專利名稱：生理狀態(tài)下外周血中穿孔素基因表達(dá)的熒光定量pcr檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體育訓(xùn)練和運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及對外周血中與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測的方法。該方法可以直接從2ml外周血中特異性地檢出細(xì)胞因子(perforin，簡稱為PFR)基因表達(dá)，并且在檢測前無需任何刺激，可直接在生理狀態(tài)下檢測上述細(xì)胞因子基因的表達(dá)，從而用于判定早期疲勞，避免過度運動負(fù)荷訓(xùn)練所造成的機體免疫功能下降。
背景技術(shù)：
人類輔助性T細(xì)胞(Th)含有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫的兩個亞群，即Th1與Th2。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-10，調(diào)節(jié)體液免疫功能。TH1型細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2、TNF-β)介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)分化與激活等。TH2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)促進(jìn)B細(xì)胞分化與激活，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，是IgG和IgE類抗體生成的轉(zhuǎn)換因子。
TH1和TH2型細(xì)胞因子的平衡，是機體處于生理狀態(tài)的保證。二者失衡，是感染、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、器官移植排斥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生與惡化的重要促發(fā)因素。
近來，在運動醫(yī)學(xué)界過度運動負(fù)荷訓(xùn)練后機體免疫功能下降、感染機會窗出現(xiàn)以及對病原體的抵抗力降低等理論上人們已達(dá)成共識。如果在機體免疫系統(tǒng)機能尚未完全恢復(fù)正常時又重復(fù)下一周期高強度的運動，則會加深對它的抑制。如此反復(fù)，則會深度抑制免疫機能。反之，短時間高強度運動則提高機體免疫機能，反復(fù)多次短時間高強度運動則誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)機能的“超量恢復(fù)”。所以發(fā)現(xiàn)判定早期疲勞的免疫指標(biāo)對合理的制定訓(xùn)練計劃和運動處方是很有益的。
目前，對運動疲勞的判斷主要從代謝角度入手，主要指標(biāo)有血乳酸濃度、血糖、血尿素氮等至多再測試血中睪酮、皮質(zhì)醇濃度，從主導(dǎo)合成代謝激素(睪酮)和分解代謝激素(皮質(zhì)醇)的比值評判機體代謝狀態(tài)、推斷疲勞程度，但是這些指標(biāo)出現(xiàn)異常與生理機能、運動能力的下降是同步的，缺乏前瞻性?？傊?，目前運動醫(yī)學(xué)界尚缺乏判定早期疲勞的敏感指標(biāo)。
此外，測定上述這些指標(biāo)測定所需的血液樣品數(shù)量較多，通常為4-5ml。目前在檢測細(xì)胞因子(如測量IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12)時是通過刺激相應(yīng)細(xì)胞并從蛋白水平觀察細(xì)胞因子。但這種檢測反映的是細(xì)胞對刺激的反應(yīng)能力而不是其在體內(nèi)的真實狀況，所以要客觀真實地反映體內(nèi)細(xì)胞免疫機能，必須在無任何刺激狀態(tài)下檢測細(xì)胞因子的表達(dá)水平。但目前尚缺乏此類檢測手段。
綜上所述，目前缺乏對生理狀態(tài)下免疫力水平的測定缺乏準(zhǔn)確、有效的檢測方法，導(dǎo)致在體育訓(xùn)練中無法有效避免過度運動負(fù)荷訓(xùn)練所造成的機體免疫功能下降。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能準(zhǔn)確、有效地判定早期疲勞，從而有效調(diào)控運動訓(xùn)練強度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種準(zhǔn)確、有效地判定早期疲勞，從而有效調(diào)控運動訓(xùn)練強度的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測細(xì)胞因子基因表達(dá)的試劑盒，它包括以下擴(kuò)增和檢測穿孔素的引物對和探針(a)具有SEQ ID NO23和24所示序列的引物對；(b)具有SEQ ID NO25所示序列的Taqman探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有以下試劑(c)穿孔素的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
更佳地，所述的DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO21和22所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有擴(kuò)增和檢測GAPDH的引物對和探針(d)具有SEQ ID NO28和29所示序列的引物對；(e)具有SEQ ID NO30所示序列的Taqman探針；(f)GAPDH的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO26和27所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有1-4套選自下組的引物對和探針(1)γ干擾素的引物對和探針(a1)具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對；(b1)具有SEQ ID NO5所示序列的Taqman探針；(c1)γ干擾素的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO1和2所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)白細(xì)胞介素4的引物對和探針(a2)具有SEQ ID NO13和14所示序列的引物對；(b2)具有SEQ ID NO15所示序列的Taqman探針；(c2)白細(xì)胞介素4的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO11和12所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)白細(xì)胞介素10的引物對和探針(a3)具有SEQ ID NO18和19所示序列的引物對；(b3)具有SEQ ID NO20所示序列的Taqman探針；(c3)白細(xì)胞介素10的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO16和17所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)白細(xì)胞介素2的引物對和探針(a4)具有SEQ ID NO8和9所示序列的引物對；(b4)具有SEQ ID NO10所示序列的Taqman探針
