專利名稱：用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器系統(tǒng)，具體地說涉及一種用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增是干細(xì)胞生物工程的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，而要實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞在體外的生長、擴(kuò)增和定向分化誘導(dǎo)，則必需為其提供理想的培養(yǎng)環(huán)境，其中能滿足干細(xì)胞培養(yǎng)要求的生物反應(yīng)器系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)這一目的的基礎(chǔ)。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，從某種意義上說，生命體是通過干細(xì)胞的分裂來實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞的更新和持續(xù)生長的，新的分化細(xì)胞的不斷產(chǎn)生以及由分化細(xì)胞組成而本身不能再分裂的細(xì)胞或組織，都要通過由干細(xì)胞所產(chǎn)生的具有分化能力的細(xì)胞來維持機(jī)體細(xì)胞的數(shù)量，因此干細(xì)胞在生命體中起著決定性的作用。
研究發(fā)現(xiàn)，人類胚胎干細(xì)胞可在體外培養(yǎng)，成體干細(xì)胞也可在體外橫向分化為其它類型的細(xì)胞和組織，這就為干細(xì)胞的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。隨著基因工程、胚胎工程、細(xì)胞工程等各種生物技術(shù)的快速發(fā)展，在體外分離、培養(yǎng)干細(xì)胞已成為可能，而且可以利用干細(xì)胞進(jìn)一步構(gòu)建各種細(xì)胞、組織、器官等，以此作為移植組織和器官的來源，這是干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向，目前利用干細(xì)胞生成或修復(fù)造血、皮膚、神經(jīng)、軟骨等組織的技術(shù)都取得了一定的成功。
但干細(xì)胞的數(shù)目很少，需要在體外對其進(jìn)行增殖。在體內(nèi)，干細(xì)胞的發(fā)育和增殖受到多種機(jī)制和微環(huán)境的影響。在體外培養(yǎng)時(shí)，同樣需要進(jìn)行干細(xì)胞與各類生長因子和間質(zhì)細(xì)胞等輔助細(xì)胞的共培養(yǎng)；而且不同組織來源的干細(xì)胞，其培養(yǎng)條件也不盡相同，需要分別進(jìn)行研究；另外，在應(yīng)用前，需要根據(jù)靶組織的類型對所培養(yǎng)干細(xì)胞進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)，使其向所需細(xì)胞或組織方向分化。這些過程都要求對與干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的調(diào)節(jié)信號和微環(huán)境的影響進(jìn)行詳細(xì)的研究，在此基礎(chǔ)上，模擬其體內(nèi)微環(huán)境，給干細(xì)胞提供較理想的生長發(fā)育條件，以培養(yǎng)得到所需的細(xì)胞或組織產(chǎn)品。
干細(xì)胞體外培養(yǎng)的難點(diǎn)在于干細(xì)胞本身數(shù)量較少，適應(yīng)環(huán)境能力差，其生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制也較復(fù)雜，因此，需要先進(jìn)的培養(yǎng)裝置，以使其分離得到的干細(xì)胞能快速適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，而且要求在此裝置中可方便地進(jìn)行模擬體內(nèi)微環(huán)境的各項(xiàng)操作，滿足干細(xì)胞生長發(fā)育的需要。
