專利名稱：一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明為生物技術(shù)領域，尤其涉及一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法。
背景技術(shù)：
自20世紀60年代Nass M.等首次用電子顯微鏡直接觀察到線粒體內(nèi)細絲狀的DNA以來(Nass M M K.，et al.1963)，至上世紀80年代末90年代初，人們對線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)結(jié)構(gòu)與遺傳特性的研究更為深入，mtDNA分析方法已滲入傳統(tǒng)的分類、系統(tǒng)進化、群體遺傳、法醫(yī)學及人類學等研究領域，并逐步成為這些領域重要的研究工具。由于技術(shù)條件的限制，早期應用mtDNA的工作主要是對mtDNA進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，自聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)出現(xiàn)以及DNA序列測定技術(shù)推廣以來使得對mtDNA的分析更加簡便，特別是非損傷性DNA分析技術(shù)的建立克服了以往取樣的困難?，F(xiàn)在，可利用毛發(fā)、干皮張標本、液體浸泡標本、石蠟包埋組織、骨骼、木乃伊、化石、甚至動物糞便和尿液等材料提取并擴增出特定的mtDNA片段用于序列分析(Cockbuurn A，et al.1980；方盛國等，1997；Matthias H，et al.1993；PaaboS，et al.1988)。1988年，Pabbo等人首先從7000年前的人腦中擴增出mtDNA片段，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)代的美洲土著人中未曾發(fā)現(xiàn)的線粒體基因型(Paabo S，et al.1988)。此后，有關(guān)mtDNA用作分子標記進行分類學、系統(tǒng)進化、群體遺傳、人類學、法醫(yī)學等方面研究的成果層出不窮(Pavel L I.et al，1996；于寧等，1998；Yun N.et al.2000；Vigilant L，et al.1991)。
同動物mtDNA相比較，高等植物的線粒體基因組(mitochondrial DNA，mtDNA)主要具有以下特點1)大小差異很大，介于208×103bp(油菜)與2500×103bp(西瓜)之間。不僅科間差異大，即使同是葫蘆科的植物間也可相差7～8倍(Levings III C S，et al.1989)；2)基因組的存在形式很不相同。一般認為呈環(huán)狀(Levings III C S，et al.1989)，但也有人報道玉米S型CMS材料的mtDNA呈線型(Schardl C L，et al.1984)，更有人根據(jù)分離的mtDNA分子主要是線型的結(jié)果認為植物mtDNA以線型為主，環(huán)狀僅是復制的一種暫時狀態(tài)(Bendich A T.et al.1993)；3)存在大量的非編碼序列(Gray M W，et al.1992)；4)發(fā)現(xiàn)有其它細胞器漂流而來的DNA成分，即漫游DNA(Ellis J.1982)；5)線粒體基因存在嵌合現(xiàn)象，并能編碼出新的閱讀框架(Bonen L，et al.1993)；6)線粒體中還存在大量的類質(zhì)粒DNA或RNA質(zhì)粒，且類質(zhì)粒DNA在不育系和保持系間表現(xiàn)特異分布(Levings III C S，et al.1989；Newton K J，et al.1988)。
運用線粒體基因組序列進行法醫(yī)學鑒定的報道已屢見不鮮，這些報道主要有三個特點1)所研究的多以動物的線粒體基因組為主。2)所采用的證據(jù)標本多以犯罪嫌疑人或受害者或其家屬身上攜帶的遺傳信息為主，如毛發(fā)、血跡等。3)所用的檢測試劑盒都是從國外進口，價格非常昂貴。這樣，不僅大大限制了能夠提供證據(jù)的范圍和數(shù)量，也使受害家庭不堪負重。若能從案發(fā)現(xiàn)場及犯罪嫌疑人身上找到除了人和動物標本作為證據(jù)外的其它遺傳信息，并對此進行基因組DNA和RFLP分析，根據(jù)植物線粒體的特點，將犯罪嫌疑人攜帶的標本與作案現(xiàn)場獲得的標本進行同一性鑒定，不僅能夠提供更充分的證據(jù)，同時也能擴大所得證據(jù)的范圍和數(shù)量，使犯罪分子早日伏法。但以植物線粒體基因組序列為手段設計引物，并進行法醫(yī)學鑒定至今尚未見報道。
由于植物線粒體基因組序列具有變化相差巨大、結(jié)構(gòu)復雜多樣(基因組呈現(xiàn)環(huán)狀、線狀；點突變、缺失、置換、倒位等)、DNA漂移、以及質(zhì)粒和類質(zhì)粒等的存在，這對線粒體基因組的測序帶來了很大的不便，致使到目前為止，在互聯(lián)網(wǎng)上公開的植物線粒體基因組屈指可數(shù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。本文正是根據(jù)這個特點，按照擬南芥為依據(jù)設計了一系列的引物，PCR擴增并用2％的瓊脂糖凝膠分離，無論是不同引物對同一物種或同一引物對不同物種，都在一定程度上對不同植物加以區(qū)分。
