專利名稱：豬抑肌素基因(mstn)真核表達載體的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真核表達載體的構(gòu)建，具體的說是構(gòu)建了豬抑肌素基因的真核表
達載體。
背景技術(shù)：
Pichia pastoris表達系統(tǒng)是近年來迅速發(fā)展起來的一種真核表達系統(tǒng)。Pichia pastoris是一種甲醇酵母，可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長。在表達 真核細胞外源蛋白時，不僅具有原核生物生長快、操作簡便、成本低的特點，又具備哺乳 動物的翻譯后加工修飾的功能，從而表達有生物活性的外源蛋白。肌肉生長抑制素基因 (Myostatin， MSTN)屬TGF-P超家族，其主要功能是特異性的抑制骨骼肌細胞的增殖與分 化，是骨骼肌生長和發(fā)育的負調(diào)控因子。隨著對該基因進一步了解現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Myostatin在 體內(nèi)眾多代謝調(diào)控中起著重要的作用。因此采用DNA重組技術(shù)在真核系統(tǒng)中表達該蛋白對 其進行研究無疑具有重要的意義。本發(fā)明以含有強啟動子P皿i和a-factor信號肽序列的 巴斯德畢赤酵母載體質(zhì)粒PPICZ a C構(gòu)建豬Myostatin基因的真核表達載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用已有的畢赤酵母真核表達載體，通過基因工程的方法，構(gòu)建
豬的抑肌素基因的真核表達載體。 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是 首先，使用重組PCR法擴增出目的基因，使其兩端分別帶上Cla I和Xba I的酶切 位點，電泳圖上顯示出一條單一明亮的DNA條帶。 其次，將Myostatin基因片段和載體雙酶切后用T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 入大腸桿菌JM109。 最后，對在LB_Amp+平板上生長的菌落，分別使用了 PCR法，雙酶切法和測序法三 種方法進行篩選和鑒定陽性菌落。 具體的鑒定方法包括(1)用自行設(shè)計的引物進行PCR擴增快速篩選陽性菌落，經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌落能擴增出與目的基因大小相符的基因片段，再用質(zhì)粒PPICZ a C 上的特征引物(5' A0X引物和3' AOX引物)進行PCR擴增，結(jié)果獲得的片段大小與預(yù)計 的相符，大小基本等于載體上AOX基因的大小+插入的外源基因大小。(2)用Cla I和Xba I對從陽性菌落中提取的質(zhì)粒進行雙酶切，得到了兩個片段，一個是3kb左右的載體和一個 1. lkp左右的外源基因片段。(3)測序結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒序列與GenBank中目的片段的 序列是一致的。以上這些實驗結(jié)果聯(lián)合證明了目的基因已插入PPICZ a C載體，重組質(zhì)粒構(gòu) 建成功。


圖1為表達載體構(gòu)建流程圖。
圖2為RT-PCR擴增Myostatin基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。 M :DL2000Marker ;1 :Myostatin基因片段;2 :陰性對照;3 :陽性對照 圖3為PMD18-T-MSTN雙酶切鑒定結(jié)果。 圖4為pPICZ a C-MSTN的PCR檢測結(jié)果。 1-5 :陽性重組質(zhì)粒；M :DL2000Marker ;6 :質(zhì)粒pPICZ a C 圖5為pPICZ a C-MSTN的雙酶切鑒定結(jié)果。
具體實施例方式
—、實驗材料 1.實驗動物 大白豬1頭，屠宰后取大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織，立即放于液氮中保存。
2.菌株 大腸桿菌(Escherichia coli) JM109購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。
T0P10F'菌株購自Invitrogen公司。
3.分子克隆主要相關(guān)試劑 (l)BamHI、 EcoRI、 Hindi 11等限制性內(nèi)切酶、rTaq酶、dNTP、 DL2000Marker、
pMD-18T載體連接試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司。 (2) EasySelect 畢赤酵母表達試劑盒購自Invitrogen公司。 (2)酵母基因組提取試劑盒、山梨糖醇購自上海華舜生物工程有限公司。 (3)細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨和酵母提取物均購自O(shè)xid公司。 (4)瓊脂糖、溴化乙錠、Tris等購自Sigma公司。 (5)其他試劑均為分析純的國產(chǎn)生化試劑。 (6)E卯endorf管和移液器槍尖等塑料耗材均購自哈爾濱伊事達生物技術(shù)有限公 司。 二、實驗方法
( — )RNA的提取 1.研磨組織樣取100mg組織樣于裝有液氮的研缽中，充分研磨，研磨后加入裝有 lml Trizol的EP管中，充分振蕩。 2.分相15-3(TC溫育2-5min以完全解離核蛋白復(fù)合體，2-8 °C 12000rpm離心 10min，上清移至新EP管，加0. 2ml氯仿用力搖動15sec， 15_30°C放置2_3min， 12000rpm 2-8。C離心15min。 3. RNA沉淀移水相于 一 新EP管，加0. 8ml異丙醇混勻，室溫放置10_15min， 2-8°C 12000rpm離心lOmin。4.洗滌RNA沉淀棄上清，加lml 75%乙醇洗滌RNA， 2-8°C 7500rpm離心5min。