(c4)白細(xì)胞介素2的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO6和7所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
更佳地，所述的試劑盒共含有5套引物和探針。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量的方法，包括步驟(1)抽提白細(xì)胞的mRNA；(2)對mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA；(3)以步驟(2)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用具有SEQ ID NO23和24所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且用具有SEQ ID NO25所示序列的Taqman探針進(jìn)行熒光定量檢測，從而測得熒光信號；(4)根據(jù)測得的熒光信號確定白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而得出穿孔素的mRNA數(shù)量，并且與管家基因的mRNA數(shù)量相比較，計算出經(jīng)校正后的穿孔素mRNA相對數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，所述的白細(xì)胞是通過以下方法制備的從待測對象抽取1-3毫升血液，溶解血液中紅細(xì)胞，然后離心獲得白細(xì)胞沉淀；并且步驟(3)的PCR擴(kuò)增條件是50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種調(diào)控運動員訓(xùn)練運動量的方法，包括步驟(i)用本發(fā)明上述的方法測定運動員的白細(xì)胞中穿孔素mRNA數(shù)量，計為N1；(ii)按2-10天的時間間隔，用本發(fā)明上述方法測定運動員的白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量，依次計為N2....Nn，其中n表示2-10000(更佳地2-1000)的正整數(shù)；(iii)在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1，且(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％，其中n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值，否則維持或加大運動量。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)中所述的條件還包括(c)當(dāng)IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12這4個細(xì)胞因子有至少一個滿足免疫力下降指標(biāo)；(d)Th1/Th2比值T出現(xiàn)下降幅度為5-10％；或(e)Th1/Th2比值T的下降幅度為10％-50％。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明所述試劑盒的用途，它用于測定運動員的白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量，從而作為調(diào)控運動量的指標(biāo)。


圖1顯示了用本發(fā)明引物對擴(kuò)增IFN-γ(A)、IL-2(B)、IL-4(C)、IL-10(D)和穿孔素(E)的檢測結(jié)果。其中泳道1為各對應(yīng)的細(xì)胞因子；泳道2為GAPDH；泳道3為分子量標(biāo)準(zhǔn)物(Marker)。
圖2顯示了對IFN-γ進(jìn)行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關(guān)系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關(guān)系圖(B)。
圖3顯示了對IL-2進(jìn)行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關(guān)系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關(guān)系圖(B)。
圖4顯示了對IL-4進(jìn)行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關(guān)系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關(guān)系圖(B)。
圖5顯示了對IL-10進(jìn)行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關(guān)系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關(guān)系圖(B)。
圖6顯示了對穿孔素進(jìn)行熒光定量PCR檢測的循環(huán)數(shù)-熒光值關(guān)系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關(guān)系圖(B)。
圖7顯示了生理狀態(tài)下和病例狀態(tài)下細(xì)胞因子陽性率表達(dá)比較。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，為了有效準(zhǔn)確地判定早期疲勞，可以采用改進(jìn)的高度敏感和特異的熒光定量PCR技術(shù)，通過直接檢測外周血白細(xì)胞中細(xì)胞因子的自發(fā)性基因表達(dá)水平而實現(xiàn)。
眾所周知，免疫機能狀態(tài)直接影響機體工作能力，而免疫機能狀態(tài)的維持有賴于Th1和Th2細(xì)胞機能的相互平衡，通過觀察它們各自特異的細(xì)胞因子(IL-2，INF-γ、IL-4，IL-10)可反映Th1細(xì)胞(IL-2，INF-γ)和Th2細(xì)胞(IL-4，IL-10)，可能會比較客觀地反映機體細(xì)胞免疫機能，并且這種變化會先于其他生理學(xué)代謝學(xué)指標(biāo)甚至常規(guī)免疫指標(biāo)(如淋巴細(xì)胞增殖機能)的改變。所以檢測細(xì)胞因子不僅是基礎(chǔ)免疫研究的有效手段，亦是臨床上探索疾病發(fā)病機制、判斷預(yù)后和考核療效的指標(biāo)，更是評判早期運動疲勞的指標(biāo)。而且免疫細(xì)胞之間存在錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)關(guān)系，細(xì)胞因子又是傳遞這種調(diào)節(jié)信號必不可少的信息分子。通過研究細(xì)胞因子的免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，可以更好地理解完整的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制，了解運動過程中機體生理機能狀態(tài)，并且在臨床醫(yī)學(xué)方面有助于指導(dǎo)細(xì)胞因子作為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床治療免疫性疾病。
白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)最初被認(rèn)為是一種T細(xì)胞生長因子。分子量為15.5KDa。IL-2對B細(xì)胞的生長及分化均有一定的促進(jìn)作用。另外，單核-巨噬細(xì)胞受到IL-2的持續(xù)作用后，其抗原遞呈能力、殺菌力、細(xì)胞毒性均明顯增強，分泌某些細(xì)胞因子的能力也得到加強。IL-2可以誘導(dǎo)CTL、NK和LAK等多種殺傷細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能，并誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子。IL-2還可增強CTL細(xì)胞穿孔素(perforin)基因的表達(dá)。
