專利名稱：：豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種病毒的感染性克隆，尤其涉及豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆以及由該感染性克隆拯救得到的重組豬圓環(huán)病毒1型病毒，本發(fā)明還涉及該感染性克隆的構建方法以及其用該感染性克隆拯救的病毒在診斷技術中的應用，屬于病毒分子生物學及獸醫(yī)免疫學領域。
背景技術：
：根據(jù)豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus,PCV)的致病性、抗原性及核苷酸序列，可以將其分為兩個基因型，即PCV1和PCV2。PCVl由德國學者Tischer等(1974)首次從污染的豬腎傳代細胞系(PK-15)分離獲得，通過人工感染豬試驗證實，該病毒沒有引起顯著臨床癥狀和病理變(TischerI,GelderblomH,VetteermannW,etal.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J].Nature,1982，295:64-66;TischerI,MieldsW,WolffD,etal.Studiesonepidemiologyandpathogenicityofporcinecircovirus[J].ArchVirol,1986，91:271-276.)。PCV2從斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)患豬分離獲得，證實對豬具有致病性(AllanG,MeehanB,ToddD,etal.Novelporcinecircovirusesfrompigswithwastingdiseasesyndromes[J].VetRecord,1998,142:467-468.)。豬圓環(huán)病毒是一種圓形小顆粒病毒，直徑17nm，呈二十面體對稱，無囊膜，基因組由單股負鏈閉合環(huán)狀DNA組成，PCVl含有1759bp，PCV2含有1767或1768bp。病毒基因組包括兩個大的開放閱讀框架(0RFs)，0RF1基因編碼病毒復制酶相關蛋白(R印)，0RF2基因編碼病毒結構蛋白(Cap)(CheungAK.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2[J].Virology,2003,305:168-180.)。PCV1和PCV2全基因組序列的同源性為67%，在0RF1區(qū)段同源性為86X，而0RF2區(qū)段同源性僅為51%(MeehanBM,CreelanJL，McNultyMS,etal.SequenceofporcinecircovirusDNA:affinitieswithplantcircoviruses[J].JGeneralVirol,1997,78:221-227.)。兩種病毒在0RF1所編碼的蛋白抗原存在交叉，而0RF2所編碼的蛋白抗原不存在交叉(Mah6D,BlanchardP,TruongC，etal.DifferentialrecognitionofORF2proteinfromtype1andtype2porcinecircovirusesandidentificationofimmunorelevantepitopes[J].JGeneralVirol,2000,81:1815-1824.)。因此，PCVl與PCV2之間存在有一定親緣關系，但也發(fā)生了較大的遺傳變異。由于PCV2感染豬會導致P麗S或其它癥候群成為研究熱點，而PCV1的研究報道較少。為深入了解PCV1與PCV2遺傳變異，探討PCV1與其它病原混合感染的致病性，調查我國獸用疫苗中PCV1污染情況，需要開展該病毒的研究。近年來，國內外學者采用不同方式構建了PCV2的感染性克隆，但拯救的毒株均無分子耙標設計，其獲得的毒株也無法與親本病毒相鑒別(FenauxM，OpriessingT,HalburPG，etal.Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVlinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J].JVirol,2004,78:6297-6303.)。PCV1來源于PK-15細胞污染物，由于該病毒不能夠引起細胞病變，分離或克隆該病毒十分困難，給研究工作帶來一定影響。迄今為止，對PCVl研究報道相對較少，原因可能與該病毒對豬無致病性有關，沒有能夠引起研究者關注。