專利名稱：水稻雜種花粉育性基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及水稻雜種花粉育性基因的分 離克隆及其功能驗證，以及在水稻雜交育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物通過不同品種間的雜交產(chǎn)生雜種。雜種在生長勢、適應(yīng)性、 產(chǎn)量等方面具有優(yōu)勢，稱為雜種優(yōu)勢。利用雜種優(yōu)勢可以提高農(nóng)作物
的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。亞洲栽培稻的秈稻(Oy加^rira ssp. /mfea ) 和粳稻(a^"wzssp.y^x m'cfl)亞種間的雜種有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢，增 產(chǎn)潛力很大。另 一方面，通過栽培稻與野生稻雜交和回交等育種方法， 可以將存在于野生稻的一些有用性狀如抗病、抗蟲、高產(chǎn)等導(dǎo)入栽培 稻，培育出優(yōu)良新品種。但是，秈粳亞種間雜交以及栽培稻與野生稻 雜交產(chǎn)生的雜種存在育性低或不育的問題，稱為雜種不育(hybrid sterility)。所述的雜種不育是稻屬物種分化過程中產(chǎn)生的生殖隔離的 機(jī)制之一，屬于合子后生殖隔離(postzygotic isolation )。雜種不育現(xiàn) 象嚴(yán)重阻礙了水稻雜種優(yōu)勢和野生稻有用基因的利用。
在水稻中，有多個基因座(locus)與水稻雜種育性有關(guān)。所述的 基因座是細(xì)胞遺傳學(xué)水平的概念，是指染色體的一個特定區(qū)域，可能 包含1個或1個以上的相關(guān)基因控制同一性狀。這些雜種育性基因座 中，有些是導(dǎo)致雌配子不育，如S5，57, S&S9，W5，W7，有些是導(dǎo)致 雄配子(花粉)不育，如Sa，幼，&， 51《&， # Kinoshita 1995， Rice Genet. Newsl., 12:9-15; Ikehashi等1988, Japan J. Breed. 38:283-291; Ikehashi 等1996, Rice Genet III， pp404-408; Wang等1996, Theor Appl Genet 92:183-190; Wang等1998, Rice Genet Newsl 15:151-154;張桂權(quán)等 1989,中國水稻科學(xué)3: 97-101;張桂權(quán)等1993,遺傳學(xué)報20:222-228;張桂權(quán)等1993,遺傳學(xué)報20: 541-551;張桂權(quán)等1994， 遺傳學(xué)報21: 34-41)。這些基因座在不同品種或品系或野生稻材料 中可以有不同程度的變異分化，產(chǎn)生多種復(fù)等位基因座。根據(jù)攜帶這 些復(fù)等位基因座的水稻亞種類型以及對雜種育性的效應(yīng)，它們被劃分 為秈型(y)、粳型(50、親和型(y)、或其它過渡類型。所述的基 因符號S代表雜種育性基因座，S5， &等指特定的雜種不育基因座， ''，、"分別代表秈型(,V2A'cfl)、粳型O'apo"/ca)、和中性型("eutral) 的復(fù)等位基因座，如5W、或S""。中性型也稱為親和型
(compatibility)或廣親和型(wide compatibility )。
在水稻雜種中，分化程度較大的雜種育性基因座在雜合狀態(tài)下 往往發(fā)生不親和互作，導(dǎo)致攜帶某一等位基因座的雄配子(或雌配子) 發(fā)育不正常。這種現(xiàn)象也稱為雜種的等位基因特異殺配子
(allele-specific gamete elimination)效應(yīng)。但是，這些基因座在纟電合
狀態(tài)下(如純合的親本)不影響配子的正常發(fā)育。大部分雜種不育基 因座的遺傳行為符合"單座位孢子體_配子體互作"的模式(Oka, 1974, Genetics 77, 521-534)。例如，用分別攜帶A/ASW^ 6"a'AStf'基因 型的水稻粳稻和近等基因系雜交，產(chǎn)生的雜種一代(F0的基因型為 Sa'ASA其產(chǎn)生的雄配子中，攜帶&''等位基因座的正?？捎鴶y 帶5^'等位基因的雄配子發(fā)育異常(不育)。因此表現(xiàn)為約50%的花 粉不育即半不育。但雌配子的育性不受&'AS乂雜合基因座的影響。結(jié) 果導(dǎo)致雜種二代(F2)代群體中攜帶基因型的植株的比例嚴(yán)重 偏少，即嚴(yán)重偏離Sa'/6tf : 5tfASW': ^/fe^l: 2: 1的孟德爾分離 規(guī)律。但是，用攜帶親和型等位基因座^fASfl"的親本與攜帶 或WW等位基因的水稻親本雜交(F！的基因型為或 F2代群體中3種基因型的分離符合l: 2: 1的分離規(guī)律，即該雜合的 等位基因不產(chǎn)生等位基因特異殺配子效應(yīng)，對秈型和粳型等位基 因座都是親和的。因此，用攜帶親和等位基因座的親本與粳稻或秈稻雜交，可以提高雜種的育性。
目前已報道了 一些水稻雜種育性基因的染色體定位，但雜種花粉 不育或親和(可育)的分子基礎(chǔ)還不清楚。S"是控制水稻雜種花粉 育性的基因座之一，它已被初步定位于第1染色體(莊楚雄等1994,
遺傳學(xué)報21: 34-37)。為了在雜交水稻育種中有效地克服雜種不育 性問題，本發(fā)明通過圖位克隆(map-based cloning)技術(shù)在& 座獲得 了的2個相鄰的雜種育性相關(guān)基因，包括它們的秈型和粳型等位基 因，以及產(chǎn)生親和性的等位基因組合。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒烌炞C了這些基 因的功能，并提出通過基因工程技術(shù)或雜交-回交育種培育雜種育性 親和系的方法。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 所要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明的第一個目的是分離克隆水稻雜種花粉育性基因的DNA片段。
本發(fā)明的第二個目的是提供上述雜種花粉育性基因所編碼的蛋 白質(zhì)。
本發(fā)明的第三個目的是提供上述雜種育性基因在培育雜種育性 親和系中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供上述雜種育性基因產(chǎn)生的分子標(biāo)記 或其緊密連鎖標(biāo)記及其在水稻雜交育種中的應(yīng)用。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用包含雜種育性基因座Sa有關(guān)的基因，該 基因控制水稻品種(系)間或水稻與野生稻間雜交產(chǎn)生的雜種的花粉 育性。
本發(fā)明利用圖位克隆法克隆了 &基因座有關(guān)基因并驗證了其功 能，其技術(shù)方案如下
1、 ^基因座的精細(xì)定位和目標(biāo)基因的發(fā)現(xiàn)&基因座已被定位于水稻第1染色體上的大致區(qū)域(莊楚雄等
1994，遺傳學(xué)報21: 34-37)。根據(jù)公開的水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫的 資料(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，在該區(qū)域發(fā)展了多個分子標(biāo)記。 用粳稻臺中65 (代號T65，攜帶&V5^'基因型)和它的近等基因系E4 (攜帶秈型基因型&'/& )雜交，產(chǎn)生Fi和F2群體，經(jīng)過連鎖分析， 把&精細(xì)定位在一個10.6kb的區(qū)間。
根據(jù)水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)的資 料，在定位的10.6 kb區(qū)間內(nèi)有2個相鄰的基因，本發(fā)明將它們分別 命名為&M和&尺遺傳分析表明，在F2重組體中，只有含有雜合 的5Wlf以及同時有來源于E4的等位基因，即同時含有這3種等 位基因的個體才能產(chǎn)生雜種花粉半不育。表明&座位由SoM和 組成，這2個基因的遺傳互作是&座位產(chǎn)生雜種不育的原因。進(jìn)一 步用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)證實這2個基因的特定等位基因編碼的蛋白之 間發(fā)生相互作用。
2、 ^M和5V^等位基因的序列測定比較分析
用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從多個秈型、粳型、和親和型水 稻品種(系)擴(kuò)增出5^M和5WF等位基因片段并測定其序列。秈型 feM和5"aF等位基因被命名為&^和5""Z，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:5所示，它們分別編碼具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸多肽序列。粳型的和&f等位基因 被命名為feM和其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO:7所示，它們分別編碼具有SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 8所示 的氨基酸多肽序列。5""AT和SflM編碼新的蛋白SaM+和SaM-,其C 端與酵母的Mms21蛋白即類泛素E3連接酶(small ubiquitin-like modifier E3 ligase )有部分同源。與SaM+相比，SaM—的C端截斷了 40個氨基酸。Sa纊和SoP編碼功能未知的F-box蛋白，它們之間存 在l個氨基酸差異，即在287位處SaF+是苯丙氨酸氨，SaF變?yōu)榻z氨酸。親和型品種含有5"aMV^aMV/SaFASaF基因型。這些不同的基因 型品種間的雜種含有不同組合的雜合基因型，產(chǎn)生雄配子不親和效應(yīng) 即花粉半不育，或親和效應(yīng)即花粉全可育。 3、 5^M和&F等位基因的功能驗證