對于干細(xì)胞培養(yǎng)，前人也曾開發(fā)了一些靜態(tài)培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如美國Aastrom公司開發(fā)的用于造血干細(xì)胞培養(yǎng)的平板式生物反應(yīng)器，但由于培養(yǎng)環(huán)境不均一，培養(yǎng)基中pH、溶氧、營養(yǎng)物和代謝物存在濃度梯度，此濃度梯度還會由于初始條件如接種濃度、細(xì)胞類型的分布、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)樣品的擴(kuò)增程度不同而在各批培養(yǎng)之間造成很大的差異。而且，靜態(tài)系統(tǒng)沒有操作彈性，不能實(shí)現(xiàn)三維培養(yǎng)，受底面積的限制，在細(xì)胞增殖到較高密度時(shí)細(xì)胞沒有足夠空間生長，而是相互疊加在底面上，因此造成生長的限制，而不能培養(yǎng)大量的細(xì)胞。另外靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用過程中所遇到的細(xì)胞收獲困難的問題一時(shí)也不能得到有效解決。
而另一方面，目前已有的攪拌式生物反應(yīng)器一般都是針對成系細(xì)胞設(shè)計(jì)，并不適合于干細(xì)胞的培養(yǎng)，其不足之處主要在于(1)達(dá)到要求混合效果并使細(xì)胞懸浮的攪拌強(qiáng)度較高，一般至少在50rpm以上，且深層鼓泡是常用通氣方式，但由于干細(xì)胞比成系細(xì)胞對剪切力更為敏感，因此這些反應(yīng)器應(yīng)用于干細(xì)胞培養(yǎng)往往會導(dǎo)致細(xì)胞受損而不能正常生長；(2)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中要經(jīng)歷從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的適應(yīng)過程，因此細(xì)胞本身對材料的生物相容性要求更高，而一般的生物反應(yīng)器所用的材料只是針對成系細(xì)胞設(shè)計(jì)，對于干細(xì)胞的特殊要求未作考慮，培養(yǎng)結(jié)果并不理想；(3)一般生物反應(yīng)器的體積在1.5升以上，其最小工作體積至少也要500ml以上，其操作彈性不能滿足干細(xì)胞培養(yǎng)的要求。成系細(xì)胞一般可通過種子細(xì)胞培養(yǎng)后再接種至反應(yīng)器中，不存在種子細(xì)胞數(shù)量過少的問題。但對干細(xì)胞來說，其來源和數(shù)量十分有限，一次采集并純化后獲得的細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重不足，如果接種時(shí)初始培養(yǎng)體積過大，則接種密度會過低，不利于細(xì)胞的生存和生長；(4)現(xiàn)有應(yīng)用于成系細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，在控制pH和溶氧(DO)濃度時(shí)采用二氧化碳、氧氣、氮?dú)猹?dú)立脈沖進(jìn)氣再合并進(jìn)入反應(yīng)器的方式，對一般動物細(xì)胞培養(yǎng)過程而言可以不考慮氣體間的相互干擾，但由于干細(xì)胞培養(yǎng)過程中氣體流量較小，進(jìn)氣間的相互干擾會導(dǎo)致各氣體分壓的劇烈波動，進(jìn)而造成pH和DO的大幅度波動，嚴(yán)重影響干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定和均一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足生物工程發(fā)展的需要。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，至少包括一個(gè)圓柱狀上端具有封蓋的圓柱狀反應(yīng)器，高徑比為2～4∶1；一個(gè)設(shè)置在所述反應(yīng)器中的攪拌裝置；一個(gè)設(shè)置在封蓋上的混合氣體和堿液入口；一個(gè)設(shè)置在封蓋上的混合氣體出口；一個(gè)設(shè)置在反應(yīng)器內(nèi)設(shè)有上部出氣口和下部出氣口并與所說的混合氣體出口相連通的通氣管；