然而，PCVl作為PK-15細胞源污染病毒存在，對該病毒的起源與演化，分子遺傳變異機制等問題所知甚少；PCVl在疫苗生物制品中污染情況，以及在臨床病例中由多種病原混合感染的條件下的致病性如何尚不清楚。通過構建PCV1感染性克隆技術，獲得帶有分子靶標的克隆毒株，為深入開展該病毒基礎研究將具有重要推動作用。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一是提供一種PCVl感染性克?。槐景l(fā)明的目的之二是提供一種構建上述PCVl感染性克隆的方法；本發(fā)明的目的之三是提供一種由上述PCVl感染性克隆拯救得到PCVl重組毒株；本發(fā)明的目的之四是提供一種用所拯救的重組病毒株用于制備檢測豬圓環(huán)病毒血清抗體的試劑。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種PCV1感染性克隆，該感染性克隆的一個載體上順式連接兩個PCV1病毒基因組，構成順式基因功能區(qū)；該序列中含有SWI酶切位點。一種構建上述PCV1感染性克隆的方法，包括(1)提取PCVl病毒基因組；以所提取的PCV1病毒基因組為模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為引物進行PCR擴增；(2)PCR產物經SdI酶切處理及凝膠電泳純化，插入到相同處理的質粒載體pUC19SaiI酶切位點，得到含PCV1全長基因組質粒；(3)將含PCVl全長基因組質粒先行ScaI完全酶切，再進行Sa』I部分酶切，純化含病毒全長基因組與載體長臂和短臂的兩條泳帶，用T4連接酶連接，即得。本研究沿用了構建PCV2感染性克隆的技術路線，首先將PCV1單基因組線性化克隆，再進行雙基因組順式連接，在重組質粒上形成一個完整的病毒基因組調控單元，經質粒轉染細胞獲得感染性病毒。在構建病毒感染性克隆時，引物設計是關鍵環(huán)節(jié)。設計原則一般應避開病毒基因轉錄區(qū)、啟動子區(qū)和蛋白翻譯起始密碼子等重要調控元件，盡量不改變基因編碼閱讀框架和氨基酸編碼序列，從而保證了克隆病毒復制酶的功能和對細胞的感染性。本發(fā)明在PCV1基因組0RF1編碼區(qū)末端區(qū)設計一對引物，通過計算機軟件程序分析，在引物序列中替換兩個堿基，形成一個SaiI酶切位點，目的是利用PCR-RFLP法將克隆毒株與親本野生型病毒相鑒別，證明所獲得的克隆病毒的真實性和可靠性。用本發(fā)明所構建的感染性克隆成功地拯救出重組病毒，該重組病毒命名為PCV1/G株，其微生物保藏號是CGMCCNO.2658;分類命名是豬圓環(huán)病毒l型(Porc化ecir，i潔加ei);保藏時間是2008年8月29日;保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所。用本發(fā)明PCV1/G株同步接種PK-15細胞后連續(xù)帶毒傳代試驗證明，該毒株能夠感染細胞，但不產生明顯細胞病變(CPE);病毒增殖性能穩(wěn)定，分子耙標能夠穩(wěn)定遺傳；第10代病毒培養(yǎng)物病毒測定為10"TCID5。/mL，基本與親本病毒相似。通過免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)在病毒感染細胞中檢出病毒抗原，其抗原性僅與PCV1/Cap蛋白單價特異性抗體發(fā)生反應，而與抗PCV2/Cap蛋白抗體無交叉本發(fā)明克隆毒株帶有SWI酶切位點；而野生型親本病毒不含Sa]I位點。用PCR結合限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)可以將本發(fā)明克隆的PCV1/G株與親本病毒相鑒別從病毒形態(tài)學、抗原性、細胞感染性等方面進行分析表明，本發(fā)明所構建的PCV1克隆毒株與其親本病毒相似，通過細胞連續(xù)傳代，分子靶標能夠穩(wěn)定遺傳，且病毒適應性增強，病毒繁殖能力穩(wěn)定，為今后探討該病毒的致病性、遺傳變異規(guī)律、分子診斷等方面奠定了重要的基礎。采用免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)方法，本發(fā)明拯救的重組PCV1/G株可應用于檢測豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)血清抗體。本發(fā)明對IPMA抗原反應板的制備、被檢血清稀釋倍數(shù)、酶標抗體及底物顯色液等進行了系統(tǒng)試驗。