專利名稱：熱穩(wěn)定的Taq聚合酶片斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種具有DNA聚合酶活性的多肽。本發(fā)明提供了一種具有熱穩(wěn)定的DNA聚合酶活性，從而熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的多肽。本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
源自嗜溫性微生物如大腸桿菌的DNA聚合酶是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Bessman et al.，J.Biol.Chem.223(1957)171-177和Buttin，G.，andKornberg，A.，J.Biol.Chem.241(1966)5419-5427。源自嗜熱細(xì)菌如棲熱水生菌種的DNA聚合酶也是本領(lǐng)域已知的。在US 4,683,195、US 4,683,202和US 4,965,188中描述了熱穩(wěn)定酶在與起始存在數(shù)量比較以巨大數(shù)量擴(kuò)增現(xiàn)有的核酸序列的用途，其中描述了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的過程。商業(yè)銷售商如Roche DiagnosticsGmbH(曼海姆，德國(guó))銷售PCR試劑并公布了PCR方案。引物、模板、核苷三磷酸、適當(dāng)?shù)木彌_液及反應(yīng)條件和聚合酶用于PCR過程中，其中包括目標(biāo)DNA的變性、引物的雜交和由聚合酶合成互補(bǔ)鏈。每一引物的延伸產(chǎn)物成為生產(chǎn)所需核酸序列的模板。這些專利公開了，如果使用的聚合酶是一種熱穩(wěn)定酶，則不需要在每個(gè)變性步驟之后加入聚合酶，因?yàn)闊崃坎粫?huì)破壞該聚合酶的活性。然而，在循環(huán)PCR過程中反復(fù)的加熱會(huì)影響聚合酶的酶活性，這依賴于其熱穩(wěn)定性。特定的PCR循環(huán)次數(shù)后，具有較高熱穩(wěn)定性的聚合酶會(huì)比具有較低熱穩(wěn)定性的聚合酶保留更多的酶活性。因此，熱穩(wěn)定性對(duì)于聚合酶而言是一種期望得到的特征。
US 4,889,818和US 5,079,352描述了，從棲熱水生菌中分離和重組表達(dá)一種分子量約為94kDa的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶，也稱為TaqWT)和該聚合酶在PCR中的應(yīng)用。
例如由于其高合成速率(每秒能聚合大約75個(gè)核苷酸)，棲熱水生菌DNA聚合酶特別優(yōu)選用于PCR和其它重組DNA技術(shù)中。不過，仍然需要可供選擇的熱穩(wěn)定聚合酶。特別地，在PCR之前延長(zhǎng)起始熱孵的情況中，DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)是有利的。像這種情況的例子是DNA聚合酶的DNA聚合酶活性的激活，為了可逆性地阻斷其酶促活性該DNA聚合酶已被化學(xué)修飾。
特別地，Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性勝過其它聚合酶。雖然95℃時(shí)純化的TaqWT的半衰期在穩(wěn)定的制劑中約為40分鐘，然而在用于LightCycler PCR中的典型反應(yīng)混合物中約為20分鐘，增加了其它DNA聚合酶如Pwo DNA聚合酶(源自沃氏熱球菌；Roche目錄號(hào)1664947)。Pwo DNA聚合酶顯示了增加的熱穩(wěn)定性，在100℃時(shí)半衰期大于2h，相對(duì)而言該溫度時(shí)Taq DNA聚合酶的半衰期少于5min。
WO 91/02090描述了一種從棲熱水生菌中純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。該聚合酶是完整的聚合酶(分子量為94kDa)的80或85kDa的降解產(chǎn)物，據(jù)說基本上沒有5’-3’核酸外切酶活性。沒有提供有關(guān)該聚合酶的序列數(shù)據(jù)。
Lawyer，F(xiàn).C.等人已在J.Biol.Chem.264(1989)6427-6437中描述了在大腸桿菌中分離、定性和表達(dá)源自棲熱水生菌的DNA聚合酶基因。也公開了包含編碼缺失了天然酶的N-末端的Taq DNA聚合酶片斷的DNA序列的表達(dá)載體的克隆。
Kaledin等人已在Chemical Abstract 93，No.40169p(1989)中報(bào)道了一種分子量約為60-62kDa的源自棲熱水生菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的純化。該聚合酶的序列數(shù)據(jù)沒有提供。
Chien等人已在Chemical Abstract 85，No.155559t(1976)中報(bào)道了一種源自棲熱水生菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的純化。據(jù)報(bào)道該酶的分子量，由蔗糖梯度離心測(cè)得為68kDa，而由凝膠過濾測(cè)得為63kDa。該聚合酶的序列數(shù)據(jù)沒有提供。
US 5,616,494教導(dǎo)了一種有酶活性的截短的Taq DNA聚合酶的片斷，其缺失了N-末端的235個(gè)氨基酸殘基。該純化的酶描述為具有完全的活性，然而持續(xù)合成能力降低并缺乏了5’-核酸外切酶活性。與天然Taq DNA聚合酶相比，由于缺失完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)的片斷，因此必需更多的DNA聚合酶單位。在大腸桿菌中表達(dá)了N-末端添加了甲硫氨酸的截短形態(tài)。
US 5,885,813公開了缺失N-末端271和272個(gè)氨基酸的Taq DNA聚合酶的具有酶活性的截短形態(tài)，在其dNMP結(jié)合位點(diǎn)中，在相應(yīng)于天然Taq DNA聚合酶的667位殘基處都有一個(gè)酪氨酸。這兩種截短形態(tài)都在大腸桿菌中表達(dá)，其每個(gè)閱讀框中都融合了一個(gè)附加的編碼甲硫氨酸的起始密碼子。
US 5,079,352教導(dǎo)了一種分子量約為61kDa的Taq DNA聚合酶的截短形態(tài)(實(shí)施例IX)。在純化過程中，該形態(tài)(也被稱為是Stoffel片斷)原先被認(rèn)為是蛋白水解的人為產(chǎn)物。N-末端測(cè)序顯示該截短形態(tài)是由于在Glu289和Ser290之間發(fā)生了蛋白水解剪切的結(jié)果。從天然Taq DNA聚合酶的N-末端刪除289個(gè)氨基酸產(chǎn)生了一個(gè)有完全活性的DNA聚合酶。該文獻(xiàn)進(jìn)一步描述了包含編碼該截短形態(tài)即Stoffel片斷的DNA和一個(gè)附加的編碼甲硫氨酸的起始密碼子的載體的構(gòu)建。運(yùn)用該載體，使分子量約為61kDa的天然Taq DNA聚合酶的該截短形態(tài)在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。在本文中，如US 5,079,352記載的天然Taq DNA聚合酶的Stoffel片斷(可從Applied Biosystem通過商業(yè)性渠道獲得，其名稱為AmpliTaq DNA聚合酶)還被稱為TaqΔ289。
US 5,436,149教導(dǎo)了一種具有酶活性的截短的棲熱水生菌DNA聚合酶，然而其缺失了N-末端的279個(gè)氨基酸殘基。該片斷被在大腸桿菌中表達(dá)，其具有融合到編碼相應(yīng)于天然Taq DNA聚合酶280位殘基的氨基酸的閱讀框中的兩個(gè)附加的編碼甲硫氨酸(起始密碼子)和甘氨酸殘基的密碼子。在本文中，如US5,436,149記載的天然Taq DNA聚合酶的片斷(也稱為Klentaql，可從AB Peptides，Inc以商業(yè)方式獲得，而也稱為AdvanTaq DNA聚合酶，可從Clontech，Inc以商業(yè)方式獲得)進(jìn)而被稱為TaqΔ279。該截短形態(tài)顯示出在反復(fù)暴露于99℃的溫度下仍具有酶活性。
就現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)而言，期望得到一種純化的、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，當(dāng)在其它重組技術(shù)如DNA測(cè)序，和其它利用DNA聚合酶活性、依賴于模板的延伸DNA引物的方法中，可以使用一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶來改善上述的PCR方法和改善獲得的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，天然棲熱水生菌DNA聚合酶(TaqWT)的一個(gè)缺失了N-末端的288個(gè)氨基酸的片斷(TaqΔ288)具有比TaqWT、TaqΔ279和TaqΔ289增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。因此本發(fā)明通過提供TaqΔ288、編碼它或其衍生物的重組表達(dá)載體以及純化TaqΔ288的方法，有助于滿足上述需求。本發(fā)明也包括含有TaqΔ288的試劑盒以及TaqΔ288和含有TaqΔ288的試劑盒的用途。此外，本發(fā)明包含核酸模板的測(cè)序方法和擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法。
為了方便理解本發(fā)明，將一些術(shù)語定義如下。
氨基酸的識(shí)別使用三字母縮寫，也可以是單字母的氨基酸字母表，例如AspD天冬氨酸，IleI異亮氨酸，ThrT蘇氨酸，LeuL亮氨酸，SerS絲氨酸，TyrY酪氨酸，GluE谷氨酸，PheF苯丙氨酸，ProP脯氨酸，HisH組氨酸，GlyG甘氨酸，LysK賴氨酸，AlaA丙氨酸，ArgR精氨酸，CysC半胱氨酸，TrpW色氨酸，ValV纈氨酸，GlnQ谷氨酰胺，MetM甲硫氨酸，AshN天冬酰胺。一個(gè)氨基酸在氨基酸序列中的特定位置由它的三字母縮寫和一個(gè)數(shù)字給出。例如，參考SEQ ID NO2所示的天然Taq DNA聚合酶的氨基酸序列，“Glu7”表示氨基酸位置7上的谷氨酸。
術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以互換使用，所有這類定義包括子代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”或者“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括初級(jí)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和由該細(xì)胞衍生得到的培養(yǎng)物而不考慮傳代數(shù)。由于有意或無意的突變，所有子代不可能在DNA含量上完全相同。與篩選到的原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有相同功能的突變體子代包括在轉(zhuǎn)化體的定義中。
術(shù)語“調(diào)控序列”是指對(duì)于在特定的宿主細(xì)胞中，可操作地連接的編碼序列的表達(dá)所必需的DNA序列。適合于原核生物的調(diào)控序列例如包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和可能的其它序列。已知真核細(xì)胞可利用啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
術(shù)語“表達(dá)系統(tǒng)”是指包含所需的可操作地連接的編碼序列和調(diào)控序列的DNA序列，致使用這些序列轉(zhuǎn)化的宿主能生產(chǎn)編碼蛋白。為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，該表達(dá)系統(tǒng)可以被包含在載體上；然而，相關(guān)的DNA也可能被整合到宿主的染色體中。
術(shù)語“基因”是指包含對(duì)于生產(chǎn)可復(fù)原的具生物活性的多肽或者前體所必需的調(diào)控和編碼序列的DNA序列。該多肽可由全長(zhǎng)編碼序列編碼，或者由該編碼序列的任何部分編碼，只要保留其酶活性就行。
術(shù)語“可操作地連接定位”和“可操作地連接的”是指編碼序列的定位使得調(diào)控序列發(fā)揮驅(qū)使由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)的作用。因此，編碼序列“可操作連接”到調(diào)控序列是指一種其中編碼序列能在調(diào)控序列的指導(dǎo)下表達(dá)的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“非離子聚合型去污劑”是指沒有離子性電荷且具有本發(fā)明目的特征的表面活性劑，其在pH從約3.5至約9.5優(yōu)選從4至8.5的范圍內(nèi)具有穩(wěn)定TaqΔ288的能力。
如這里使用的術(shù)語“寡核苷酸”被定義為包含兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，優(yōu)選多于三個(gè)，且通常多于十個(gè)的分子。確切的大小取決于許多因素，這些因素又取決于寡核苷酸的根本功能或用途。寡核苷酸可以通過合成或克隆獲得。
如這里使用的術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，當(dāng)置于引物延伸開始的條件下，其可擔(dān)當(dāng)合成的起始點(diǎn)。寡核苷酸“引物”可自然產(chǎn)生如同在純化的限制性消化那樣或者以合成方式產(chǎn)生。與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成，是在合適的溫度下，在存在四種不同的核苷三磷酸和熱穩(wěn)定聚合酶的情況下在合適的緩沖液中開始的?！熬彌_液”包含輔因子(如二價(jià)金屬離子)和鹽(以提供合適的離子強(qiáng)度)，并且被調(diào)節(jié)至所需的pH。
擴(kuò)增中效率最大的是單鏈引物，但是也可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，則在用于制備延伸產(chǎn)物前，首先要對(duì)該引物進(jìn)行處理以分開它的兩股鏈。引物通常為寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng)以在聚合酶存在下引導(dǎo)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度取決于許多因素，如引物的來源和所需的結(jié)果，且根據(jù)引物長(zhǎng)度和核苷酸序列，必須將反應(yīng)溫度調(diào)整至以確保將引物正確地退火到模板上。根據(jù)目標(biāo)序列的復(fù)雜性，典型的寡核苷酸引物包含15至35個(gè)核苷酸。短的引物分子一般要求較低的溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的復(fù)合物。
選擇與模板的特定序列的鏈“充分”互補(bǔ)的引物。引物必須是充分互補(bǔ)的，是以與模板鏈雜交以發(fā)生引物的延伸。引物序列不一定反映模板的確切序列。例如，一個(gè)非互補(bǔ)的核苷酸片斷可以附著于引物的5’末端，而該引物序列的其余部分充分互補(bǔ)于該鏈。如果引物序列與模板序列充分互補(bǔ)以至于雜交，從而為引物的延伸產(chǎn)物合成形成一個(gè)模板引物復(fù)合物，則非互補(bǔ)性堿基或較長(zhǎng)序列可以分散于引物中。
術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”和“限制性酶”是指在特定或接近特定的核苷酸序列處剪切雙鏈DNA的細(xì)菌酶。
術(shù)語具有DNA聚合酶活性的“熱穩(wěn)定的”多肽是指一種酶，其對(duì)熱穩(wěn)定且具有耐熱性，能催化(促進(jìn))核苷酸以合適的方式結(jié)合，以形成與模板核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。一般而言，引物延伸產(chǎn)物的合成開始于引物的3’末端，并沿著模板鏈向5’方向前進(jìn)，直到合成結(jié)束。一個(gè)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的例子是Taq DNA聚合酶(TaqWT)或者其缺失片斷如TaqΔ279、TaqΔ289和本發(fā)明的酶即TaqΔ288。
DNA聚合酶活性的測(cè)定使用一種DNA寡核苷酸進(jìn)行，其末端序列富含G+C，且能互相雜交。當(dāng)末端序列雜交時(shí)，該寡核苷酸形成一個(gè)環(huán)。雜交導(dǎo)致帶有5’單鏈突出端的雙鏈DNA發(fā)生一個(gè)短的延伸。同時(shí)，在相對(duì)的鏈上，提供了末端3’-OH的功能，從而為DNA聚合酶提供了底物。在dNTPs和二價(jià)離子存在下在反應(yīng)混合物中和在維持DNA聚合酶活性的條件下，DNA聚合酶用與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸，催化具有末端3’-OH功能的鏈即具有5’突起的鏈的延伸。反應(yīng)進(jìn)行到5’突起轉(zhuǎn)變成一個(gè)平末端。
該測(cè)定基于熒光共振能量傳遞(FRET)的原理，由DNA聚合酶活性引發(fā)。一般而言，第一和第二標(biāo)記的熒光基團(tuán)是優(yōu)選的，其能彼此作用以產(chǎn)生FRET。為了進(jìn)行檢測(cè)，使用如上所述的特定寡核苷酸，在雙鏈部分內(nèi)，一個(gè)連接第一熒光基團(tuán)的核苷酸或核苷酸類似物，位于靠近最初提供5’單鏈突起的核苷酸的位置上。優(yōu)選地，第一熒光基團(tuán)是熒光素。在5’單鏈突起內(nèi)和從熒光基團(tuán)標(biāo)記的第一位置起約10個(gè)核苷酸的位置上有一個(gè)腺嘌呤。反應(yīng)混合物含有標(biāo)記的dUTP或者標(biāo)記的和未標(biāo)記的dUTP混合物，以代替dTTP；dUTP能被摻入到相對(duì)鏈中以與所述的腺嘌呤配對(duì)。優(yōu)選地，結(jié)合到dUTP的標(biāo)記是作為第二熒光基團(tuán)的LightCycler-Red 640。一旦標(biāo)記的dUTP通過DNA聚合酶酶活性被摻入，則第一和第二標(biāo)記被帶入一個(gè)支持FRET的鄰近位置。測(cè)量摻入了標(biāo)記的dUTP的寡核苷酸分子可通過定量FRET，使用特異于熒光素而非LightCycler-Red 640的確定的激發(fā)波長(zhǎng)的光，用熒光計(jì)測(cè)量在LightCycler-Red 640的發(fā)射波長(zhǎng)處的發(fā)射光。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知該原理、方法和儀器以定量FRET。
使用FRET測(cè)定，本發(fā)明人比較了TaqWT、TaqΔ289、TaqΔ279和TaqΔ288，從而使每一聚合酶在大腸桿菌中重組表達(dá)。在各自表達(dá)培養(yǎng)的溶菌產(chǎn)物中，每一DNA聚合酶被測(cè)試了DNA聚合酶活性的熱穩(wěn)定性。在97℃下熱孵35分鐘之前和之后，測(cè)量溶菌產(chǎn)物樣品中的活性。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由于熱處理，TaqWT、TaqΔ289和TaqΔ279的DNA聚合酶活性減少到小于50％，TaqΔ279的保留活性在約30％和小于約50％之間，TaqΔ289的保留活性在約15％和約30％之間，而TaqWT的保留活性在0％和約5％之間。相反，具有末端甲硫氨酸的表達(dá)的TaqΔ288的保留活性在大于約50％和約80％之間。
使用相同的FRET活性測(cè)定方法，在PCR反應(yīng)混合物中對(duì)作為純化酶的TaqWT和TaqΔ288進(jìn)行了比較。在98℃下熱孵30分鐘后，TaqWT保留的活性在約10％和約15％之間。相反，TaqΔ288保留的活性在約30％和35％之間。
使用相同的FRET活性測(cè)定方法，在穩(wěn)定的制劑即含有50％甘油的貯存緩沖液中對(duì)作為純化酶的TaqWT、TaqΔ279和TaqΔ288進(jìn)行了比較。TaqWT、TaqΔ279和TaqΔ288保存在相同的貯存緩沖液中。在98℃下熱孵30分鐘后，TaqWT保留的活性在約40％和約50％之間。TaqΔ279保留活的性約在80％和約100％之間。TaqΔ288保留的活性在約90％和100％之間。
帶有和不帶N-末端甲硫氨酸的TaqΔ288的熱穩(wěn)定性是不能區(qū)分的。
