專利名稱：：水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界人口的一半以上以稻米為主要食物。隨著全球人口的激增，耕地面積的逐年減少，如何進一步提高水稻產(chǎn)量來滿足人類不斷增長的需求已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一項主要任務(wù)。分蘗是影響水稻產(chǎn)量的一個重要農(nóng)藝性狀，水稻形成的分蘗數(shù)是決定每畝穗數(shù)的前提，而穗數(shù)又是構(gòu)成產(chǎn)量的重要基礎(chǔ)。影響水稻分蘗發(fā)生的栽培條件和生理機制已有廣泛深入的研究，但關(guān)于水稻如何控制分蘗發(fā)生的分子生物學(xué)機制，目前尚不十分清楚。一般認為水稻的分蘗數(shù)目是受多基因控制的數(shù)量性狀，并且很容易受到環(huán)境條件的影響。J.Q.Yan等研究報道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了23個影響分蘗數(shù)目的數(shù)量性狀位點(QTLs)，分布在除第9，第10號之外的其余10條染色體上。此外，主效基因的突變造成的有關(guān)水稻分蘗性狀的突變體也分別被收集和研究，一類降低水稻分蘗數(shù)目的少分蘗突變體，分別被命名為rc"厶rc/么jr;7ArciAir/5"(rcn，reducedculm薩ber),經(jīng)典遺傳學(xué)分析表明這類突變體是由單個隱性基因控制，并且rc/7厶2,5被分別定位在水稻的第6，4，6號染色體上。寡分蘗突變體monoculml由于其幾乎喪失分蘗的能力而成為研究分蘗分子生物學(xué)機制很好的材料，M"是第一個被克隆的控制水稻分蘗的基因，它是番茄和擬南芥中控制側(cè)枝發(fā)生的Zafera7sw/reMM基因的同源基因，表達的蛋白屬于GRAS家族的轉(zhuǎn)錄因子。水稻的另一類分蘗突變體，表現(xiàn)為單株分蘗數(shù)目的增加，但在這類多分蘗突變體中分蘗的增多卻總是和植株的矮化協(xié)同出現(xiàn)，如8個非等位的矮化突變體d3，4，5，10，14，17，27，33都表現(xiàn)出很強的分蘗能力，矮化并且叢生，看起來象草。此外，在水稻的細稈多分蘗突變體fineculml中，通過同源克隆FINECULM1(FC1)被鑒定為TE0SINTEBRANCHED1(TBI)的同源基因0STB1，該基因的蛋白產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子，其功能主要為抑制側(cè)芽的活性。最近，Shinji通過對5個多分蘗矮稈突變體(d3，d10，d14，d17，d27)的研究發(fā)現(xiàn)這些分蘗相關(guān)的基因主要是控制分蘗芽的休眠來影響芽的生長活性；通過圖位克隆鑒定出D3為擬南芥MAX2/0RE9的同源基因。至今尚未有報道發(fā)現(xiàn)僅分蘗數(shù)增多而株高未受影響的水稻多蘗突變體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的水稻分蘗相關(guān)蛋白，名稱為HTD1，來源于水稻(fo丁M幼^'Ksvar)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID他3;2)將序列表中SEQID他3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)。序列表中的序列3由609個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。如將序列3的自氨基端第599位脯氨酸殘基取代為亮氨基酸殘基的與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)；將序列3的自氨基端第599位脯氨酸殘基取代為亮氨基酸殘基且將序列3缺失自氨基端第37位-39位氨基酸殘基而得到的由606個氨基酸殘基組成的與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)。.HTDl的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。HTD1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNq:2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQIDNa:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDN2:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQIDN2:2限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中的序列2由2017個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'端第28位至1857位堿基。HTD1的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDN2:1的DNA序列;2)編碼序列表中SEQIDN2:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDN2:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQIDN2:1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中的序列1為^r貝的基因組序列，包含了2626個堿基，該基因含有7個外顯子(序列1的5'端起1-419，506-864，960-1088，1177-1308，1421-1693，1798-2198，2323-2626)，6個內(nèi)含子(序列1的5'端起420-505，865-959，1089-1176，1309-1420，1694-1797，2199-2322)。所述高嚴謹條件可為在O.1XSSPE(或O.IXSSC)，0.P/oSDS的溶液中，在65。C下雜交并洗膜。含有i7H^基因的表達載體，細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。HTD1的基因表達為組成型表達。擴增^n^基因中任一片段的引物也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)?？衫盟鏊痉痔Y相關(guān)蛋白編碼基因中的15個或15個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸選育水稻品種。