引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。引物設計需遵循一定的規(guī)則，否則達不到預期的目的。因此在設計引物時，我們的原則是1)根據(jù)國外的相關(guān)的文獻報道和引物設計軟件的原理，所設計的引物必須是保守序列，且每一對引物之間所要擴增的序列在不同物種當中存在差異(包括點突變、缺失、置換、倒位等)，這種差異至少存在于兩個以上的物種之間；包含的物種越多，引物的質(zhì)量就越高。2)要設計的每一對引物必須以一種已知線粒體基因組序列的物種為基礎進行設計。3)要確證已知的線粒體基因組序列存在序列多態(tài)性。4)設計的所有引物進行PCR擴增時，必須在相同的條件下進行，這樣，才能進行高通量的PCR，減少不必要的工作量。5)所設計的引物長度要適合以增加引物的特異性。6)堿基隨機分布引物中4種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚膘吟或聚嘧啶的存在。7)引物自身引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)形成引物本身復性。8)引物之間兩引物之間不應有互補性，尤應避免3’端的互補重疊以防引物二聚體的形成。
由于法醫(yī)學所提供證據(jù)的多樣化以及不可預測性，以及線粒體基因組的相對穩(wěn)定性，針對植物線粒體基因組的特點，若按照一定的引物設計原則，建立一個以覆蓋整個線粒體基因組PCR引物為基礎用以區(qū)分任何不同物種的線粒體基因組PCR引物數(shù)據(jù)庫，顯得尤為突出和重要。同時應用該數(shù)據(jù)庫對研究與線粒體基因控制的生物學特性的相關(guān)基因克隆、生物學功能及其作用機理、法醫(yī)學鑒定將具有非常重要的理論意義和應用價值。
從國際互聯(lián)網(wǎng)站http//www.ncbi.nih.hlm.gov中查找擬南芥(ababidopsisthaliana)、水稻(oryza sativa)、高粱(grain sorghum)、小麥(wheat)和煙草(tobacco)等幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運用DNAtools和ClusterW等相關(guān)軟件進行序列比較，挖掘其相對保守的序列(長度為20～25bp)，對這些保守序列進行網(wǎng)上查詢，觀察其所在物種的數(shù)量并遵循上述引物設計原則，運用引物設計軟件Primer Premier5.0軟件設計了一系列的引物。然后從各種不同的植物當中抽提基因組DNA和線粒體DNA，以此為模板進行PCR反應，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對所合成的引物進行篩選。
綜上所述，運用線粒體基因組自身的特點，按照上述引物設計原則，以其保守序列進行一系列的引物設計，并進行PCR反應，可以對不同的植物加以區(qū)分，對研究與線粒體基因控制的生物學特性的相關(guān)基因克隆、生物學功能及其作用機理、法醫(yī)學鑒定將具有非常重要的理論意義和應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法。
方法的步驟為1)從新鮮的或干枯的植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體基因組DNA；2)從國際互聯(lián)網(wǎng)站中查找擬南芥、水稻、高粱、小麥和煙草幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運用DNAtools和ClusterW相關(guān)軟件進行序列比較，挖掘其相對保守的序列，運用引物設計軟件DNAUser軟件設計引物；3)以提取的基因組DNA和線粒體DNA為模板，對2)當中的引物進行聚合酶鏈式反應；4)對聚合酶鏈式反應的結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并分析。
本發(fā)明的優(yōu)點是1)以植物線粒體基因組序列為手段設計引物，并用于法醫(yī)學鑒定；2)可以以此為思路，按照一定的引物設計原則，擴大到整個線粒體而進行引物設計，建立一個以覆蓋整個線粒體基因組PCR引物為基礎用以區(qū)分任何不同物種的線粒體基因組PCR引物數(shù)據(jù)庫。應用該數(shù)據(jù)庫對研究與線粒體基因控制的生物學特性的相關(guān)基因克隆、生物學功能及其作用機理、法醫(yī)學鑒定將具有非常重要的理論意義和應用價值。3)應用該方法設計的引物應用于法醫(yī)學進行同一性鑒定，可以大大降低費用。目前應用于法醫(yī)學所用的檢測試劑盒都是從國外進口，價格非常昂貴。這樣，不僅大大限制了能夠提供證據(jù)的范圍和數(shù)量，也使受害家庭不堪負重。若能從案發(fā)現(xiàn)場及犯罪嫌疑人身上找到除了人和動物標本作為證據(jù)外的其它遺傳信息，并對此進行基因組DNA和RFLP分析，根據(jù)植物線粒體的特點，將犯罪嫌疑人攜帶的標本與作案現(xiàn)場獲得的標本進行同一性鑒定，不僅能夠提供更充分的證據(jù)，同時也能擴大所得證據(jù)的范圍和數(shù)量，使犯罪分子早日伏法。另外，該方法具有高敏感性和特異性、穩(wěn)定性好以及不需要特殊儀器設備、易于推廣應用的優(yōu)點。