用IPMA法對已知PCV1和PCV2參考陽性血清進行試驗表明，血清稀釋倍數(shù)21:100可消除兩種病毒間存在的低水平交叉反應。該方法與用昆蟲桿狀病毒表達的PCVl-Cap重組蛋白抗原建立的間接ELISA檢測符合率為88.9。/。,與其它幾種豬病毒參考陽性血清無交叉反應。對來自黑龍江、吉林、河北、上海、遼寧等地豬場送檢的257份血清樣品進行檢測，PCV1和PCV2血清抗體陽性檢出率分別為19.1%、80.5%。PCV1抗體陽性豬中有95.9。/。為PCV2陽性，表明我國豬群已存在PCV1感染，在臨床上PCV1與PCV2多以混合感染形式存在。本發(fā)明建立的PCV1-IPMA方法具有操作簡便、特異和敏感等特點，可為PCV1流行病學調查及血清抗體檢測提供了一種技術手段。圖1重組質粒SamHI與ffi;idIII酶切反應鑒定1:單基因組加載體；2:雙基因組加載體；3:空載體；M:DNAmarkers。圖2PCV1/G株病毒抗原檢測與血清學交叉反應；A:PCV1/G株加anti-PCVl/Cap血清；B:PCV2加anti-PCVl/Cap血清；C:陰性對照；D:PCV1/G株加anti-PCV2/Cap血清；E:PCV2加anti-PCV2/Cap血清；F:陰性對照。圖3PCR-RFLP法鑒別PCV1/G克隆毒株與PCV1親本病毒；1:克隆病毒的PCR產物的SaJI酶切結果；2:親本病毒的PCR產物的SdI酶切結果。圖4PCV1/G株免疫電鏡形態(tài)學觀察。圖5PCV1和PCV2毒種的PCR鑒定結果。圖6用IPMA方法檢測豬血清中PCV1抗體試驗。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實施例1感染性克隆的構建、重組病毒的拯救、傳代與測定1材料和方法1.1病毒、細胞、抗體、菌株及載體從污染的豬腎傳代細胞系(PK-15)獲得PCV1病毒基因組；基因克隆所用的大腸桿菌菌株(Top10)、載體(pUC19)及限制性內切酶類為寶生物工程(大連)有限公司產品；轉染試劑Lipofectamine2000和RPMI1640培養(yǎng)液為Gibco產品；PCV1-free豬腎傳代細胞系(PK-15)由國外引進。兔抗PCV1/Cap和PCV2/Cap重組蛋白單因子血清自制。1.2引物設計與PCR擴增根據(jù)GenBank提供的PCV1序列NC001792設計引物PCV1-F907:5'-GTCGACGGAAGTACCCGAAGGCCGATTTGA-3，(SEQIDNO.1)，對應序列為907936;PCV1-R912:5，-GTCGACTGTTCTCCAGCAGTCTTCCA-3，(SEQIDNO.2)，對應序列為887912。下劃線斜體字母表示替換的堿基，構成SaJI酶切位點。病毒DNA按文獻(LiuC，WeiY，ZhangC,etal.Constructionandcharacterizationofporcinecircovirustype2carryingageneticmarkerstrain[J].VirusResearch,2007,127:95-99.)方法提取，TaKaRaExTaqPCR試劑盒進行擴增，條件為預變性94。C2min，35個循環(huán)[94。C30s，60°C30s，72°C1.5min]，延伸反應72。C7min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.3病毒基因組克隆與測序PCR產物經SaI酶切處理及凝膠電泳純化，插入到相同處理的質粒載體pUC19Sa』I酶切位點，操作程序按文獻(LiuC,WeiY,ZhangC,etal.Constructionandcharacterizationofporcinecircovirustype2carryingageneticmarkerstrain[J].VirusResearch,2007，127:95-99.)。采用373A型DNA序列儀測序(Perkin-Elmer試劑盒)，DNAsis軟件進行序列分析。1.4感染性分子克隆構建及鑒定含PCV1全長基因組質粒先行SeaI完全酶切(pU19載體上單酶切位點)，再進行SWI部分酶切(插入基因組兩側酶切位點)。凝膠純化含病毒全長基因組與載體長臂和短臂的兩條泳帶，用T4連接酶連接獲得一個載體上順式連接的兩個病毒基因組，構成順式基因功能區(qū)，獲得PCV1感染性克隆。用插入位點兩側的Ba/HHI與//kefIII進行酶切反應鑒定。1.5重組質粒細胞轉染用6孔培養(yǎng)板接種1.5X105個細胞/孔，置37°C5%0)2培養(yǎng)在24h達到6080%單層時用于轉染試驗。