IL-4是一種分子量為18-20KDa的糖蛋白。在小鼠由Th2亞群產(chǎn)生。IL-4可以促使抗原或絲裂原活化的B細(xì)胞分裂增殖，但其作用遠(yuǎn)弱于IL-2；IL-4也是CD4+T細(xì)胞的自分泌性生長因子；此外，IL-4還能促進(jìn)Tc細(xì)胞的活性。IL-4不能刺激巨噬細(xì)胞增殖，但可增強巨噬細(xì)胞的功能；巨噬細(xì)胞受刺激后抗原和FcγR的表達(dá)量均明顯增加；同時巨噬細(xì)胞遞呈抗原的能力及對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素作用也顯著增強。IL-4與IL-3協(xié)同可維持和促進(jìn)肥大細(xì)胞的增殖，在某些起敏反應(yīng)性疾病發(fā)生中具有一定的意義；可與CSF協(xié)同作用，促進(jìn)骨髓造血前體細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞定向分化；誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)，對淋巴細(xì)胞的遷移具有一定意義。
白細(xì)胞介素10(IL-10)分子量為35～40kD，通常為二聚體；主要由TH2細(xì)胞產(chǎn)生，也可由單核細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及活化的B細(xì)胞產(chǎn)生。IL-10能夠抑制活化的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，因此曾稱為細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，特別是抑制TH1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFNγ和LT等細(xì)胞因子，從而抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-1O可降低單核-巨噬細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)水平，損害了APC的抗原遞呈能力，實際上這可能是其抑制細(xì)胞介導(dǎo)免疫的原因。此外，IL-10還能抑制NK細(xì)胞活性，干擾NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子；但可刺激B細(xì)胞分化增殖，促進(jìn)抗體生成。
IFN-γ是分子量為20-25Kda的糖蛋白。IFN-γ可以誘導(dǎo)MHC II類抗原的表達(dá)，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。IFN-γ可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1(CD54)表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞FcγR表達(dá)，協(xié)同誘導(dǎo)TNF并促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物，此外，還可協(xié)同IL-2誘導(dǎo)LAK活性，促進(jìn)T細(xì)胞IL-2R表達(dá)；誘導(dǎo)急性期蛋白合成，誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞分化。IFN-γ亦具有增強NK細(xì)胞活性等作用。
上述細(xì)胞因子(IL-2、INF-γ、IL-4和IL-10)不僅在免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要的作用，而且通過觀察他們的分泌量可以反映TH1(IL-2和INF-γ)和TH2型細(xì)胞(IL-4和IL-10)的平衡，而TH1型細(xì)胞和TH2型細(xì)胞的平衡是機體處于生理狀態(tài)的保證。近來的研究表明TH2型淋巴細(xì)胞上調(diào)的同時會抑制TH1型淋巴細(xì)胞的數(shù)量。TH1型淋巴細(xì)胞和細(xì)胞免疫相關(guān)，所以細(xì)胞免疫的抑制將會促使機體對感染性疾病的易感性增加。目前，確定體液免疫(TH2)或細(xì)胞免疫(TH1)狀態(tài)最準(zhǔn)確的方法就是檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子。運動醫(yī)學(xué)界以前的研究表明運動后與TH2相關(guān)的細(xì)胞因子上調(diào)，特別是IL-10明顯升高，這表明細(xì)胞免疫受到抑制。而以往的檢測手段多使用流式細(xì)胞儀、ELISA和RT-PCR半定量等，所以目前尚缺乏高度敏感性、高度特異性的早期診斷方法。
穿孔素(perforin，簡稱為PFR)是一種蛋白毒素，存在于CTL和NK細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。成熟CTL識別抗原和MHCl類分子復(fù)合物并被激活后，迅速向靶細(xì)胞貼近、兩者細(xì)胞膜發(fā)生接觸，CTL胞漿中的殺傷顆粒借助微管作用被集中在靠靶細(xì)胞的一側(cè)，然后顆粒中的大分子內(nèi)容物被釋放至CTL和靶細(xì)胞的空隙中，其中的穿孔素在膜外鈣離子的作用下，與靶細(xì)胞膜結(jié)合、聚合，最終在細(xì)胞膜上形成不同孔徑(50～160納米)的跨膜孔道，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞膜去極化，使細(xì)胞外水分進(jìn)入胞內(nèi)，一些電解質(zhì)和大分子物質(zhì)流出胞外，最終引起靶細(xì)胞滲透性壞死。所以PFR在保護(hù)機體抗胞內(nèi)病原體如細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染、抗腫瘤和同種排斥應(yīng)答中起重要作用，是免疫系統(tǒng)重要的效應(yīng)分子。從理論上講，當(dāng)運動疲勞出現(xiàn)后，機體的免疫力下降，感染機會窗出現(xiàn)，所以機體對病毒的殺傷力也會不同程度的減弱。R.Staats等人的研究表明，訓(xùn)練有素的運動員外周血中PFR的百分比較高，但是在耐力運動(過度疲勞)后PFR出現(xiàn)暫時性的下降。在R.Staats等人的研究中使用流式細(xì)胞儀，因此，不能用于早期精確地診斷機體免疫力的改變。
如本文所用，術(shù)語“Taqman探針”是一種在其5′端帶有報告基團(tuán)并且在3′端帶有猝滅基團(tuán)的寡核苷酸，所述的猝滅基團(tuán)會抑制報告基團(tuán)產(chǎn)生可檢測的信號(例如熒光)。Taqman探針設(shè)計是現(xiàn)有技術(shù)，并且可以從公開途徑獲得有關(guān)信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996 Oct.；6(10)986-94)。
