水稻條紋病毒p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用水稻條紋病毒p3基因獲得抗白葉枯病水稻的應(yīng)用。本發(fā)明利用水稻條紋病毒p3基因構(gòu)建雙元表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)化水稻，獲得抗白葉枯病轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明p3基因在再生植物體內(nèi)表達(dá)，并證明再生植株對白葉枯病具有很強(qiáng)是抗性能力。目前的抗白葉枯病基因多數(shù)是水稻內(nèi)源基因，p3作為病毒蛋白能夠提高水稻對白葉枯病的抗性，豐富了抗白葉枯病基因資源，對培育高抗白葉枯病水稻具有重要的理論及實(shí)際意義。
【專利說明】水稻條紋病毒p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】及植物病害防治領(lǐng)域，尤其涉及水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)P3基因在植物抗白葉枯病中的應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻條紋病毒(TPice Stripe virus, RSV)是由灰飛虱傳播的一種重要水稻病毒，由該病毒導(dǎo)致的水稻條紋葉枯病在我國持續(xù)發(fā)生，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。近年來，我國科學(xué)家針對RSV的生物學(xué)和分子生物學(xué)研究開展了一系列細(xì)致而深入的工作:測定了病毒全基因組序列、鑒定了病毒沉默抑制蛋白、運(yùn)動蛋白、開展了水稻互作蛋白的分離篩選工作、建立了灰飛虱飼毒、檢測技術(shù)、綜合防治技術(shù)等工作，這些工作所取得的進(jìn)展加深了人們對于RSV致病機(jī)制的了解。RSV的p3基因編碼一個(gè)沉默抑制蛋白，通過與siRNA結(jié)合起到抑制RNA沉默的作用。
[0003]水稻白葉枯病(bacterial blight)由黃單胞桿菌水稻變種oryzaepv.引起，是一種世界性的重要稻病，在全球各稻區(qū)幾乎均有發(fā)生。在我國，白葉枯病同紋枯病、稻瘟病被列為水稻三大病害，對我國水稻生產(chǎn)危害極大，一直是影響我國水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一個(gè)嚴(yán)重性病害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在發(fā)病較重的年份和地區(qū)該病引起的水稻減產(chǎn)高達(dá)50%甚至絕收。
[0004]防治水稻白葉枯病的最經(jīng)濟(jì)有效的措施是選育和種植抗病品種。傳統(tǒng)的防治方法是通過不斷更換農(nóng)藥品種以及加大農(nóng)藥使用量來防治稻瘟病，這對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生壓力。利用植物基因工程可向現(xiàn)有栽培品種中導(dǎo)入外源基因而不受種屬限制，拓展可利用基因的來源，為作物抗病育種工作開辟了一條嶄新而有效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供水稻條紋病毒{Ricestripe virus, RSV)p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種抗白葉枯病的水稻的制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
水稻條紋病毒stripe virus, RSV)p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用。該基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示。該基因來源于水稻條紋病毒，通過GenBank序列比對設(shè)計(jì)引物從我們田間采集的水稻病株上序列擴(kuò)增而來。作為優(yōu)選，該基因用于制備抗白葉枯病水稻 。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，該方法采用包含水稻條紋病毒{Rice stripevirus, RSV)p3基因的宿主細(xì)胞對水稻成熟胚進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化獲得。作為優(yōu)選，所述的宿主細(xì)胞由包含水稻條紋病毒stripe virus, RSV)p3基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。作為再優(yōu)選，轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
[0008]作為優(yōu)選，所述的宿主細(xì)胞的制備方法包括以下的步驟:
(1)水稻條紋病毒P3基因的克隆及載體構(gòu)建
通過GenBank中的RSV p3序列分析,設(shè)計(jì)如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴(kuò)增得到水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，引物設(shè)計(jì)時(shí)已加入酶切位點(diǎn)，用于將p3基因重組到雙元表達(dá)載體PCV1300中；引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’ - G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’ ；
(2)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
取-70 °C保存的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，置冰上融解；取I μ I抽純pCV_P3_C質(zhì)粒加入到100 μ I感受態(tài)中，混勻，加入到處理好的電擊杯；設(shè)置2200V電壓，電擊轉(zhuǎn)化；點(diǎn)擊完成加入900 μ I的液體YEP培養(yǎng)基，28 V，200 rpm搖床培養(yǎng)1.5 h，菌液涂布在含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上，28 °C培養(yǎng)至形成單菌落。
[0009]作為優(yōu)選，所述的抗白葉枯病的水稻的制備方法包括以下的步驟:
1)菌液的準(zhǔn)備
取-70 °C保存的包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的陽性轉(zhuǎn)化菌株，于含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上劃線，28 °C培養(yǎng)至形成單菌落，挑取單菌落于含50 μ g/ml KanUOO ug/ml Rif的YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)24 h ;將菌液按1:100用YEP培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至0D600為0.6 ;