一個(gè)設(shè)置在封蓋上的培養(yǎng)液入口；一個(gè)設(shè)置在封蓋上的培養(yǎng)液出口；一個(gè)設(shè)置在封蓋上的細(xì)胞回流入口；一個(gè)設(shè)有清液出口且入口與所說的培養(yǎng)液出口相連接的細(xì)胞截留器，截留器的出口與細(xì)胞回流入口相連接；一個(gè)通過封蓋設(shè)置在反應(yīng)器內(nèi)的pH電極；一個(gè)通過封蓋設(shè)置在反應(yīng)器內(nèi)的溶氧(DO)濃度電極；一個(gè)與pH電極和溶氧濃度電極相連接并用于控制堿液和混合氣體量的控制裝置。
所說的混合氣體包括CO2、O2、N2和空氣。
進(jìn)一步，所說的攪拌裝置的攪拌槳葉可采用20～40°斜葉提升式攪拌槳葉，并且槳葉直徑與反應(yīng)器直徑比達(dá)到3～4∶5，確保低轉(zhuǎn)速時(shí)有良好的混合效果，能有效懸浮細(xì)胞，并降低流體剪切。
本發(fā)明的反應(yīng)器是這樣操作的啟動攪拌裝置，調(diào)整轉(zhuǎn)速控制范圍，使反應(yīng)器能在1-40rpm之間穩(wěn)定運(yùn)行。培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液入口連續(xù)地送入預(yù)置有細(xì)胞的反應(yīng)器，以補(bǔ)充營養(yǎng)物，混合氣體通過混合氣體和堿液入口連續(xù)地送入預(yù)置有細(xì)胞的反應(yīng)器的上部和下部，混合氣體通過混合氣體出口排出反應(yīng)器，含有細(xì)胞的培養(yǎng)液由培養(yǎng)液出口進(jìn)入細(xì)胞截留器，活細(xì)胞與培養(yǎng)液通過細(xì)胞回流入口回流進(jìn)入反應(yīng)器，代謝副產(chǎn)物由細(xì)胞截留器清液出口排出，pH電極與溶氧濃度電極所測得的信號輸入控制裝置，以控制混合氣體的輸入量和比例，并同時(shí)控制堿液輸入量，以調(diào)節(jié)反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的pH值。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的生物反應(yīng)器在干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，pH、溶氧濃度等培養(yǎng)過程的相關(guān)參數(shù)采用自動檢測控制技術(shù)，有利于實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)過程優(yōu)化和模擬體內(nèi)環(huán)境，干細(xì)胞以懸浮培養(yǎng)方式取代傳統(tǒng)靜止或貼壁培養(yǎng)，便于細(xì)胞收獲和維持培養(yǎng)環(huán)境的均一，有利于參數(shù)的檢測、控制和優(yōu)化；本發(fā)明針對干細(xì)胞的剪切敏感性，對通氣和攪拌系統(tǒng)進(jìn)行了特殊設(shè)計(jì)，其中通氣采用表面通氣和深層鼓泡相結(jié)合的方式，攪拌槳采用30°斜葉提升式攪拌槳，并且槳葉直徑與反應(yīng)器直徑比達(dá)到4/5，確保低轉(zhuǎn)速時(shí)有良好的混合效果，能有效懸浮細(xì)胞，并降低流體剪切。針對干細(xì)胞來源有限數(shù)量不足的問題，反應(yīng)器罐體設(shè)計(jì)采用較大的高徑比，達(dá)到3/1，大大提高操作彈性，使反應(yīng)器工作體積的操作范圍達(dá)到0.1升至1.2升。在初始培養(yǎng)時(shí)由于干細(xì)胞數(shù)量偏少，可以采用小體積以提高細(xì)胞接種密度，使細(xì)胞在最短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。然后隨著細(xì)胞生長和細(xì)胞密度的提高以及營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物結(jié)累，可以采用培養(yǎng)基流加的方式補(bǔ)充營養(yǎng)物，稀釋細(xì)胞密度和代謝副產(chǎn)物濃度，同時(shí)使培養(yǎng)體積提高到反應(yīng)器工作體積。在該生物反應(yīng)器中干細(xì)胞培養(yǎng)過程能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基連續(xù)灌注，取代現(xiàn)有間歇換液方式，有利于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定和模擬體內(nèi)微環(huán)境；在pH和溶氧(DO)濃度控制方面，針對干細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)波動十分敏感的特點(diǎn)，將pH和DO控制作為兩個(gè)既獨(dú)立又相關(guān)的控制系統(tǒng)來進(jìn)行設(shè)計(jì)，雖然它們有著各自獨(dú)立的控制目標(biāo)(即培養(yǎng)過程中的pH值和溶氧水平)，但由于四氣體(空氣、氮?dú)?