在本發(fā)明的一個實例中，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的IL-2(v00564)、IL-4(M13982)、IL-10(M57627)、IFN-γ(X13274)、PFR(NM_005041)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國賽百盛公司提供的引物設(shè)計軟件，分別設(shè)計和篩選出了5組引物(見表1)，PCR擴(kuò)增后獲得了相應(yīng)的條帶。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定，證實擴(kuò)增產(chǎn)物序列與文獻(xiàn)報道完全一致，說明上述引物對選定的基因具有高度特異性。
用表1中所示的特異性引物，通過熒光實時PCR檢測方法，能對細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR)基因表達(dá)水平進(jìn)行絕對定量分析。具體而言，先采用引物1(序列見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到雙鏈DNA片段，經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)品。以引物2及探針組合對此標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量PCR檢測，經(jīng)過條件優(yōu)化，獲得了線性結(jié)果。
實驗證明，采用該項技術(shù)對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因表達(dá)進(jìn)行檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.99。上述試劑保存于-20℃在6個月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實驗間的誤差小于5％。
對25例肺部疾病患者以及25例健康人進(jìn)行定量PCR分析。結(jié)果顯示25例健康人中IL-2、IFN-γ、IL-4、PFR和IL-10基因表達(dá)陽性率分別為100％、92％、88％、80％和12％。25例病人中均可檢測到IFN-γ、IL-2基因和PFR基因表達(dá)，陽性率為100％；IL-4和IL-10表達(dá)陽性率分別為96％和72％；實驗結(jié)果證明應(yīng)用本方法能夠高靈敏度地直接檢測出外周血白細(xì)胞中細(xì)胞因子基因的自發(fā)性表達(dá)，并且在生理和病理狀態(tài)下上述因子的基因表達(dá)有明顯差異。
本發(fā)明在生理狀態(tài)下的熒光定量PCR檢測技術(shù)在運動醫(yī)學(xué)上廣泛的應(yīng)用價值。可以比較運動前后PFR數(shù)量的改變從而對運動員的免疫機能狀態(tài)進(jìn)行評估，調(diào)控運動員訓(xùn)練量。通過檢測一定間隔(如2-14天，較佳地3-10天，更佳地5-7天)內(nèi)運動員體內(nèi)PFR數(shù)量的變化，可以及時反映出運動員免疫機能的變化，從而作為科學(xué)調(diào)控運動量的指標(biāo)之一。
一種優(yōu)選的訓(xùn)練方法是通過維持一定百分比的最大攝氧量來進(jìn)行一定運動量的訓(xùn)練，并通過監(jiān)測PFR等細(xì)胞因子的變化水平來調(diào)控訓(xùn)練量。
人體需氧量取決于生理機能狀態(tài)，運動強度增大時，需氧量相應(yīng)改變。例如，安靜每分鐘需氧量為200-300ml，劇烈運動是每分鐘需氧量可增加200倍以上。人的攝氧能力有一定局限性，但需氧量卻隨運動強度的加大而上升。當(dāng)人體進(jìn)行長時間的劇烈運動時，每分?jǐn)z氧量達(dá)到最高水平，稱為最大攝氧量。這是反映心肺功能的重要指標(biāo)，也是有氧工作能力的重要指標(biāo)。最大攝氧量的測定有許多方法，比如試驗方法受試者戴好呼吸口罩，使呼出氣體與氣體分析儀相連。然后在功率跑臺或功率自行車上進(jìn)行遞增負(fù)荷運動，分析儀每分鐘自動記錄心率、通氣量和吸氧量。此時，吸氧量隨負(fù)荷的遞增而遞增。當(dāng)心率達(dá)到180次/分以上，呼吸商超過1，吸氧量不再升高(或比兩次測量數(shù)值相差少于2毫升/分)，或者受試著極度疲勞不能再繼續(xù)運動下去，這時的吸氧量即最大吸氧量。得到最大吸氧量后，可計算出60％的最大攝氧量，然后可從氣體分析儀上得到60％最大攝氧量對應(yīng)的心率，運動過程中通過控制心率而控制60％最大攝氧量的運動強度。
例如，當(dāng)間隔時間為7天時(當(dāng)然，每個間隔可以相同也可以不相同)，第一周以一定強度進(jìn)行運動，本周最后一次運動結(jié)束即刻抽血，然后進(jìn)行定量PCR測得的結(jié)果為N1；接著第二周的運動負(fù)荷加大，仍連續(xù)運一周，再次進(jìn)行PFR的定量PCR檢測，其結(jié)果為N2，如果N2小于N1，且相對下降幅度大于一定數(shù)值(如大于5％，較佳地大于10％)，則說明運動負(fù)荷過大，運動員免疫機能下降，應(yīng)該減少運動量；否則說明運動員免疫機能沒有下降，可以維持運動量或加大運動量。
第3周，比較第3周的PFR數(shù)量與第二周的PFR數(shù)量，如果N3小于N2，且相對下降幅度大于一定數(shù)值(如大于5％，較佳地大于10％)，則說明運動負(fù)荷過大，運動員免疫機能下降，應(yīng)該減少運動量；否則說明運動員免疫機能沒有下降，可以維持運動量或加大運動量。
第4周至第n周，如果Nn小于Nn-1，且相對下降幅度大于一定數(shù)值(如大于5％，較佳地大于10％)，則說明運動負(fù)荷過大，運動員免疫機能下降，應(yīng)該減少運動量；否則說明運動員免疫機能沒有下降，可以維持運動量或加大運動量。
綜上所述，對于穿孔素，通常其表達(dá)量多少與細(xì)胞免疫狀況成正相關(guān)。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化 n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
此外，在以PFR數(shù)據(jù)為主的情況下，還可以參考一個或多個其他免疫相關(guān)的細(xì)胞因子的數(shù)量。
例如，對于IFN-γ，通常其表達(dá)量多少與細(xì)胞免疫狀況成正相關(guān)。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIFN-γ=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
對于IL-2，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIL-2=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
對于IL-4，通常其表達(dá)量多少與細(xì)胞免疫狀況成反相關(guān)。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＞Nn-1
(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIL-4=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
對于IL-10，通常其表達(dá)量多少與細(xì)胞免疫狀況成反相關(guān)。因此，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＞Nn-1(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中相對變化VIL-10=|Nn-Nn-1|Nn-1×100%]]>n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值。