用PCR技術(shù)從E4擴(kuò)增&7/和fei^，以及從T65擴(kuò)增SaM, 它們包括啟動子區(qū)、編碼區(qū)、以及下游序列，構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化表達(dá)載體。 將^M轉(zhuǎn)化含有基因型為SaiW7&7k/7/S"a/^ASai^的E4，獲得的T0代 轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為花粉半不育；將S"W轉(zhuǎn)化含有基因型為 5WW76^W7/S"7^AS"F的花粉全可育重組體，獲得的T。代轉(zhuǎn)化體表現(xiàn) 為花粉全不育；將5^,轉(zhuǎn)化含有基因型為Sa^W7& iW7/SbFASaF的花 粉全可育重組體，獲得的T。代轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為花粉半不育。另外，在 粳稻中導(dǎo)入產(chǎn)生RNA干擾(RNA interference, RNAi)反應(yīng)的5"aM或 &尸的序列結(jié)構(gòu)，再與E4雜交。產(chǎn)生的雜種F,的SaM或feF的表 達(dá)受到抑制，結(jié)果其花粉育性得到恢復(fù)。這些結(jié)果證明了各個等位基 因的生物學(xué)功能，說明只有當(dāng)Sa7kT、 6bM以及&LF^這3個等位基因 都具備時才使含有S"M的花粉產(chǎn)生不育；植株中缺少其中的任何一 個等位基因，或抑制任何一個基因的表達(dá)，可以恢復(fù)雜種的花粉育性。
應(yīng)當(dāng)理解，在不影響S"M以及&^蛋白活性的前提下，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可對SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6以及SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個或幾 個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。
此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨 基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響SflM或5WF表達(dá)的條 件下，對編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對 編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個或多個核 苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包
括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述 核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。 (三)有益效果
本發(fā)明提供的雜種育性基因具有重要的應(yīng)用價值。應(yīng)用之一是培 育雜種育性親和系。本發(fā)明提供通過基因工程技術(shù)如使用RNA干擾
技術(shù)或反義RNA技術(shù)或其它有效技術(shù)，控制feM或^F或它們二者 的表達(dá)，獲得能抑制所述基因表達(dá)的雜種育性親和系。還可以用獲得 的轉(zhuǎn)化植株為親本與其它水稻品種或品系雜交，培育出新的雜種育性 親和系。本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到轉(zhuǎn)化載體中，可以對所述基因或其 調(diào)控序列作適當(dāng)修飾，也可以用其它啟動子取代所述基因原有的啟動 子，使之達(dá)到同等的或強(qiáng)化的表達(dá)效果。
本發(fā)明提供的雜種育性基因的另一個應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列 信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態(tài))、 Indel (插入缺失多態(tài))、RFLP (限制性內(nèi)切酶長度多態(tài))、CAP (切 割擴(kuò)增片段多態(tài))。用這些標(biāo)記可鑒定栽培稻或野生稻或它們的雜交 后代群體植株的基因型，培育水稻雜種育性親和系。例如，可以用攜 帶親和型&基因座如其基因型為feil/ZSa^V/S^FASaF的栽培稻或野 生稻材料為供體親本，其它粳稻或秈稻品種(系)為輪回親本，進(jìn)行 雜交和回交，利用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的特異分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，培育出 新的雜種育性親和系。用本發(fā)明的方法獲得雜種育性親和系與其它粳 稻或秈稻或野生稻親本雜交，可產(chǎn)生育性正常的雜種，有利于新的品 種選育或生產(chǎn)雜交種。


圖1、顯示水稻5""基因的遺傳模式及其基因型對花粉育性的效 應(yīng)。(A)粳稻T65 (&"W)產(chǎn)生的正?？捎ǚ郏?B)近等基因系 E4(& 》a')產(chǎn)生的正?？捎ǚ郏?C )T65與E4雜交的雜種F,(5"a':SaO 產(chǎn)生半不育花粉，即約50%的花粉不育；(D-F) T65 x E4雜種的F2
8植株中，不同基因型植株的頻率及其花粉育性。各種基因型頻率是用
共分離標(biāo)記M76.3 (圖2,表1 )檢測666株F2植株所得。 圖2、顯示水稻5"a基因座在第1染色體的精細(xì)定位及5bM與 基因的發(fā)現(xiàn)。各標(biāo)記的數(shù)字同時表示在一個公開的細(xì)菌人工染色體 P0013G02上的位置(kb )。 ATG和TAG/TGA分別表示起始密碼和終 止密碼。
圖3、顯示秈型(E4)和粳型(T65)的SaM和SaF蛋白結(jié)構(gòu)及
其差異。
圖4、顯示功能互補(bǔ)實驗，轉(zhuǎn)基因?qū)雝SbM(A)、 tSfl7kT(B)、和
t&y(c)使受體水稻產(chǎn)生花粉半不育或全不育。轉(zhuǎn)化受體水稻的基因
型如圖所示。
圖5、顯示用細(xì)菌雙雜交檢測&7l^(M")、 5""AT(M)、 5"ai^C^)、 和&F(F)的互作。細(xì)菌生長表示有互作。pBT和pTRG為誘餌載體 和捕獲載體，分別用于表達(dá)SaM和SaF。
圖6、顯示用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測& M和5^F在親本幼穗的表達(dá)以 及它們在雜種Fi幼穗的表達(dá)受RNA干擾(RNAi)的抑制。(E4) 和(T65)的全長cDNA分別為1101 bp和1021 bp。
圖7、顯示RNA干擾抑制^M和SaF在雜種Fi的表達(dá)產(chǎn)生育性 恢復(fù)。
具體實施例方式
以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。若未特別指明，所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例l:多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選和S"的精細(xì)定位
已知^定位在水稻第1染色體上的大致區(qū)域(莊楚雄等1994，遺 傳學(xué)報21: 34-37)。本發(fā)明用如圖2所示的圖位克隆方法進(jìn)一步克 隆Sa基因。首先用粳稻品種臺中65 (簡稱T65，具有基因型&占《0 與其近等基因系E4(W&0雜交，建立了一個F2代分離群體。本發(fā)明所用的近等基因系E4，是除了 6""'等位基因座及其附近區(qū)域是來源
于秈稻外，其核基因組背景與T65相同的品系(莊楚雄等1994，遺傳 學(xué)報21: 34-37)。因此它們的雜種的雄性不育性的遺傳分離只受 雜合基因互作效應(yīng)的影響。用1% 12-KI溶液染色鑒定花粉的形態(tài)， 確定F2植株的花粉育性表型，即全可育或半不育(圖1)。
根據(jù)公開的水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫的資料 (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，在該區(qū)域發(fā)展了多個多態(tài)性分子標(biāo)記， 如表1所示。
表l.與^/緊密連鎖或共分離的多態(tài)性分子標(biāo)記
標(biāo)記名標(biāo)記類型引物名引物序列(5'.…3')
M63SSRG02-63ATGATGAGATGGCGCTGACAT
G02-63BGTTTCCCGTCGCCGTTTCT
M69Indel68861ATGTGCACTCGTCTCTCATCT
69002BGGTGGTGAAGAGAGGCTTG
M69.8SNP69421ACCGCTGTGTTCTCCTGCTCA
