專利名稱：造血細(xì)胞連續(xù)灌注懸浮培養(yǎng)過程細(xì)胞沉降截留裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于造血細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞截留裝置，具體地說涉及一種用于連續(xù)灌注培養(yǎng)過程中截留造血細(xì)胞的沉降分離裝置。
背景技術(shù)：
臍血造血干細(xì)胞移植在治療造血功能障礙，及惡性腫瘤患者放療后造血能力的恢復(fù)等方面有著良好的應(yīng)用前景。但由于臍血的來源局限性，臍血造血干細(xì)胞數(shù)量不足已成為臍血造血干細(xì)胞移植研究和臨床應(yīng)用的瓶頸，所以臍血造血干細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增的研究變得非常迫切。灌注培養(yǎng)過程因其能在培養(yǎng)過程中不斷更新培養(yǎng)基，維持良好的培養(yǎng)環(huán)境，有利于細(xì)胞擴(kuò)增，而被認(rèn)為是實現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)的有效途徑。
平板灌注腔被用來培養(yǎng)造血細(xì)胞，Koller等開發(fā)了無基質(zhì)細(xì)胞的灌注式培養(yǎng)體系，成功地將CFU-GM擴(kuò)增了17-19倍。這種培養(yǎng)腔包括多個微槽(與培養(yǎng)基流動的方向垂直)，它能提供均一的環(huán)境，允許營養(yǎng)物的擴(kuò)散，但把細(xì)胞保留在腔體中，不易回收。固定床生物反應(yīng)器也是實現(xiàn)造血細(xì)胞關(guān)注培養(yǎng)的一種構(gòu)思，一般也需要采用一定的介質(zhì)來截留細(xì)胞，同樣存在細(xì)胞難于回收的問題。
造血細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在傳質(zhì)和檢測方面具有優(yōu)勢，在培養(yǎng)過程中有效截留細(xì)胞是懸浮灌注培養(yǎng)反應(yīng)器系統(tǒng)開發(fā)的關(guān)鍵問題。旋轉(zhuǎn)絲網(wǎng)過濾是動物細(xì)胞(雜交瘤、CHO細(xì)胞等)連續(xù)灌注培養(yǎng)中常用的細(xì)胞截留裝置，該裝置通過旋轉(zhuǎn)過濾絲網(wǎng)分離細(xì)胞和培養(yǎng)基，該方法的顯著缺點(diǎn)在于絲網(wǎng)作為過濾介質(zhì)容易被堵塞。造血細(xì)胞與一般動物細(xì)胞(雜交瘤、CHO細(xì)胞等)相比，細(xì)胞的均一性較差，故難于確定旋轉(zhuǎn)過濾絲網(wǎng)的轉(zhuǎn)速。此外，造血細(xì)胞對剪切較為敏感，高剪切會引起較大的細(xì)胞損傷，故不宜采用旋轉(zhuǎn)絲網(wǎng)過濾截留。膜過濾，特別是錯流膜過濾也被用來分離細(xì)胞與培養(yǎng)基，但膜過濾不僅同樣存在剪切較大和易被堵塞的問題，而且膜材料與造血細(xì)胞的生物相容性較差，所以會引起較大的細(xì)胞損傷。
沉降過程由于不存在堵塞失效問題，也被應(yīng)用于成系動物細(xì)胞的截留。垂直細(xì)胞沉降器因必須保證沉降器截面向上的流速小于細(xì)胞的沉降速率，往往需要較大的橫截面積，從而使垂直沉降裝置體積龐大。細(xì)胞截留過程中，大量細(xì)胞懸液離開反應(yīng)器的培養(yǎng)空間，加上細(xì)胞沉降沉降速率較小，致使細(xì)胞在反應(yīng)器外的平均停留時間較長，不利于細(xì)胞的正常生長。傾斜式細(xì)胞沉降器利用細(xì)胞在狹槽中的沉降效應(yīng)，能使細(xì)胞較快沉降到底面，但傾斜式沉降器操作中細(xì)胞回流的方向與沉降器內(nèi)主體流動的方向相反，導(dǎo)致大量細(xì)胞沉積于沉降器底面，難于回流至反應(yīng)器，同樣存在細(xì)胞在反應(yīng)器外的平均停留時間較長的問題。大量細(xì)胞的積累會惡化沉降器內(nèi)的培養(yǎng)環(huán)境，對細(xì)胞擴(kuò)增不利。
王兆偉，譚文松等(ZL 00116518.6)提出的沉降器設(shè)計雖然能有效地進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞或其他成系動物細(xì)胞的截留，但由于該沉降器操作參數(shù)的確定需要確定臨界沉降速率，而造血細(xì)胞為非均一細(xì)胞群，其中干細(xì)胞、祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞之間存在顯著的大小差異，難于確定臨界沉降速率，故操作困難。若對造血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞全截留時，又由于其沉降面長度較大和流場不易控制等，細(xì)胞易沉積于沉降器下底面無法順利回流，造成細(xì)胞損傷。一系列實驗也發(fā)現(xiàn)，該方法不適用于造血細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)過程的細(xì)胞截留。