此外，還可以同時參考Th1/Th2比值T。該比值T可用下式計算T＝(NIFN-γ+NIL-2)/(NIL-4+NIL-10) (I-1)由于，IL-2的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他因子，通常其拷貝數(shù)高于其他因子10-50倍，因此，為了更準(zhǔn)確地計算T值，也可用下式計算T＝(NIFN-γ+NIL-2/20)/(NIL-4+NIL-10) (I-2)例如，對于第n周，可以在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Tn＜Tn-1(b)Tn與Tn-1的相對變化幅度大于5％(較佳地大于10％)，其中T值相對變化 此外，本發(fā)明在生理狀態(tài)下的熒光定量PCR檢測技術(shù)還可用于多種疾病如感染、過敏、某些炎癥、某些自身免疫病的診斷或輔助診斷，用于預(yù)后和療效判定以及對某些免疫調(diào)節(jié)性治療進(jìn)行指導(dǎo)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)檢測靈敏度高，可以直接從2ml外周血中特異性地檢出細(xì)胞因子(PFR)基因表達(dá)，比現(xiàn)有的RT-PCR方法提高了100倍。
(2)在檢測前無需任何刺激，可直接在生理狀態(tài)下檢測上述細(xì)胞因子基因的表達(dá)。
(3)快速，可以在數(shù)小時內(nèi)獲得檢測結(jié)果。
(4)引物設(shè)計極其合理，反應(yīng)條件均一性好。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1引物設(shè)計及定量PCR產(chǎn)物檢測方法1.1 材料淋巴細(xì)胞來自健康人體。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液均為GIBCO公司產(chǎn)品。經(jīng)典法RNA抽提試劑盒由上海申能博采生物科技有限公司提供。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司。各PCR引物及熒光素標(biāo)記探針由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。10mM dNTP、Pfu高保真DNA聚合酶(5Unit/μl)購自上海申能博采公司。PCR產(chǎn)物測序由上海申友公司完成。
1.2 方法根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的IL-2(v00564)、IL-4(M13982)、IL-10(M57627)、IFN-γ(X13274)、PFR(NM_005041)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國賽百盛公司提供的引物設(shè)計軟件，分別設(shè)計了6組引物(表1)。由上海申友公司合成各引物及熒光素標(biāo)記探針。
表1

其中，各探針在兩端分別具有報告基團(tuán)6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)，和猝滅基團(tuán)6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端)。
抽提RNA應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，加入1000U/m1 IL-2培養(yǎng)1周，選擇活躍增殖期細(xì)胞，按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度計(Biophotometer，德國Eppendorf公司)測定A260及A280。
標(biāo)準(zhǔn)品制備取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
PCR反應(yīng)混合液為2μl cDNA，上游及下游引物1(50μM)各1μl，dNTP 1μl，Pfu酶1μl，buffer 5μl，加DEPC-H2O至50μl，石臘油30μl覆蓋。
IL-2、IL-4、IL-10和PFR的PCR反應(yīng)條件為95℃變性5min；95℃ 1min，57℃1min，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。
IFN-γ的PCR反應(yīng)條件為95℃變性5min；95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。
分別把IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和PFR的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖電泳100V 30min，然后，使用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon，GIS-120D)攝片。
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后采用紫外分光光度計測定雙鏈DNA含量，純化產(chǎn)物中的基因拷貝數(shù)按下述公式計算基因拷貝數(shù)/μl＝[A260/13.2×片斷長度(kb)]×6.02×1011定量PCR檢測定量PCR反應(yīng)母液為10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl，50μM熒光素標(biāo)記探針0.1μl，10mM dNTP 0.5μl，0.5μl Taq酶(5units/μl)，DEPC-H2O 17.7μl。上述反應(yīng)母液保存于-20℃。
定量PCR反應(yīng)液23μl反應(yīng)母液中加入2μl DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
定量PCR反應(yīng)條件50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)，60℃檢測；37℃ 30秒。
定量PCR儀為Rotor-Gene RG 3000型(澳大利亞Corbett公司)或LightCycler(瑞士Roche公司)。
1.3 結(jié)果A、根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列以及設(shè)計的5組引物(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、和PFR)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別獲得了相應(yīng)的單一條帶，其結(jié)果分別如圖1A-E所示。測序后證明其序列與預(yù)期相同。
B、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和PFR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)品，以引物2及探針組合進(jìn)行定量PCR檢測，獲得了線性結(jié)果。IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、和PFR的結(jié)果分別如圖2-6所示，包括循環(huán)數(shù)-熒光值關(guān)系圖(A)和對數(shù)濃度-循環(huán)數(shù)關(guān)系圖(B)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線分析結(jié)果表明，在基因拷貝數(shù)為105-108范圍內(nèi)，應(yīng)用本方法能夠給出線性結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R均＞0.99，擴(kuò)增效率在0.68-1.00之間。