、氧氣及二氧化?之間的相互干擾而使兩者之間又相互關(guān)聯(lián)。為此該反應(yīng)器采用了新穎的pH和DO四氣體關(guān)聯(lián)控制設(shè)計(jì)，通過分別調(diào)節(jié)空氣、氮?dú)狻⒀鯕饧岸趸妓臍怏w的進(jìn)氣流量來改變總進(jìn)氣中氧和二氧化碳的分壓比率，以實(shí)現(xiàn)精確控制pH和DO的目的。當(dāng)系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)氮?dú)饣蜓鯕鈦砀淖兛傔M(jìn)氣中氧分壓時(shí)，系統(tǒng)會自動修正由此引起的二氧化碳分壓變化，進(jìn)而穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境的pH值(±0.02)；當(dāng)系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)二氧化碳?xì)怏w來改變總進(jìn)氣中二氧化碳的分壓時(shí)，系統(tǒng)也會自動修正由此引起的氧分壓變化，使培養(yǎng)環(huán)境DO水平實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定(±1％)。


圖1為用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2控制裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
參見圖1，本發(fā)明用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括一個(gè)圓柱狀上端具有封蓋1的圓柱狀反應(yīng)器2，高徑比為2～4∶1，優(yōu)選的高徑比為3∶1；一個(gè)設(shè)置在所述反應(yīng)器2中的攪拌裝置3；一個(gè)設(shè)置在封蓋1上的混合氣體和堿液入口4；一個(gè)設(shè)置在封蓋1上的混合氣體出口5；一個(gè)設(shè)置在反應(yīng)器2內(nèi)設(shè)有上部出氣口6和下部出氣口7并與所說的混合氣體出口5相連通的通氣管8；一個(gè)設(shè)置在封蓋1上的培養(yǎng)液入口9；一個(gè)設(shè)置在封蓋1上的培養(yǎng)液出口10；一個(gè)設(shè)置在封蓋1上的細(xì)胞回流入口11；一個(gè)設(shè)有清液出口12且入口13與所說的培養(yǎng)液出口10相連接的細(xì)胞截留器14，截留器14的出口15與細(xì)胞回流入口11相連接，該截留器14為一種本領(lǐng)域常規(guī)的裝置，如可采用“王兆偉、譚文松ZL00116518.6細(xì)胞灌注培養(yǎng)過程中的細(xì)胞截留分離方法及其裝置”專利公開的技術(shù)；一個(gè)通過封蓋1設(shè)置在反應(yīng)器2內(nèi)的pH電極16；一個(gè)通過封蓋1設(shè)置在反應(yīng)器2內(nèi)的溶氧濃度電極17；一個(gè)與pH電極16和溶氧濃度電極17相連接的控制裝置18，控制裝置18的輸出端分別與堿液泵22、CO2氣源23上的CO2流量控制閥、空氣氣源24上的空氣流量控制閥、N2氣氣源25上的N2氣流量控制閥和O2氣氣源26上的O2氣流量控制閥相連接，用于控制堿液和混合氣體量，堿液泵22、CO2氣源23、空氣氣源24、N2氣氣源25和O2氣氣源26與混合氣體和堿液入口4相連通。圖中虛線表示電氣連接。
所說的攪拌裝置2的攪拌槳葉27可采用20～40°斜葉提升式攪拌槳，并且槳葉27直徑與反應(yīng)器2直徑比為3～4∶5。
由圖2可見，所說的控制裝置18包括pH控制儀表19和溶氧濃度控制儀表20；pH控制儀表19與pH電極16相連接，pH控制儀表19由SIEMENS公司S7系列S7-226型的可編程序控制器構(gòu)成；pH控制儀表19的輸出端與堿液泵22、CO2氣源23上的控制閥相連接；溶氧濃度控制儀表20與溶氧濃度電極17相連接，溶氧濃度控制儀表20的輸出端分別與N2氣、O2氣和空氣氣源上的控制閥相連接，溶氧濃度控制儀表20由SIEMENS公司S7系列的S7-226型可編程序控制器構(gòu)成。