70891BATGGAGAGGAACTACTGACACA
69799B-iCCAAAATGCGCATTTT
69799B-JCCAAAATGCGCATTTC
M72Indel71928ACATTTCAAGGAGACGATAAAGT
72108BGCCAAAATTCTCTATGTATTACT
M73SSR72863ACGCAGAGGCTGGAGGATGTGCT
73050BCTTCCCCCAAAATGCTATCGT
M74.6SNP73791AGCAGTTATGTGGTTATGTCTGATT
74801BCCCTGATGAAGTCAATGGCA
74.6B-iTATGTGGCCACAAGTCATAC
74.6B-JTATGTGGCCACAAGTCATAA
M76.3Indel76.3AGTCATGCTGTTGTTGCCGTA
76.4BCACAAACTCAGATGTATCAATTA
M78.5Indel78431AGGTCGGATTATCACAAGGGA
78579BAGGTCCATCCCTCTCCTCT
M79.6SNP79.0AGTGCGTGGCCCTCCCGGA
79672BGGAGGAGCACCAGTTCCAGTT
79576B-4CACCACGTCCTTGAAA
79576B-5CACCACGTCCTTGAGC
表1中的SSR為微衛(wèi)星標(biāo)記；Indel為插入/缺失標(biāo)記；SNP為單
10核苷酸多態(tài)性標(biāo)記。基于PCR的一種SNP檢測方法為在20plPCR 反應(yīng)液中加入1 ^水稻DNA(約50ng)，用表1所示的引物"A"和"B" 擴(kuò)增33個循環(huán)(94。C 30s, 63°C lmin， 72°C lmin)。然后取0.5 pl PCR 產(chǎn)物為第2次PCR的模板，每個樣品配制2個PCR反應(yīng)(20 pl)， 即用引物"A"和"B-i"為E4基因型的特異反應(yīng)，用引物"A"和"B-j"為 T65基因型的特異反應(yīng)，擴(kuò)增8-IO個循環(huán)(94°C 30s， 58°C lmin， 72°C lmin)。用1 %瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。
利用遺傳作圖的方法和上述10000多株F2植株構(gòu)建了一個&基 因座的遺傳連鎖圖(圖2)。圖中所示的重組體將S"基因座確定在2 個標(biāo)記即M69和M79.6之間的10.6 kb區(qū)域內(nèi)。所述的定位區(qū)域位于 已公開的水稻細(xì)菌人工染色體P0013G02 (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov) 的約69-79.6 kb處。
實施例2: 5 座位相關(guān)基因的序列分析
根據(jù)GenBank公開的水稻(粳稻)基因組DNA序列和RiceGAAS 軟件(http:〃ricegaas.dna.affrc.go.jp)分析，在所述的定位區(qū)域內(nèi)只存在 2個預(yù)測的基因，分別命名為S"M和So尺遺傳分析表明，在不同的 F2重組體中，只有含有雜合的&M以及同時有1個或2個來源于E4 的等位基因即雜合或純合的E4 的個體才能產(chǎn)生雜種花 粉半不育(圖2)。表明5"a座位由SaF和SaM組成，這2個基因的3
個等位基因的遺傳互作產(chǎn)生雜種不育。
使用引物5，-TCTAAGGGATCCAGGCGCGGGTGAAGCAAACT AGAC-3，(下劃線為萬amHI)和5，-ATTTAAGAATTCGCCGTCTTA ACACACATTGGAAAA-3，(下劃線為五coRI)用PCR技術(shù)從T65、 E4、和多個秈型(廣路矮4、 93-11、明恢63等等)和粳型(日本睛、 中花11等等)水稻DNA擴(kuò)增出S"F基因片段。本PCR反應(yīng)使用高 保真LA-Taq酶(寶生物工程公司)，擴(kuò)增30個循環(huán)(94°C 30s, 62°C 1 min， 72°C 5 min )。
使用 引 物5，-TGGATAAGCTTAGTACTATACTTGATGGGGTGCAAGTAA-3' (下劃線為州"din)和5，-TGTTGAGCTCGGGCGTTGTTTCATC TTATTAAAAATAATG-3，(下劃線為5""cl)，用PCR技術(shù)從T65、 E4、 和多個秈型(廣路矮4、 93-11、明恢63等等)和粳型(曰本晴、中 花11等等)水稻DNA擴(kuò)增出feM基因片段。將獲得的基因片段連 接克隆到質(zhì)粒載體pUC18,并測定其序列。
E4及其它秈稻品種如廣路矮4、 93-11、明恢63的6bM和5kF 等位基因被命名為&^和&7^,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1、 SEQIDNO:5所示，它們分別編碼具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸多肽序列。T65及其它粳稻品種如曰本晴、中花11 的StxP和5"aM等位基因被命名為5bM和&F，其核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO: 3、 SEQ IDNO:7所示，它們分別編碼具有SEQ ID NO: 4、 SEQIDNO:8所示的氨基酸多肽序列。這些秈稻和粳稻品種可以 從中國的育種機(jī)構(gòu)(如中國水稻研究所種質(zhì)資源庫)或種子商品巿場 獲得。5^M編碼l個新的蛋白，其C端與酵母的Mms21蛋白即類泛 素E3連接酶有部分同源。與S^W"的基因組序列相比，SaM在第5 內(nèi)含子的3'剪切位點(diǎn)即分子標(biāo)記M74.6的位置存在1個單核苷酸的 變異即"G"改變?yōu)?T"。此變異導(dǎo)致SaM丟失了第6個外顯子(80 bp ) 以及移碼產(chǎn)生新的終止密碼，使其編碼的蛋白的C端截斷了 40個氨 基酸(圖2、圖3)。 &尸編碼1個功能未知的F-box蛋白，feF"和&F 之間存在由編碼區(qū)的860位即分子標(biāo)記M68.9的1個單核苷酸多態(tài)產(chǎn) 生的1個氨基酸差異，即在蛋白序列287位處SaF+是苯丙氨酸氨， SaF—變?yōu)榻z氨酸(圖2、圖3)。
實施例3:遺傳轉(zhuǎn)化鑒定目標(biāo)基因的功能
將實施例2所述的&W、 ^M、以及&F",它們包括啟動子區(qū)、 編碼區(qū)、以及下游序列，克隆到雙元轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300 (澳大 利亞CAMBIA公司)。獲得的載體轉(zhuǎn)基因分別命名為tSa71/、 t5aM、和tSa^。用電激法將這些載體導(dǎo)入土壤根癌農(nóng)桿菌(jgra^cfen'wm ^we/ac/my)菌株EHA105，以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Hiei等，Plant J. 6: 271-282 )轉(zhuǎn)化適合基因型的水稻。將tSbM轉(zhuǎn)化含有基因型為 ^71//SflMV/SoFV5Wi^的E4,獲得的4株T。代轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為花粉半 不育(圖4A)。將tS"7kT轉(zhuǎn)化由65與E4雜交產(chǎn)生的雜種后代中分離 出的含有基因型為&^/7^7^7/&7^/5^尸的花粉全可育重組體，獲得 的8株To代轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為花粉全不育即不育花粉率達(dá)到或接近100 % (圖4B)。這是因為這種轉(zhuǎn)化體有純合的5bTW75^M，其產(chǎn)生的全 部攜帶&zM的花粉不育。將& 礦轉(zhuǎn)化由65與E4雜交產(chǎn)生的雜種后 代中分離出的含有基因型為^TW7&M〃&FASaF的花粉全可育重組 體，獲得的4株T。代轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為花粉半不育(圖4C)。
本實施例驗證了各個等位基因的生物學(xué)功能，并證明Sa^、 SaM、以及^i^這3個等位基因具備時使含有S"M的花粉產(chǎn)生不育； 缺少其中的任何一個等位基因時不產(chǎn)生雜種不育。
實施例4: 5^Af和StfF的表達(dá)蛋白的互作
用引物對5，-TCAGAATTCGAACTCCCGACTCCTTCCTC-37 5, -TGACTCGAGTCAGTGGCAGTACTTTATGTC-3 ，,和5, -TCAGAAT TCGAACTCCCGACTCCTTCCTC-3 7 5 ，-TGACTCGAGCAAATACC AGGTCGTTTGACAC-3，，將&71^和5"aM的編碼區(qū)序列PCR擴(kuò)增； 用引物對 5，-CCACCGGGATCCCATGGAGGAGG TCATCG-3V 5'-AGAACACTCGAGAGG GAATAATCTAAAGGATCATC-3，將&r 和&F的編碼區(qū)序列PCR擴(kuò)增，克隆到細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)BacterioMatch two-hybrid system試劑盒(美國Stratagene公司)的載體，按照試劑盒 說明的實驗條件和步驟進(jìn)行了蛋白互作實驗。結(jié)果表明，SaF+和SaF 蛋白能夠與SaM—互作，但不能與SaM+互作(圖5),表明SaM+的C 端存在抑制該蛋白與SaF互作的氨基酸序列。
實施例5:抑制SflM和SflF的表達(dá)產(chǎn)生雜種親和性