此外，用于定量PCR的定量PCR反應(yīng)母液，在保存于-20℃條件下，在6個月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實驗間誤差≤5％。將含250微升定量PCR反應(yīng)母液的容器置于盒中，就構(gòu)成了檢測試劑盒。
實施例2生理狀態(tài)下健康人外周血白細(xì)胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)2.1 材料25名健康志愿者來自上海市體育學(xué)院2003級入學(xué)新生。TriBlue RNA抽提試劑盒及糖原購自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司。Taq DNA聚合酶購自上海申友公司。
2.2 方法抽提RNA及反轉(zhuǎn)錄成cDNA取2ml肝素抗凝全血，溶解全血中的紅細(xì)胞，制備成白細(xì)胞沉淀保存于-20℃。按試劑盒要求抽提抽提RNA。
取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
定量PCR檢測定量PCR反應(yīng)母液為10×PGR反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，100μM上游及下游引物2(表1)各0.1μl，50μM熒光素標(biāo)記探針0.1μl，10mM dNTP 0.5μl，0.5μl Taq酶(5units/μl)，DEPC-H2O 17.7μl。上述反應(yīng)母液保存于-20℃。
定量PCR反應(yīng)液23μl反應(yīng)母液中加入2μl cDNA。
定量PCR反應(yīng)條件50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)，60℃檢測；37℃ 30秒。
定量PCR儀為Rotor-Gene RG 3000型(澳大利亞Corbett公司)或LightCycler(瑞士Roche公司)。按順序?qū)FN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR進(jìn)行定量PCR。
2.3 結(jié)果A、25名健康人生理狀態(tài)下外周血白細(xì)胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)狀況見下表2
表2

-表示未能檢測到基因表達(dá)。
B、結(jié)果分析若以內(nèi)參照基因GAPDH拷貝數(shù)作為基準(zhǔn)，25名健康人外周血白細(xì)胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)狀況[即靶基因拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝數(shù)]見表3。
表3

實施例3肺部疾病患者外周血白細(xì)胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)3.1 材料25名肺部疾病患者來自上海市肺科醫(yī)院住院病人。TriBlue RNA抽提試劑盒及糖原購自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBIFermentas公司。Taq DNA聚合酶購自上海申友公司。
3.2 方法(與實施例2方法相同)抽提RNA及反轉(zhuǎn)錄成cDNA取2ml肝素抗凝全血，溶解全血中的紅細(xì)胞，制備成白細(xì)胞沉淀保存于-20℃。按試劑盒要求抽提抽提RNA。然后取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
定量PCR定量PCR反應(yīng)母液為10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl，50μM熒光素標(biāo)記探針0.1μl，10mM dNTP 0.5μl，0.5μl Taq酶(5units/μl)，DEPC-H2O 17.7μl。上述反應(yīng)母液保存于-20℃。
定量PCR反應(yīng)液23μl反應(yīng)母液中加入2μl cDNA。
定量PCR反應(yīng)條件50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃ 20秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)，60℃檢測；37℃ 30秒。
定量PCR儀為Rotor-Gene RG 3000型(澳大利亞Corbett公司)或LightCycler(瑞士Roche公司)。按順序?qū)FN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR進(jìn)行定量PCR。
3.3 結(jié)果A、25名肺部疾病患者外周血白細(xì)胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)狀況見下表4表4

-表示未能檢測到基因表達(dá)。
B、結(jié)果分析若以內(nèi)參照基因GAPDH拷貝數(shù)作為基準(zhǔn)，25名肺部疾病患者外周血白細(xì)胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)狀況[即靶基因拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝數(shù))]見表5。
表5

表3和表5的陽性率結(jié)果總結(jié)于圖7。分別用25例肺部疾病患者以及25例健康人進(jìn)行定量PCR分析，以便證明本發(fā)明方法不僅可以在病人(非生理狀態(tài)下)當(dāng)中對細(xì)胞因子進(jìn)行定量，而且也可以在健康人(生理狀態(tài)下)對細(xì)胞因子進(jìn)行定量。總的陽性率如下IFN-γ總陽性率為96％；IL-2總陽性率為100％；IL-4總陽性率為92％；IL-10總陽性率42％；PFR為總陽性率為90％。陽性率表明了本發(fā)明方法的敏感性很高。
目前，用熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子的報道中均需體外刺激才能測出，且陽性率較低，如對IL-4的陽性率為81％，而本發(fā)明方法檢測到IL-4的陽性率較高為92％。
其中，IL-10陽性率較低的原因是因為IL-10是最具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞因子，正常情況下很難檢測到。在健康自愿測試者處于健康的生理狀態(tài)下時，所以具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)率很低，故陽性率低。而檢測病人的結(jié)果表達(dá)率為92.6％。從理論上講，隨著運動量的加大，運動疲勞的出現(xiàn)，IL-10的表達(dá)量會升高。這樣通過對運動前和運動后的IL-10表達(dá)量進(jìn)行比較，或與TH1型細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-2)的表達(dá)量進(jìn)行比較，可能會得出較有意義的結(jié)論。如Nieman DC(2001)的研究中指出總體來講馬拉松運動前很難檢測到IL-10(幾乎為0)，但是在運動后(約為75pg/ml)以及運動后1.5小時(約為28pg/ml)會出現(xiàn)明顯的升高。但是，Nieman DC使用的方法是ELISA，他是從蛋白水平對IL-10進(jìn)行定量，所以敏感性及前瞻性均不如本發(fā)明方法。
