名肺部疾病患者來自上海市肺科醫(yī)院住院病人。TriBlue RNA抽提試劑盒及糖原購自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBIFermentas公司。Taq DNA聚合酶購自上海申友公司。
3.2 方法(與實施例2方法相同)抽提RNA及反轉錄成cDNA取2ml肝素抗凝全血，溶解全血中的紅細胞，制備成白細胞沉淀保存于-20℃。按試劑盒要求抽提抽提RNA。然后取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應體積為20μl。
定量PCR定量PCR反應母液為10×PCR反應緩沖液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl，50μM熒光素標記探針0.1μl，10mM dNTP 0.5μl，0.5μl Taq酶(5units/μl)，DEPC-H2O 17.7μl。上述反應母液保存于-20℃。
定量PCR反應液23μl反應母液中加入2μl cDNA。
定量PCR反應條件50℃預熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)，60℃檢測；37℃ 30秒。
定量PCR儀為Rotor-Gene RG 3000型(澳大利亞Corbett公司)或LightCycler(瑞士Roche公司)。按順序對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR進行定量PCR。
3.3 結果A、25名肺部疾病患者外周血白細胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達狀況見下表4表4

-表示未能檢測到基因表達。
B、結果分析若以內(nèi)參照基因GAPDH拷貝數(shù)作為基準，25名肺部疾病患者外周血白細胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達狀況[即靶基因拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝數(shù))]見表5。
表5

表3和表5的陽性率結果總結于圖7。分別用25例肺部疾病患者以及25例健康人進行定量PCR分析，以便證明本發(fā)明方法不僅可以在病人(非生理狀態(tài)下)當中對細胞因子進行定量，而且也可以在健康人(生理狀態(tài)下)對細胞因子進行定量?？偟年栃月嗜缦翴FN-γ總陽性率為96％；IL-2總陽性率為100％；IL-4總陽性率為92％；IL-10總陽性率42％；PFR為總陽性率為90％。陽性率表明了本發(fā)明方法的敏感性很高。
目前，用熒光定量PCR檢測細胞因子的報道中均需體外刺激才能測出，且陽性率較低，如對IL-4的陽性率為81％，而本發(fā)明方法檢測到IL-4的陽性率較高為92％。
其中，IL-10陽性率較低的原因是因為IL-10是最具有免疫抑制效應的細胞因子，正常情況下很難檢測到。在健康自愿測試者處于健康的生理狀態(tài)下時，所以具有免疫抑制效應的細胞因子表達率很低，故陽性率低。而檢測病人的結果表達率為92.6％。從理論上講，隨著運動量的加大，運動疲勞的出現(xiàn)，IL-10的表達量會升高。這樣通過對運動前和運動后的IL-10表達量進行比較，或與TH1型細胞因子(IFN-γ和IL-2)的表達量進行比較，可能會得出較有意義的結論。如Nieman DC(2001)的研究中指出總體來講馬拉松運動前很難檢測到IL-10(幾乎為0)，但是在運動后(約為75pg/ml)以及運動后1.5小時(約為28pg/ml)會出現(xiàn)明顯的升高。但是，Nieman DC使用的方法是ELISA，他是從蛋白水平對IL-10進行定量，所以敏感性及前瞻性均不如本發(fā)明方法。
實施例4通過對γ干擾素基因表達的熒光定量PCR檢測來調(diào)控運動員的訓練量在本實施例中，用實施例2中相同的檢測方法，對測試組運動員(10人)，共進行訓練(并非完全進行完如下的運動負荷，但是在發(fā)現(xiàn)運動員免疫機能下降前必須按照此方案進行)。第一周以60％最大攝氧量運動30分鐘×2次，間歇5分鐘；第二周以70％最大攝氧量運動20分鐘×3次，間歇5分鐘；第三周以80％最大攝氧量運動15分鐘×4次，間歇5分鐘；第四周以90％最大攝氧量運動10分鐘×6次，間歇5分鐘；第五周以95％最大攝氧量運動3分鐘×10次，間歇5分鐘。每周運動前和運動后即刻取2ml外周血，對γ干擾素基因表達的熒光定量PCR檢測。比較運動前后IFN-γ數(shù)量的改變從而對運動員的免疫機能狀態(tài)進行評估，調(diào)控運動員訓練量。如第一周運動后即刻抽血，然后進行定量PCR測得的結果為N1；第二周運動后即刻抽血進行定量PCR的結果為N2；第三周運動后即刻抽血，然后進行定量PCR測得的結果為N3，依次類推為N4-Nn。如果((Nn-1-Nn)/Nn-1)＞5％，則說明運動負荷過大，運動員免疫機能下降，應該減少運動量；當((Nn-Nn-1)/Nn-1)＞5％，說明運動員免疫機能增強，應維持運動量或加大運動量。
對照組運動員(10人)運動方案同前，但是根據(jù)教練員經(jīng)驗判定運動員是否過度疲勞，或者根據(jù)醫(yī)生的診斷確定是否免疫力下降。一旦判定運動員過度疲勞或免疫力下降，則減少運動量，否則維持運動量。
結果表明，測試組運動員患感冒等病癥的次數(shù)遠低于對照組(低45％以上)，同時運動成績也優(yōu)于對照組。這表明，本發(fā)明方法可準確地判定早期疲勞，有效地避免過度運動負荷訓練所造成的機體免疫功能下降。
實施例5通過對多個細胞因子基因表達的熒光定量PCR檢測來調(diào)控運動員的訓練量本實施例的方法同實施例4，不同點僅在于同時對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達進行熒光定量PCR檢測，并根據(jù)表6調(diào)控測試組運動員的運動量。測試組運動員為10人，對照組運動員10人。試驗持續(xù)5周。
表6