本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方式是一種具有DNA聚合酶活性的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列是棲熱水生菌(Taq)DNA聚合酶的氨基酸序列，其缺失Taq DNA聚合酶的N-末端的288個(gè)氨基酸。本文中所述的多肽也被稱為TaqΔ288。優(yōu)選地，該多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的多肽可以用不止一種方法生產(chǎn)。例如，可以從重組表達(dá)該多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中獲得該多肽。然而該多肽的氨基酸序列是由編碼該多肽的開放閱讀框的密碼子決定的。功能性開放閱讀框要求一個(gè)編碼N-末端甲硫氨酸殘基的起始密碼子。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該多肽的氨基酸序列另外含有一個(gè)N-末端甲硫氨酸殘基。優(yōu)選地，該多肽的氨基酸序列是SEQ IDNO4所示的氨基酸序列。在本文中，SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示的多肽都被稱為TaqΔ288。
優(yōu)選地，相對(duì)于天然酶即具有SEQ ID NO7所示的原始氨基酸序列的TaqDNA聚合酶(TaqWT)，該多肽的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)了。也優(yōu)選地，相對(duì)于缺失片斷TaqΔ289和TaqΔ279，其熱穩(wěn)定性增強(qiáng)了。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在大腸桿菌中在相同的條件下重組表達(dá)TaqΔ288(帶有N-末端甲硫氨酸)、TaqΔ289、TaqΔ279和TaqWT時(shí)，與其它的相比較，TaqΔ288具有最高的熱穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，根據(jù)本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性且熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的多肽是最容易通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該核苷酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也知道沉默的密碼子改變(即編碼的氨基酸沒有改變)，它能被導(dǎo)入編碼該多肽的最先10到20個(gè)氨基末端的氨基酸殘基的核苷酸序列中，而不影響該多肽的序列。該變化可能導(dǎo)致一種最優(yōu)化的核苷酸序列，可以存在于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞中，或者存在于無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中例如成為根據(jù)引起本發(fā)明的多肽產(chǎn)量增加的原因。其它優(yōu)化的編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，可以通過在整個(gè)編碼序列中導(dǎo)入沉默密碼子改變來獲得。如果該多肽在原核宿主細(xì)胞如桿菌菌種或者在真核宿主細(xì)胞如酵母細(xì)胞優(yōu)選甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母細(xì)胞中表達(dá)，則這是特別有用的。
為了構(gòu)建表達(dá)載體，獲得了一種DNA，它能編碼具有本發(fā)明DNA聚合酶活性的多肽，或者是該多肽與不破壞活性的附加序列或在調(diào)控條件下(如用肽酶處理)可剪切的以產(chǎn)生一種活性蛋白的附加序列的一種融合體。然后在表達(dá)載體中該編碼序列與合適的調(diào)控序列可操作地連接。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是包含本發(fā)明DNA序列的重組DNA載體。
將載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，并在適合表達(dá)具有DNA聚合酶活性的重組多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該載體可設(shè)計(jì)成在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或者能整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。
前述的每一步驟可以用多種方法進(jìn)行。例如，所需的編碼序列可從基因組片斷中獲得，并且直接用于合適的宿主中。在各種宿主中可操作的表達(dá)載體的構(gòu)建可使用合適的復(fù)制子和調(diào)控序列進(jìn)行，正如下面一般所提到的。含有所需的編碼和調(diào)控序列的合適載體的構(gòu)建，使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)的連接和限制性酶切技術(shù)。將分離的質(zhì)粒、DNA序列或合成的寡核苷酸剪切、修飾和重新連接成所需的形式。如果不是正?？捎玫脑?，合適的限制性酶切位點(diǎn)可以被加在編碼序列的末端，以便有助于表達(dá)載體的構(gòu)建，如下面舉例說明。
對(duì)于要求序列修飾的載體或編碼序列部分，可使用各種位點(diǎn)特異性的引物指導(dǎo)的突變方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于進(jìn)行位點(diǎn)特異性的突變。現(xiàn)在在本領(lǐng)域的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中，編碼所需突變的合成的寡核苷酸用作引物指導(dǎo)單鏈載體的互補(bǔ)核酸序列的合成，如pBS13+，其在突變引物的延伸產(chǎn)物的構(gòu)建中用作模板。將突變的DNA轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌中，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行鋪板和鑒別。鑒別修飾的載體可能包括將篩選的轉(zhuǎn)化體的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其它膜上，使“電梯”與激酶化的合成引物在某一溫度下雜交，該溫度允許與修飾序列進(jìn)行準(zhǔn)確配對(duì)的雜交，但阻止與原始鏈進(jìn)行雜交。然后培養(yǎng)含有與探針雜交的DNA的轉(zhuǎn)化體，并用作修飾DNA的儲(chǔ)存庫。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也知道允許通過含有所謂的“組氨酸標(biāo)記”的融合多肽的重組方法來構(gòu)建表達(dá)載體。(聚)組氨酸標(biāo)記是優(yōu)選含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸的氨基酸序列。該組氨酸標(biāo)記通常融合到所需多肽的N-末端或C-末端。該融合多肽很容易通過固定化金屬親和層析而便于純化，其中用聚組氨酸標(biāo)記的融合多肽被固定在金屬螯合樹脂上的金屬離子吸附。因此一個(gè)例子是來自Qiagen的QIA表達(dá)純化系統(tǒng)。該公司提供了一種能用于生產(chǎn)聚組氨酸標(biāo)記的融合多肽的表達(dá)載體(pQE)。
然而，不必要求該組氨酸標(biāo)記作為具有DNA活性的純化的多肽的部分。這了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以將能提供蛋白酶剪切位點(diǎn)的附加序列插入到組氨酸標(biāo)記和所需多肽之間。一個(gè)熟知的例子是為因子X蛋白酶提供剪切位點(diǎn)的序列。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是包含本發(fā)明的DNA序列的重組DNA載體。優(yōu)選地，該DNA序列編碼由(i)末端組氨酸標(biāo)記、(ii)與組氨酸標(biāo)記相鄰的能提供因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)的氨基酸序列和(iii)本發(fā)明的多肽組成的融合多肽。應(yīng)當(dāng)理解融合多肽中的因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)能被具有因子X蛋白酶活性的蛋白質(zhì)識(shí)別和剪切。更優(yōu)選地，該DNA序列編碼具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的融合多肽。
當(dāng)想要生產(chǎn)本發(fā)明具有DNA聚合酶活性的多肽或者其衍生物如融合多肽時(shí)，該多肽重組形式的生產(chǎn)典型地包括表達(dá)載體即重組DNA載體的構(gòu)建，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以及在發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是用本發(fā)明的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。
調(diào)控序列、重組DNA載體和轉(zhuǎn)化方法取決于用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型。一般而言，原核生物、酵母、昆蟲或者哺乳動(dòng)物的細(xì)胞用作宿主。原核生物宿主對(duì)于生產(chǎn)重組蛋白一般是最有效的和最方便的，因此優(yōu)選被用于本發(fā)明多肽或融合多肽的表達(dá)。
最常用于表達(dá)重組蛋白的原核生物是大腸桿菌。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道許多能用于實(shí)施本發(fā)明的大腸桿菌菌株和表達(dá)系統(tǒng)。然而，除了大腸桿菌外的微生物菌株，像桿菌例如枯草芽孢桿菌、各種假單胞菌和其它細(xì)菌菌株，也可用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的重組表達(dá)。在這樣的原核生物系統(tǒng)中，典型地使用含有衍生自宿主或者與宿主相容的種類的復(fù)制位點(diǎn)和調(diào)控序列的質(zhì)粒載體。
除了細(xì)菌外，真核微生物如酵母也能用作重組宿主細(xì)胞。因此優(yōu)選使用甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母作為真核微生物宿主體也能生產(chǎn)本發(fā)明的多肽或融合多肽。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母具有利用甲醇所必需的生物化學(xué)途徑，基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)特征它被分為四個(gè)屬Hansenula、Pichia、Candida和Torulopsis。發(fā)育程度最高的甲基營(yíng)養(yǎng)型宿主系統(tǒng)利用Pichia pastoris(Komagataella pastoris)和Hansenulapolymorpha(Pichia angusta)。在US 5,618,676、US 5,854,018、US 5,856,123和US5,919,651中描述了異源蛋白在酵母中的表達(dá)。
當(dāng)終止子序列置于編碼序列的3’末端時(shí)，也可以用于增強(qiáng)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)這樣的終止子在3’非翻譯區(qū)，緊跟在源于酵母的基因中的編碼序列之后。任何包含與酵母相容的啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和其它調(diào)控序列的載體，都適合用于構(gòu)建本發(fā)明的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的酵母表達(dá)載體。
此外，也可在源自多細(xì)胞有機(jī)體的真核宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)編碼具有本發(fā)明DNA聚合酶活性的多肽或融合多肽的核苷酸序列。
根據(jù)使用的宿主細(xì)胞的不同，用適合該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用氯化鈣的鈣處理，如Cohen，S.N.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69(1972)2110-2114所述，用于原核生物或其它含有真實(shí)的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染(Shaw，CH.，et al.，Gene 23(1983)315-330)用于某些植物細(xì)胞。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選Graham和van det Eb，Virology 52(1978)546的磷酸鈣沉淀法。根據(jù)van Solingen，P.，and Plaat，J.B.，J.Bact.130(1977)946-947和Hsiao，C.L.，and Carbon，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)3829-3833的方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種生產(chǎn)具有DNA聚合酶活性的多肽的方法，包括下列步驟(a)用本發(fā)明的重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞并且在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)具有DNA聚合酶活性的多肽；(c)純化在步驟(b)中表達(dá)的具有DNA聚合酶活性的多肽。重組表達(dá)多肽的純化以與重組表達(dá)TaqWT(US 5,079,352)或其缺失片斷(US 5,616,494；US 5,436,149)相似的方式達(dá)到，除了獲得TaqΔ288之外。更優(yōu)選的是一種生產(chǎn)具有DNA聚合酶活性的多肽的方法，包括下列步驟(a)用本發(fā)明的重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞并且在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)一種由(i)末端組氨酸標(biāo)記、(ii)與組氨酸標(biāo)記相鄰的能提供因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)的氨基酸序列和(iii)本發(fā)明的多肽組成的融合多肽；(c)純化在步驟(b)中表達(dá)的融合多肽；(d)在具有因子X蛋白水解酶活性的蛋白酶的存在下，通過培育所述融合多肽的方式剪切該融合多肽，從而將具有DNA聚合酶活性的多肽與因子X的蛋白酶剪切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)記分離；(e)純化步驟(d)中的具有DNA聚合酶活性的多肽。甚至更優(yōu)選地，用可結(jié)合組氨酸標(biāo)記的顆粒狀親和基質(zhì)純化步驟(c)中的融合多肽。甚至更優(yōu)選地，步驟(d)中融合多肽的組氨酸標(biāo)記與顆粒狀親和基質(zhì)結(jié)合。甚至更優(yōu)選地，顆粒狀親和基質(zhì)是一種涂有螯合的金屬樹脂的層析物質(zhì)，且金屬離子被固定在涂有樹脂的層析物質(zhì)上。甚至更優(yōu)選地，層析物質(zhì)涂有鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)。在這點(diǎn)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員已注意到EP1 069131。因此，分離已經(jīng)在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物中重組表達(dá)的本發(fā)明的組氨酸標(biāo)記的融合多肽的優(yōu)選的方法是制備細(xì)胞的溶菌產(chǎn)物。制備溶菌產(chǎn)物的一種方法是通過在溶菌產(chǎn)物緩沖液中懸浮細(xì)胞并且用超聲波處理細(xì)胞。將存在于溶菌產(chǎn)物中的DNA用DNA酶優(yōu)選DNA酶I消化。大腸桿菌蛋白質(zhì)隨后通過熱變性方法(優(yōu)選72℃30分鐘)降解，且能通過離心從溶菌產(chǎn)物中被分離出。在離心后，將澄清的上清液用Ni-NTA超流柱(Qiagen目錄號(hào)30410、30430或30450)層析，借此將組氨酸標(biāo)記的融合多肽與柱的固定化的金屬親和基質(zhì)結(jié)合。用清洗緩沖液清洗兩次后，運(yùn)用清洗緩沖液和洗脫緩沖液的梯度，從而用洗脫緩沖液階梯式地逐漸代替清洗緩沖液。從而組氨酸標(biāo)記的融合多肽可從柱上被洗脫下來。進(jìn)一步，在存在因子X蛋白酶的情況下，于支持因子X蛋白酶的特定蛋白水解活性的條件下，孵育洗脫的融合多肽。在熱變性(優(yōu)選72℃30分鐘)之后，通過使用Ni-NTA超流柱的再次層析，將剪切下來的組氨酸標(biāo)記和未剪切的融合多肽與產(chǎn)物即TaqΔ288中分離開來。收集包括產(chǎn)物的流通物質(zhì)。進(jìn)一步的處理步驟可以包括濃縮和透析，優(yōu)選在一種能穩(wěn)定TaqΔ288的緩沖液中進(jìn)行濃縮和透析，從而得到本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定制劑。
可選擇地，當(dāng)與柱的固定化的金屬親和基質(zhì)結(jié)合時(shí)，可用因子X蛋白酶剪切融合多肽。這樣，在因子X蛋白酶的存在下，于支持因子X蛋白酶的特定蛋白水解活性的條件下，孵育與融合多肽結(jié)合的柱物質(zhì)。隨后用非洗脫緩沖液的緩沖液，即支持組氨酸標(biāo)記與涂有Ni-NTA的層析物質(zhì)結(jié)合的緩沖液清洗，在流體物質(zhì)中獲取TaqΔ288多肽以及因子X蛋白酶。隨后，滅活因子X并純化TaqΔ288多肽。
為了長(zhǎng)期穩(wěn)定，可將本發(fā)明的熱穩(wěn)定DNA聚合酶貯存于含有一種或多種非離子聚合去污劑的緩沖液中。該去污劑的分子量一般約在100至250,000道爾頓的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約4,000至200,000道爾頓，將酶穩(wěn)定在pH約為3.5至9.5，優(yōu)選約4至8.5。該去污劑的例子包括由McCutcheon Division of MC Publishing Co.，175Rock Road，Glen Rock，NJ(USA)公布的McCutcheon’s Emulsifiers & Detergents，North American edition(1983)的第295-298頁上列出的那些。
優(yōu)選地，去污劑選自包含乙氧基化的脂肪醇醚和十二烷基醚、乙氧基化的烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、經(jīng)修飾的氧基乙基化的和/或氧基丙基化的直鏈醇、聚乙二醇單油酸酯化合物、聚山梨醇酯化合物和酚脂肪醇醚的組。更特別優(yōu)選的是吐溫20，一種源自ICI Americas Inc.，Wilmington，DE的聚氧基乙基化的(20)聚山梨糖醇單月桂酸酯，和Iconol NP-40，一種源自BASFWyandotte Corp.，Parsippany，NJ的乙氧基烷基酚(壬基)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是在含有一種或多種非離子型聚合物去污劑的緩沖液中的包含本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定制劑。優(yōu)選地，穩(wěn)定制劑的緩沖液含有選自由甘油、KCl、Tris/HCl(Tris(羥甲基)-氨基甲烷鹽酸鹽)、EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)、吐溫20和二硫蘇糖醇(DTT)組成的組的成分。更優(yōu)選的是一種由63％(重量/體積)甘油、100mM KCl、20mM Tris/HCl pH8.5、0.1mM EDTA、0.5％(體積/體積)吐溫20、1mM DTT組成的穩(wěn)定制劑。