實施例4通過對穿孔素基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測來調(diào)控運動員的訓(xùn)練量在本實施例中，用實施例2中相同的檢測方法，對測試組運動員(10人)，共進(jìn)行訓(xùn)練(并非完全進(jìn)行完如下的運動負(fù)荷，但是在發(fā)現(xiàn)運動員免疫機能下降前必須按照此方案進(jìn)行)。第一周以60％最大攝氧量運動30分鐘×2次，間歇5分鐘；第二周以70％最大攝氧量運動20分鐘×3次，間歇5分鐘；第三周以80％最大攝氧量運動15分鐘×4次，間歇5分鐘；第四周以90％最大攝氧量運動10分鐘×6次，間歇5分鐘；第五周以95％最大攝氧量運動3分鐘×10次，間歇5分鐘。每周運動前和運動后即刻取2ml外周血，對穿孔素基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測。比較運動前后PFR數(shù)量的改變從而對運動員的免疫機能狀態(tài)進(jìn)行評估，調(diào)控運動員訓(xùn)練量。如第一周運動后即刻抽血，然后進(jìn)行定量PCR測得的結(jié)果為N1；第二周運動后即刻抽血進(jìn)行定量PCR的結(jié)果為N2；第三周運動后即刻抽血，然后進(jìn)行定量PCR測得的結(jié)果為N3，依次類推為N4-Nn。如果((Nn-1-Nn)/Nn-1)＞5％，則說明運動負(fù)荷過大，運動員免疫機能下降，應(yīng)該減少運動量；當(dāng)((Nn-Nn-1)/Nn-1)＞5％，說明運動員免疫機能增強，應(yīng)維持運動量或加大運動量。
對照組運動員(10人)運動方案同前，但是根據(jù)教練員經(jīng)驗判定運動員是否過度疲勞，或者根據(jù)醫(yī)生的診斷確定是否免疫力下降。一旦判定運動員過度疲勞或免疫力下降，則減少運動量，否則維持運動量。
結(jié)果表明，測試組運動員患感冒等病癥的次數(shù)遠(yuǎn)低于對照組(低35％以上)，同時運動成績也優(yōu)于對照組。這表明，本發(fā)明方法可準(zhǔn)確地判定早期疲勞，有效地避免過度運動負(fù)荷訓(xùn)練所造成的機體免疫功能下降。
實施例5通過對多個細(xì)胞因子基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測來調(diào)控運動員的訓(xùn)練量本實施例的方法同實施例4，不同點僅在于同時對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR基因的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR檢測，并根據(jù)表6調(diào)控測試組運動員的運動量。測試組運動員為10人，對照組運動員10人。試驗持續(xù)5周。
表6

具體地，通常維持或加大測試組運動員的運動量，但當(dāng)運動員處于以下情況之一時，減少運動量甚至停止。
(a)PFR基因的出現(xiàn)免疫力下降指標(biāo)(即變化幅度出現(xiàn)免疫力下降趨勢或絕對拷貝數(shù)過低表明免疫力下降)，且另外4個細(xì)胞因子有至少一個出現(xiàn)免疫力下降指標(biāo)(變化幅度出現(xiàn)免疫力下降趨勢或絕對拷貝數(shù)表明免疫力下降)；(b)5個細(xì)胞因子有至少3個出現(xiàn)免疫力下降的指標(biāo)。
(c)PFR基因的出現(xiàn)免疫力下降指標(biāo)，且Th1/Th2比值T出現(xiàn)下降幅度為5-10％。
(d)Th1/Th2比值T的下降幅度大于10％。
對照組運動員(10人)根據(jù)教練員經(jīng)驗判定運動員是否過度疲勞，或者根據(jù)醫(yī)生的診斷確定是否免疫力下降。一旦判定運動員過度疲勞或免疫力下降，則減少運動量，否則維持運動量。
結(jié)果表明，測試組運動員患感冒等病癥的次數(shù)遠(yuǎn)低于對照組(低60％以上)，同時運動成績也優(yōu)于對照組。這表明，本發(fā)明方法可準(zhǔn)確地判定早期疲勞，有效地避免過度運動負(fù)荷訓(xùn)練所造成的機體免疫功能下降。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海體育學(xué)院<120>生理狀態(tài)下外周血中穿孔素基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測<130>036347<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>5tcttggctgt tactgccagg accca 25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>6acctcaactc ctgccacaat 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>7ttgctgatta agtccctggg 20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>8ctggagcatt tactgctgga tt 22<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>9gccttcttgg gcatgtaaaa c 21<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>10aaatgtgagc atcctggtga gtttggg 27<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>11gcttccccct ctgttcttc 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>12tctggttggc ttccttcac 19<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>13caccgagttg accgtaacag a 21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>14ttctcatggt ggctgtagaa ctg 23<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸
<400>15agcacagtcg cagccctgca ga 22<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>16tgagaaccaa gacccagaca t 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>17caataaggtt tctcaagggg c 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>18agaacctgaa gaccctcagg c 21<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>19cctcggcctt gctcttgtt 19<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>20aggctacggc gctgtcatcg atttct 26