圖1.引物1-12對薺菜染色體基因組DNA進行PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖2.引物1-12對玫瑰染色體基因組DNA進行PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖3.引物1-12對醡漿草染色體基因組DNA進行PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖4.引物1-12對茶樹染色體基因組DNA進行PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖5.引物10、13對芹菜、大白菜、甘藍、菠菜、玫瑰、茶樹和香菜的電泳圖，圖中，左邊一組是引物10，右邊一組為引物13；圖6.引物6、7對芹菜、大白菜、甘藍、菠菜、玫瑰、茶樹和香菜的電泳圖，圖中，左邊一組是引物6，右邊一組為引物7。
具體實施例方式
以下具體實驗步驟有關(guān)的其他未列出的常用試劑及其配制方法請參考文獻DNA PROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實驗手冊書籍如《分子克隆實驗指南》(1989年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學出版社。
實施例1植物基因組DNA的提取
在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I，60℃水浴預熱。水稻幼苗或葉子5～10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30～60min(時間長，DNA產(chǎn)量高)，不時搖動。加20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫靜置5～10min，使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。室溫5000rpm離心5min。仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻棒撈出DNA絮團，干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。若DNA未形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶于TE，可在60℃水浴置15min以上，以助溶。將DNA溶液3000rpm離心5min，將上清倒入干凈的5ml離心管。加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃置20min左右，DNA形成絮狀沉淀。用玻棒撈出DNA沉淀，70％乙醇漂洗，吸水紙吸干。將DNA重溶于1ml TE，-20貯存。取2μl DNA樣品在0.7％Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質(zhì)量。分裝后存放于-20℃。
實施例2植物線粒體基因組的提取所需試劑STE緩沖液400mM蔗糖，50mM Tris(pH7.8)，20mM EDTA，0.2％牛血清白蛋白，0.2％β巰基乙醇。
ST緩沖液400mM蔗糖，50mM Tris(pH7.8)，20mM EDTA，0.1％牛血清白蛋白。
TEN緩沖液100mM Tris(pH7.2)，50mM EDTA，100mM NaCl和0.2％β巰基乙醇。
NETF緩沖液1.25M NaCl，50mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，50mM NaF。
1M醋酸鎂5M醋酸銨5M醋酸鉀20％SDS1M EDTA苯酚(用Tris(pH8.0)飽和)
苯酚∶氯仿＝1∶1氯仿∶異戊醇(24∶1)96％和70％乙醇異丙醇DNA酶(一)線粒體的分離1)準備STE緩沖液。加入BSA和β巰基乙醇。
2)將樣品漂洗(0℃)，隨后的步驟都要求在0℃進行。
3)將樣品用20ml STE緩沖液勻漿。
4)用50μm尼龍膜過濾并用4,000rpm離心20min。
5)丟棄核酸沉淀，12,000rpm離心20min。
6)用毛筆輕輕懸浮沉淀，12,000rpm離心20min。
加入不超過200μl的ST緩沖液，用毛筆輕輕懸浮沉淀。DNA酶用含有0.02M醋酸鎂的新鮮的ST緩沖液溶解，并加入植物材料，使DNA酶的終濃度為25μg/mlDNA酶每克材料。DNA酶和Mg/EDTA的比例對完全去除核DNA是很重要的。醋酸鎂可以用氯化鎂或硫酸鎂代替(Herrmann，1982)。DNA酶處理在37℃進行20分鐘(Crouzillat et al.，1987)。用NETF緩沖液除去DNA酶(Loeb和Chouvean，1969)。
(二)線粒體基因組的提取7)不超過200μl的ST緩沖液重新懸浮細胞器。