13用引物對5'隱CCCTGCAAGCTTCGCCCGCCCCGGCCGTCC-3，/ 5 ， -TTGGAACGGATCCATTCCATGTACAGAATA-3'和5 ， -CCACCG GGATCCCATGGAGGAGGTCATCG-3 ，/ 5 ，-CCGAAGCTTGGGAATA ATCTAAAGGATCATC-3，分別擴(kuò)增^M和&尸的cDNA片段，按公 開的方法克隆到RNA干擾載體(胡旭霞、劉耀光2006，分子植物育 種4: 621-626 )。用電激法將這些載體導(dǎo)入土壤根癌農(nóng)桿菌 (Jgra6acfeWwm fwwey^c/e似)菌株EHA105， 以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 (Hiei等,Plant J. 6: 271-282)轉(zhuǎn)化粳稻品種T65，獲得轉(zhuǎn)化體。 將轉(zhuǎn)化體與E4雜交，獲得雜種F,。利用引物對 5 ，-GTCCCTGCCCATTTCGCCCT-3 7
5 ， -GCCCAACGCTGACAGTGCTCA-3'和5 ， -CCGCTGTGTTCTCCTG CTCA-3V 5，-GGGGATAAGTGTCTTGAAGCTTA-3，，按照反轉(zhuǎn)錄酶 試劑盒Superscript III kit (美國Invitrogen公司)說明的條件分別對這 些雜種的SaM和6"(xF進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測。PCR反應(yīng)利用Ex Taq DNAPolymerase Kit (大連Takara公司)進(jìn)行28個循環(huán)(94°C 30s， 65°C lmin, 72°C 2min)。結(jié)果證實，SaM和的表達(dá)受到抑制(圖 6)。觀察這些雜種的花粉育性，表現(xiàn)為全可育(圖7)。因此，利用 本發(fā)明的方法，可以創(chuàng)建S"M或SaF的表達(dá)受抑制的水稻雜種親和 系，用于產(chǎn)生可育的雜種。
實施例6:利用&F和5ViM的分子標(biāo)記鑒定水稻的基因型
利用本發(fā)明提供的序列信息可以產(chǎn)生和等位基因特異 的分子標(biāo)記，用于鑒定水稻和野生稻^座位的基因型，可在分子標(biāo) 記輔助選擇育種過程中加以應(yīng)用。例如，本實施例利用表l所示的標(biāo) 記M68.9和M74.6，鑒定了多個粳稻和秈稻的基因型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所 有檢測的粳稻品種具有&^7&^〃^^/5("^基因型，大部分秈稻品種 有SaW/SaMV/Sai^ASfli^基因型，約 10 %的秈稻品種有 ^MVSaAiV/SaFASbF基因型(表2),這些品種均表現(xiàn)為花粉全可育。由于&^7&^7/&^/5^^基因型的秈稻品種與粳稻品種雜交的雜種 在該座位缺少等位基因^lF",因此不產(chǎn)生花粉不育性。它與
^MV^TkrV/s^FV^i^^因型的秈稻品種的雜種在該座位缺少等位基
因^^M,因此也不產(chǎn)生花粉不育性。因此該基因型為親和型等位基
因座，即sw。含有此等位基因的品種為&親和品種。用這些品種為 親和基因供體，與其品種雜交和回交，可培育新的雜種親和品種。
表2.用分子標(biāo)記M68.9和M74.6鑒定秈稻和粳稻品種的基因型
水稻亞種基因型品種(系)數(shù)
(9. s"riv" ssp, zWZca96
9
108序列表
<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>水稻雜種花粉育性基因及其應(yīng)用
<130>
<160> 8
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 5700
<212> DNA
<213>稻屬水稻品系E4
<220>
<221> CDS
<222> (1292)..(1556)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1641)..(1712)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2625)..(2720)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2814)..(2888)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2971)..(3084)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (3411)..(3夠
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (4639)..(4715)
<400> 1
gtggaggaag tcccaacaaa atttagagac agcataaaac agctgtaatt ccattcgagc 60 caatatatct tttttccttc ttcttccaga tgttaactgg ttactataga atttgttcaa 120 ttagatggaa aagac幼tct gatttagcga acaataatgt tgtggtcgta attaagcaca 180 tcagttttgg gctaccagaa ctggtgtcac ttggtaaggc ctttcgaata taagttattt 240 ttctcttttt tttaatcaac tattaagttg ttctggcaaa aatctttgta aattctaaac 300 aaggcttggt tacccaacat tttgatatgt gcttggtcca tctxcaatgc agcttgtaca 360
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gccctaactcccgactccttcctcgccgcgccgccatggcgccccctcggcccgcttcac1320
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犯3CgCtgCCt￡LCtg￡lg￡L3tggcaccaacact朋cattagttaggccatt2520
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gcctaataactgcagcctacttcactgattattttttttctttgattcagtatgacttgt3420
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ccggtcattggtgttcatttgtgaggat肌tttttcaaatgtgccatcac3540
aagtatacaactggatttgcacaatgttacttgaaatgcctcagggaala3600
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cacgccgcctgctgagccgcccacgtctctcccacacgcgtcctcgtgctgctacgttcg5640ccaccacata ttccgttgca ataaatcact cacatatttt gaaaaccctc tactaatcta 5700
<210> 2 <211> 257 <212〉 PRT
〈213〉稻屬水稻品系E4 <400> 2
Pro Pro Arg Pro
Met 1
Ala
Leu
Pro
Ser
65
Gin
Arg
Arg
Ala
Val 145 Leu
Asn
Ser
Cys
Ser 225 Asp
His
<210> 3 〈211〉 5640 <212> DNA
Ala
Thr
lie
Arg
50
Asp
Pro
Asp
Lys
lie 130 Lys
Gin
His
Gly
Gly 210 Leu
Leu
Arg Ser
20 Gly Glu 35
Pro Ala
Thr Val
His His
Val Ala 100 lie Val 115
Arg Ala
Pro His
Phe Lys
Glu lie 180 Thr Glu 195
His lie Lys Gly Val Phe
5
Arg
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Gly
Ala
Leu
85
Phe
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Pro
Leu
Ala 165 Ala
lie
Phe
Cys
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Gly
Arg
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Pro
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Gly
Gin
Val
Glu
Leu 150 Ala
lie
Ala
Asp
Pro 230 Asp
Ala
Arg
Arg
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Lys
Phe
Ala
Ala 135 Lys
Leu
Ser
Glu
Arg 215 Val
Ala
Ser
Pro
Ceu
40
Asp
Pro
Arg
lie
His 120 Phe
lie
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Leu
Leu 200 Gin
lie
Glu
Pro
Tyr
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Leu
Pro