<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>21agtcagctcc actgaagctg t 21<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>22tgaagtgggt gccgtagtt 19<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>23accagcaatg tgcatgtgtc t 21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>24ccacatggaa actgtagaag c 21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>25tggccggctc acactcacag g 21<210>26<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>26cacatcgctc agacaccatg 20<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>27aggcattgct gatgatcttg a 21<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>28ggaaggtgaa ggtcggagtc 20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>29gaagatggtg atgggatttc 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>30caagcttccc gttctcagcc 20
權(quán)利要求
1.一種檢測細(xì)胞因子基因表達(dá)的試劑盒，其特征在于，它包括以下擴(kuò)增和檢測穿孔素的引物對和探針(a)具有SEQ ID NO23和24所示序列的引物對；(b)具有SEQ ID NO25所示序列的Taqman探針。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還含有以下試劑(c)穿孔素的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ IDNO21和22所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還含有擴(kuò)增和檢測GAPDH的引物對和探針(d)具有SEQ ID NO28和29所示序列的引物對；(e)具有SEQ ID NO30所示序列的Taqman探針；(f)GAPDH的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO26和27所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還含有1-4套選自下組的引物對和探針(1)γ干擾素的引物對和探針(a1)具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對；(b1)具有SEQ ID NO5所示序列的Taqman探針；(c1)γ干擾素的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO1和2所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)白細(xì)胞介素4的引物對和探針(a2)具有SEQ ID NO13和14所示序列的引物對；(b2)具有SEQ ID NO15所示序列的Taqman探針；(c2)白細(xì)胞介素4的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO11和12所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)白細(xì)胞介素10的引物對和探針(a3)具有SEQ ID NO18和19所示序列的引物對；(b3)具有SEQ ID NO20所示序列的Taqman探針；(c3)白細(xì)胞介素10的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO16和17所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)白細(xì)胞介素2的引物對和探針(a4)具有SEQ ID NO8和9所示序列的引物對；(b4)具有SEQ ID NO10所示序列的Taqman探針(c4)白細(xì)胞介素2的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品是用SEQ ID NO6和7所示序列的引物對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.一種檢測白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量的方法，其特征在于，包括步驟(1)抽提白細(xì)胞的mRNA；(2)對mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA；(3)以步驟(2)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用具有SEQ ID NO23和24所示序列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且用具有SEQ ID NO25所示序列的Taqman探針進(jìn)行熒光定量檢測，從而測得熒光信號；(4)根據(jù)測得的熒光信號確定白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)中通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而得出穿孔素的mRNA數(shù)量，并且與管家基因的mRNA數(shù)量相比較，計算出經(jīng)校正后的穿孔素mRNA相對數(shù)量。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的白細(xì)胞是通過以下方法制備的從待測對象抽取1-3毫升血液，溶解血液中紅細(xì)胞，然后離心獲得白細(xì)胞沉淀；步驟(3)的PCR擴(kuò)增條件是50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40個循環(huán)。
9.一種調(diào)控運動員訓(xùn)練運動量的方法，其特征在于，包括步驟(i)用權(quán)利要求6所述的方法測定運動員的白細(xì)胞中穿孔素mRNA數(shù)量，計為N1；(ii)按2-10天的時間間隔，用權(quán)利要求6所述的方法測定運動員的白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量，依次計為N2....Nn，其中n表示2-10000的正整數(shù)；(iii)在滿足以下條件下，減少運動量或停止運動(a)Nn＜Nn-1，且(b)Nn與Nn-1的相對變化幅度大于5％，其中n為2-10000的正整數(shù)，Nn和Nn-1為第n次和第n-1次的測量值，否則維持或加大運動量。
10.如權(quán)利要求1所述試劑盒的用途，其特征在于，它用于測定運動員的白細(xì)胞中穿孔素的mRNA數(shù)量，從而作為調(diào)控運動量的指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對外周血中與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測的方法。該方法可以直接從2ml外周血中特異性地檢出細(xì)胞因子(PFR)基因表達(dá)，并且在檢測前無需任何刺激，可直接在生理狀態(tài)下檢測上述細(xì)胞因子基因的表達(dá)，從而用于判定早期疲勞，避免過度運動負(fù)荷訓(xùn)練所造成的機體免疫功能下降。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK1629312SQ200310109558
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者陳佩杰, 董強剛, 王茹 申請人:上海體育學(xué)院