專利名稱：新的融合標(biāo)簽進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)基因快速篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及帶有融合標(biāo)簽的植物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體及使用其的植物轉(zhuǎn)基因的篩選方法等。
背景技術(shù)：
植物(尤其是水稻)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最為繁瑣的步驟是后期轉(zhuǎn)化子(株)的篩選。目前主要借助標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子，其中，標(biāo)記基因主要分為2類:選擇基因和報(bào)告基因。選擇基因主要包括抗生素抗性基因(如HPT基因，Gent基因等)和抗除草劑基因。然而，使用選擇基因作為標(biāo)記基因的篩選方法會(huì)有部分假陽(yáng)性植株，還需要進(jìn)一步提取植物基因組，借助PCR等方法檢測(cè)。常用的報(bào)告基因是β -葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene, gus)、gfp等。這些基因能夠進(jìn)行可視化篩選，但是主要問(wèn)題是它們較大，導(dǎo)致T-DNA轉(zhuǎn)化載體變大，轉(zhuǎn)化效率降低，而為了提高轉(zhuǎn)化效率不得不設(shè)計(jì)在不同啟動(dòng)子和/或終止子控制下的開放閱讀框(ORF)。更加困難的是，轉(zhuǎn)基因植物往往背景復(fù)雜，有可能導(dǎo)入過(guò)多次外源基因，由于植物轉(zhuǎn)基因常用啟動(dòng)子和終止子類型有限而且同源性較高，加之目的基因的同源性也較高，如果重復(fù)使用相同的啟動(dòng)子和終止子，可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)生遺傳重組，尤其是保留了標(biāo)簽而失去了目的基因的同源重組，給后期高成本篩選帶來(lái)了更大的難度，而要設(shè)計(jì)不同啟動(dòng)子和/或終止子控制，則更加 難以在實(shí)踐中操作。為此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而艱苦的研究，憑借一些運(yùn)氣，發(fā)明了新的融合標(biāo)簽，兼有選擇基因和報(bào)告基因的功能，既能對(duì)潮霉素具有抗性，又有可視化特性，在水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程的愈傷篩選和轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)階段都可以觀察，大幅提高篩選正確性；而且，該標(biāo)簽較小，且僅需要一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子控制，無(wú)需設(shè)計(jì)多個(gè)啟動(dòng)子和/或終止子。尤其是，本發(fā)明人還在啟動(dòng)子和終止子的選擇及序列作了新的優(yōu)化，不同于現(xiàn)有技術(shù)的，配合本發(fā)明的融合標(biāo)簽使用，構(gòu)建成的轉(zhuǎn)化載體不容易發(fā)生同源重組，不容易發(fā)生僅保留標(biāo)簽的同源重組，從而使得篩選本身穩(wěn)定，更能夠快速有效的篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，尤其是水稻植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供新的帶有融合標(biāo)簽的植物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體，其標(biāo)簽較小，從而便于在一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子下就能控制較大的目的基因的轉(zhuǎn)化，而且采用了可視化標(biāo)簽，更便于篩選，配合啟動(dòng)子和終止子，更能夠快速有效的篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。另外，本發(fā)明還提供了新的植物轉(zhuǎn)基因的篩選方法和植物轉(zhuǎn)基因的方法等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了帶有融合標(biāo)簽的植物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。該載體是環(huán)形載體，即首尾的核苷酸是相連的，連接成環(huán)形。
該載體的多克隆位點(diǎn)有Sac1、KpnI, SmaI, XmaI, Acc65I和BamHI等，足夠滿足作為植物轉(zhuǎn)化載體之用。這些多克隆載體涵蓋了常用且成本低的內(nèi)切酶，與常用的克隆載體的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)，為向植物轉(zhuǎn)化目的基因提供了便利。在第二方面，本發(fā)明提供了鑒定細(xì)菌體中帶有在本發(fā)明第一方面所述的載體的方法，其使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)直接擴(kuò)增細(xì)菌體，其中PCR引物對(duì)如下所示:tttccttcctcttttctacagt,和gtaatgcagaagaagaccatggo本發(fā)明第一方面所述的載體在菌體中克隆的過(guò)程中，尤其是成線形化的狀態(tài)時(shí)，會(huì)有自連的情況發(fā)生，為此需要進(jìn)行鑒定；但是，成為環(huán)形后就不會(huì)有自連情況發(fā)生。除了測(cè)序等高成本的方法，采用本發(fā)明第二方面的方法進(jìn)行鑒定，是成本低且方便、快捷的手段。當(dāng)然，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的方法，其還進(jìn)一步包括對(duì)PCR直接擴(kuò)增細(xì)菌體呈陽(yáng)性的菌體中載體進(jìn)行測(cè)序的過(guò)程。在第三方面，本發(fā)明提供了植物轉(zhuǎn)基因的篩選方法，其包括，(I)將需要轉(zhuǎn)入植物的基因克隆入本發(fā)明第一方面所述的載體；(2)轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌；