細(xì)胞沉降器的尺寸對細(xì)胞截留效果有較大的影響。沉降器截面的寬高比太小(＜1)時，細(xì)胞懸液在不同徑向高度的流速將出現(xiàn)較大的差異，造成沉降器內(nèi)部流體的整體流動，不利于細(xì)胞沉降過程的控制，嚴(yán)重時徑向漩渦引起的返混，會破壞整個沉降過程的定態(tài)；沉降器截面的寬高比太大(＞5)時，懸液中的大量細(xì)胞易沉積于沉降器底面，不利于細(xì)胞的回收。
沉降器長度的確定是依據(jù)細(xì)胞的平均沉降速率通過模型計算加以設(shè)計的，對于造血細(xì)胞，沉降器長度過小會削弱沉降器的細(xì)胞截留能力，使部分個體較小的細(xì)胞隨上清液溢出；而沉降器長度過大，不但會加大沉降器的加工難度和材料成本，而且在操作中需要更長的系統(tǒng)穩(wěn)定時間。所以本專利通過一系列的模型計算和實驗研究，確定了較為優(yōu)化的寬高比和沉降器長寬比。
實驗表明，根據(jù)所述尺寸設(shè)計加工的沉降裝置，可有效截留造血細(xì)胞，并取得了較高的細(xì)胞截留效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種用于造血細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，在造血細(xì)胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng)中能有效截留細(xì)胞，而不引起較大細(xì)胞損傷、損失的造血細(xì)胞截留裝置。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思顆粒沉降操作常被應(yīng)用于液固分離的化工過程。1920年，醫(yī)師Boycotts首先報道了血細(xì)胞在傾斜狹槽中的沉降效應(yīng)，之后許多學(xué)者對傾斜式沉降器的沉降現(xiàn)象進(jìn)行了深入的理論研究，通過數(shù)學(xué)模型提出了上流式傾斜沉降槽工作流量的理論計算式S(vw)＝vw(L sinθ+b cosθ)其中為S(v)體積流量，v為顆粒沉降速率，L、w、b分別是沉降槽的長、寬、高，θ為沉降槽與垂直方向之間的傾角。
本發(fā)明公開的裝置首先使大多數(shù)細(xì)胞經(jīng)過垂直沉降區(qū)快速回流，再利用造血細(xì)胞的Boycotts效應(yīng)，使上溯細(xì)胞沉降到底面，上清液從沉降器上端的溢流口流出，有效截留細(xì)胞懸液中的造血細(xì)胞，回流反應(yīng)器；少量沉積于沉降器底部的細(xì)胞在沉降器內(nèi)靜態(tài)培養(yǎng)，最后用培養(yǎng)液沖洗回收。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種用于連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器，其一端的上部設(shè)有進(jìn)料口，沉降器對應(yīng)于進(jìn)料口位置的底部設(shè)有出料口，其另一端設(shè)有排液口和排氣口，進(jìn)料口與排液口之間為傾斜沉降區(qū)，進(jìn)料口與出料口之間為垂直沉降區(qū)，排氣口的作用是排除沉降器內(nèi)的空氣。
沉降器可采用低毒生物玻璃制作，沉降器內(nèi)部在使用前用硅化劑(二甲基硅烷2％/甲苯)進(jìn)行硅化處理。管狀沉降器的寬度與高度之比為寬度∶高度＝1.5～3∶1；長度為寬度的15～30倍。
生物反應(yīng)器來的細(xì)胞懸液從進(jìn)料口流入，大部分活細(xì)胞在垂直沉降區(qū)沉降，并從底端出料口流出，回流至生物反應(yīng)器；少量細(xì)胞向上流動，在傾斜沉降區(qū)；沉降上清液從上部的排液口排出，工作前沉降器內(nèi)的空氣從排氣口排出。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于避免了平板灌注腔或固定床培養(yǎng)反應(yīng)器細(xì)胞難于回收的問題，細(xì)胞容易回收，避免了旋轉(zhuǎn)絲網(wǎng)過濾和膜過濾的堵塞失效問題，解決了其它截留裝置所用材料的生物相容性較差的問題，本裝置內(nèi)部由垂直沉降區(qū)和傾斜沉降區(qū)組成，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)，減少了細(xì)胞在沉降器底面的沉積，有效縮短了截留過程中細(xì)胞在反應(yīng)器外的平均停留時間。采用水浴夾套能使沉降器內(nèi)沉積細(xì)胞處于相對穩(wěn)定的環(huán)境，加上定時通過使細(xì)胞回流，可緩解沉積引起的細(xì)胞損傷，。


圖1為細(xì)胞沉降截留裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為矩形沉降器橫截面圖。
圖3為細(xì)胞密度隨時間的變化。
圖4為造血細(xì)胞截留效果。
圖5為為上清液取樣和沖洗回流后沉降器下底面的顯微照片。
具體實施例方式
一種用于連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器1，其一端的上部設(shè)有進(jìn)料口2，沉降器1對應(yīng)于進(jìn)料口2位置的底部設(shè)有出料口3，其另一端設(shè)有上清液的排液口4和排氣口5，進(jìn)料口2與排液口4之間為傾斜沉降區(qū)，進(jìn)料口2與出料口3之間為垂直沉降區(qū)。