權(quán)利要求
1.一種用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，包括一個(gè)圓柱狀上端具有封蓋(1)的圓柱狀反應(yīng)器(2)；一個(gè)設(shè)置在所述反應(yīng)器(2)中的攪拌裝置(3)；一個(gè)設(shè)置在封蓋(1)上的混合氣體和堿液入口(4)；一個(gè)設(shè)置在封蓋(1)上的混合氣體出口(5)；一個(gè)設(shè)置在反應(yīng)器(2)內(nèi)設(shè)有上部出氣口(6)和下部出氣口(7)并與所說的混合氣體出口(5)相連通的通氣管(8)；一個(gè)設(shè)置在封蓋(1)上的培養(yǎng)液入口(9)；一個(gè)設(shè)置在封蓋(1)上的培養(yǎng)液出口(10)；一個(gè)設(shè)置在封蓋(1)上的細(xì)胞回流入口(11)；一個(gè)設(shè)有清液出口(12)且入口(13)與所說的培養(yǎng)液出口(10)相連接的細(xì)胞截留器(14)，截留器(14)的出口(15)與細(xì)胞回流入口(11)相連接；一個(gè)通過封蓋(1)設(shè)置在反應(yīng)器(2)內(nèi)的pH電極(16)；一個(gè)通過封蓋(1)設(shè)置在反應(yīng)器2內(nèi)的溶氧濃度電極(17)；一個(gè)與pH電極(16)和溶氧濃度電極(17)相連接的控制裝置(18)，控制裝置(18)的輸出端分別與堿液泵(22)、CO2氣源(23)上的CO2流量控制閥、空氣氣源(24)上的空氣流量控制閥、N2氣氣源(25)上的N2氣流量控制閥和O2氣氣源(26)上的O2氣流量控制閥相連接，堿液泵(22)、CO2氣源(23)、空氣氣源(24)和N2氣氣源(25)與混合氣體和堿液入口(4)相連通。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，反應(yīng)器(2)高徑比為2～4∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，反應(yīng)器(2)高徑比為3∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，所說的攪拌裝置(2)的攪拌槳葉(27)采用20～40°斜葉提升式攪拌槳。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，槳葉(27)直徑與反應(yīng)器(2)直徑比為3～4∶5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，所說的控制裝置(18)包括pH控制儀表(19)和溶氧濃度控制儀表(20)；pH控制儀表(19)與pH電極(16)相連接，pH控制儀表(19)的輸出端分別與堿液泵(22)、CO2氣源(23)上的控制閥相連接；溶氧濃度控制儀表(20)與溶氧濃度電極(17)相連接，溶氧濃度控制儀表(20)的輸出端分別與N2氣、O2氣和空氣氣源上的控制閥相連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，至少包括反應(yīng)器，攪拌裝置，混合氣體和堿液入口，混合氣體出口，設(shè)有上部出氣口和下部出氣口并與所說的混合氣體出口相連通的通氣管，培養(yǎng)液入口，培養(yǎng)液出口，細(xì)胞回流入口，細(xì)胞截留器，pH電極，溶氧濃度電極和控制裝置。本發(fā)明的生物反應(yīng)器在干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，能模擬體內(nèi)環(huán)境，反應(yīng)器操作彈性大，系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)氮?dú)饣蜓鯕鈦砀淖兛傔M(jìn)氣中氧分壓，培養(yǎng)環(huán)境的pH值和DO水平穩(wěn)定。
文檔編號C12N5/08GK1546641SQ200310109169
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者譚文松, 遲占有, 顧小華, 蔡海波 申請人:上海伯瑞生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 華東理工大學(xué)