2)水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)
取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子；將種子放入100 ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒lmin，無菌水洗3_5遍，直到?jīng)]有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸鈉；溶液，浸泡30min ;倒去次氯酸鈉溶液,用無菌蒸懼水清洗種子4_5遍,最后一遍浸泡30min ;種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿9-12顆；操作完畢用封口膜；封好培養(yǎng)皿，在28°C光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織，置入繼代培養(yǎng)基中，在28°C光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)I周；
3)愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)
收集菌體，用含200 Mmol/L As的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液0D600的終濃度為
0.1 ;將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5min ;將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30-40min ;將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上；26°C暗培養(yǎng)2.5d ；
4)抗性愈傷的篩選與分化
將愈傷組織取出，用無菌水清洗I遍，再用含500 mg/L頭孢拉定或頭孢噻肟鈉的無菌水浸泡30 min,清洗3-5遍，置于無菌濾紙上浙干2h。隨后將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇，28°C，光照培養(yǎng)14d ;將長有抗性愈傷的初始愈傷進(jìn)行第二輪選擇，28°C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；挑取顏色鮮黃的顆粒類抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的塑料廣口瓶中，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗；
5)生根壯苗和移載
當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長至約2 cm時(shí)，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周；選擇高10 Cm、根系發(fā)達(dá)的小苗，洗去培養(yǎng)基，在溫室內(nèi)移栽入土。[0010]本發(fā)明通過設(shè)計(jì)引物克隆基因閱讀框全長，構(gòu)建表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化與分子技術(shù)檢測，獲取穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)p3基因植株。然后對轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯菌，進(jìn)行抗白葉枯分析，篩選抗病株系。本發(fā)明獲取的轉(zhuǎn)P3基因水稻，主要應(yīng)用于抗白葉枯菌水稻育種，避免真菌病害的為害。本發(fā)明對培育高抗白葉枯病水稻具有重要的理論及實(shí)際意義，對植物病害防治其他領(lǐng)域也有指導(dǎo)作用。與通過其他抗白葉枯菌策略獲得的抗性株系相比，本發(fā)明具體優(yōu)勢如下:
(I)目前的抗白葉枯病基因多數(shù)是水稻內(nèi)源基因，P3作為病毒蛋白能夠提高水稻對白葉枯病的抗性，豐富了抗白葉枯病基因資源。
[0011](2)正因?yàn)閜3基因不是水稻內(nèi)源抗性基因，所以它的抗性機(jī)制可能與其他抗性基因不同，有助于人們對水稻抗白葉枯菌機(jī)理和白葉枯菌致病機(jī)理的理解。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:含有p3基因的載體圖譜。
[0013]圖2:轉(zhuǎn)p3基因水稻的DNA PCR檢測。
[0014]圖3:轉(zhuǎn)p3基因水稻的Northern blot檢測。
[0015]圖4:轉(zhuǎn)p3基因水稻的抗白葉枯病鑒定顯示接種葉片枯斑面積。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明所轉(zhuǎn)水稻品種為日本晴。
[0017]1.重組農(nóng)桿菌的獲得
(1)P3克隆及載體構(gòu)建
本發(fā)明通過GenBank中的RSV p3序列分析,設(shè)計(jì)如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴(kuò)增得到P3基因序列，引物設(shè)計(jì)時(shí)已加入酶切位點(diǎn)，用于將p3基因重組到雙元表達(dá)載體PCV1300中。引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5，- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3，
(2)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
取-70 °C保存的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，置冰上融解。取I μ I抽純pCV_P3_C質(zhì)粒加入到100 μ I感受態(tài)中，混勻，加入到處理好的電擊杯。設(shè)置2200V電壓，電擊轉(zhuǎn)化。點(diǎn)擊完成加入900 μ I的液體培養(yǎng)基(YEP)。28 °C, 200 rpm搖床培養(yǎng)1.5 h，菌液涂布在含50μ g/ml卡那霉素(Kan)和100 μ g/ml利福平(Rif)平板上,28 °C培養(yǎng)至形成單菌落。
[0018](3)陽性克隆的鑒定與保存
挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50 μ g/ml KanUOO μ g/ml Rif的液體培養(yǎng)基中，28 °C, 200 rpm搖培16 h，取I μ I菌液進(jìn)行PCR檢測。檢測引物為Ρ3 (+)、Ρ3㈠。取檢測結(jié)果為陽性的菌液，混合15-30%甘油，置甘油管中，于_70°C超低溫冰箱中保存，備用。
[0019]PCR體系如下:__

2X TaqMasterMix 10 μ I