具體地，通常維持或加大測試組運動員的運動量，但當運動員處于以下情況之一時，減少運動量甚至停止。
(a)IFN-γ基因的出現(xiàn)免疫力下降指標(即變化幅度出現(xiàn)免疫力下降趨勢或絕對拷貝數(shù)過低表明免疫力下降)，且另外4個細胞因子有至少一個出現(xiàn)免疫力下降指標(變化幅度出現(xiàn)免疫力下降趨勢或絕對拷貝數(shù)表明免疫力下降)；(b)5個細胞因子有至少3個出現(xiàn)免疫力下降的指標。
(c)IFN-γ基因的出現(xiàn)免疫力下降指標，且Th1/Th2比值T出現(xiàn)下降幅度為5-10％。
(d)Th1/Th2比值T的下降幅度大于10％。
對照組運動員(10人)根據(jù)教練員經(jīng)驗判定運動員是否過度疲勞，或者根據(jù)醫(yī)生的診斷確定是否免疫力下降。一旦判定運動員過度疲勞或免疫力下降，則減少運動量，否則維持運動量。
結果表明，測試組運動員患感冒等病癥的次數(shù)遠低于對照組(低60％以上)，同時運動成績也優(yōu)于對照組。這表明，本發(fā)明方法可準確地判定早期疲勞，有效地避免過度運動負荷訓練所造成的機體免疫功能下降。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海體育學院<120>生理狀態(tài)下外周血中γ干擾素基因表達的熒光定量PCR檢測<130>036345<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>1agtcctttgg acctgatcag 20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>30caagcttccc gttctcagcc20
權利要求
1.一種檢測細胞因子基因表達的試劑盒，其特征在于，它包括以下擴增和檢測γ干擾素的引物對和探針(a)具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對；(b)具有SEQ ID NO5所示序列的Taqman探針。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還含有以下試劑(c)γ干擾素的DNA標準品。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的DNA標準品是用SEQ IDNO1和2所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還含有擴增和檢測GAPDH的引物對和探針(d)具有SEQ ID NO28和29所示序列的引物對；(e)具有SEQ ID NO30所示序列的Taqman探針；(f)GAPDH的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO26和27所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還含有1-4套選自下組的引物對和探針(1)白細胞介素2的引物對和探針(a1)具有SEQ ID NO8和9所示序列的引物對；(b1)具有SEQ ID NO10所示序列的Taqman探針；(c1)白細胞介素2的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO6和7所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物；(2)白細胞介素4的引物對和探針(a2)具有SEQ ID NO13和14所示序列的引物對；(b2)具有SEQ ID NO15所示序列的Taqman探針；(c2)白細胞介素4的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO11和12所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物；(3)白細胞介素10的引物對和探針(a3)具有SEQ ID NO18和19所示序列的引物對；(b3)具有SEQ ID NO20所示序列的Taqman探針；(c3)白細胞介素10的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO16和17所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物；(4)穿孔素的引物對和探針(a4)具有SEQ ID NO23和24所示序列的引物對；(b4)具有SEQ ID NO25所示序列的Taqman探針(c4)穿孔素的DNA標準品，所述DNA標準品是用SEQ ID NO21和22所示序列的引物對得到的擴增產(chǎn)物。
6.一種檢測白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量的方法，其特征在于，包括步驟(1)抽提白細胞的mRNA；(2)對mRNA進行反轉錄，獲得反轉錄產(chǎn)物cDNA；(3)以步驟(2)的反轉錄產(chǎn)物為模板，用具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對進行PCR擴增，并且用具有SEQ ID NO5所示序列的Taqman探針進行熒光定量檢測，從而測得熒光信號；(4)根據(jù)測得的熒光信號確定白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)中通過與標準曲線比較而得出γ干擾素的mRNA數(shù)量，并且與管家基因的mRNA數(shù)量相比較，計算出經(jīng)校正后的γ干擾素mRNA相對數(shù)量。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的白細胞是通過以下方法制備的從待測對象抽取1-3毫升血液，溶解血液中紅細胞，然后離心獲得白細胞沉淀；步驟(3)的PCR擴增條件是50℃預熱300秒；95℃變性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40個循環(huán)。
9.一種調(diào)控運動員訓練運動量的方法，其特征在于，包括步驟(i)用權利要求6所述的方法測定運動員的白細胞中γ干擾素mRNA數(shù)量，計為N1；(ii)按2-10天的時間間隔，用權利要求6所述的方法測定運動員的白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量，依次計為N2....Nn，其中n表示2-10000的正整數(shù)；(iii)在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1，且(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％，其中n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值，否則維持或加大運動量。
10.如權利要求1所述試劑盒的用途，其特征在于，它用于測定運動員的白細胞中γ干擾素的mRNA數(shù)量，從而作為調(diào)控運動量的指標。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對外周血中與免疫相關的細胞因子進行定量檢測的方法。該方法可以直接從2ml外周血中特異性地檢出細胞因子(IFN－γ)基因表達，并且在檢測前無需任何刺激，可直接在生理狀態(tài)下檢測上述細胞因子基因的表達，從而用于判定早期疲勞，避免過度運動負荷訓練所造成的機體免疫功能下降。本發(fā)明還提供了相應的檢測試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK1629314SQ200310109560
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權日2003年12月19日
發(fā)明者陳佩杰, 董強剛, 王茹 申請人:上海體育學院