5.RNA重溶棄乙醇，離心機甩下液滴并小心吸棄液滴，空氣中干燥或真空干燥 5-10min，加適量0. 1% DEPC處理水溶解總RNA。
(二)引物的設(shè)計與合成
1.克隆用引物 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的序列，用DNAMAN和Primer5. 0軟件在其完整的閱讀框架外設(shè)計上、下游引物。 上游引入Cla I酶切位點，下游引入Xbal酶切位點。



































上游引物(P》24bp :5 — - |GCTGA^ATC^| ATGCAAAAACTG-3 下游引物(P2)27bp :5 — - JGTTCTAGAAAl TCATGAGCACCCACAGC-3-
注引物中加框的堿基為引入的酶切位點序列 退火溫度Tm 二 59 °C 2.鑒定重組菌用引物
上游引物(P3)21bp :5—-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3— 下游引物(P4)27bp :5—-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3— 退火溫度Tm 二 55 °C
(三) 腦A反轉(zhuǎn)錄成cDNA
1. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
2XBca 1st Buffer 10. Oil 1
25,1/L MgS04 4. Oil 1
d證Mixture 1. Oil 1
RNAse Inhibitor(40U/ul) 0. 5u 1
BcaBEST Polymerase (22U/ li 1) 1. 0 u 1 Oligo dT Primer 1. Ou 1
RNA Sample 1. Oil g
RNAse Free dH20 1. 5ii 1
Total 20. 0 ill
2. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件 65°C lmin
30°C 5min I15-30min內(nèi)勻速升溫 65°C 25min
98 °C 5min
5°C 5min
(四) Myostatin基因全長編碼區(qū)的克隆 1. PCR反應(yīng)體系
10XPCR Buffer dNTP Mixture r-T叫(5U/'P 1)
Forward Primer (lOpmol/ii 1) Reverse Primer (lOpmol/ii 1)
2. 5u 1 2. 0u 1
0. 2u 1
1. Oil 1 1. Oil 1
50078] 0079] 0080] 0081] 0082] 0083] 0084] 0085] 0086] 0087] 0088] 0089] 0090]
RT—Products Water
1. Oil 1 17. 3ii 1
25. Oil 1
7min
30sec
30sec
50sec
lOmin
to 2 25循環(huán)
Total
2. 反應(yīng)條件 預(yù)變性94°C
變性94°C 退火58°C 延伸72°C 孵育72°C
4°C
3. PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測及鑒定
反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 ill上樣于1 %瓊脂糖凝膠，同時在一點樣孔中加3. 0 ill DNA DL2000Maker作對照，電泳20 30min，在計算機凝膠成像系統(tǒng)上觀察，如果PCR產(chǎn)物 無其它雜帶，且擴增片段大小與設(shè)計相符，就可以用于回收、測序。 0091] 4. PCR擴增片段的純化
0092] (1)將含目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1. 5ml的離心管中。 0093] (2)按每lOOmg瓊脂糖加入300-600 y 1的比例加入SI液，置55。C水浴10min，使 瓊脂糖塊完全溶化，每2min顛倒混勻一次。 0094] (3)加入1/3S1體積的異丙醇，混勻，55"溫育lmin。
0095] (4)將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，離心lmin。倒掉收集管中的液體，再將吸附 柱放入同一個收集管中。
0096] (5)在吸附柱中加入450iU Wl液，靜置lmin后，離心15sec。倒掉收集管中的液 本，將吸附柱放入同一個收集管中。
0097] (6)在吸附柱中加入450 ill Wl液，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱 放入同一個收集管。 0098] (7)離心lmin。
00"] (8)將吸附柱放入一個干凈的1. 5ml的離心管中 靜置lmin后，離心lmin。將1. 5離心管中的DNA貯存于-0100] 5.PCR回收產(chǎn)物與T載體連接反應(yīng) 連接體系如下
pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul
DNA 20-40ng Solution 15ul 加去離子水至 10ul 將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30min或14"C過夜。 6.感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)
(1) 挑取JM109大腸桿菌原種，在LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)。
(2) 挑取新鮮的單菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)過夜。