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Lys 105 Asp
Lys
Asp
Arg
Asp 185 Thr
His
Gly
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Gin
10
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Arg
Asp
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Glu
90
lie
lie
Leu
His
Glu 170
Cys
Gin
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Cys
Arg 250
Ser
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Gin
Pro
75
Asp
Gly
Val
Val
Asp 155 Gin
Tyr
Pro
Met
Pro 235 His
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Trp
Ala
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Cys
Val
Arg
Val
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Gin
Thr
Leu
Asn 220 Gly
Asp
Pro
Thr
Ser
45
Asp
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Leu
Gin
Asn 125 Ala
Asn
Val
Asn
Arg 205 Tyr
Ala
lie
Pro
Leu
30
Ser
Ala
Ser
lie
Asp 110 Phe
Ala
Leu
His
Cys 190 Ser
Met
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Lys
Val
15
Lys
Ala
Arg
Gin
Ser
95
Glu
Cys
Glu
Leu
Asn 175 Pro
Met
Gly
Ser
Tyr 255
Ala
Glu
Pro
Ala
Glu
80
Leu
Val
Asn
Asn
Phe 160 Val
Leu
Thr
Ser
Asn 240 Cys
19<formula>formula see original document page 20</formula>tcgttgtaaagatggatgagggU卿gct卿ggttgattagtaagtactagtaatact1140
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ttggacttttaggtctttcaatgttggggggatggg,tactgtaatatttatcgtgaa3840
ac卿gfLgggagggggtagtataatgccgccattatttat3900
agaacttggtatgtataccattccattgctttgctttattcaaaaacaac3960
agctatgtgatggtggg.tgtctagcactgtsgtgggtctttttatctggtttgttca4020
3C犯tgtgCtgC3tggttgtggcaagtccaacaagtggcatgttgtgtgggtgagatcca4080
tgggtgstggtgtgagagtggtggc犯ggttgttgc已a(bǔ)gctatgtgctacctgattccat4140
ggtggtg獄tggtggggcatatgaccgacatgtcccttatgg已t犯ggta^cagcggt4200
agtctgactagtatgactggcagttcctgtggtt￡l￡ltggCtgagtatcca4260
gacgtgtgtaattcttttcaagaagtgactagcaaagccattttggttaattttgtgagt4320
gcaaccagtggtgctg卿gat犯cgctgatagtccttgacatatttttt4380
tat taaaaaa￡Ltattcta_gtaaggccattttgtgc犯aatcagttgcata4440
gttgcatttagccgatttctgatgttattttgtagtt33ggatggcsttt4500
gaaaatctctctttttttaatttgtgttgaggttgtotgaggttctaagt4560
cttctttaggUgtcctggtgctgtgtcaaacgacctggt4620
ggcacgacataaagtactgccactgacagagagtaagccaaatggtttca3tCC3gtt3C4680
tagctcggtsa_ctgga_tctt3tatgaaaagagactattgttttctttgta4740
tgC3gg組gtgC3卿ggtttggtttggttacaggtcgaacaggcttcaattctgcaac4800
gcgaggcaaacgtctgctgtgttttgtttctctgggcacctgtcatttacctttggctta4860
aacaaggcattcagcggttgatcgctgtgccatgcccttgcaaatattat4920
tctgtacatggttccaacacCtgC3朋tg3atgagcactgtC3gCgttgg4980
gcaagtggttccgatttcggctggtgtggattttaatccgtgcgtgcatc5040
ggcagatatcELtatgCCggtcatgctgttgttgccgtaacttctaattgt5100
tgctacttgctactccctcggttccataaggttccataat犯gttC3tttttttatctcc5160
ccgtctaccccaaaat犯gttcaaagttcatttttagtaattgatacatctgagtttgtg5220
gg,t卿tgtattgtgataaat已a(bǔ)已gtggcattgggat5280
ttaatagagttaatccgttttatgttatattggteitacgtgg組ggatg5340
ttattttgagacggacgatggaggtaataattcca_gcga_tcgagctggat5400
gaagctgtcacaactgtatcaccaaggttcgttacgttcatElggg卿EiC5460
gccagccaccgggcgcccgatgcggcgcgcatgcatccgacgctgctgccgtcggggtcc5520
accacgccgcctgctgagccgcccacgtctctcccacacgcgccctcgtgctactatgtt5580
tCCC3CC3C3tattccgttgcccacatatttctactaatc5640
<210〉 4 <211> 257 〈212〉 PRT
<213〉 稻屬水稻品系T65 <400〉 4
Met Ala Pro Pro Arg Pro Ala Ser Pro Gin Ser Leu Pro Pro Val Ala
15 10 15
Ala Thr Arg Ser Arg Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Trp Thr Leu Lys Glu
20 25 30
Leu lie Gly Glu Val Arg Arg Leu Arg Arg Ala Ala Ser Ser Ala Pro 35 40 45
22Pro Arg Pro Ala Gly Val Leu Asp Leu Asp Gin Gly Asp Ala Arg Ala
50 55 60
Ser Asp Thr Val Ala Pro Ser Pro Pro Ser Pro Cys Glu Ser Gin Glu 65 70 75 80
Gin Pro His His Leu Gly Lys Arg Leu Glu Asp Val Leu lie Ser Leu
85 90 95
Arg Asp Val Ala Phe Gin Phe lie Lys lie Gly Arg Gin Asp Glu Val
100 105 110
Arg Lys lie Val Asn Val Ala His Asp lie Val Val Asn Phe Cys Asn
115 120 125
Ala lie Arg Ala Pro Glu Ala Phe Lys Leu Val Ala Ala Ala Glu Asn
130 135 140
Val Lys Pro His Leu Leu Lys lie Asp His Asp Asp Asn Leu Leu Phe 145 150 155 160
Leu Gin Phe Lys Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gin Gin Val His Asn Val
165 170 175
Asn His Glu lie Ala lie Ser Leu Asp Lys Tyr Thr Asn Cys Pro Leu
180 185 190
Ser Gly Thr Glu lie Ala Glu Leu Thr Gin Pro Leu Arg Arg Leu Ser
195 200 205
Trp Cys Cys Val Lys Arg Pro Gly lie 210 215
<210> 5 〈211〉 3540 <212> DNA
<213>稻屬水稻品系E4 <220>
〈221〉 CDS
〈222〉 (1178). . (2092)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2182), . (2325)
<223>
<220>
<221> CDS