在PCR擴(kuò)增的每一循環(huán)中，將雙鏈目標(biāo)序列變性，將引物退火到每一變性目標(biāo)鏈上，通過DNA聚合酶的作用將引物延伸。擴(kuò)增的特異性取決于引物雜交的特異性。選擇與目標(biāo)核酸序列的每一條鏈的3’末端的序列互補(bǔ)或者充分互補(bǔ)的引物。在典型的PCR中使用的提高的溫度下，引物只與想要的目標(biāo)序列雜交。然而，擴(kuò)增反應(yīng)混合物典型地在低于確保引物的雜交特異性所需的溫度許多的室溫下裝配。在這樣的較不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，引物可能非特異性地與其它僅部分互補(bǔ)的核酸序列結(jié)合(或甚至與其它引物結(jié)合)，并且開始合成非所需的延伸產(chǎn)物，其可以沿著目標(biāo)序列擴(kuò)增。非特異性的引物延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增可與所需的目標(biāo)序列的擴(kuò)增相競(jìng)爭(zhēng)，并可顯著地降低所需序列擴(kuò)增的效率。在Chou，Q.，et al.，Nucleic Acids Res.20(1992)1717-1723中進(jìn)一步討論了非特異性擴(kuò)增所引起的問題。
在反應(yīng)開始之前，通過減少由與非目標(biāo)序列結(jié)合的引物形成延伸產(chǎn)物，可以減少非特異性擴(kuò)增。在一種被稱為“熱啟動(dòng)”方案的方法，一種或多種關(guān)鍵試劑在反應(yīng)混合物中被抑制，直到提高溫度到足夠提供必要的雜交特異性。如此，在反應(yīng)條件不確保特異性的引物雜交期間，反應(yīng)混合物不能支持引物延伸。
作為“熱啟動(dòng)”方案中一個(gè)常見的特征，通過可逆地滅活DNA聚合酶的方式，也就是說，可逆地阻斷DNA聚合酶抑制PCR反應(yīng)混合物中的DNA聚合酶活性。一種方法使用一種化學(xué)修飾的DNA聚合酶，其只在提高的溫度下孵育DNA聚合酶一段時(shí)間之后才變得有活性，因此在構(gòu)成PCR反應(yīng)混合物期間阻止不想要的DNA合成產(chǎn)物的生產(chǎn)。US 6,183,998描述了用醛如甲醛進(jìn)行熱穩(wěn)定DNA的可逆滅活。本質(zhì)上，在高于50℃的溫度下恢復(fù)酶活性，在環(huán)境溫度下可達(dá)到酶的完全失活。專利EP 0 771 870和US 6,479,264描述了用二羧酸酐可逆地滅活熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。US 5,773,258和US 5,677,152描述了一種熱穩(wěn)定酶的酶活性的可逆滅活。優(yōu)選的共價(jià)修飾試劑包括馬來酸酐；取代的馬來酸酐如檸檬酸酐、順式烏頭酸酐和2，3-二甲基馬來酸酐；外-順-3，6-橋氧基-Δ4-四氫鄰苯二甲酸酐；和3，4，5，6-四氫鄰苯二甲酸酐。因此，檸檬酸酐和順-烏頭酸酐被優(yōu)選用于PCR擴(kuò)增中制備可逆阻斷的DNA聚合酶?？赡鏈缁畹拿甘菍?duì)使酶失活的蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾的結(jié)果。在擴(kuò)增反應(yīng)之前或作為其一部分，在提高的溫度下孵育反應(yīng)混合物，可恢復(fù)失活酶的活性。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)共價(jià)地結(jié)合所述多肽時(shí)，本發(fā)明的多肽則共價(jià)地結(jié)合到能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的化合物上。更優(yōu)選地，該化合物選自由(a)檸檬酸酐，(b)順-烏頭酸酐，(c)2，3-二甲基馬來酸酐，(d)外-順-3，6-橋氧基-Δ4-四氫鄰苯二甲酸酐，和(e)3，4，5，6-四氫鄰苯二甲酸酐組成的組。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是包含具有DNA聚合酶活性的多肽的穩(wěn)定制劑，當(dāng)共價(jià)地結(jié)合所述多肽時(shí)，該多肽共價(jià)地結(jié)合到能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的化合物上。更優(yōu)選地，該化合物選自由(a)檸檬酸酐，(b)順-烏頭酸酐，(c)2，3-二甲基馬來酸酐，(d)外-順-3，6-橋氧基-Δ4-四氫鄰苯二甲酸酐，和(e)3，4，5，6-四氫鄰苯二甲酸酐組成的組。
還有，本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是包含具有DNA聚合酶活性的多肽的穩(wěn)定制劑，當(dāng)結(jié)合所述多肽時(shí)，通過能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的抗體結(jié)合該多肽。也可通過DNA聚合酶的非共價(jià)修飾來可逆地阻斷DNA聚合酶的活性。US 5,338,671公開了使用特異于DNA聚合酶的抗體來抑制DNA聚合酶活性。DNA聚合酶和DNA聚合酶的特異性抗體的預(yù)混合導(dǎo)致形成一個(gè)抗體-聚合酶復(fù)合物。在這些條件下，基本上沒有檢測(cè)到寡核苷酸的延伸活性。在提升的溫度下，抗體從復(fù)合物中分離，從而釋放DNA聚合酶，然后其在PCR過程中在DNA合成中發(fā)揮作用。優(yōu)選地，抗體是一種抗Taq DNA聚合酶的單克隆抗體?？筎aq DNA聚合酶的單克隆抗體是本領(lǐng)域所已知的，例如描述于US5,338,671中。優(yōu)選地，抗Taq DNA聚合酶的單克隆抗體是TP4-9.2和TP1-12.2，得自保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，由ATCC指定保藏號(hào)分別為HB11807和HB11127的雜交瘤。優(yōu)選的抗體具有與聚合酶的締合常數(shù)至少約為1×107M-1。根據(jù)本發(fā)明，定義為特異于DNA聚合酶的抗體，是那些在溫度約為20-40℃下能抑制DNA聚合酶酶活性的抗體。在PCR熱循環(huán)過程中使用提升的溫度，或者在熱循環(huán)開始之前在提升的溫度下預(yù)孵PCR反應(yīng)混合物來滅活本發(fā)明的抗體。通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的測(cè)定方法，可檢測(cè)抗體抑制聚合酶酶活性的能力，例如像Sharkey，D.J.，et al.，BioTechnology 12(1994)506-509所描述的。例如，DNA聚合酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定可以基于聚合酶在DNA中形成的單鏈缺口中摻入3H-dNTP的能力。用聚合酶預(yù)孵抗體，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)聚合酶測(cè)定，可檢測(cè)抗體抑制聚合酶活性的能力。在該測(cè)定中能顯著降低聚合酶活性的抗體對(duì)本發(fā)明是有用的。類似的測(cè)定可以用于檢測(cè)所需抗體的熱滅活。簡(jiǎn)言之，通過提高至所需溫度后冷卻并測(cè)定聚合酶活性，可改進(jìn)抗體抑制聚合酶能力的測(cè)定。所需抗體在85-95℃的溫度下失活，從而釋放有活性的聚合酶。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是本發(fā)明多肽的、與一種化合物共價(jià)地偶聯(lián)的本發(fā)明的多肽、與一種抗體結(jié)合的本發(fā)明的多肘或本發(fā)明的一種穩(wěn)定制劑用于生產(chǎn)引物延伸產(chǎn)物用途，其中當(dāng)該化合物共價(jià)偶聯(lián)于所述多肽時(shí)，它能可逆地阻斷該多肽DNA聚合酶的活性，當(dāng)該抗體結(jié)合所述多肽時(shí)，它能可逆地阻斷該多肽DNA聚合酶的活性。例如當(dāng)進(jìn)行PCR或者用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)時(shí)，則生產(chǎn)出引物延伸產(chǎn)物。因此本發(fā)明的用途優(yōu)選用于核酸模板的測(cè)序。本發(fā)明的用途也優(yōu)選用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸。引物延伸的另一個(gè)例子是切口平移。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道許多闡明術(shù)語“生產(chǎn)引物延伸產(chǎn)物”的其它例子。本發(fā)明包括用本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的多肽或者含有該多肽的制劑來生產(chǎn)引物延伸產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種用于生產(chǎn)包含本發(fā)明穩(wěn)定制劑的引物延伸產(chǎn)物的試劑盒。優(yōu)選用于核酸模板測(cè)序的試劑盒。也優(yōu)選用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的試劑盒。非常優(yōu)選使用LightCycler擴(kuò)增目標(biāo)核酸的試劑盒。因此一個(gè)例子是LightCycler DNA Master SYBR Green I試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆；目錄號(hào)2015099)。因此，這樣的試劑盒可包含三個(gè)小瓶，其中一個(gè)小瓶(1)包含濃縮10倍的反應(yīng)混合物，含有TaqΔ288或具有可逆阻斷的DNA聚合酶活性的TaqΔ288的穩(wěn)定制劑，以及附加的dNTP與任選的dUTP而不是dTTP、SYBR綠I染料和10mM MgCl2的混合物。試劑盒的另一個(gè)小瓶(2)包含一定濃度的MgCl2原液，例如濃度為25mM。試劑盒的另一個(gè)小瓶(3)包含用于調(diào)節(jié)最終的反應(yīng)體積的無菌的PCR等級(jí)的純水。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括下列步驟(a)使所述樣品與擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，該混合物含有與所述目標(biāo)核酸互補(bǔ)的引物和多肽，其中多肽選自由下列組成的組(i)本發(fā)明的多肽，(ii)與一種化合物共價(jià)地偶聯(lián)的本發(fā)明的多肽，當(dāng)共價(jià)偶聯(lián)于所述多肽時(shí)，該化合物能可逆阻斷該多肽DNA聚合酶的活性，和(iii)與一種抗體結(jié)合的本發(fā)明的多肽，當(dāng)結(jié)合所述多肽時(shí)，該抗體能與可逆地阻斷該多肽DNA聚合酶的活性，(b)任選地通過熱處理釋放阻斷的DNA聚合酶活性，(c)將步驟(a)得到的混合物中將所述引物退火到所述目標(biāo)核酸上，(d)通過孵育步驟(b)后的混合物來擴(kuò)增目標(biāo)核酸，從而形成引物延伸產(chǎn)物。
為了易于討論，下面的方案假設(shè)將要擴(kuò)增的特定序列包含在雙鏈核酸中。然而，該方法在擴(kuò)增單鏈核酸如mRNA中同樣有用，雖然在優(yōu)選的實(shí)施方式中終產(chǎn)物仍舊是雙鏈DNA。在單鏈核酸的擴(kuò)增中，第一步涉及互補(bǔ)鏈的合成(兩個(gè)擴(kuò)增引物中的一個(gè)可用于該目的)，后續(xù)步驟的進(jìn)行如同在以下所述的雙鏈擴(kuò)增過程。
因此，一個(gè)示范性的擴(kuò)增過程包括下列步驟(a)使每條核酸鏈與四種不同的核苷三磷酸和要擴(kuò)增的每條特定序列的兩條寡核苷酸引物接觸，其中選擇與特定序列的不同鏈充分互補(bǔ)的引物，以便由一個(gè)引物合成的衍生產(chǎn)物，當(dāng)與其互補(bǔ)物分離時(shí)，可以作為合成其它引物的延伸產(chǎn)物的模板，所述接觸是在允許每一引物與互補(bǔ)核酸鏈雜交的溫度下進(jìn)行的；(b)在步驟(a)的同時(shí)或者之后，使每一核酸鏈與本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的、能與核苷三磷酸結(jié)合而形成與特定核酸序列的每條鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的多肽接觸；(c)在有效溫度下將步驟(b)中的混合物維持一段有效的時(shí)間，以提高具有DNA聚合酶活性多肽的活性，以及針對(duì)要擴(kuò)增的每一不同序列合成每一引物的延伸產(chǎn)物，該引物與每一核酸鏈模板互補(bǔ)，而溫度不會(huì)太高以至于使每一延伸產(chǎn)物與互補(bǔ)鏈模板分離；(d)將步驟(c)中的混合物在有效溫度下加熱一段有效的時(shí)間，以從模板中分離引物延伸產(chǎn)物，在該模板上合成了這些產(chǎn)物延伸以生產(chǎn)單鏈分子，而溫度不會(huì)太高以至于使酶不可逆地變性；(e)將步驟(d)中的混合物冷卻至有效溫度維持一段有效的時(shí)間，以促進(jìn)引物與步驟(d)中生產(chǎn)的每一單鏈分子的雜交；和(f)將步驟(e)中的混合物在有效溫度下維持一段有效的時(shí)間，以提高具有DNA聚合酶活性的多肽的活性，及針對(duì)要擴(kuò)增的每一不同序列合成每一引物的延伸產(chǎn)物，該引物與步驟(d)中生產(chǎn)的每一核酸模板互補(bǔ)，但是溫度不會(huì)太高以至于使每一延伸產(chǎn)物與互補(bǔ)鏈模板分離。步驟(e)和(f)中的有效時(shí)間和溫度可以一致，以使步驟(e)和(f)可同時(shí)進(jìn)行。重復(fù)步驟(d)-(f)直到獲得所需的擴(kuò)增水平。
擴(kuò)增方法不僅可用于生產(chǎn)大量的已知序列的特定核酸序列，而且可用于生產(chǎn)已知存在的但是并不完全確定的核酸序列。只需充分詳細(xì)知道序列的兩個(gè)末端的足夠多數(shù)量的堿基，使得能夠制備兩個(gè)寡核苷酸引物，其將與所需序列的不同鏈在沿著序列的相關(guān)位置上雜交，以使從一個(gè)引物出發(fā)合成的延伸產(chǎn)物，當(dāng)與模板(補(bǔ)體)分離時(shí)，可作為用于將另一引物延伸成所定義的長(zhǎng)度的核酸序列的模板。對(duì)序列兩端的堿基了解得越多，針對(duì)目標(biāo)核酸序列的引物的特異性和方法的效率以及反應(yīng)的特異性就會(huì)越高。
在任何情況下，雖然序列不必是純的或者分離的分子，但是要擴(kuò)增的序列的初始復(fù)制必須是可靠的。一般而言，擴(kuò)增過程涉及鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于以相對(duì)于所涉及的反應(yīng)步驟的數(shù)目呈指數(shù)值的方式，生產(chǎn)至少一種特定的核酸序列條件是(a)充分詳細(xì)地了解所要求的序列的末端，以至于能合成與該末端雜交的寡核苷酸，和(b)可獲得少量的序列用于啟動(dòng)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物將是一種分離的核酸雙鏈體，具有與使用的特異引物的5’末端相對(duì)應(yīng)的終端。
如果它含有或被懷疑含有所要擴(kuò)增的特異性核酸序列，任何純化或非純化形式的核酸序列都可被用作起始核酸。要擴(kuò)增的核酸可以從任何來源獲得，例如，源自質(zhì)粒如pBR322、源自克隆的DNA或RNA或者源自任何來源的天然DNA或RNA，包括細(xì)菌、酵母、病毒、細(xì)胞器和較高等生物體如植物和動(dòng)物。DNA或RNA可通過各種技術(shù)從血液、組織原料如絨毛膜或羊膜細(xì)胞中提取。例如參見Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982，pp.280-281。因此，該方法可使用例如DNA或RNA，包括信使RNA，其中DN或RNA可以是單鏈或者雙鏈的。另外，可以使用含有每種中一條鏈的DNA-RNA雜合體。也可以使用這些核酸的任意混合物，因?yàn)楹怂峥梢詮南惹暗臄U(kuò)增反應(yīng)生產(chǎn)(使用相同或不同的引物)。要擴(kuò)增的特異性核酸序列可以僅僅是大分子的一個(gè)片斷，或者最初以分離的分子存在，以使特異性序列構(gòu)成了整個(gè)核酸。
要擴(kuò)增的序列最初不必以純體形式存在；該序列可以是復(fù)雜的混合物的一小部分，如在整個(gè)人類DNA中含有的β-球蛋白的一部分(如Saiki，R.K.，et al.，Science 230(1985)1350-1354中例舉的)或者屬于特定微生物的核酸序列的一部分，該生物可能僅占特定生物樣品的很小的部分。在低滲緩沖液懸浮和在約90℃-100℃下熱處理后，可直接將細(xì)胞用于擴(kuò)增過程中，直到細(xì)胞發(fā)生裂解，細(xì)胞內(nèi)成分分散開來(一般1到15分鐘)。在加熱步驟后，可直接將擴(kuò)增試劑加入到裂解的細(xì)胞中。起始核酸序列可以包含比所需的特異性核酸序列更多的序列。擴(kuò)增過程不僅可用于生產(chǎn)大量的一種特異性核酸序列，而且可用于同時(shí)擴(kuò)增位于相同或不同核酸分子上的不止一種不同的特異性核酸序列。
引物在PCR方法中起著關(guān)鍵的作用。詞語“引物”用于描述擴(kuò)增過程時(shí)，可以指不止一個(gè)引物，特別是在要擴(kuò)增片斷的末端序列的信息有些不明確的情況下，或者在使用WO 91/05753中所述的簡(jiǎn)并引物方法的情況下。例如，在從蛋白質(zhì)序列信息中推導(dǎo)出核酸序列的情況下，含有基于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的代表所有可能的密碼子的序列的引物的集合，可用于每一條鏈。該集合中的一個(gè)引物將與所要擴(kuò)增的序列的一部分充分同源，以便可用于擴(kuò)增。
另外，不止一個(gè)特異性核酸序列可從第一個(gè)核酸或核酸混合物中擴(kuò)增，只要使用適當(dāng)數(shù)量的不同寡核苷酸引物。例如，如果要生產(chǎn)兩種不同的特異性核酸序列，則要使用四個(gè)引物。兩個(gè)引物特異于其中一種特異性核酸序列，而另兩個(gè)引物特異于第二種特異性核酸序列。如此，通過本發(fā)明的方法能指數(shù)性地生產(chǎn)兩種不同的特異性序列。
在給定數(shù)量的擴(kuò)增循環(huán)之后，可擴(kuò)增給定序列范圍內(nèi)的序列，通過在至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后，加入一套與要擴(kuò)增序列的內(nèi)部序列(即不是末端序列)互補(bǔ)的引物，可在反應(yīng)中獲得更高的特異性。這樣的引物可在任何階段加入且能提供一種較短的擴(kuò)增片斷。可選擇地，用具有非互補(bǔ)性末端但與先前擴(kuò)增中使用的引物有些重疊的引物，可制備較長(zhǎng)的片斷。
當(dāng)擴(kuò)增過程用于體外突變時(shí)，引物也起關(guān)鍵作用。在其中使用與原始模板非準(zhǔn)確互補(bǔ)的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物中，將包含引物的序列而不是模板的序列，這樣引入一種體外突變。在進(jìn)一步的循環(huán)中，該突變會(huì)以不可減少的效率被擴(kuò)增，因?yàn)闆]有要求進(jìn)一步的錯(cuò)配引導(dǎo)。用不同引物引入進(jìn)一步序列變化，可在改變的DNA上重復(fù)如上所述的制備改變的DNA序列的過程。這樣，能逐步地產(chǎn)生一系列突變序列，其中每添加一個(gè)新的突變到系列中都與上一個(gè)差異較小，但是與原始的DNA來源序列差異較大。
由于引物可包含非互補(bǔ)性序列作為其序列的一部分，如果足夠量的引物包含與要擴(kuò)增的鏈互補(bǔ)的序列，則可實(shí)現(xiàn)許多其它優(yōu)點(diǎn)。例如，與模板序列不互補(bǔ)的核苷酸序列(例如像啟動(dòng)子、連接區(qū)、編碼序列等)可在一個(gè)或兩個(gè)引物的5’末端被附著，且附加于擴(kuò)增過程的產(chǎn)物上。在加入延伸引物后，進(jìn)行足夠的循環(huán)，以獲得所需數(shù)量的含有非互補(bǔ)性核苷酸插入片斷的新模板。用簡(jiǎn)單的技術(shù)，在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)(例如兩個(gè)小時(shí)或更少)，允許生產(chǎn)大量的組合片斷。
用任何合適的方法例如像上述的磷酸三酯和磷酸二酯方法，或者其自動(dòng)化的實(shí)施方式可制備寡核苷酸引物。在一個(gè)這樣的自動(dòng)化的實(shí)施方式中，二乙基亞磷酰胺被用作起始原料，并且可以如Beaucage et al.，Tetrahedron Letters 22(1981)1859-1862所述方式被合成。在美國(guó)專利4,458,066中描述了一種在修飾的固相支持物上合成寡核苷酸的方法。也可以使用已從生物來源分離的(如限制性內(nèi)切酶消化)引物。
然而，無論用什么引物，反應(yīng)混合物必須包含進(jìn)行PCR的模板，因?yàn)樘禺愋院怂嵝蛄惺峭ㄟ^使用含有作為模板序列的核酸而生產(chǎn)的。第一步包括使每一核酸鏈與四種不同的核苷三磷酸和被擴(kuò)增或檢測(cè)的每一個(gè)特異性核酸序列的兩個(gè)寡核苷酸引物接觸。如果要擴(kuò)增或檢測(cè)的核酸是DNA，則核苷三磷酸通常是dATP、dCTP、dGTP和dTTP，盡管各種核苷酸衍生物也可用于該過程中。例如，當(dāng)使用PCR在未知序列的樣品中檢測(cè)已知的序列時(shí)，dTIP經(jīng)常被替換為dUTP，以減少WO 91/05210中教導(dǎo)的樣品之間的污染。