,在吸附柱的中央加30iU Tl液， -2Q。C中。
0101] 0102] 0103] 0104] 0105] 0106] 0107] 0108] 0109]
(3)取1ml培養(yǎng)好的菌液，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37。C 300rpm強烈振蕩培養(yǎng) 2h，使細胞濃度達到5X 107個細胞/ml，此時，細菌的0D6。。 一般在0. 5 0. 6之間，為對數(shù)
生長期。 (4)將培養(yǎng)物在冰上放置10min，轉(zhuǎn)移到2個50ml預(yù)冷的離心管中，4000rpm4t:離
心5min。去上清，倒置離心管，使殘液流盡，回收細菌沉淀。 (5)加入20ml冰預(yù)冷的0. 1M CaCl2懸浮細菌沉淀，然后冰浴30min。 (6)4000rpm，4t:離心10min，去上清，倒置離心管，回收細菌沉淀。 (7)加入4ml 0. lmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，這時的細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。 (8)加甘油至終濃度為15% 20%，混勻，分裝成200111/份，凍存于-801:。
7.轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi) (1)從-7(TC冰箱中取出一管感受態(tài)細胞(200iU感受態(tài)細胞)，在冰上放置 10min助溶。 (2)將lOiU連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰上放置 30min。 (3)將管放到預(yù)加溫到42t:的水浴鍋中，熱激90sec。
(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1 2min。 (5)加入400iULB培養(yǎng)基，37t:溫和振蕩(100 150rpm)培養(yǎng)45min，使細菌復(fù) 蘇。 (6)取lOOiil菌液鋪于含AMP(100iil/ml)培養(yǎng)基上，37"倒置培養(yǎng)12 16h。
8.陽性菌落的鑒定與培養(yǎng) (1)用記號筆標記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。 (2)以單菌落作為模板，加入PCR反應(yīng)液(不含模板)中，用獲得該片段的PCR條
件進行擴增。 (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒別T載體上是否含有目的片段。 (4)若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40ml LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中預(yù)先加入O. 1% (V/V)的Amp(100mg/ml)，37t:過夜振蕩培養(yǎng)，用 于質(zhì)?；厥?。 9.質(zhì)粒DNA的小規(guī)模提取 (1)接種一單菌落于3ml含50ug/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，以37°C 220rpm培 養(yǎng)過夜。 (2)取1. 5ml菌液于離心管中，4，000rpm離心5min，棄去上清液，收集菌體。
(3)在細菌沉淀中加入250 iU Pl液，震蕩至徹底懸浮。 (4)加入250 ii 1 P2液，立即溫和顛倒離心管5_10次以混勻管中液體，室溫靜止 4min。 (5)加入350 ii 1 P3液，立即溫和顛倒離心管5_10次以混勻管中液體。 (6) 12， OOOrpm離心10min，將上清液小心移入吸附柱，離心15sec。倒掉收集管中
的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。 (7)向吸附柱中加入500iU Bl液，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。 (8)向吸附柱中加入500iUWl液，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放 入同一個收集管中。 (9)向吸附柱中加入500ii1 Wl液，靜止lmin后，離心15sec。倒掉收集管中的液 體，將吸附柱放入同一個收集管中，再離心lmin。 (10)將吸附柱放入一個干凈的1. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入50iU Tl液，
室溫靜止lmin，離心lmin。將1. 5ml離心管(DNA溶液)-20中。C保存。 10.雙酶切鑒定質(zhì)粒 (1)雙酶切反應(yīng)體系 HindIII 0.80 iil BamHI 0. 80 ii 1 10 XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反應(yīng)條件:37。C 2 3h。 (3)酶切產(chǎn)物的電泳檢測 制備1 %的瓊脂糖凝膠，把酶切產(chǎn)物20 ii 1全部加到點樣孔中，120V電泳30min，檢 測到大小相符的目的基因片段后，將重組質(zhì)粒PMD18-T-MSTN寄往測序公司測序。
(五)Myostatin基因真核表達載體的構(gòu)建 1. Myostatin基因轉(zhuǎn)錄片段的獲得 以PMD18-T-MSTN質(zhì)粒為模板，進行Clal和Xbal的雙酶切。 (1)雙酶切反應(yīng)體系 Clal 0.80 ill Xbal 0.80 ill 10XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反應(yīng)條件:37。C 2 3h。 (3)濃度測定 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，回收酶切產(chǎn)物，用分光光度計測0D26。的值，并根據(jù)