用無血清0ptiMEM培養(yǎng)液(GibcoBRL)洗滌細胞1次，將1.2l^g純化的感染性克隆質粒轉染PK-15細胞，用Lipofectamine2000試劑進行轉染，按說明書進行。轉染后細胞置37°C5%0)2條件下培養(yǎng)至72h，收獲轉染細胞培養(yǎng)物上清。1.6病毒拯救與傳代按5%接種量將收獲的上清液同步加入到新消化的細胞懸液中，混合后置37°C5%0)2條件下靜置培養(yǎng)24h形成單層，按文獻(TischerI,PetersD,RaschR，etal.Replicationofporcinecircovirus:inductionbyglucosamineandcellcycledependence[J].ArchVirol，1987,96:39-57.)方法進行D-氨基葡萄糖處理。培養(yǎng)72h后收取病毒培養(yǎng)物，經3次凍融后同步接種細胞進行傳代。1.7病毒抗原性及含量測定用兔抗PCV1/Cap單因子血清進行免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)(LiuC,IharaT，NunoyaT，etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMedSci，2004，66:237-242.)測定病毒的抗原反應活性。將病毒液作10倍系列稀釋測定病毒含量，取各稀釋度分別接種96孔板，每個稀釋度設4L(100"L/孔)，同步加入新消化的PK-15細胞(100uL/孔)，置37。C5%(:02培養(yǎng)72h，甩掉細胞培養(yǎng)液，用PBS(pH7.4)浸洗一次，固定細胞后進行IPMA測定。用IPMA法對幾種豬病毒參考血清進行抗原交叉反應試驗。1.8病毒形態(tài)學觀察取病毒感染后72h細胞，用PBS洗滌細胞3次，預留0.5mLPBS凍融3次，12000r/min離心20min取上清，加入終濃度為1%的PCV1陽性血清混合，4。C感作過夜，12000r/min離心20min，沉淀用0.lmLPBS溶解，2%磷鎢酸液(pH6.8)負染制樣，進行免疫電鏡觀察。1.9克隆毒株與親本病毒鑒別根據(jù)GenBank提供的PCV1序列NC001792設計引物。PCV1-F42:5，-TGMMTGCCAAGCAAGMAAGCGG-3，(SEQIDNO.3)對應序列為4771;PCV1-R1102:5，-ACAGCCCAMATTATGTGGTAAGGC-3，(SEQIDN0.4)對應序列為10771102。擴增目的基因片斷長為1061bp，PCR反應條件同1.2項，獲得的PCR產物進行Sa]I酶切鑒別克隆毒株與親本病毒。2試驗結果2.1基因克隆與序列分析PCV1基因組PCR擴增產物約1.7kb，經SdI酶切消化，克隆到pUC19載體(2686bp)。取3個陽性克隆進行序列測定，結果一致，未發(fā)現(xiàn)堿基錯配和缺失。PCV1基因組全長1759bp，含0RF1和0RF2編碼區(qū)，測序結果與GenBank登錄的PCV1序列AF071879，NC001792和Y09921進行比較，核苷酸序列同源性大于99.9%。2.2感染性克隆的構建對含PCV1單基因組重組質粒進行SeaI完全酶切消化，然后用SaiI進行部分酶切消化，凝膠電泳回收含單基因組的長臂(基因組1759bp+部分載體1747bp)和另一含單基因組短臂(基因組1759bp+部分載體939bp),將兩者連接后獲得含雙基因組順式排列的重組質粒(雙基因組3518bp+載體2686bp)，獲得的重組質粒命名為pUC/PCVl。2.3重組質粒酶切鑒定對純化的含PCV1雙基因組重組質粒進行Sa/nHI和//i;^III酶切鑒定。如圖1所示，泳道1為含單基因組重組質粒酶切反應，獲得單基因組與載體兩條帶，分別為1759bp和2686bp;泳道2為含雙基因組重組質粒酶切反應，獲得雙基因組與載體兩條帶，分別為3518bp和2686bp;泳道3為空質粒對照。2.4克隆病毒檢測與血清學交叉反應用兔抗PCVl/Cap抗體進行IPMA法檢測拯救病毒，如圖2所示，克隆的病毒感染細胞呈棕紅色(圖2A)，對照細胞無著色(圖2C);病毒感染的陽性細胞呈點式分布，抗原主要聚中在細胞漿和細胞核內。結果表明，用構建的感染性克隆成功地拯救出重組病毒，命名為PCV1/G株。用兔抗PCV2/Cap單因子血清與PCV1/G株進行抗原交叉試驗結果顯示，兩種病毒無血清學交叉反應(圖2B、2E);同時與其它幾種豬病毒參考血清(PRRSV、PPV、PRV、CSFV)也無交叉反應。