<222〉 (2542).. (2913)
〈223〉
〈400〉 5
aggcgcgggt gaagcaaact agaccttttt tctgggccaa aaagggccca agctgaggag 60 aggattttta ttacttttcc aattaaccaa tgaaatgaac tacttccaat gctcacataa 120 tttcatgaaa aaaatcctga aaatacttgg acactta犯g tatttaacaa aattaaaatc 180 agatcattta atgattaatt tattatttaa atattattaa aatgttcttt tattattaaa 240
23gagctctgaaaaaattccactaattatgga300
gagtttaataaaaat taaa tccaaccatgctttatatttagaaaattttatttcccacat360
ttaacttcacttgtaaattaataaatgtttaatataaattctaagaataa420
aatt tataaatcctgaaacg肌aatcatgatgtg8C^tggtttctgccagtgctcctag480
ctcccgcagatacccccgtgcccctggccattgcacctcactcggtggctcggtgccctt540
gacgacatcgacaagatggagacaaatcggactccctccg600
tccaataatatagtagcctagtaccggacgtagtaccacg犯tccg犯ca660
tgcttactgtccagattcgttgtactatgaagtgtc已catccggtcctaggttgctatat720
t3tgggatggagggagtactcgctaacatgtaggtcccatggatgtttctttagctcttt780
ctatataacagccacatatatgctatgttagt3C3ggtggaccaaatcagcgtgcc犯gc840
tgcccttaaagagtcattttgtgttgtttt900
ggggtcgacataccctagttttagggtcgaggg聊tg肌ta卿ttgggccactagctg960
agggactcagattggactttctttcccctattttcacagttggttttgtgctgggcccaa1020
犯taaggagggcctctcagtcgcccac肌cctcagaccaa朋ggcttgtgcactcgtctc1080
tcatctcgtcctcctcgtgctcctccgccaaB3ccccg3cgccgcc肌eiaCCCC犯tCCEl1140
atcgggctccgactccgactccgaccaccgcgccggcatggaggcggtcatcgcggagtg1200
ccgccccaagcctctcttcaccax:cgggcccttcctctccgccgtcggcggcggcggcgg1260
cggcgtcgaccgcatxtccgggctccccgacgacctcctctttgtcatcctctccaagct1320
ccccgtcagggatgccgtggcgacgtxcgccctctccccccgctgg犯gagcctctggtc1380
cagcgtcccgctccgcctcgacgscgccggcctcctccaccgccgcgacggcacgcgcct1440
cggccgggaaggcgtcgccgccaccgtctccgccgtcctcgccgcccaccCELggCCCCgt1500
gcccgcggcctccgttgggtgctgcctctcctccgacgaccagggctacc,tgggagg1560
ctggctccgagccctcgccgcc犯gggcgttcggcaactgtgcctgatgggcgcgccatg1620
gtcgccgcgcgctgctctcccctccgctgtgttctcctgctcatccctgcggcgcctctt1680
ccttggttccgtgc犯tgcasctgggacctcataccagaccatgcctgcttccctgagct1740
cagatatgcaacgccctaatgatctgtcccttgttttggc1800
tgtctgcccagcgcttg聊cagtggagattcttgcgagctccccaccgt1860
gcg肌tgagtagccatactatccgcaatactttgctatgg犯gtcggtggccaagg犯gt1920
gaacgttttggacaccccttgcctcagcagggttgttttgtggcaggstcttctgctgcc1980
tataattctaeiggtcaca^tcagccgtgccaccaa肌tgcgcattttcgg2040
ttacctggacaccggcatcaacactttggtgatc肌cgaaaccacagttaaggtatttgt2100
ccctttgttggatactatatatctctaatcatatcgaatctgtgaaactgtgttaacgcg2160
ttttaatcgttgaatttgaaggtaaacacaaatataagcttcaagacacttatccccagc2220
tgggtctctctgttcatttcggagtacga已gatgtccatc2280
agcttccttaggtgttttcc卿ggttgagacsic tacatataactgtgagatttctttcc2340
ttctttcattcccgacatatatatacatatgtgagattgcg卿tagctgtctttctt2400
ctttcattcctgacatatgcatxattttacacactcactgcagccattctttcattcccg2460
cattttacacactcactgcagccatatgttcctttgatagctggaggtga2520
tcaatttttcttcttgtgcag3C33ggCttc兆fiagccgaaca^ttcagt2580
ttctgggg犯tgttgagtgtgtgacctctcatctcaagaagttagtgttc2640
catgggatgccatggtgtcctggaaaccttgagtttctcaaattcatcgtggaaggggca2700
tacttgctaggattgttcttcttacactagcatgcatagc2760
gttatcaccaaactcaagttagcacctttgacctctgcaagttgggct兆tcacatctgt2820
ttgtccaatccagtcaaggaactttgagctaccaaagggcatctgatcat2880tccgtcgatgatcctttagattattccctgtaggctgttctatctgtttgttgtgattat2940
aacatattgtcgatatggttatcctttaggtccttcatgtctgtatgccattttcatgtg3000
ttttggcttgttatctagagaaa肌tgtatggtttgUggatatgcttagtactatactt3060
g"ggggtgcaagt犯tagaatgcagagcatctgatgtgtcagtagttcctctccattac3120
ttcttgtggcaagacagcaagatactctactctcgattttgttgcctctgcttctgtttc3180
ttgtggsttaattcatcatgcgtcatattgggcggcatcggtctctcatgtctgagaatt3240
gtagt肌gagcaggtacaatagcaggctataagccagctgc a aa t a t a 11ttaaggagat3300
咖tgaggag卿ga卿gcagatttgtagccagctgtagtacagactcc3360
c郷tgtgactfigtgtagta>tgtaactatt3420
gccattagattgaattggagtt3gt3gttggctatactat3480
ta犯cttgcggtggagg犯gt c c c aac aaa3540
<210> 6 <211> 476 <212> PRT
〈213〉稻屬水稻品系E4 <400〉 6
Met Glu Ala Val lie 1 5 Gly Pro Phe Leu Ser
lie Ser Gly 35
Pro Val Arg 50
Ser Leu Trp 65
His Arg Arg
Val Ser Ala
Val Gly Cys 115
Trp Leu Arg
130 Gly Ala Pro 145
Cys Ser Ser
Asp Leu lie
lie Cys Asn 195
Val Cys Pro
Leu 20 Leu
Asp
Ser
Asp
Val 100 Cys
Ala
Trp
Leu
Pro 180 Ala
Ala
Pro
Ala
Ser
Gly
85
Leu
Leu
Leu
Ser
Arg 165 Asp
Leu
Leu
Ala
Ala
Asp
Val
Val
70
Thr
Ala
Ser
Ala
Pro 150 Arg
His
Met
Glu
Glu
Val
Asp
Ala
55
Pro
Arg
Ala
Ser
Ala 135 Arg
Leu
Ala
Lys
Thr
Cys
Gly
!Leu
40
Thr
Leu
Leu
His
Asp 120 Lys
Ala
Phe
Cys
Ser 200 Val
Arg
Gly
25
Leu
Ser
Arg
Gly
Pro 105 Asp
Gly
Ala
Leu
Phe 185 Gin
Glu
Pro
10
Gly
Phe
Ala
Leu
Arg
90
Gly
Gin
Val
Leu
Gly 170 Pro
Asp
lie
Lys
Gly
Val
Leu
Asp
75
Glu
Pro
Gly
Arg
Pro 155 Ser
Glu
Leu
Leu
Pro
Gly
lie
Ser
60
Asp
Gly
Val
Tyr
Gin 140 Ser