(3)對(duì)植物愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(4)在含潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物愈傷組織；和(5)檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)出的熒光。相應(yīng)地，在第四方面，本發(fā)明還提供了植物轉(zhuǎn)基因的方法，其包括，(I)將需要轉(zhuǎn)入植物的基因克隆入本發(fā)明第一方面所述的載體；(2)轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌；( 3)對(duì)植物愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(4)在含潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物愈傷組織；和( 5 )檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)出的熒光，保留檢測(cè)陽(yáng)性的愈傷組織。優(yōu)選本發(fā)明第三或第四方面所述的方法，其還進(jìn)一步包括檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)育成的植物苗發(fā)出的熒光。這樣能夠進(jìn)一步植物培育階段的初期，在時(shí)間、人力、場(chǎng)地和試劑成本都較大的階段到來(lái)前，盡可能使得保證轉(zhuǎn)化的正確率(本發(fā)明人根據(jù)本發(fā)明的方法，還未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果產(chǎn)生)，從而防止在成本較大的階段做無(wú)用功，造成更大的損失。優(yōu)選本發(fā)明第三或第四方面所述的方法中，植物是水稻。優(yōu)選本發(fā)明第三或第四方面所述的方法中，熒光是紅色熒光。這樣，在本發(fā)明第三方面所述的方法中，篩選陽(yáng)性的植物愈傷組織是發(fā)出紅色熒光的愈傷組織；相應(yīng)地，在本發(fā)明第四方面所述的方法中，保留發(fā)出紅色熒光的愈傷組織。更優(yōu)選本發(fā)明第三方面所述的方法，其還進(jìn)一步包括檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)育成的植物苗發(fā)出的熒光，篩選陽(yáng)性的植物苗是根部發(fā)出紅色熒光的植物苗。相應(yīng)地，也更優(yōu)選本發(fā)明第四方面所述的方法，其還進(jìn)一步包括檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)育成的植物苗發(fā)出的熒光，保留根部發(fā)出紅色熒光的植物苗。在第五方面，本發(fā)明提供了引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示:tttccttcctcttttctacagt,和
gtaatgcagaagaagaccatggo該引物對(duì)可以用于鑒定細(xì)菌體中是否帶有在本發(fā)明第一方面所述的載體。本發(fā)明的有益效果在于:保留對(duì)潮霉素具有抗性，又能可視化便于檢測(cè)觀察；在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程的愈傷篩選和轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)階段都可以觀察，而且大幅提高篩選正確率；而且，該標(biāo)簽較小，僅需要一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子就能完全控制，無(wú)需設(shè)計(jì)多個(gè)啟動(dòng)子和/或終止子的0RF，相應(yīng)地，可以將更大的目的基因轉(zhuǎn)入植物，而不降低轉(zhuǎn)化率；構(gòu)建成的轉(zhuǎn)化載體不容易發(fā)生同源重組，更不容易發(fā)生僅保留標(biāo)簽的同源重組，使得篩選本身穩(wěn)定，從而更能夠快速有效的篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，尤其是水稻植株。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例僅是為了說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說(shuō)明書中重復(fù)敘述過(guò)一樣。