2.5克隆毒株與親本病毒鑒別從PCV1/G株第10代培養(yǎng)物提取DNA為模板，連同與親本病毒基因組一起，用PCV1-F42和PCV1-R1102引物分別進行PCR擴增，其產物預測為1061bp。由于克隆毒株帶有SWI酶切位點，用SdI酶切其PCR產物，獲得195bp和866bp兩個片段；而野生型親本病毒不含Sa〗I位點，酶切后片段不變。用PCR結合限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)將克隆的PCV1/G株與親本病毒相鑒別(圖3)。2.6克隆毒株形態(tài)學觀察免疫電鏡形態(tài)學觀察顯示，克隆病毒粒子與特異性抗體結合后，形成了巨大的免疫復合物(圖4)，其中單個病毒呈圓形顆粒，直徑約17nm，與文獻(TischerI,GelderblomH,VetteermannW，etal.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J].Nature,1982,295:64-66.)報道的PCVl形態(tài)一致，未發(fā)現(xiàn)有其它外源病毒污染。2.7克隆病毒細胞感染特性用PCV1/G株同步接種PK-15細胞后連續(xù)帶毒傳代試驗證明，該毒株能夠感染細胞，但不產生明顯細胞病變(CPE);病毒增殖性能穩(wěn)定，分子靶標能夠穩(wěn)定遺傳；第IO代病毒培養(yǎng)物病毒測定為1048TCID5。/mL，基本與親本病毒相似。試驗例11材料和方法1.1病毒、抗體、細胞PCV1/G株為本發(fā)明實施例1所構建。PCV1和PCV2陽性血清及陰性血清由本方面人實驗室提供；幾種豬病毒參考陽性血清由申請人相關課題組提供。PK-15細胞系由國外引進，經PCR檢測無PCV1污染，用于病毒增殖，細胞培養(yǎng)液為RPMI1640，添加10%犢牛血清(FCS)和青霉素、鏈霉素；辣根過氧化物酶-葡萄球菌A蛋白標記物(服P-SPA)為Zymed產品；3_氨基-9-乙基咪唑(AEC)為Sigma產品；其它化學試劑為國產分析純試劑。1.2PCR鑒別試驗根據(jù)GenBank發(fā)表的PCV1序列(NC001792)和PCV2序列(AF201311)設計引物。PCV1-F:5，-TTGCTGAGCCTAGCGACACC-3，；PCV1-R:5，-TCCACCTGCTTTCAMTCGGCC-3，用于擴增PCV1片段為349bp。PCV2-F:5，-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3,和PCV2-R:5，-CCGCACCTTCGGATATACTG-3，用于擴增PCV2片段為263bp。按常規(guī)方法提取病毒DNA，TaKaRaExTaqPCR試劑盒進行基因擴增。PCR反應條件預變性94°C2min，35個循環(huán)[94。C30s，60°C30s，72°C1.5min]，延伸反應72°C7min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，用于PCV1和PCV2種毒的鑒別。1.3病毒增殖與毒價測定用PCV1/G株第18代作為毒種，按10%同步接種于新消化的PK-15細胞懸液(2X10VmL)，病毒維持液為含2%FCSRPMI1640,病毒培養(yǎng)物于37'C培養(yǎng)120h，經三凍融后收獲，經3000r/min離心10min，取上清小量分裝于-8(TC保存，用IPMA方法測定毒價，達到lX105TCID5。/mL以上用于制備IPMA反應板。1.4IPMA反應板的制備按5%、10%和15X種毒劑量同步接種PK-15細胞懸液，以100叱/孔分注于96孔板中，同時設未接種病毒細胞對照。置37'C5%0)2條件下培養(yǎng)形成單層，用丙酮-PBS固定，干燥后置-2(TC保存?zhèn)溆谩?.5IPMA操作程序取IP區(qū)反應板置室溫預熱，用PBS浸洗一次，用PBS將待檢血清按1:25起進行2倍系列稀釋，同時作陽性血清、陰性血清和未接毒細胞對照，加樣量為100叱/孔。置37。C濕盒孵育lh。PBS洗3次，加入l:3000稀釋的HRP-SPA(100叱/孔)，置37。C濕盒孵育lh，PBS洗3次，加入AEC底物液顯色30min，用光學顯微鏡觀察判定結果。1.6PCV1與PCV2血清學交叉反應測定將已知PCV1和PCV2陽性參考血清分別做l:251:12800系列稀釋，分別進行兩種病毒的IPMA交叉反應試驗，同設未接毒細胞對照。