8)在加有0.02M醋酸鎂的0.2ml ST緩沖液溶解125μgDNA酶，并加入細胞器懸浮液。調(diào)節(jié)終體積到0.5ml。DNA酶的終濃度為250μg/ml。
9)37溫浴20min，定時混合(Crouzillat et al.，1987)。
10)加入EDTA使終濃度為0.2M，用以終止反應。
11)用NETF緩沖液除去DNA酶(Loeb和Chouvean，1969)。緩沖液越多，效果越好。離心收集線粒體細胞器。
12)-20℃保存，或馬上裂解。
13)用600μl TEN緩沖液重新懸浮細胞器(0℃)，滴加30μl的20％SDS，不斷地振蕩混合液。
14)如果組織聚合在一起，將試管放入60℃水浴，直到組織完全裂解。
15)去除蛋白。加入等體積的平衡酚后劇烈振蕩5min。12,000rpm離心10min。
16)去除上層水相。加入苯酚/氯仿重復上述步驟。加入氯仿/異戊醇重復上述步驟。
17)用1/10體積的5M醋酸銨和等體積的異丙醇，-20℃放置2～3小時或過夜。12,000rpm離心3～5min。用70％的乙醇洗滌DNA，然后，用無水乙醇去除殘留的鹽分。
18)室溫干燥后，加入20μl TE緩沖液溶解。
19)DNA完全溶解后，加入150μl TEN緩沖液。
20)加入10μl 20％的SDS，65℃溫浴15min。加50μl 5M的醋酸鉀，65℃搖動混合物幾分鐘，直到沉淀溶解。
21)-20℃放置30min。12,000rpm離心10min。
22)收集上清液。
23)加入10μl 5M的醋酸鉀和100μl異丙醇，混合后-20□放置30min。
24)12,000rpm離心10min。分別用70％和96％的乙醇洗滌DNA沉淀，室溫干燥后重新溶解于TE緩沖液中。
實施例3運用引物進行PCR擴增所需試劑①10×PCR反應緩沖液500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％Triton X-100。
②MgCl225mmol/L。
③4種dNTP混合物每種2.5mmol/L。其④Taq DNA聚合酶5U/μl。
⑤T4 DNA連接酶及連接緩沖液。
⑥經(jīng)Sma I酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。
⑦其它試劑礦物油(石蠟油)，1％瓊脂糖，5×TBE，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，無水乙醇和70％乙醇。
PCR反應操作步驟①依次混勻下列試劑35μl H2O5μ10×PCR反應緩沖液4μl 25mmol/L MgCl24μl 4種dNTP0.5μl上游引物(表1)0.5μl下游引物(表1)
0.5μl模板DNA(約1ng)混勻后離心5秒。
②將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。
③用94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35輪，進行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應產(chǎn)物擴增充分。
表1.設計的引物名稱和引物序列P1F 5’-ACGGCCTGTATTCGGAGTTT-3’P1R 5’-ATACGGGGATGACTTGTGGC-3’P2F 5’-GCTTCTCGCTGGAGACTCGG-3’P2R 5’-TTAAGCGGAAACCTGATGGC-3’P3F 5’-AAACCCAACTCACGTACCAC-3’P3R 5’-AAGGACCAATCCTGAAAGAC-3’P4F 5’-TTCTCGCTGGAGACTCGGG-3’P4R 5’-CTTTGAGTGAAGGCAGCATA-3’P5F 5’-CCAGCACCGGGCAGGTGTCA-3’P5R 5’-AAGGAACTCGGCAAAATGAC-3’P6F 5’-GCCTGTTATCCCCGGCGTAC-3’P6R 5’-GTCGCATAAGTAGCGACCTG-3’P7F 5’-CCTCGGGTTCGTAGAGTCGG-3’P7R 5’-GTCAGATCGTTCCTGCGTTT-3’P8F 5’-ACTAACTCTGCCTGGGGTGG-3’P8R 5’-CTCCTTCGTATAGGTTCCGT-3’P9F 5’-GTTTCCCGTTTACCCACAAC-3’P9R 5’-GTCAGATCGTTCCTGCGTTT-3’P10F 5’-AATACGAGACGATGGAATGC-3’P10R 5’-CCGTCCACGAGGCTGTAAAA-3’P11F 5’-CCCGCTGATCCGAAGTGATT-3’P11R 5’-GCTTTCGTCTCGGTAGGTGT-3’P12F 5’-CCGGGTGTTTTCCAGTGGTC-3’
P12R 5’-GTAAAGATGCGTAGTAGCGT-3’P13F 5’-CGGACATCTGCAACGTCCTC-3’P13R 5’-GTAAAGATGCGTAGTAGCGT-3’P14F 5’-CGTCGGAACGGTCGGTGGCT-3’P14R 5’-AGGCCTAGTCTGATCTGAGA-3’P15F 5’-CGTCGCCGGTCCGGCTTAAT-3’P15R 5’-CTCCTTCGTATAGGTTCCGT-3’P16F 5’-TATGGTTCTTTGTAGGCTCT-3’P16R 5’-TAAGGATACGGTAAAACAGG-3’實施例4瓊脂糖凝膠電泳所需試劑①5×TBE電泳緩沖液稱取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定容至1000ml。