核苷三磷酸的濃度可變化很大。典型地，用于擴(kuò)增的緩沖液中每一dNTP的濃度是50至500μM，存在于緩沖液中的MgCl2量為1至3mM以激活聚合酶和增強(qiáng)反應(yīng)的特異性。然而，在一些應(yīng)用中，如在高比活性下進(jìn)行DNA測(cè)序或者生產(chǎn)放射性同位素標(biāo)記探針中，可以優(yōu)選dNTP的濃度為1至20pM。
目標(biāo)核酸的核酸鏈用作附加的核酸鏈合成的模板，該附加的核酸鏈?zhǔn)且锏难由飚a(chǎn)物。該合成可用任何合適的方法進(jìn)行，但一般發(fā)生在緩沖的水溶液中，優(yōu)選在pH為7至9，最優(yōu)選約為8下。為促進(jìn)合成，將摩爾過量的兩個(gè)寡核苷酸引物加入到含有模板鏈的緩沖液中。在實(shí)際情況中，當(dāng)要擴(kuò)增的序列被包含于復(fù)雜的長(zhǎng)鏈核酸鏈的混合物中時(shí)，加入的引物量一般會(huì)摩爾過量于互補(bǔ)鏈(模板)的量。優(yōu)選大的摩爾過量以改善擴(kuò)增效率。因此，用于克隆的DNA模板一般使用的引物∶模板比率至少為1000∶1或者更高，用于從復(fù)雜的基因組樣品中擴(kuò)增時(shí)一般使用的引物∶模板比率約為100∶1或更高。
然后根據(jù)被擴(kuò)增或檢測(cè)的核酸是否是雙鏈或單鏈來處理模板、引物和核苷三磷酸的混合物。如果核酸是單鏈的，則在第一個(gè)延伸循環(huán)之前不需要變性步驟，并且將反應(yīng)混合物維持在能促進(jìn)引物與其互補(bǔ)目標(biāo)(模板)序列雜交的溫度。這樣的溫度一般約為35℃至65℃或更高，優(yōu)選約為37℃至60℃維持一段有效的時(shí)間，一般為幾秒到五分鐘，優(yōu)選為30秒到一分鐘。雜交溫度可以使用35℃至70℃。使用長(zhǎng)度為15個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的引物以增加引物雜交的特異性。引物越短要求的雜交溫度越低。
在存在合適的緩沖液、dNTPs和一個(gè)或更多個(gè)寡核苷酸引物時(shí)，通過加入本發(fā)明具有DNA聚合酶活性的多肽，可以合成原始單鏈核酸的互補(bǔ)鏈。如果加入合適的單引物，則引物延伸產(chǎn)物會(huì)與單鏈核酸互補(bǔ)，且會(huì)以相等或不等長(zhǎng)度的雙鏈與核酸鏈雜交(取決于引物與模板雜交的位置)，然后如上所述可分離成單鏈，以產(chǎn)生兩個(gè)單一的、分離的互補(bǔ)鏈。然后加入第二引物，以便隨后使用原始的單鏈核酸和第一引物的延伸產(chǎn)物作為模板，發(fā)生引物延伸的循環(huán)。可選擇地，可將兩個(gè)或更多個(gè)合適的引物(其中一個(gè)引物能用其它引物的延伸產(chǎn)物作為模板而引導(dǎo)合成)加入到單鏈核酸中并進(jìn)行反應(yīng)。
如果核酸含有兩條鏈，如同在雙鏈目標(biāo)的擴(kuò)增或單鏈目標(biāo)的第二循環(huán)擴(kuò)增的情況下，核酸鏈必須在引物雜交之前被分離。通過任何合適的變性方法，包括物理的、化學(xué)的或酶的方法可實(shí)現(xiàn)這種鏈分離。一個(gè)優(yōu)選的分離核酸鏈的物理方法包括加熱核酸直到發(fā)生完全的(＞99％)變性。典型的熱變性涉及范圍約為80℃到105℃的溫度，維持范圍一般約為幾秒到幾分鐘的時(shí)間，這取決于核酸的組成和大小。優(yōu)選地，有效的變性溫度是90℃-100℃維持幾秒到1分鐘。用選自被稱為解螺旋酶的一類酶或者酶RecA也可誘導(dǎo)鏈分離，該酶RECA具有解螺旋酶活性且已知在存在ATP時(shí)能使DNA變性。適用于用解螺旋酶分離核酸鏈的反應(yīng)條件由Kuhn Hoffmann-Berling，CSH-Quantitative Biology 43(1978)63描述，而使用RecA的技術(shù)見Radding，C.M.，Ann.Rev.Genetics16(1982)405-437的綜述。變性產(chǎn)生兩條相等或不等長(zhǎng)度的分離的互補(bǔ)鏈。
如果通過加熱使雙鏈核酸變性，則允許將反應(yīng)混合物冷卻至能促進(jìn)每一引物與互補(bǔ)目標(biāo)(模板)序列雜交的溫度。該溫度一般約為35℃至65℃或更高，取決于試劑，優(yōu)選37℃至60℃。將雜交溫度維持一段有效的時(shí)間，一般幾秒至幾分鐘，優(yōu)選地10秒到1分鐘。在實(shí)際情況中，簡(jiǎn)單地將溫度從約95℃降低至37℃，且在該溫度范圍內(nèi)發(fā)生雜交。
無論核酸是單鏈的還是雙鏈的，在變性步驟之前或期間，或者當(dāng)溫度降低至或在促進(jìn)雜交的范圍內(nèi)時(shí)，可以加入本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的多肽。雖然本發(fā)明聚合酶的熱穩(wěn)定性允許在任何時(shí)間將該酶加入該聚合酶到反應(yīng)混合物中，但是通過在混合物還沒有被冷卻至嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交溫度以下的在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)將聚合酶加入到反應(yīng)混合物中，可以充分地抑制非特異性擴(kuò)增。雜交后，則將反應(yīng)混合物加熱至或維持在能促進(jìn)或優(yōu)化具有DNA聚合酶活性的多肽的活性的溫度，即該溫度足以增加具有DNA聚合酶活性的多肽的活性，有助于從雜交的引物和模板合成引物延伸產(chǎn)物。實(shí)際上該溫度必須足以合成與每一核酸模板互補(bǔ)的每一引物的延伸產(chǎn)物，但必須不能太高以將每一延伸產(chǎn)物從其互補(bǔ)性模板上變性下來(即溫度一般約低于80℃至90℃)。
根據(jù)使用的核酸，對(duì)該合成反應(yīng)有效的典型的溫度一般在約為40℃至80℃，優(yōu)選為50℃至75℃的范圍內(nèi)。對(duì)于本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的多肽，更優(yōu)選的溫度范圍約為65℃至75℃。該合成所要求的時(shí)間范圍可約為10秒到幾分鐘或更長(zhǎng)，主要取決于溫度、核酸的長(zhǎng)度、酶和核酸混合物的復(fù)雜性。延伸時(shí)間通常約為30秒到幾分鐘。如果核酸較長(zhǎng)，則一般合成互補(bǔ)鏈要求更長(zhǎng)的時(shí)間。
新合成的鏈和互補(bǔ)核酸鏈形成一個(gè)雙鏈分子，其用于擴(kuò)增過程的后續(xù)步驟中。在下一步中，在使分子變性的有效溫度下和作用時(shí)間內(nèi)，而不是在使具有DNA聚合酶活性的多肽完全不可逆變性或失活的溫度下和作用時(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)，進(jìn)行熱變性，將雙鏈分子的鏈分離。在模板變性之后，如上所述，將溫度降低至能促進(jìn)引物與前一步驟產(chǎn)生的互補(bǔ)單鏈分子(模板)雜交的水平。
在該雜交步驟之后，或者與該雜交步驟的同時(shí)，將溫度調(diào)節(jié)至能有效地促進(jìn)具有DNA聚合酶活性的多肽的活性的溫度，用新合成鏈和原始鏈作為模板能夠合成引物延伸產(chǎn)物。如上所述，溫度也必須不能太高到將延伸產(chǎn)物從其模板中分離(變性)。在該步驟中可發(fā)生雜交，以至于不要求先前的變性后的冷卻步驟。在這種使用同步的情況下，優(yōu)選的溫度范圍是50℃到70℃。
包括在一個(gè)鏈分離、雜交和延伸產(chǎn)物合成的循環(huán)中的加熱和冷卻步驟，根據(jù)生產(chǎn)所需數(shù)量的特異性核酸序列的需要可被重復(fù)許多次。僅有的限制是引物、具有DNA聚合酶活性的多肽和提供的核苷三磷酸的量。通常，完成15至30個(gè)循環(huán)。對(duì)于擴(kuò)增的DNA的診斷性檢測(cè)來說，循環(huán)的數(shù)量將取決于樣品的特性、樣品中起始目標(biāo)物的濃度和在擴(kuò)增后所使用的檢測(cè)方法的靈敏度。對(duì)于給定的檢測(cè)靈敏度，如果被擴(kuò)增的樣品是純的并且起始目標(biāo)物濃度很高，則要求較少的循環(huán)。如果樣品是復(fù)雜的核酸混合物并且起始目標(biāo)物的濃度很低，則要求更多的循環(huán)來擴(kuò)增到足以進(jìn)行檢測(cè)的信號(hào)。對(duì)于一般的擴(kuò)增和檢測(cè)，該過程約重復(fù)15次。當(dāng)擴(kuò)增用于產(chǎn)生要檢測(cè)的帶標(biāo)記的序列特異性探針的序列時(shí)，并且當(dāng)人的基因組DNA是擴(kuò)增的目標(biāo)時(shí)，該過程重復(fù)15至30次，以充分?jǐn)U增序列以至于產(chǎn)生清楚的可檢測(cè)的信號(hào)，也就是說使背景噪聲不干涉檢測(cè)。
在起始添加后不必加入另外的核苷酸、引物或具有DNA聚合酶活性的多肽，如果關(guān)鍵的反應(yīng)物沒有被耗盡，并且具有DNA聚合酶活性的多肽沒有變性或沒有不可逆地失活，則在該情況下必須加入另外的聚合酶或其它反應(yīng)物以繼續(xù)反應(yīng)。在完成合適數(shù)量的循環(huán)以產(chǎn)生所需數(shù)量的特異性核酸序列后，可以以常用方式，例如通過加入EDTA、苯酚、SDS或CHCl3，使具有DNA聚合酶活性的多肽失活或者分離反應(yīng)的組分來停止反應(yīng)。
擴(kuò)增過程可連續(xù)地操作。在一個(gè)自動(dòng)化方法的實(shí)施方式中，可以讓反應(yīng)混合物進(jìn)行溫度循環(huán)，將溫度程序控制在一定水平維持一定的時(shí)間。用于該目的的一個(gè)儀器是由Perkin-Elmer Cetus Instruments開發(fā)和銷售的用于操作擴(kuò)增反應(yīng)的自動(dòng)化的機(jī)器。使用該儀器進(jìn)行PCR的詳細(xì)說明可通過購買該儀器獲得。這樣儀器的另一個(gè)例子是LightCycler，可獲自Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德國(guó)。
本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的多肽在各種方法中是很有用的，在這些方法中通過PCR擴(kuò)增核酸序列是有用的。如US 4,800,159中所述的，擴(kuò)增方法可用于克隆要插入到合適的表達(dá)載體中的特定核酸序列。通過重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，可使用載體其轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞以生產(chǎn)該序列的基因產(chǎn)物。這樣的克隆可包括用平末端連接直接連接到載體中，或者使用限制性酶在引物中含有的位點(diǎn)處進(jìn)行剪切。其它適合于本發(fā)明的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的方法包括描述于US 4,683,195和US 4,683,202和EP 0 229 701；EP 0 237 362；和EP 0 258 017中的那些方法。此外，本發(fā)明的酶可用于非對(duì)稱PCR(見Gyllensten，U.B.，and Erlich，H.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)7652-7656)；反向PCR(Ochman，H.，et al.，Genetics 120(1988)621-623)；和DNA測(cè)序(見Innis，M.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)9436-9440，and McConlogue，L.，et al.，NucleicAcids Res.16(1988)9869)，cDNA末端的隨機(jī)擴(kuò)增(RACE)，用于擴(kuò)增一系列DNA片斷的隨機(jī)引導(dǎo)PCR，和如同由Loh，E.，in METHODSA Companion toMethods in Enzymology(1991)2，pp.11-19所述的具有單側(cè)特異性的PCR方法如錨定PCR和連接介導(dǎo)的錨定PCR。
特別地，本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的多肽對(duì)于用LightCycler擴(kuò)增目標(biāo)核酸是有用的。進(jìn)行PCR LightCycler的儀器和方案描述于“LightCycler操作者手冊(cè)3.5版”手冊(cè)中(2000年10月)，可獲自Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德國(guó)。因此，第4.3.1章節(jié)中給出的建議同樣可用于TaqΔ288。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種用于測(cè)定核酸序列的方法，它包括下列步驟在至少一種鏈終止試劑和一種或更多種核苷酸三磷酸的存在下，用本發(fā)明的多肽從要測(cè)序的核酸模板產(chǎn)生鏈終止的片斷，以及從所述片斷的大小測(cè)定所述核酸的序列。
最近幾年，通過Sanger雙脫氧核苷酸方法測(cè)定DNA序列(Sanger，F(xiàn).，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)5463-5467)已經(jīng)歷了重大的改進(jìn)，包括新載體的開發(fā)(Yanisch-Perron，C.，et al.，Gene 33(1985)103-119)、堿基類似物(Mills，D.R.，and Kramer，F(xiàn).R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)2232-2235，and Barr etal.，BioTechniques 4(1986)428-432)、酶(Tabor，S.，and Richardson，C.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)4767-4771，and Innis，M.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)9436-9440)和用于局部自動(dòng)分析DNA序列的儀器(Smith，L.M.，et al.，Nature 321(1986)674-679；Prober，J.M.，et al.，Science 238(1987)336-341；and Ansorge，W.，et al.，Nuc.Acids Res.15(1987)4593-4602)。基本的雙脫氧測(cè)序程序包括(i)將引物和合適的單鏈或變性的雙鏈DNA模板退火；(ii)在四個(gè)分離的反應(yīng)中用DNA聚合酶延伸引物，每個(gè)反應(yīng)包括一個(gè)α-標(biāo)記的dNTP或ddNTP(可選擇地，可以使用標(biāo)記的引物)、未標(biāo)記的dNTPs混合物和一個(gè)終止鏈的雙脫氧核苷酸-5’-三磷酸(ddNTP)；(iii)在高分辨聚丙烯酰胺脲凝膠上分離四組反應(yīng)產(chǎn)物；和(iv)產(chǎn)生一個(gè)可被檢測(cè)的凝膠放射自顯影影像以推斷DNA序列?？蛇x擇地，熒光標(biāo)記的引物或核苷酸可用于識(shí)別反應(yīng)產(chǎn)物。已知的雙脫氧測(cè)序方法利用DNA聚合酶如大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片斷、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶或者修飾的T7 DNA聚合酶。
對(duì)于基本的雙脫氧測(cè)序的替代方法，循環(huán)雙脫氧測(cè)序是一個(gè)在雙脫氧鏈終止子存在下目標(biāo)序列的線性、非對(duì)稱擴(kuò)增。一個(gè)單循環(huán)產(chǎn)生一族所有可能長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物。在來自DNA模板的延伸反應(yīng)產(chǎn)物變性后，在雙脫氧終止子的存在下發(fā)生多個(gè)循環(huán)的引物退火和引物延伸。該方法不同于PCR因?yàn)橹皇褂靡粋€(gè)引物，在每一循環(huán)中測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的增長(zhǎng)是線性的，并且擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上是不均一的，不會(huì)作為下一反應(yīng)的模板。循環(huán)雙脫氧測(cè)序是一種為使用自動(dòng)化的DNA測(cè)序儀的實(shí)驗(yàn)室和其它高容量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室提供優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)。由于該技術(shù)的特異性和產(chǎn)生的信號(hào)量增加了，有可能在無克隆的情況下直接進(jìn)行基因組DNA的測(cè)序。循環(huán)測(cè)序方案適用于單鏈和雙鏈模板，包括基因組的、克隆的和PCR擴(kuò)增的模板。
具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，特別是TaqΔ288，在循環(huán)測(cè)序中具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)它們能經(jīng)受引物與基因組目標(biāo)物的特異性雜交所要求的嚴(yán)謹(jǐn)退火溫度，也能經(jīng)受多個(gè)發(fā)生在每一循環(huán)中的高溫變性循環(huán)。在高溫即70-75℃下進(jìn)行延伸反應(yīng)，由于二級(jí)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致對(duì)含有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA的測(cè)序結(jié)果有重大改進(jìn)。然而，這樣的溫度不會(huì)消除所有的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
提供以下的實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表、表格和附圖，以幫助理解本發(fā)明，在附帶的權(quán)利要求書中闡明的真正的保護(hù)范圍?？梢岳斫庠诓幻撾x本發(fā)明精神的情況下可以對(duì)所提出的程序進(jìn)行修改。
參考文獻(xiàn)目錄Ansorge，W.，et al.，Nuc.Acids Res.15(1987)4593-4602Barr et al.，BioTechniques 4(1986)428-432
Beaucage er al.，Tetrahedron Letters 22(1981)1859-1862Bessman et al.，J.Biol.Chem.233(1957)171-177Buttin，G.，and Kornberg A.，J.Biol.Chem.241(1966)5419-5427Chien et al.，Chemical Abstract 85，No.155559t(1976)Chou，Q.，et al.，Nucleic Acids Res.20(1992)1717-1723Cohen，S.N.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA69(1972)2110-2114EP 0 229 701EP 0 237 362EP 0 258 017EP 0 771 870EP 1 069 131Graham and van der Eb，Virology 52(1978)546Gyllensten，U.B.，and Erlich，H.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)7652-7656Hsiao，C.L.，and Carbon，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)3829-3833Innis，M.A，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)9436-9440Kaledin et al.，Chemical Abstract 93，No.40169p(1989)Kuhn Hoffmann-Berling，CSH-Quantitative Biology 43(1978)63Lawyer，F(xiàn).C.，et al.，J.Biol.Chem.264(1989)6427-6437Loh，E.，in METHODSA Companion to Methods in Enzymology(1991)2，pp.11-19Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982，pp.280-281McConlogue，L.，et al.，Nucleic Acids Rec.16(1988)9869McCutcheon’s Emulsifiers & Detergents，North American edition(1983)，McCutcheon Division of MC Publishing Co.，175 Rock Road，Glen Rock，NJ(USA)，pp.295-298Mills，D.R.，and Kramer，F(xiàn).R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)2232-2235Ochman，H.，et al.，Genetics 120(1988)621-623Prober，J.M.，et al.，Science 238(1987)336-341