1.7PCV1-IPMA特異性、敏感性和重復性試驗用己知豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)參考血清進行交叉反應試驗。將PCV1陽性血清進行1:1001:12800系列稀釋，進行IPMA敏感性試驗。制備三批IPMA反應板，選用陽性和陰性血清各5份，用相同批次和不同批次三個IPMA反應板進行批內和批間重復性試驗。1.8PCV1-IPMA與ELISA符合試驗用IPMA與昆蟲桿狀病毒表達的PCV1-Cap重組蛋白作抗原建立的間接ELISA方法，進行符合試驗。1.9臨床血清樣品的檢測對來自黑龍江、吉林、河北、上海、遼寧等地豬場送檢的257份血清樣品進行PCV1-IPMA和PCV2-IPMA檢測。2試驗結果2.1PCV1和PCV2毒種鑒定對試驗使用的PCV1和PCV2毒種及PK-15細胞系進行了PCR交叉反應鑒定。如圖5所示，泳道13為PCV1特異性引物進行的PCR反應；泳道46為PCV2特異性引物進行的PCR。第2、5泳道為PCV1提取的核酸，PCV1-PCR擴增出349bp片段(2泳道)；第3、4泳道為PCV2提取的核酸，PCV2-PCR擴增出263bp片段(4泳道)；第1、6泳道為PK-15細胞系對照。PCR鑒定結果證明，用感染性分子克隆分別構建的PCV1/G株與PCV2株制備的種毒純凈，無交叉污染；所用的PK-15細胞系也無這兩種病毒污染。因此，上述2個毒株和細胞系可用于IPMA反應板的制備。2.2PCV1-IPMA反應條件的測定用PCV1/G株培養(yǎng)物病毒含量為1.3X105TCID5。/mL制備IPMA反應板。按10%接種量同步接種PK-15細胞，培養(yǎng)至72h固定；被檢血清樣品以1:25起進行2倍系列稀釋；HRP-SPA的工作濃度為1:3000稀釋；AEC底物液顯色30min。PCV1陽性血清與病毒感染細胞染色呈棕紅色(圖6A)，與對照健康細胞染色無著色(圖6B)，作為IPMA陽性判定標準；PCV1陰性血清與病毒感染細胞和健康細胞對照孔染色均無著色反應判為陰性。2.3PCV1與和PCV2血清抗體交叉反應測定以己知PCV1和PCV2標準毒株制備IPMA反應板，分別與系列稀釋的PCV1和PCV2參考陽性和陰性血清進行交叉反應，結果見表1。IPMA檢測結果表明，在血清稀釋倍數(shù)為1:25和1:50，兩種病毒存在低水平的血清抗體交叉反應;但血清稀釋度大于l:100以上，完全消除了這種低水平的抗體交叉。因此，用PCV1和PCV2建立的IPMA方法均可用于檢測各自病毒產生的特異性抗體。表1用IPMA法檢測PCV1與PCV2血清抗體交叉反應試驗結果IPMA檢測255010020040080016003200640012800PCV1陽性血清+++++++++—PCV1抗原PCV2陽性血清+陰性血清PCV1陽性血清+±PCV2抗原PCV2陽性血清++++++++++陰性血清2.4PCV1-IPMA特異性、敏感性和重復性試驗對幾種豬病毒參考血清(PPV、PRV、TGEV、PEDV、CSFV和PRRSV)進行的IPMA交叉反應試驗結果表明，除PCV1陽性血清呈陽性反應外，其他幾種豬病毒參考血清均呈陰性反應，證明對這幾種病毒無血清學交叉反應。敏感性試驗結果表明，當PCV1陽性血清稀釋至1:6400，還能檢測到陽性反應結果，證明該方法敏感性較高。用同批次和不同批次進行的PCV1-IPMA試驗結果表明，該方法獲得的結果重復性良好。2.5IPMA與ELISA符合試驗用PCVl-IPMA與用昆蟲桿狀病毒表達的PCVl-Cap重組蛋白抗原包被ELISA方法，對54份臨床血清樣品進行了平行檢測試驗。結果表明，PCV1-Cap/ELISA13檢測樣品中有35份陽性和19份陰性，而IPMA法檢測有40份陽性和14份陰性。這兩種方法總符合率為88.9%，其中陽性符合率為97.1%，陰性符合率為73.7%。2.6對臨床樣品檢測結果用PCV1-IPMA和PCV2-IPMA對來自黑龍江、吉林、河北、上海、遼寧等地9個豬場送檢的257份血清樣品進行檢測(表2)。結果表明，PCV1-IPMA血清抗體陽性檢測率為19.1%，其中已知備母豬血清樣品陽性檢出率為35.9%(28/78),仔豬血清樣品陽性檢出率為9.8%(10/102)。PCV2-IPMA抗體陽性檢測率為80.5%，顯著高于前者，其中PCVl抗體陽性豬中有95.9y。(47/49)為PCV2抗體陽性。試驗結果表明，我國豬群已存在PCV1感染，且PCV1和PCV2在臨床上多以混合感染形式存在。