P3(+) (10umol/L) ~0.3μ I

P3(-) (10umol/L) |θ.3μ I
【權(quán)利要求】
1.水稻條紋病毒{Ricestripe virus, RSV)p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:該基因用于制備抗白葉枯病水稻。
3.一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于:該方法采用包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的宿主細(xì)胞對水稻成熟胚進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于:所述的宿主細(xì)胞由包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于:轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于:所用載體為 pCV1300-p3o
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于宿主細(xì)胞的制備方法包括以下的步驟: (1)水稻條紋病毒P3基因的克隆及載體構(gòu)建 通過GenBank中的RSV p3序列分析,設(shè)計(jì)如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴(kuò)增得到水稻條紋病毒(/Pice stripe virus, RSV)p3基因，引物設(shè)計(jì)時(shí)已加入酶切位點(diǎn)，用于將P3基因重組到雙元表達(dá)載體PCV1300中，稱為pCV1300-p3 ;引物序列如下:
P3 (+): 5’- T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’ ； (2)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 取-70 °C保存的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，置冰上融解；取I μ I抽純pCV_P3_C質(zhì)粒加入到100 μ I感受態(tài)中，混勻，加入到處理好的電擊杯；設(shè)置2200V電壓，電擊轉(zhuǎn)化；點(diǎn)擊完成加入900 μ I的液體YEP培養(yǎng)基，28 0C, 200 rpm搖床培養(yǎng)1.5 h，菌液涂布在含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上，28 °C培養(yǎng)至形成單菌落。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或5或7所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)菌液的準(zhǔn)備 取-70 °C保存的包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的陽性轉(zhuǎn)化菌株，于含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上劃線，28 °C培養(yǎng)至形成單菌落，挑取單菌落于含50 μ g/ml KanUOO ug/ml Rif的YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)24 h ;將菌液按1:100用YEP培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD_為0.6 ; 2)水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng) 取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子；將種子放入100 ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒lmin，無菌水洗3_5遍，直到?jīng)]有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸鈉；溶液，浸泡30min ;倒去次氯酸鈉溶液,用無菌蒸懼水清洗種子4_5遍,最后一遍浸泡30min ;種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿9-12顆；操作完畢用封口膜；封好培養(yǎng)皿，在28°C光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織，置入繼代培養(yǎng)基中，在28°C光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)I周； 3)愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)收集菌體，用含200 Mmol/L As的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD6c?的終濃度為0.1 ；將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5min ;將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30-40min ;將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上；26°C暗培養(yǎng)2.5d ； 4)抗性愈傷的篩選與分化 將愈傷組織取出，用無菌水清洗I遍，再用含500 mg/L頭孢拉定或頭孢噻肟鈉的無菌水浸泡30 min，清洗3-5遍，置于無菌濾紙上浙干2h ； 隨后將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇，28°C,光照培養(yǎng)14d ;將長有抗性愈傷的初始愈傷進(jìn)行第二輪選擇，28°C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；挑取顏色鮮黃的顆粒類抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的塑料廣口瓶中，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗； 5)生根壯苗和移載 當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長至約2 cm時(shí)，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周；選擇高10 cm、根系發(fā)達(dá)的小苗， 洗去培養(yǎng)基，在溫室內(nèi)移栽入土。
【文檔編號】A01H4/00GK103497956SQ201310470167
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】燕飛, 吳根土, 楊勇, 嚴(yán)成其, 陳劍平 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院