Qiagen manual“The QIAexpressionistTM”，5th edition，June 2003Radding，C.M.，Ann.Rev.Genetics 16(1982)405-437Saiki，R.K.，et al.，Science 230(1985)1350-1354Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rdedition，CSHL Press，2001Sanger，F(xiàn).，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977)5463-5467Sharkey，D.J.，et al.，Bio Technology 12(1994)506-509Shaw，C.H.，et al.，Gene 23(1983)315-330Smith，L.M.，et al.，Nature 321(1986)674-679Tabor，S.，and Richardson，C.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)4767-4771US 4,458,066US 4,683,195US 4,683,202US 4,889,818US 4,965,188US 5,079,352US 5,338,671US 5,436,149US 5,616,494US 5,618,676US 5,677,152US 5,773,258US 5,854,018US 5,856,123US 5,885,813US 5,919,651US 6,183,998US 6,479,264van Solingen，P.，and Plaat，J.B.，J.Bact.130(1977)946-947WO 91/02090
WO 91/05210WO 91/05753Yanisch-Perron，C.，et al.，Gene 33(1985)103-119


附圖1用來檢測(cè)TaqΔ288(1)、TaqΔ279(2)、TaqΔ289(3)和TaqWT(4)的相對(duì)活性的四個(gè)實(shí)驗(yàn)的比較。用一般的填充圖案顯示對(duì)應(yīng)于相同實(shí)驗(yàn)的豎條。豎條代表表1中給出的數(shù)值。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
實(shí)施例1缺失突變體TaqΔ288的構(gòu)建和生產(chǎn)從SEQ ID NO6所示的編碼TaqWT的DNA序列、一種包含編碼序列MRGS-6xHis-IEGR的DNA序列的寡核苷酸引物、一種與編碼TaqWT的C末端的DNA序列雜交的寡核苷酸引物開始，用PCR組裝編碼SEQ ID NO5所示氨基酸序列的DNA。將構(gòu)建體插入到pQE80L表達(dá)載體中。
實(shí)施例2在細(xì)菌溶菌產(chǎn)物中WT Taq聚合酶和Taq聚合酶的N-末端缺失變體的活性用表達(dá)載體pQE80L(Qiagen目錄號(hào)32923)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將TaqWT、TaqΔ279、TaqΔ288和TaqΔ289的閱讀框克隆到大腸桿菌菌株XL-1 Blue中(Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rdedition，CSHL Press，2001；Qiagen manual“The QIAexpressionistTM”，5thedition，June 2003)。將轉(zhuǎn)化的菌落接種到dYT培養(yǎng)基(每升水中含16g細(xì)菌用胰蛋白胨、10g細(xì)菌用酵母提取物、5g NaCl；25μM氨芐青霉素)，并在37℃連續(xù)搖動(dòng)(搖床孵育器，每分鐘150轉(zhuǎn))的條件下，在微孔板(Falcon No.353227)中過夜培養(yǎng)生長(zhǎng)。將100μl過夜培養(yǎng)物與100μl新鮮培養(yǎng)基混合并孵育1小時(shí)。加入IPTG導(dǎo)致終濃度為500μM并將培養(yǎng)物再孵育4小時(shí)。隨后，將培養(yǎng)物與10％B-PER溶液(例如B-PER蛋白提取試劑，Pierce)混合并在60℃下將混合物孵育20分鐘，將細(xì)菌溶解。將微孔板在每分鐘3,300轉(zhuǎn)(rpm)下離心以分離溶菌產(chǎn)物。將每一溶菌產(chǎn)物的第一個(gè)40μl等分試樣移液到微量PCR平板中(96孔每孔體積為0.2ml)。將平板在微量“主循環(huán)梯度”熱循環(huán)儀中于97℃下孵育35分鐘。將每一溶菌產(chǎn)物的第二個(gè)40μl等分試樣保存在室溫下作為陽性對(duì)照。
隨后，將30-40μl每一溶菌產(chǎn)物(加熱后的溶菌產(chǎn)物以及對(duì)照)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微孔板(Costar No.3903,96孔)中并用PCR主混合物混合，以達(dá)到終體積為100μl。PCR主混合物含有10μl 10×Taq緩沖液，各0.15mM的dATP、dCTP和dGTP，0.2mM的還含有LightCycler Red 640-N-羥基琥珀酰亞胺酯標(biāo)記的dUTP(等摩爾的)的dNTP、0.5mM MgCl2(除了10×Taq緩沖液中包含的MgCl2)和50pM熒光素標(biāo)記的SEQ ID NO8所示的模板(即0.5μl含有1.6μg/μl模板的溶液)。將微孔板在72℃下孵育60分鐘以允許模板延伸。
隨后，將平板在4℃下冷卻10分鐘。用熒光計(jì)(Tecan)定量測(cè)定FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)。激發(fā)波長(zhǎng)為485nm。在635nm波長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行光輻射的測(cè)量。除去背景信號(hào)后，發(fā)射值為殘留的DNA聚合酶活性的函數(shù)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，通過用加熱后樣品的測(cè)量值除以未加熱的對(duì)照樣品的測(cè)量值并將結(jié)果乘以100，可計(jì)算出相對(duì)的活性值。表1總結(jié)了在四個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的相對(duì)活性值。
表1在97℃下在35分鐘后具有DNA聚合酶活性的多肽的相對(duì)活性

實(shí)施例3具有DNA聚合酶活性的多肽的表達(dá)和純化將總體積為4L的dYT培養(yǎng)基，分成800ml的等分試樣裝入2L燒瓶中，接種用pQE80L表達(dá)載體(Qiagen目錄號(hào)32923)轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌菌株XL-1Blue，其中編碼TaqΔ288、TaqΔ279(Klentaq)、Stoffel片斷(TaqΔ290)和TaqWT的閱讀框已被插入到載體中。將細(xì)胞在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)生長(zhǎng)(搖床孵育器，每分鐘250轉(zhuǎn))。在光密度約為0.8(在600nm下測(cè)量)時(shí)，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度為500μM。細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)直到光密度達(dá)到2和3之間。然后離心沉淀細(xì)胞，將沉淀物在室溫下重新懸浮在B50緩沖液(25mM TrisHCl pH8.5，0.1mM EDTA，5％甘油，1mMDTT(二硫蘇糖醇)，50mM NaCl)中。
純化方案1
用弗氏壓碎器在1,000巴下溶解細(xì)胞兩次。加入NaCl至1.5M以從DNA中溶解聚合酶。隨后，在水浴中將混合物加熱至75℃維持15分鐘。隨后，不再進(jìn)一步加熱，將混合物留在水浴中維持15分鐘。通過離心從上清液中分離沉淀物。將上清液在B100緩沖液(25mM TrisHCl pH8.5，0.1mM EDTA，5％甘油，1mMDTT，100mM NaCl)中透析。隨后，進(jìn)行層析步驟。第一步使用肝素瓊脂糖凝膠柱和通過用B100和B600(25mM TrisHCl pH8.5，0.1mM EDTA，5％甘油，1mM DTT，600mM NaCl)梯度洗脫方法進(jìn)行TaqΔ288多肽的洗脫。在B50中透析含有TaqΔ288的級(jí)分之后，用Q瓊脂糖凝膠柱進(jìn)一步純化該酶并用B50和B250(25mM TrisHCl pH8.5，0.1mM EDTA，5％甘油，1mM DTT，250mM NaCl)進(jìn)行梯度洗脫。最后將帶有洗脫后的TaqΔ288的級(jí)分在貯存緩沖液中透析(50％[v/v]甘油，100mM KCl，20mM TrisHCl pH8.5，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.25％聚醚醇)。
純化方案2如果在純化過程中使用組氨酸標(biāo)記，則有助于純化。將5g沉淀的細(xì)胞在25ml溶胞緩沖液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，1mM DTT，pH8.0)中重新懸浮并用超聲波溶解。加入DNA酶I(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)以使終濃度為20mg/ml而且MgCl2終濃度為4mM。在25℃下將混合物孵育30分鐘。在72℃下熱孵30分鐘后，通過離心(22,000×g)將沉淀物沉淀。將澄清的上清液加載到10ml Ni-NTA超流柱(Qiagen)上。用兩倍體積的緩沖液A(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)清洗該柱。用體積為100ml的線性梯度洗脫該柱，開始用緩沖液A，最后用緩沖液B(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)。將組氨酸標(biāo)記的TaqΔ288多肽進(jìn)一步通過帶有Q瓊脂糖凝膠的陰離子交換層析純化。最后，將含有純化的組氨酸標(biāo)記的TaqΔ288多肽的級(jí)分在貯存緩沖液中透析。
為了除去組氨酸標(biāo)記，將Ni-NTA純化的組氨酸標(biāo)記的TaqΔ288多肽在Xa反應(yīng)緩沖液中(20mM TrisHCl pH6.5，50mM NaCl，1mM CaCl2)透析。將因子Xa蛋白酶(1U/毫克TaqΔ288多肽)和總反應(yīng)體積1/10的10倍濃縮反應(yīng)緩沖液一起加入。將混合物在4℃下孵育3到6天。隨后，通過加入1M pH8.5的TrisHCl(約1/100體積)將pH提高到8.0。此外，加入經(jīng)平衡的Ni-NTA超流物質(zhì)并將混合物在室溫下連續(xù)攪動(dòng)(轉(zhuǎn)動(dòng))孵育30分鐘。將上清液從帶有未切除組氨酸標(biāo)記的TaqΔ288多肽的Ni-NTA超流物質(zhì)中分離并在72℃下熱失活30分鐘。接下來的步驟是帶有Q瓊脂糖凝膠的陰離子交換層析，其后是在貯存緩沖液中透析。
實(shí)施例4TaqΔ288的活性用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定DNA聚合酶的活性，即先將M13引物在65℃下雜交到M13mp9ss DNA，然后摻入放射性標(biāo)記的α32dCTP。通過液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)量摻入量。將該活性與作為參照的主要批號(hào)的TaqWT制劑進(jìn)行比較。表2概括了該結(jié)果。
表2具有DNA聚合酶活性的多肽的比活性

關(guān)于TaqΔ288多肽中組氨酸標(biāo)記的存在或不存在，沒有檢測(cè)到關(guān)于DNA聚合酶活性的差異。
實(shí)施例5TaqΔ288的分子特性已制備了不帶組氨酸標(biāo)記的TaqΔ288多肽。N-末端測(cè)序已顯示出氨基酸序列ESPKALEEAPWPPPE。TaqΔ288多肽的分子量已通過MALDI TOF方法測(cè)定為62.5kDa。
實(shí)施例6TaqΔ288的檸康?；瘜?mg純化的組氨酸標(biāo)記的TaqΔ288多肽置于3ml反應(yīng)緩沖液(50mMHEPES，300mM KCl，1mM EDTA，pH8.5)中與2μl檸康酸酐在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。隨后將混合物在貯存緩沖液(63％[w/v]甘油，100mM KCl，20mM TrisHClpH8.5，0.1mM EDTA，0.5％吐溫20，1mM DTT)中透析。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>熱穩(wěn)定的Taq聚合酶片段<130>21822<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1638<212>DNA<213>人工的<220>
<223>TaqΔ288_Δ-2，切去了因子Xa<220>
<221>CDS<222>(1)..(1638)<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1638)<223>不帶N-末端甲硫氨酸的TaqΔ288<400>1gaa agc ccc aag gcc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg48Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly1 5 10 15gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tcc cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat96Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp20 25 30ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc ccc144Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro35 40 45
gag cct tat aaa gcc ctc agg gac ctg aag gag gcg cgg ggg ctt ctc192Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu50 55 60gcc aaa gac ctg agc gtt ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc ctc ccg240Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro65 70 75 80ccc ggc gac gac ccc atg ctc ctc gcc tac ctc ctg gac cct tcc aac288Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn85 90 95acc acc ccc gag ggg gtg gcc cgg cgc tac ggc ggg gag tgg acg gag336Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu100 105 110gag gcg ggg gag cgg gcc gcc ctt tcc gag agg ctc ttc gcc aac ctg384Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu115 120 125tgg ggg agg ctt gag ggg gag gag agg ctc ctt tgg ctt tac cgg gag432Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu130 135 140gtg gag agg ccc ctt tcc gct gtc ctg gcc cac atg gag gcc acg ggg480Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly145 150 155 160gtg cgc ctg gac gtg gcc tat ctc agg gcc ttg tcc ctg gag gtg gcc528Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala165 170 175gag gag atc gcc cgc ctc gag gcc gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc cac576Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His180 185 190ccc ttc aac ctc aac tcc cgg gac cag ctg gaa agg gtc ctc ttt gac624Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp195 200 205gag cta ggg ctt ccc gcc atc ggc aag acg gag aag acc ggc aag cgc672Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg210 215 220
tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag gcc ctc cgc gag gcc cac ccc atc720Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile225 230 235 240gtg gag aag atc ctg cag tac cgg gag ctc acc aag ctg aag agc acc768Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr245 250 255tac att gac ccc ttg ccg gac ctc atc cac ccc agg acg ggc cgc ctc816Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu260 265 270cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc acg ggc agg cta agt agc864His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser275 280 285tcc gat ccc aac ctc cag aac atc ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag912Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln290 295 300agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc gag gag ggg tgg cta ttg gtg gcc960Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala305 310 315 320ctg gac tat agc cag ata gag ctc agg gtg ctg gcc cac ctc tcc ggc1008Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly325 330 335gac gag aac ctg atc cgg gtc ttc cag gag ggg cgg gac atc cac acg1056Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr340 345 350gag acc gcc agc tgg atg ttc ggc gtc ccc cgg gag gcc gtg gac ccc1104Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro355 360 365ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acc atc aac ttc ggg gtc ctc tac ggc1152Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly370 375 380atg tcg gcc cac cgc ctc tcc cag gag cta gcc atc cct tac gag gag1200Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu385 390 395 400