表2用IPMA法對現(xiàn)地臨床送檢血潔中:PCV1和K:V2抗體檢測結果豬場別血清樣本PCV1-IPMAPCV2-IPMA陽性數(shù)陰性數(shù)檢出率(％)陽性數(shù)陰性數(shù)檢出率(％)TN3092130.029196.7DZ2962320.722775.9SFH2361726.119482.6TY20101050.019195.0JMS101910.06460.0AC3260.03260.0見3843416.3191950.0WJ4363714.035881.4HB594556.855493.2總計2574920819.12075080.5序列表<110>中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>豬圓環(huán)病毒l型感染性克隆及其所拯救的病毒和應用<130>KLPI0788<160>4<170〉Patentlnversion3.1<210〉<211〉<212><213〉30Porcinecircovirus<咖>1gtcgacggaagtacccgaaggccgatttga<210〉2〈211〉26<212>DNA<213〉Porcinecircovirus<400>2gtcgactgttctccagcagtcttcca<210〉3<211>25<212>腿<213〉Porcinecircovirus3026<400>3tgaaaatgccaagcaagaaaagcgg<210>4<211>25<212>DNA<213>Porcinecircovirus25<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權利要求1、一種豬圓環(huán)病毒1型的(Porcinecircovirus1)感染性克隆，其特征在于該感染性克隆的一個載體上順式連接兩個PCV1病毒基因組，構成順式基因功能區(qū)。2、按照權利要求l所述的感染性克隆，其特征在于PCV1感染性克隆中含有Sa〗I酶切位點。3、按照權利要求l所述的感染性克隆，其特征在于所述載體是pUC19質粒載體。4、一種構建權利要求1-3任何一項所述感染性克隆的方法，包括(1)提取PCVl病毒基因組；以所提取的PCV1病毒基因組為模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為引物進行PCR擴增；(2)PCR產物經SdI酶切處理及純化，插入到相同處理的質粒載體pUC19Sa_ZI酶切位點，得到含PCV1全長基因組的質粒；(3)將含PCVl全長基因組的質粒先行ScaI完全酶切，再進行Sa〗I部分酶切，純化含病毒全長基因組的產物以及載體長臂和短臂的產物，用l連接酶連接獲得。5、由權利要求1-3任何一項所述感染性克隆拯救獲得的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株。6、按照權利要求5所述的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株，其特征在于所述重組豬圓環(huán)病毒1型毒株的基因組帶有-一個SaH內切酶位點。7、按照權利要求6所述的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株，其特征在于其微生物保藏號是CGMCCNO.2658。8、權利要求5所述的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株在制備檢測豬圓環(huán)病毒抗體的試劑或藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和應用。本發(fā)明將豬圓環(huán)病毒1型2個基因組順式連接插入到載體中構建得到感染性分子克隆。該感染性分子克隆中插入SalI酶切位點作為分子靶標，所拯救出的重組病毒(PCV1/G株)帶有分子標記，其保藏號是CGMCCNO.2658。本發(fā)明重組病毒的抗原性僅與PCV1/Cap蛋白單價特異性抗體發(fā)生反應，而與抗PCV2/Cap蛋白抗體無交叉?？捎肞CR結合RFLP將其與親本病毒相鑒別。本發(fā)明毒株體外培養(yǎng)增殖性能穩(wěn)定，病毒滴度高，所拯救的毒株可用于檢測該病毒抗體。本發(fā)明為今后開展豬圓環(huán)病毒的起源與演化、遺傳變異規(guī)律、分子鑒別診斷等研究奠定了基礎。文檔編號C12N7/01GK101423836SQ20081017365公開日2009年5月6日申請日期2008年11月5日優(yōu)先權日2008年11月5日發(fā)明者劉長明,危艷武,張朝霞,婧袁,陸月華,黃立平申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所