Val
Ceu
Ser
Ala
Leu
Gly
Leu
45
Pro
Ala
Val
Pro
Gin 125 Leu
Ala
Gin
Arg
Leu 205 Ser
Phe Thr 15
Val Asp 30
Ser Lys
Arg Trp
Gly Leu
Ala Ala
95 Ala Ala 110
Leu Gly
Cys Leu
Val Phe
Cys Asn 175 Glu lie 190
Val Leu Arg Asn
Thr
Arg
Leu
Cys
Leu
80
Thr
Ser
Gly
Met
Ser 160 Trp
Gin
Ala
Lyslie 225 Trp
Ser
Asn
Tyr
Lys 305 Val
Ser
Thr
Gly
Val 385 Phe
Pro
Leu
Glu
Asp 465
210 Pro
Lys
Arg
Ser
Leu 290 Val
Leu
lie
Ser
Lys 370 Phe
lie
Lys
Ala
Val 450 His
Thr
Ser
Val
Lys 275 Asp
Asn
Gly
Ser
Lys 355 Val
His
Val
Gly
Pro 435 Val
Ser
Val
Val
Val 260 Val
Thr
Thr
Leu
Phe 340 Thr
Asp
Gly
Glu
Thr 420 Leu
Gin
Val
Arg
Ala 245 Leu
Thr
Gly
Asn
Ser 325 Leu
Asp
Pro
Met
Gly 405 Tyr
Thr
Ser
Asp
Met 230 Lys
Trp
lie
lie
lie 310 Val
Arg
Lys
Val
Pro 390 Ala
Thr
Ser
Ser
Asp 470
215 Ser
Glu
Gin
Ser
Asn 295 Ser
His
Cys
Ala
Glu 375 Trp
Tyr
Ser
Ala
Gin 455 Pro
Ser
Val
Asp
Arg 280 Thr
Phe
Phe
Phe
Ser 360 Cys
Cys
Leu
Met
Ser 440 Gly
Leu
His
Asn
Leu 265 Ala
leu
Lys
Gly
Pro 345 Glu
Val
Pro
Leu
His 425 Trp
Thr
Asp
Thr
Val 250 Leu
Thr
Val
Thr
Val 330 Glu
Ala
Thr
Gly
Glu 410 Ser
Ala
Leu
Tyr
lie 235 Leu
Leu
Lys
lie
Leu 315 Arg
Val
Glu
Ser
Asn 395 Lys
Val
Ser
Ser
Ser 475
220 Arg
Asp
Pro
Met
Asn 300 lie
Lys
Glu
Gin
His 380 Leu
Val
lie
His
Tyr 460 Leu
Asn
Thr
His
Arg 285 Glu
Pro
Glu
Thr
Phe 365 Leu
Glu
Leu
Thr
lie 445 Gin
Thr
Pro
Ser 270 lie
Thr
Ser
Ala
Leu 350 Ser
Lys
Phe
lie
Lys 430 Cys
Leu Leu 240 Cys Leu 255
Arg Tyr
Phe Gly
Thr Val
Val Lys 320 Leu Met 335
His lie
Phe Trp
Lys Leu
Leu Lys 400 Val Leu 415
Leu Lys
Lys Met Arg Ala Ser
〈210〉 7
<211〉 3540
<212> DNA
<213> 稻屬水稻品系T65 〈220〉
<221> CDS
〈222〉 (1161). . (2075)
<223>
<220〉
<221> CDS
26<222〉 (2162).. (2305)
〈223〉
<220>
<221> CDS
<222〉 (2522). . (2993)
<223〉
〈400〉 7
哪cgcgggtg犯gc犯actagaccttttttctgggcc犯aaagggcccaagctgaggag60
3ggalttttattacttttcctacttccaatgctcacataa120
aa肌tcctgaaaatacttggacacttaaagtatt taacaaat taaaatca180
atgttctttt240
￡tgCtCtgM￡laaattccacagagtal犯tt300
agtttaataaaaat taaat ccaaccatactttatatttagaaaat111atttcccacatt360
taacttcacttgtaaattaataaat at 11aatataaattcttattaaata420
at ttataaatcctgaaacgagtgac組ggtttctgcc兆tgctcctagc480
tcccgc肌tacccccgtgcccctggccattgcacatcactcggtggctcggtgccattga540
cgacatcggccaaatcggtttaagagtagtactccctccg600
tccaataatatagtagcctagtaccggacgagacacttcata_gta_caacgaatctggaca660
gt犯gcctgtccagattcgttgt3cta_tgaiagtgtcatatccggtcctaagttgctatat720
tatgggatggcgctaacatataggtcccatggatgtttctttagctcttt780
ctatataacagccaca/tatatgctatgttagtacaggtggaccaaatcagcgtgccaagc840
ceitcgaaaactgcccttaaaaccacagagggagtcattttgtgttgtmaatagttaga900
ggggtcgatataccctagttttagggtcgaggg,tg犯taagattgggccactagctg960
attggactttctttcccctattttcacagttggttttgtgctgggcccaa1020
組aaggagggcctctcagtCgCCC3C肌Cctcagaccaa肌ggcttgtgcactcgtctc1080
tcatctcgtcctcctcgtgctcctccgccaccaatcgggctccgactccg1140
actccgaccaccgcgccggc3tgg郷Cggtcatcgcggagtgccgccccaagcctctct1200
tcaccaccgggcccttcctctccgccgtcggcggcggcggcggcggcgtcgaccgcatct1260
ccgggctccccgacgacctcctctttgtcatcctctccaagctccccgtcagggatgccg1320
tggcgacgtccgccctctccccccgctggaagagcctctggtccagcgtcccgctccgcc1380
tcgacgacgccggcctcctccaccgccgcgacggcacgcgcctcggccggg已娜cgtcg1440
ccgccaccgtctccgccgtcctcgccgcccacccaggccccgtgcccgcggcctccgttg1500
ggtgctgcctctcctccgacgaccagggctacc兆ctgggaggctggctccgagccctcg1560
ccgcc卿ggcgttxggcaactgtgcctgatgggcgcgccatggtcgccgcgcgctgctc1620
tcccctccgctgtgttctcctgctcatccctgcggcgcctcttccttggttccgtgcaat1680
gcaactgggacctcataccagaccatgcctgcttccctgagctacg卿gatccagatat1740
gcaacgccctaatgaagagccaggatctgtcccttgttttggctgtctgcccagcgcttg1800
tggagattcttgcgagccgtaaca犯atcccc3ccgtgcg組gagtagccata1860
ctatccgcaatactttgctatgg犯gtcggtggCC犯ggdagtgaacgttttggacaccc1920
cttgcctcagc郷gttgttttgtggcaggatcttctgctgccccactcaagatataatt1980
ctaaggtcacaatcagccgtgccacc肌犯tgcgcatttccggttacctggacaccggca2040
tcaacactttggtgatc肌cgaaaccacagttaaggtatttgtccctttgttggatatat2100
atctctaatcatatcg犯tctgtg肌actgtgtt犯cgcgttttaatcgttgaatttgaa2160
aatataagcttcaagacacttatccccagcgtg犯ggttttgggtctctc2220tgttcatttcgg兆tacg犯aggaggctttgatgtccatcagcttccttaggtgttttcc2280
,ggttgagacactacatat肌ctgtgagatttctttccttctttcattcccgacatat2340
atatacataa3tgtga_g￡ittgcg卿tagctgtctttcttctttcattcctgacatatgc2400
atcattttacacactcactgcagccattctttcattcccgacatatgcatcattttacac2460
actcactgcagccatatgttcctttgatagctggaggtgatcaatttttcttcttgtgca2520
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cagtx肌ggaactttgagctaccaaagggc3tCtg3tC已ttccgtcgatgatccttt￡Lga2880
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aaaaatgtatggtttgttggatatgcttagtactatacttgatggggtgcaagtaatoga3060