DNA的濃度=0D26。X稀釋倍數(shù)X50(ng/iU)測出濃度。 2. pPICZ a C載體質(zhì)粒DNA的處理 將載體pPICZ a C用Clal和Xbal酶切。 (1)雙酶切反應(yīng)體系 Clal 0.80 ill
Xbal 0.80 ill 10 XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 14. 4 ill Plasmid 2. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反應(yīng)條件37°C 2 3h。 (3)濃度測定 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，回收酶切產(chǎn)物，用分光光度計測0026。的值，并根據(jù) DNA的濃度=0D26。X稀釋倍數(shù)X50(ng/iU)測出濃度。 3.構(gòu)建轉(zhuǎn)錄載體pPICZ a C-MSTN 將回收的Myostatin基因的PCR產(chǎn)物與pPICZaC載體按3 : l比例混合，作連接 反應(yīng)。 (1)連接反應(yīng)體系
:0181] MSTN liil
:0182] pPICZ a C Vector 0. 5 ii 1
:0183] 5 X Buffer 3. 0 ii 1
:0184] T41ignase 1.5ul
:0185] H20 14. Oil 1
:0186] _
:0187] total 20.0ul (2)反應(yīng)條件16。C 3 4h。
4.轉(zhuǎn)化和測序 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入T0P10F'菌株，培養(yǎng)基為25 y g/ml的Zeocin 低鹽LB培養(yǎng)基，
挑選陽性克隆雙酶切鑒定。 (1)雙酶切反應(yīng)體系 Cla I 0. 8ii 1 Xbal 0.8 ill 10XK Buffer 2. 0 ii 1 H20 15. 4 ill plasmid of pPICZ a C—MSTN 1. 0 ii 1 _ total 20.0ul
(2)反應(yīng)條件37。C 3 4h。 將正確的重組質(zhì)粒pPICZ a C-MSTN送往上海生工測序，檢測插入是否正確。
三、實驗結(jié)果與分析 以肌肉組織總RNA為模板進行RT-PCR，擴增出一條大約1. lkb的特異性目的條帶， 與預(yù)期條帶1128bp大小相符，初步確認為Myostatin基因。取陽性重組質(zhì)粒PMD18_T_MSTN 分別用Hindlll和BamHI (載體上的酶切位點)進行雙酶切鑒定，獲得兩個片段，分別為約3kb的PMD18-T載體片段和約1. lkb的Myostatin基因片段。測序結(jié)果表明，所擴增的序列
與GenBank上意公布的豬Myostatin基因序列完全相符，證明所擴增序列無誤。 取陽性重組質(zhì)粒pPICZ a C-MSTN分別用Clal和Xbal (載體上的酶切位點)做酶
切進行雙酶切鑒定，獲得兩個片段，分別為約3. 6kb的pPICZaC載體片段和約1. lkb的
Myostatin基因。同時以該重組質(zhì)粒為模板，用引物P3、 P4進行PCR鑒定，擴增出約1. 7kb
左右的條帶。測序結(jié)果表明在構(gòu)建Myostatin基因表達載體的過程中該基因序列未發(fā)生突
變，而且是按照設(shè)計方案準確插入到表達載體中的。
10
權(quán)利要求
一種豬全長Myostatin基因真核表達載體，其特征在于豬Myostatin基因的重組載體pPICZαC-MSTN，是通過以下方法構(gòu)建獲得的(1)豬Myostatin基因cDNA的克隆測序取豬大腿骨骼肌外側(cè)肌肉組織，用Trizol試劑提取總RNA，用BcaBEST試劑盒合成cDNA，連入pMD18-T載體，BamH I和HindIII雙酶切鑒定后，寄往測序公司測序。(2)Myostatin基因轉(zhuǎn)錄片段的獲得以pMD18-T-MSTN質(zhì)粒為模板，進行ClaI和XbaI的雙酶切，將酶切下來的片段用膠回收試劑盒回收，用于和pPICZαC的連接反應(yīng)。(3)pPICZαC質(zhì)粒的提取、酶切提取pPICZαC質(zhì)粒后，進行Cla I和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用回收試劑盒進行大片段的回收，-20℃?zhèn)溆谩?4)連接Myostatin片段和pPICZαC載體片段按3∶1摩爾比例，在T4 DNA連接酶的作用下，4℃16小時進行連接反應(yīng)。(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10F’菌株，培養(yǎng)基為25μg/ml的ZeocinTM低鹽LB培養(yǎng)基，挑選陽性克隆雙酶切鑒定。將正確的重組質(zhì)粒pPICZαC-MSTN送往測序公司測序，檢測插入是否正確。
全文摘要
從大白豬的肌肉組織的cDNA中，PCR擴增出豬抑肌素基因(Myostatin)全長cDNA序列，產(chǎn)物全長1128bp，即為豬Myostatin編碼蛋白376個氨基酸序列。構(gòu)建了大白豬Myostatin蛋白編碼序列的真核表達載體pPICZαC-MSTN，經(jīng)PCR、酶切和測序檢測分析，片段大小與理論相符，證明構(gòu)建成功?？蔀檫M一步表達具有生物活性的豬抑肌素蛋白奠定基礎(chǔ)，也可為深入研究Myostatin基因的生物學特性和功能提供一個方便有效的基本材料。
文檔編號C12N15/81GK101724647SQ200810172948
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者劉娣 申請人:劉娣;丁鐫;張冬杰