gcc cag gcc ttc att gag cgc tac ttt cag agc ttc ccc aag gtg cgg1248Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg405 410 415gcc tgg att gag aag acc ctg gag gag ggc agg agg cgg ggg tac gtg1296Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val420 425 430gag acc ctc ttc ggc cgc cgc cgc tac gtg cca gac cta gag gcc cgg1344Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg435 440 445gtg aag agc gtg cgg gag gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg ccc1392Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro450 455 460gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg aag ctg gct atg gtg aag ctc1440Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu465 470 475 480ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc agg atg ctc ctt cag gtc cac1488Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His485 490 495gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc1536Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala500 505 510cgg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc1584Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro515 520 525ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag gac tgg ctc tcc gcc aag gag1632Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu530 535 540taa tga1638<210>2<211>544<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>TaqΔ288_Δ-2，切去了因子Xa<400>2Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly1 5 10 15Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp20 25 30Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro35 40 45Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu50 55 60Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro65 70 75 80Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn85 90 95Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu100 105 110Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu115 120 125Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu130 135 140Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly145 150 155 160
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala165 170 175Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His180 185 190Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp195 200 205Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg210 215 220Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile225 230 235 240Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr245 250 255Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu260 265 270His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser275 280 285Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln290 295 300Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala305 310 315 320Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly325 330 335
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr340 345 350Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro355 360 365Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly370 375 380Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu385 390 395 400Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg405 410 415Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val420 425 430Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg435 440 445Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro450 455 460Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu465 470 475 480Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His485 490 495Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala500 505 510
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro515 520 525Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu530 535 540<210>3<211>1641<212>DNA<213>人工的<220>
<223>無N-末端組氨酸<220>
<221>CDS<222>(1)..(1641)<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1641)<223>帶N-末端甲硫氨酸的TaqΔ288<400>3atg gaa agc ccc aag gcc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa48Met Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu1 5 10 15ggg gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tcc cgc aag gag ccc atg tgg gcc96Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala20 25 30gat ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc144Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala35 40 45ccc gag cct tat aaa gcc ctc agg gac ctg aag gag gcg cgg ggg ctt192Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu50 55 60
ctc gcc aaa gac ctg agc gtt ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc ctc240Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu65 70 75 80ccg ccc ggc gac gac ccc atg ctc ctc gcc tac ctc ctg gac cct tcc288Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser85 90 95aac acc acc ccc gag ggg gtg gcc cgg cgc tac ggc ggg gag tgg acg336Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr100 105 110gag gag gcg ggg gag cgg gcc gcc ctt tcc gag agg ctc ttc gcc aac384Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn115 120 125ctg tgg ggg agg ctt gag ggg gag gag agg ctc ctt tgg ctt tac cgg432Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg130 135 140gag gtg gag agg ccc ctt tcc gct gtc ctg gcc cac atg gag gcc acg480Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr145 150 155 160ggg gtg cgc ctg gac gtg gcc tat ctc agg gcc ttg tcc ctg gag gtg528Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val165 170 175gcc gag gag atc gcc cgc ctc gag gcc gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc576Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly180 185 190cac ccc ttc aac ctc aac tcc cgg gac cag ctg gaa agg gtc ctc ttt624His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe195 200 205gac gag cta ggg ctt ccc gcc atc ggc aag acg gag aag acc ggc aag672Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys210 215 220cgc tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag gcc ctc cgc gag gcc cac ccc720Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro225 230 235 240
atc gtg gag aag atc ctg cag tac cgg gag ctc acc aag ctg aag agc768Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser245 250 255acc tac att gac ccc ttg ccg gac ctc atc cac ccc agg acg ggc cgc816Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg260 265 270ctc cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc acg ggc agg cta agt864Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser275 280 285agc tcc gat ccc aac ctc cag aac atc ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg912Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly290 295 300cag agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc gag gag ggg tgg cta ttg gtg960Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val305 310 315 320gcc ctg gac tat agc cag ata gag ctc agg gtg ctg gcc cac ctc tcc1008Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser325 330 335ggc gac gag aac ctg atc cgg gtc ttc cag gag ggg cgg gac atc cac1056Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His340 345 350acg gag acc gcc agc tgg atg ttc ggc gtc ccc cgg gag gcc gtg gac1104Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp355 360 365ccc ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acc atc aac ttc ggg gtc ctc tac1152Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr370 375 380ggc atg tcg gcc cac cgc ctc tcc cag gag cta gcc atc cct tac gag1200Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu385 390 395 400gag gcc cag gcc ttc att gag cgc tac ttt cag agc ttc ccc aag gtg1248Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val405 410 415
cgg gcc tgg att gag aag acc ctg gag gag ggc agg agg cgg ggg tac1296Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr420 425 430gtg gag acc ctc ttc ggc cgc cgc cgc tac gtg cca gac cta gag gcc1344Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala435 440 445cgg gtg aag agc gtg cgg gag gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg1392Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met450 455 460ccc gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg aag ctg gct atg gtg aag1440Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys465 470 475 480ctc ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc agg atg ctc ctt cag gtc1488Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val485 490 495cac gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg1536His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val500 505 510gcc cgg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg1584Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val515 520 525ccc ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag gac tgg ctc tcc gcc aag1632Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys530 535 540gag taa tga1641Glu545<210>4<211>545<212>PRT<213>人工的<220>
<223>無N-末端組氨酸
<400>4Met Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala20 25 30Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala35 40 45Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu50 55 60Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu65 70 75 80Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser85 90 95Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr100 105 110Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn115 120 125Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg130 135 140Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr145 150 155 160Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val