atgcagagcatxcgatgtgtcagtagttcctctccattacttcttgtggcaagacsgcaa3120
gatactctactctcgattttgttgcctctgcttctgtttcttgtggattaattcatcatg3180
cgtcatattgggcggcatcggtctctcatgtctgagaatt3240
3gcaggctataagccagctgc aaatatat tttaaggagat3300
agcgggctacagatttgtagccagctgtattacagactcc■gaCgC￡Lgtgtgtgtatga3360
caggtgtgaccaggtattaatgtaactattgtetgaatgagacattagat3420
tggctatagatg組tggagctagtagttggctatactattaaacttgcgagcaacagat3480
gtggagg,tcccaacaaaatttagagacagctgt33ttccattcgagc3540
<210〉 8 <211〉 476 <212> PRT
<213>稻屬水稻品系T65 <400> 8
Met Glu Ala Val lie Ala Glu Cys Arg Pro Lys Pro Leu Phe Thr Thr
15 10 15
Gly Pro Phe Leu Ser Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Arg
20 25 30
lie Ser Gly Leu Pro Asp Asp Leu Leu Phe Val lie Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Pro Val Arg Asp Ala Val Ala Thr Ser Ala Leu Ser Pro Arg Trp Lys
50 55 60
Ser Leu Trp Ser Ser Val Pro Leu Arg Leu Asp Asp Ala Gly Leu Leu 65 70 75 80
His Arg Arg Asp Gly Thr Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Ala Ala Thr
85 90 95
Val Ser Ala Val Leu Ala Ala His Pro Gly Pro Val Pro Ala Ala Ser
100 105 110
Val Gly Cys Cys Leu Ser Ser Asp Asp Gin Gly Tyr Gin Leu Gly Gly 115 120 125
28Trp Leu 130 Gly Ala 145
Cys Ser
Asp Leu
lie Cys
Val Cys 210 lie Pro 225
Trp Lys
Ser Arg
Asn Ser
Tyr Leu 290 Lys Val 305
Val Leu
Ser lie
Thr Ser
Gly Lys 370 Val Phe 385
Phe lie
Pro Lys
Leu Ala
Glu Val 450 Asp His 465
Arg
Pro
Ser
lie
Asn 195 Pro
Thr
Ser
Val
Lys 275 Asp
Asn
Gly
Ser
Lys 355 Val
His
Val
Gly
Pro 435 Val
Ser
Ala
Trp
Leu
Pro 180
Ala
Ala
Val
Val
Val 260 Val
Thr
Thr
Leu
Phe 340 Thr
Asp
Gly
Glu
Thr 420 Leu
Gin
Val
Leu
Ser
Arg 165 Asp
Leu
Leu
Arg
Ala 245 Leu
Thr
Gly
Asn
Ser 325 Leu
Asp
Pro
Met
Gly 405 Tyr
Thr
Ser
Asp
Ala
Pro 150 Arg
His
Met
Glu
Met 230 Lys
Trp
lie
lie
lie 310 Val
Arg
Lys
Val
Pro 390 Ala
Thr
Ser
Ser
Asp 470
Ala 135 Arg
Leu
Ala
Lys
Thr 215 Ser
Glu
Gin
Ser
Asn 295 Ser
His
Cys
Ala
Glu 375 Trp
Tyr
Ser
Ala
Gin 455 Pro
Lys
Ala
Phe
Cys
Ser 200 Val
Ser
Val
Asp
Arg 280 Thr
Phe
Phe
Phe
Ser 360 Cys
Cys
Leu
Met
Ser 440 Gly
Leu
Gly
Ala
Leu
Phe 185 Gin
Glu
His
Asn
Leu 265 Ala
Leu
Lys
Gly
Pro 345 Glu
Val
Pro
Leu
His 425 Trp
Thr
Asp
Val
Leu
Gly 170 Pro
Asp
lie
Thr
Val 250 Leu
Thr
Val
Thr
Val 330 Glu
Ala
Thr
Gly
Glu 410 Ser
Ala
Leu
Tyr
Arg
Pro 155 Ser
Glu
Leu
Leu
lie 235 Leu
Leu
Lys
lie
Leu 315 Arg
Val
Glu
Ser
Asn 395 Lys
Val
Ser
Ser
Ser 475
Gin 140 Ser
Val
Leu
Ser
Ala 220 Arg
Asp
Pro
Met
Asn 300 lie
Lys
Glu
Gin
His 380 Leu
Val
lie
His
Tyr 460 Leu
Leu
Ala
Gin
Arg
Leu 205 Ser
Asn
Thr
His
Arg 285 Glu
Pro
Glu
Thr
Phe 365 Leu
Glu
Leu
Thr
lie 445 Gin
Cys Leu Met Val Cys
Glu 190 Val
Arg
Thr
Pro
Ser 270 lie
Thr
Ser
Ala
Leu 350 Ser
Lys
Phe
lie
Lys 430 Cys
Arg
Phe Ser 160 Asn Trp 175
lie Gin
Leu Ala
Asn Lys
Leu L>eu 240 Cys Leu 255
Arg Tyr
Ser Gly
Thr Val
Val Lys 320 Leu Met 335
His lie
Phe Trp
Lys Leu
Leu Lys 400 Val Leu 415
Leu Lys Lys Met Ala Ser
29
權(quán)利要求
1、水稻雜種花粉育性基因的等位基因SaM+、SaM-、SaF+和SaF-，其編碼蛋白的序列為1)SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6或SEQ IDNO8或2)它們中替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1 或SEQIDNO:3或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7，或它們中替換、 缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且編碼權(quán)利要求1所述蛋白同等功 能的基因序列。
3、 含有權(quán)利要求1或2所述基因或其片段的表達(dá)載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其為含有權(quán)利要求1或2 所述基因或其片段的正義鏈或反義鏈或產(chǎn)生RNA干擾的核苷酸序列 的表達(dá)載體。
5、 由權(quán)利要求3或4所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6、 —種培育水稻雜種育性親和系的方法，其特征在于將權(quán)利 要求l或2所述基因或權(quán)利要求3或4所述載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基 因水稻雜種育性親和系；或用雜交-回交方法和分子標(biāo)記選擇培育含 有權(quán)利要求1或2所述基因的各種基因型組合的水稻雜種育性親和 系。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2的核苷酸序列產(chǎn)生的分子標(biāo)記。
8、 權(quán)利要求7所述分子標(biāo)記在水稻雜交育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻雜種花粉育性基因座Sa的2個命名為SaM和SaF的基因的分離克隆和應(yīng)用。細(xì)菌雙雜交實驗證明秈稻和粳稻的SaM和SaF的特定等位基因編碼的蛋白發(fā)生特異的相互作用。遺傳分析和轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)實驗表明，在雜種中雜合的SaM和來源于秈稻的SaF即3個等位基因的相互作用產(chǎn)生雜種花粉不育，缺少它們中的任何一個或抑制其表達(dá)時產(chǎn)生雜種親和性即花粉可育。本發(fā)明還涉及利用所述基因培育水稻雜種育性親和系的方法和應(yīng)用，以及鑒定水稻雜種育性基因型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
文檔編號C12N15/29GK101492682SQ20081013234
公開日2009年7月29日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者劉耀光, 莊楚雄, 牛白曉, 趙利鋒, 龍云銘 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)