②6×電泳載樣緩沖液0.25％溴粉藍，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。
③溴化乙錠(EB)溶液母液將EB配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。
瓊脂糖凝膠電泳①取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。
②膠液的制備稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。
③膠板的制備將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/ml(也可不把EB加入凝膠中，而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起，阻礙緩沖液進入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。
④加樣取10μlPCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
⑤電泳加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。
⑥染色未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25min。
⑦觀察和拍照在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板，檢查反應產(chǎn)物及長度。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
權(quán)利要求
1.一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，方法的步驟為1)從新鮮的或干枯的植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體基因組DNA；2)從國際互聯(lián)網(wǎng)站中查找擬南芥、水稻、高粱、小麥和煙草幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運用DNAtools和ClusterW相關(guān)軟件進行序列比較，挖掘其相對保守的序列，運用引物設計軟件DNAUser軟件設計引物；3)以提取的基因組DNA和線粒體DNA為模板，對2)當中的引物進行聚合酶鏈式反應；4)對聚合酶鏈式反應的結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說的提取植物基因組DNA在50ml離心管中加入20ml DNA提取緩沖液，60℃水浴預熱；植物葉片5～10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30～60min，不時搖動；加20ml氯仿/異戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻，室溫靜置5～10min，使水相和有機相分層，室溫6000rpm離心5min；仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。用鉤狀玻棒撈出DNA絮團，干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含1ml TE緩沖液的1.5ml離心管中，待DNA溶解后；將DNA溶液3000rpm離心5min，將上清倒入干凈的1.5ml離心管。加5μl RNaseA，37℃10min，除去RNA；加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃置20min左右，DNA形成絮狀沉淀；用玻棒撈出DNA沉淀，70％乙醇漂洗，吸水紙吸干；將DNA重溶于1ml TE，-20貯存；取2μl DNA樣品在0.7％Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小，同時取15μl稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質(zhì)量，分裝后存放于-20℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說的提取植物線粒體基因組，其步驟為1)準備STE緩沖液。