165 170 175Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly180 185 190His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe195 200 205Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys210 215 220Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro225 230 235 240Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser245 250 255Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg260 265 270Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser275 280 285Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly290 295 300Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val305 310 315 320Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser325 330 335Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His
340 345 350Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp355 360 365Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr370 375 380Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu385 390 395 400Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val405 410 415Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr420 425 430Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala435 440 445Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met450 455 460Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys465 470 475 480Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val485 490 495His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val500 505 510Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val
515 520 525Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys530 535 540Glu545<210>5<211>558<212>PRT<213>人工的<220>
<223>TaqΔ288_Δ-2<220>
<221>misc_特征<223>帶N-末端組氨酸標(biāo)記和因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)的TaqΔ288<400>5Met Arg Gly Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg Glu Ser1 5 10 15Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe20 25 30Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu35 40 45Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro50 55 60Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys65 70 75 80
Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly85 90 95Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr100 105 110Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala115 120 125Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly130 135 140Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu145 150 155 160Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg165 170 175Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu180 185 190Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe195 200 205Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu210 215 220Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr225 230 235 240Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu245 250 255
Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile260 265 270Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr275 280 285Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp290 295 300Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile305 310 315 320Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp325 330 335Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu340 345 350Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr355 360 365Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met370 375 380Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser385 390 395 400Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln405 410 415Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp420 425 430
Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr435 440 445Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys450 455 460Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln465 470 475 480Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro485 490 495Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu500 505 510Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu515 520 525Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu530 535 540Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu545 550 555<210>6<211>2499<212>DNA<213>棲熱水生菌<220>
<221>misc_特征<223>編碼天然棲熱水生菌(Taq)DNA聚合酶的開放閱讀框
<220>
<221>CDS<222>(1)..(2499)<400>6atg agg ggg atg ctg ccc ctc ttt gag ccc aag ggc cgg gtc ctc ctg48Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu1 5 10 15gtg gac ggc cac cac ctg gcc tac cgc acc ttc cac gcc ctg aag ggc96Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly20 25 30ctc acc acc agc cgg ggg gag ccg gtg cag gcg gtc tac ggc ttc gcc144Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala35 40 45aag agc ctc ctc aag gcc ctc aag gag gac ggg gac gcg gtg atc gtg192Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val50 55 60gtc ttt gac gcc aag gcc ccc tcc ttc cgc cac gag gcc tac ggg ggg240Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly65 70 75 80tac aag gcg ggc cgg gcc ccc acg ccg gag gac ttt ccc cgg caa ctc288Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu85 90 95gcc ctc atc aag gag ctg gtg gac ctc ctg ggg ctg gcg cge ctc gag336Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu100 105 110gtc ccg ggc tac gag gcg gac gac gtc ctg gcc agc ctg gcc aag aag384Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys115 120 125gcg gaa aag gag ggc tac gag gtc cgc atc ctc acc gcc gac aaa gac432Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp130 135 140ctt tac cag ctc ctt tcc gac cgc atc cac gtc ctc cac ccc gag ggg480Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly145 150 155 160
tac ctc atc acc ccg gcc tgg ctt tgg gaa aag tac ggc ctg agg ccc528Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro165 170 175gac cag tgg gcc gac tac cgg gcc ctg acc ggg gac gag tcc gac aac576Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn180 185 190ctt ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag aag acg gcg agg aag ctt ctg624Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu195 200 205gag gag tgg ggg agc ctg gaa gcc ctc ctc aag aac ctg gac cgg ctg672Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu210 215 220aag ccc gcc atc cgg gag aag atc ctg gcc cac atg gac gat ctg aag720Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys225 230 235 240ctc tcc tgg gac ctg gcc aag gtg cgc acc gac ctg ccc ctg gag gtg768Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val245 250 255gac ttc gcc aaa agg cgg gag ccc gac cgg gag agg ctt agg gcc ttt816Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe260 265 270ctg gag agg ctt gag ttt ggc agc ctc ctc cac gag ttc ggc ctt ctg864Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu275 280 285gaa agc ccc aag gcc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg912Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly290 295 300gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tcc cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat960Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp305 310 315 320ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc ccc1008Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro325 330 335
gag cct tat aaa gcc ctc agg gac ctg aag gag gcg cgg ggg ctt ctc1056Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu340 345 350gcc aaa gac ctg agc gtt ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc ctc ccg1104Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro355 360 365ccc ggc gac gac ccc atg ctc ctc gcc tac ctc ctg gac cct tcc aac1152Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn370 375 380acc acc ccc gag ggg gtg gcc cgg cgc tac ggc ggg gag tgg acg gag1200Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu385 390 395 400gag gcg ggg gag cgg gcc gcc ctt tcc gag agg ctc ttc gcc aac ctg1248Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu405 410 415tgg ggg agg ctt gag ggg gag gag agg ctc ctt tgg ctt tac cgg gag1296Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu420 425 430gtg gag agg ccc ctt tcc gct gtc ctg gcc cac atg gag gcc acg ggg1344Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly435 440 445gtg cgc ctg gac gtg gcc tat ctc agg gcc ttg tcc ctg gag gtg gcc1392Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala450 455 460gag gag atc gcc cgc ctc gag gcc gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc cac1440Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His465 470 475 480ccc ttc aac ctc aac tcc cgg gac cag ctg gaa agg gtc ctc ttt gac1488Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp485 490 495gag cta ggg ctt ccc gcc atc ggc aag acg gag aag acc ggc aag cgc1536Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg500 505 510
tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag gcc ctc cgc gag gcc cac ccc atc1584Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile515 520 525gtg gag aag atc ctg cag tac cgg gag ctc acc aag ctg aag agc acc1632Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr530 535 540tac att gac ccc ttg ccg gac ctc atc cac ccc agg acg ggc cgc ctc1680Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu545 550 555 560cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc acg ggc agg cta agt agc1728His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser565 570 575tcc gat ccc aac ctc cag aac atc ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag1776Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln580 585 590agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc gag gag ggg tgg cta ttg gtg gcc1824Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala595 600 605ctg gac tat agc cag ata gag ctc agg gtg ctg gcc cac ctc tcc ggc1872Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly610 615 620gac gag aac ctg atc cgg gtc ttc cag gag ggg cgg gac atc cac acg1920Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr625 630 635 640gag acc gcc agc tgg atg ttc ggc gtc ccc cgg gag gcc gtg gac ccc1968Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro645 650 655ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acc atc aac ttc ggg gtc ctc tac ggc2016Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly660 665 670atg tcg gcc cac cgc ctc tcc cag gag cta gcc atc cct tac gag gag2064Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu675 680 685