所說的矩形的管狀沉降器1的寬度L與高度H之比為寬度∶高度＝1.5～3∶1；管狀沉降器1的長度為寬度的25～35倍；進(jìn)料口2，出料口3與沉降器1底面的夾角為40～50°，上下構(gòu)成垂直沉降區(qū)，進(jìn)料口2與排液口4之間構(gòu)成傾斜沉降區(qū)。
進(jìn)一步，在沉降器1外設(shè)有夾套6，用于通入保溫流體(37C°)，以緩解少量細(xì)胞在沉降器底面沉積引起的細(xì)胞損傷。
實施例1細(xì)胞分離與培養(yǎng)從新鮮臍血(取自中國福利會婦幼保健院)分離得到單個核細(xì)胞(MNCs)，用含20％FBS的IMDM培養(yǎng)基(Gibco BRL，USA)重新懸浮，添加SCF、IL-3和IL-6三種細(xì)胞因子，其濃度分別為50ng/ml、20ng/ml和40ng/ml，以1×106cells/ml接種至轉(zhuǎn)瓶中，置于37℃、5％CO2、濕度飽和的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。
實驗方法細(xì)胞懸液從沉降裝置底端上進(jìn)料口2流入，從底端下表面的出料口3流出，清液從位于上端的排液口4排出，水浴夾套通以37℃水保溫。
結(jié)果考察了沉降過程達(dá)到穩(wěn)定前的，排液口4和出料口3的細(xì)胞密度變化，如圖3?？梢钥闯觯两颠^程穩(wěn)定時間約為50min。沉降過程穩(wěn)定后，溢流出口細(xì)胞密度穩(wěn)定在較低的水平。
分析了沉降過程的細(xì)胞截留效果，沉降過程穩(wěn)定后，總細(xì)胞的截留狀況和截留比，如圖4。進(jìn)口流量在一定程度上會影響整體截留效果，進(jìn)口流量較大時(50mL/h)，總細(xì)胞密度截留率為91.88％，進(jìn)口流量較小時(20mL/h)，總細(xì)胞密度截留率達(dá)到96.47％。
沉降器內(nèi)沉積細(xì)胞的顯微照片，上清液取樣和沖洗回流后沉降器下底面的顯微照片見圖5。圖中，31為沉積于底面的細(xì)胞，32溢流口的細(xì)胞碎片，33沖洗后的沉降器底面。本實驗結(jié)果說明本裝置在一定實驗條件下能有效截留造血細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種用于造血細(xì)胞連續(xù)懸浮灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器(1)，其一端的上部設(shè)有進(jìn)料口(2)，沉降器(1)對應(yīng)于進(jìn)料口(2)位置的底部設(shè)有出料口(3)，其另一端的上底面設(shè)有上清液的排液口(4)和排氣口(5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，管狀沉降器(1)的長度為寬度的15～30倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，進(jìn)料口(2)，出料口(3)與沉降器(1)底面的夾角為40～50°。
4.根據(jù)權(quán)利要求14任一項所述的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，沉降器(1)外設(shè)有水浴夾套(6)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，沉降器采用低毒生物玻璃制作，沉降器內(nèi)部經(jīng)硅化液硅化處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，管狀沉降器與垂直方向的夾角為40～50°。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，其特征在于，所說的細(xì)胞為造血細(xì)胞，包括臍帶血或骨髓來源單個核細(xì)胞及在其基礎(chǔ)上分離得到的細(xì)胞群。
全文摘要
一種用于造血細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細(xì)胞沉降截留裝置，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器，其一端的上部設(shè)有進(jìn)料口，沉降器對應(yīng)于進(jìn)料口位置的底部設(shè)有出料口，其另一端的上底面設(shè)有排液口和排氣口，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于避免了平板灌注腔或固定床培養(yǎng)反應(yīng)器細(xì)胞難于回收的問題，細(xì)胞回收方便，避免了旋轉(zhuǎn)絲網(wǎng)過濾和膜過濾的堵塞失效問題，解決了其它截留裝置所用材料的生物相容性較差的問題，本裝置內(nèi)部由垂直沉降區(qū)和傾斜沉降區(qū)組成，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)，減少了細(xì)胞在沉降器底面的沉積，有效縮短了截留過程中細(xì)胞在反應(yīng)器外的平均停留時間。
文檔編號C12M3/00GK1546642SQ20031010926
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者譚文松, 姜華, 蔡海波, 遲占有 申請人:上海伯瑞生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 華東理工大學(xué)