加入0.2％BSA和0.2％的β巰基乙醇；2)將樣品在0℃漂洗，隨后的步驟都要求在0℃進行；3)將樣品用20ml STE緩沖液勻漿；4)用50μm尼龍膜過濾并用4,000rpm離心20min；5)丟棄核酸沉淀，12,000rpm離心20min；6)用毛筆輕輕懸浮沉淀，12,000rpm離心20min；7)不超過200μl的ST緩沖液重新懸浮細胞器；8)在加有0.02M醋酸鎂的0.2ml ST緩沖液溶解125μgDNA酶，并加入細胞器懸浮液，調(diào)節(jié)終體積到0.5ml，DNA酶的終濃度為250μg/ml；9)37溫浴20min，定時混合；10)加入EDTA使終濃度為0.2M，用以終止反應；11)用NETF緩沖液除去DNA酶，離心收集線粒體細胞器；12)-20℃保存，或馬上裂解；13)用0℃的600μl TEN緩沖液重新懸浮細胞器，滴加30μl的20％SDS，不斷地振蕩混合液；14)如果組織聚合在一起，將試管放入60℃水浴，直到組織完全裂解；15)加入等體積的平衡酚后劇烈振蕩5min。12,000rpm離心10min，去除蛋白；16)去除上層水相，加入苯酚/氯仿重復上述步驟，加入氯仿/異戊醇重復上述步驟；17)用1/10體積的5M醋酸銨和等體積的異丙醇，-20℃放置2～3小時或過夜，12,000rpm離心3～5min，用70％的乙醇洗滌DNA，然后用無水乙醇去除殘留的鹽分；18)室溫干燥后，加入20μl TE緩沖液溶解；19)DNA完全溶解后，加入150μl TEN緩沖液；20)加入10μl20％的SDS，65℃溫浴15min；加50μl 5M的醋酸鉀，65℃搖動混合物幾分鐘，直到沉淀溶解；21)-20℃放置30min后12,000rpm離心10min；22)收集上清液；23)加入10μl 5M的醋酸鉀和100μl異丙醇，混合后-20□放置30min；24)12,000rpm離心10min，分別用70％和96％的乙醇洗滌DNA沉淀，室溫干燥后重新溶解于TE緩沖液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說的運用引物進行PCR擴增PCR反應操作步驟1)依次混勻下列試劑35μl H2O，5μl 10×PCR反應緩沖液，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl Taq DNA聚合酶，0.5μl模板DNA，混勻后離心5秒；3)用94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35輪，進行PCR；最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應產(chǎn)物擴增充分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說的瓊脂糖凝膠電泳1)配制0.5×TBE稀釋緩沖液；2)膠液的制備稱取0.4g瓊脂糖，用0.5×TBE稀釋緩沖液，配制濃度為0.8％瓊脂糖凝膠液；3)膠板的制備向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠溶液使其終濃度為0.5μg/ml，將瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層；4)加樣取10μl PCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣液混勻，加入樣品槽中；5)電泳加完樣后，合上電泳槽蓋，接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上，當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿2cm時，停止電泳；6)染色未加溴化乙錠的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的溴化乙錠溶液中，室溫下染色20-25min；7)觀察和拍照在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有溴化乙錠的電泳膠板，檢查反應產(chǎn)物及長度并拍照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，方法的步驟為從新鮮的或干枯的植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體基因組DNA的提取；從國際互聯(lián)網(wǎng)站中查找擬南芥、水稻、高粱、小麥和煙草等幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運用序列分析軟件進行序列比較，挖掘其相對保守的序列，對這些保守序列進行網(wǎng)上查詢，遵循引物設計原則，運用引物設計軟件設計一系列的引物；以提取的基因組DNA和線粒體DNA為模板，對所設計的引物進行聚合酶鏈式反應；運用瓊脂糖凝膠電泳對聚合酶鏈式反應的結(jié)果檢測并分析。該方法是應用于法醫(yī)學進行同一性鑒定，具有高敏感性和特異性、穩(wěn)定性好、成本低廉，以及不需要特殊儀器設備、易于推廣應用的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK1546685SQ200310109140
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者徐林苗, 丁宏, 徐春法, 應宗敏, 朱虹輝, 吳微微, 張幼芳, 姜玉新, 董海濤 申請人:浙江省警察學會