gcc cag gcc ttc att gag cgc tac ttt cag agc ttc ccc aag gtg cgg2112Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg690 695 700gcc tgg att gag aag acc ctg gag gag ggc agg agg cgg ggg tac gtg2160Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val705 710 715 720gag acc ctc ttc ggc cgc cgc cgc tac gtg cca gac cta gag gcc cgg2208Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg725 730 735gtg aag agc gtg cgg gag gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg ccc2256Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro740 745 750gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg aag ctg gct atg gtg aag ctc2304Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu755 760 765ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc agg atg ctc ctt cag gtc cac2352Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His770 775 780gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc2400Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala785 790 795 800cgg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc2448Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro805 810 815ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag gac tgg ctc tcc gcc aag gag2496Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu820 825 830tga2499<210>7<211>832<212>PRT<213>棲熱水生菌
<400>7Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu1 5 10 15Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly20 25 30Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala35 40 45Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val50 55 60Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly65 70 75 80Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu85 90 95Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu100 105 110Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys115 120 125Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp130 135 140Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly145 150 155 160Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn180 185 190Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu195 200 205Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu210 215 220Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys225 230 235 240Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val245 250 255Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe260 265 270Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu275 280 285Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly290 295 300Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp305 310 315 320Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro325 330 335Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro355 360 365Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn370 375 380Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu385 390 395 400Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu405 410 415Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu420 425 430Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly435 440 445Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala450 455 460Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His465 470 475 480Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp485 490 495Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg500 505 510Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr530 535 540Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu545 550 555 560His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser565 570 575Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln580 585 590Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala595 600 605Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly610 615 620Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr625 630 635 640Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro645 650 655Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly660 665 670Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu675 680 685Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val705 710 715 720Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg725 730 735Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Ash Met Pro740 745 750Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu755 760 765Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His770 775 780Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala785 790 795 800Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro805 810 815Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu820 825 830<210>8<211>53<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Flu T-14寡核苷酸；用于篩選熱穩(wěn)定的DNA聚合酶突變體的DNA模板；位置14上的T帶有熒光素標(biāo)記
<220>
<221>misc_特征<222>(14)..(14)<223>帶有熒光素標(biāo)記的<400>8tcgattcggt acgtccgcgc gatcggcgca tatagcgccg atcgcggacg tac5權(quán)利要求
1.一種具有DNA聚合酶活性的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列另外具有一個(gè)N末端甲硫氨酸殘基。
3.一種編碼權(quán)利要求1和2中任意一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列是SEQ IDNO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
5.一種重組DNA載體，其包含權(quán)利要求3和4中任意一項(xiàng)的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組DNA載體，其特征在于該DNA序列編碼一種融合多肽，其由以下物質(zhì)組成(i)一個(gè)末端組氨酸標(biāo)記，(ii)一個(gè)與組氨酸標(biāo)記相鄰的提供因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)的氨基酸序列，和(iii)權(quán)利要求1的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組DNA載體，其特征在于該DNA序列編碼一種具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列的融合多肽。
8.一種生產(chǎn)具有DNA聚合酶活性的多肽的方法，包含下列步驟(a)用權(quán)利要求5的重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，(b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞并在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)具有DNA聚合酶活性的多肽，(c)純化步驟(b)中表達(dá)的具有DNA聚合酶活性的多肽。
9.一種生產(chǎn)具有DNA聚合酶活性的多肽的方法，包含下列步驟(a)用權(quán)利要求6或7中任意一項(xiàng)的重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，(b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞并在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)一種由以下物質(zhì)組成的融合多肽(i)一個(gè)末端組氨酸標(biāo)記，(ii)一個(gè)與組氨酸標(biāo)記相鄰的提供因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)的氨基酸序列，和(iii)權(quán)利要求1的多肽，(c)純化步驟(b)中表達(dá)的融合多肽，(d)在具有因子X蛋白水解活性的蛋白酶存在下，通過孵育所述融合多肽的方式剪切該融合多肽，從而從因子X蛋白酶剪切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)記中分離具有DNA聚合酶活性的多肽，(e)純化步驟(d)中具有DNA聚合酶活性的多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于在步驟(c)中使用能結(jié)合組氨酸標(biāo)記的顆粒狀親和基質(zhì)純化該融合多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求9和10中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于在步驟(d)中將融合多肽的組氨酸標(biāo)記與顆粒狀親和基質(zhì)結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于顆粒狀親和基質(zhì)是一種涂有螯合金屬的樹脂的層析物質(zhì)，并且金屬離子被固定在所述的涂有樹脂的層析物質(zhì)上。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于該層析物質(zhì)上涂有鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)。
14.一種用權(quán)利要求5至7中任意一項(xiàng)所述的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。
15.一種在含有一種或多種非離子型聚合物去污劑的緩沖液中包含權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)的多肽的穩(wěn)定制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的穩(wěn)定制劑，其特征在于當(dāng)共價(jià)結(jié)合于所述多肽時(shí)，該多肽共價(jià)地結(jié)合到能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的化合物上。
17.根據(jù)權(quán)利要求1 6的穩(wěn)定制劑，其特征在于該化合物選自由以下物質(zhì)組成的組(a)檸檬酸酐，(b)順式烏頭酸酐，(c)2，3-二甲基馬來酸酐，(d)外-順-3，6-橋氧基-Δ4-四氫鄰苯二甲酸酐，和(e)3，4，5，6-四氫鄰苯二甲酸酐。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的穩(wěn)定制劑，其特征在于當(dāng)結(jié)合所述多肽時(shí)，該多肽與能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的抗體結(jié)合。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽、與一種化合物共價(jià)地偶聯(lián)的根據(jù)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽、與一種抗體結(jié)合的根據(jù)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽、或者一種根據(jù)權(quán)利要求15至18中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定制劑在生產(chǎn)引物延伸產(chǎn)物中的用途，其中當(dāng)該化合物共價(jià)地偶聯(lián)于所述的多肽時(shí)，它能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶的活性，當(dāng)該抗體與所述多肽結(jié)合時(shí)，它能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶的活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，用于測(cè)定核酸模板的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸。
22.一種試劑盒，用于生產(chǎn)包含權(quán)利要求15至18中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定制劑的引物延伸產(chǎn)物。
23.一種用于在樣品中擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，包括下列步驟(a)使所述的樣品與含有與所述的目標(biāo)核酸充分互補(bǔ)的引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物和選自由以下物質(zhì)組成的組的多肽接觸(i)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽，(ii)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽，它共價(jià)地結(jié)合到能可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的化合物上，和(iii)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽，它能與可逆地阻斷該多肽的DNA聚合酶活性的抗體結(jié)合，(b)任選地通過熱處理釋放被阻斷的DNA聚合酶活性，(c)將步驟(a)得到的所述的引物混合物退火到所述的目標(biāo)序列上，(d)在步驟(b)后通過孵育混合物來擴(kuò)增目標(biāo)核酸以允許形成引物延伸產(chǎn)物。
24.一種測(cè)定核酸序列的方法，包含下列步驟在至少一種鏈終止試劑和一種或更多種核苷酸三磷酸的存在下，用權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的多肽從要測(cè)序的核酸模板產(chǎn)生鏈終止的片斷，以及從所述片斷的大小確定所述核酸的序列。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)天然棲熱水生菌DNA聚合酶(TaqWT)缺失288個(gè)N末端氨基酸的片斷(TaqΔ288)，具有比TaqWT、TaqΔ279和TaqΔ289增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。因此本發(fā)明提供了TaqΔ288、編碼其的重組表達(dá)載體或其衍生物，以及TaqΔ288的純化方案。本發(fā)明也包含含有TaqΔ288的試劑盒，以及TaqΔ288和含有TaqΔ288試劑盒的用途。此外，本發(fā)明包括測(cè)定核酸模板序列的方法和擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1590543SQ20041007665
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者W·安肯鮑爾, T·邁爾, A·多伊費(fèi)爾, D·海恩德爾, G·貝茨爾, R·施穆克, B·施奈丁格, J·施特里 申請(qǐng)人:霍夫曼—拉羅奇有限公司