圖1為轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定結(jié)果圖，其中(a)為選擇培養(yǎng)20天的轉(zhuǎn)基因愈傷組織；(b)選擇培養(yǎng)30天的轉(zhuǎn)基因的愈傷組織；(c)發(fā)芽7天的T1代轉(zhuǎn)基因植株；(d)轉(zhuǎn)基因水稻T1代苗的根，其中每組左邊為自然光下拍攝，右邊為熒光照射篩選的照片。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具 體的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，其中未特別詳細(xì)說(shuō)明的過(guò)程、材料、試劑均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以從商業(yè)渠道購(gòu)買或委托加工，也可以參見分子克隆和植物組培的書籍或?qū)嶒?yàn)手冊(cè)，如其中植物培養(yǎng)基可以參考潘素君等.核農(nóng)學(xué)報(bào).2006，20 (4): 263-268，篩選和轉(zhuǎn)化的細(xì)節(jié)可以參考Hiei Y, Ohta S，KomariT,Kumashiro T, 1994.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJournal6，271。實(shí)施例1改造pCAMBIA1300-UR載體用于T-DNA轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建我們?cè)诂F(xiàn)有載體pCAMBIA1300的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了新的融合標(biāo)簽，并配合以新設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子和終止子序列，改造了新的PCAMBIA1300-UR載體(簡(jiǎn)稱為1300-UR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該核苷酸為環(huán)形序列)。該改造過(guò)程委托寧波農(nóng)科院，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的PCR和點(diǎn)突變技術(shù)來(lái)進(jìn)行，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。為了挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提高測(cè)序命中效率，尤其是排除載體自連的情況，在轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序前，首先需進(jìn)行菌液PCR，其中需合成如下兩條特異性檢測(cè)引物:Check_Ftttccttcctcttttctacagt CheckmmR gtaatgcagaagaagaccatgg
PCR檢測(cè)體系和條件如下:
權(quán)利要求
1.帶有融合標(biāo)簽的植物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其為環(huán)形載體。
3.權(quán)利要求1所述的載體，其多克隆位點(diǎn)有Sac1、Kpn1、Sma1、Xma1、Acc65I和BamHI。
4.鑒定細(xì)菌體中帶有權(quán)利要求1-3之任一所述的載體的方法，其使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)直接擴(kuò)增細(xì)菌體，其中PCR引物對(duì)如下所示: tttccttcctcttttctacagt,和 gtaatgcagaagaagaccatgg。
5.植物轉(zhuǎn)基因的 篩選方法，其包括， (1)將需要轉(zhuǎn)入植物的基因克隆入權(quán)利要求1-3之任一所述的載體； (2)轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌； (3)對(duì)植物愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化； (4)在含潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物愈傷組織；和 (5)檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)出的熒光。
6.植物轉(zhuǎn)基因的方法，其包括， (1)將需要轉(zhuǎn)入植物的基因克隆入權(quán)利要求1-3之任一所述的載體； (2)轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌； (3)對(duì)植物愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化； (4)在含潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物愈傷組織；和 (5)檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)出的熒光，保留檢測(cè)陽(yáng)性的愈傷組織。
7.權(quán)利要求5或6所述的方法，其還進(jìn)一步包括檢測(cè)植物愈傷組織發(fā)育成的植物苗發(fā)出的熒光。
8.權(quán)利要求5或6所述的方法，其中植物是水稻。
9.權(quán)利要求5或6所述的方法,其中突光是紅色突光。
10.引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示: tttccttcctcttttctacagt,和 gtaatgcagaagaagaccatggo
全文摘要
本發(fā)明公開了新的帶有融合標(biāo)簽的植物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體，其能夠快速有效的篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；另外，本發(fā)明還提供了新的植物轉(zhuǎn)基因的篩選方法和植物轉(zhuǎn)基因的方法等。
文檔編號(hào)C12N15/84GK103173488SQ201310082668
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者周潔, 嚴(yán)成其, 楊勇, 王栩鳴, 余初浪, 程曄, 陳劍平 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院