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因^T"7導(dǎo)入植物細胞，可獲得改變植物分枝的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動子、增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細胞進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入可選擇性標記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達載體時也可不攜帶任何標記基因，在苗期進行特定PCR分子標記篩選。含有本發(fā)明的^^的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明的水稻分蘗相關(guān)蛋白通過抑制腋芽的生長活性而達到控制分蘗的發(fā)生。因此，通過基因工程的方法能利用該水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因有效地調(diào)節(jié)和控制分蘗的發(fā)生，從而使水稻的分蘗發(fā)生理想化，即早期分蘗發(fā)生快，中后期不發(fā)生分蘗，既保證每畝的穗數(shù)，又杜絕無效分蘗，避免浪費營養(yǎng)物質(zhì)，以最終達到光合物質(zhì)的經(jīng)濟產(chǎn)量產(chǎn)出最大化。本發(fā)明中的水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)τ诤侠砼渲盟局仓杲Y(jié)構(gòu)，進一步提高水稻產(chǎn)量具有重要的作用。下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。圖1A為肌P/基因被初步定位于RM241和RM303標記之間圖IB為y^Z7區(qū)間包含的BAC克隆群圖1C為t^Z7基因被最后定位于BACAL663000上兩個CAPS標記C2和F2之間的30Kb的物理區(qū)間圖2為dCAPS標記分析力tw/asn:"7的DNA序列單核苷酸點突變的特異性圖3為日本晴的力to7/MO^基因的結(jié)構(gòu)特征圖4為南京6的的southern分析圖5為TO代轉(zhuǎn)基因植株的Hyg基因驗證圖6為TO代轉(zhuǎn)基因植株的dCAPS驗證圖7為TO代轉(zhuǎn)基因植株的表型恢復(fù)圖8為^H7在不同組織內(nèi)的表達分析圖9為^7P7::GUS的轉(zhuǎn)基因植株的GUS分析具體實施例方式下述實施例中提到的實驗方法如無特別說明均為常規(guī)方法。T。表示由多蘗矮桿突變體新泰矮的^傷組織得到的轉(zhuǎn)基因植株，L表示T。代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。實施例l、水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因的獲得1、水稻分蘗相關(guān)基因#77^的遺傳分析'多蘗矮桿突變體新泰矮(秈稻)從雙矮突變體矮泰引-2和高稈秈稻品種南京6號的雜交組合中分離得到(LiangGH，P.，X.B,，Gu，M.H.，Ji，C.Q.(1995).〃TheisolationandgeneticidentificationofasemidwarfgenefromanindicaricevarietyAitaiyin2.〃Chinese.T.RICESci.9:189-192)。在水稻已經(jīng)抽穗植株定高后，分別測量南京6號、多蘗矮桿突變體新泰矮以及南京6號和多蘗矮桿突變體新泰矮的正交和反交F,代的株高和分蘗數(shù)，結(jié)果如表l所示，表明多蘗矮桿突變體新泰矮的株高顯著低于野生型品種南京6號(82.64/140.52)，降幅為41.2%;而新泰矮的分蘗數(shù)卻顯著高于野生型品種南京6號(99.5/11.0)，升幅為8倍多；新泰矮與南京6號的正交和反交的Fi代植株的株高和分蘗性狀與南京6號表現(xiàn)相似，說明F,代植株的株高和分蘗性狀均表現(xiàn)正常。在南京6號和新泰矮的正交和反交的R代中，得到了492株正常表型個體和155株多蘗矮稈突變體，符合3:1的分離比例(X2=0.322)。此外，新泰矮還分別與另外三個野生型水稻品種(IR24，日本晴和Lemont)進行了雜交，在各組合的&代中植株中，正常多蘗矮稈型的分離比例都符合3:1(表2)。這些結(jié)果表明，多蘗矮桿突變體新泰矮的多蘗和矮化性狀是由細胞核內(nèi)單個基因的隱性突變造成的。表1.多蘗矮桿突變體新泰矮與南京6號及其F,的分蘗數(shù)和株高<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.多蘗矮稈表現(xiàn)型在不同雜交組合F2代中的分離<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、水稻分蘗相關(guān)基因^r/^的精細定位利用新泰矮/Lemont組合F2中643個多蘗矮稈類型植株將〃H7初步定位在第4染色體上兩個微衛(wèi)星標記RM241和RM303的區(qū)間(圖1A)，具體方法為找出一系列和目的性狀連鎖的分子標記，應(yīng)用Mapmaker分析軟件對這些分子標記構(gòu)建分子遺傳圖譜，將目的基因限定在一定的區(qū)間。為了進一步縮小目的基因的界定區(qū)間，通過利用另一個組合新泰矮/日本晴R中的4600個多蘗矮稈類型植株分別篩選兩個微衛(wèi)星標記RM241和賜303，找出RM241和RM303和目的基因間發(fā)生交換的植株，通過設(shè)計新的分子標記，并將這些交換植株繼續(xù)篩選新的分子標記，通過多次的染色體步行最終將定位在BACAL663000上兩個CAPS標記C2和F2之間的30Kb的物理區(qū)間(圖1B和C)。圖1C中，橫線下的數(shù)字代表對應(yīng)標記和的-交換單株數(shù)。在^^7精細定位中根據(jù)日本晴和9311的基因組DNA的秈粳差異設(shè)計的CAPS引物及特定的限制內(nèi)切酶如表3。表3.本發(fā)明過程中所創(chuàng)制的CAPS標記和引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>d5-CGTCCCTGCCTCTATCTCTGC-31350TaqIAL6070065誦CTACTCAATCGCCACCATCCAC-3A65-ATGCCACACGGACAAGACG-31137DraIAL6630005-TGCAAGCCCCCAAGTTACC-3S25-ATGGCAAGTTCGTGGTAATGAG-3237SSLPAL6630005-GGATGCCCCTAGACAGTGACA曙3C25-AACAGGGGCAGGATTGGAAGGAGA-31357VspIAL6630005-GGGGGTGCGAAAGGCTGCTGTC-3C35-ACGCGTGGGTTGTTGGTCT-31110HinflAL6630005-ACTCCCGTATGATGCTGTCTCG-3F25隱TCTAATCTAAAAGCGAAAATGACG-31007NdeIIAL6630005-TATGTAAGTGGGGTGTAAATGAGG陽3T\5-CCGTCGGCTCCACCATCTC-31032AccIAL6630005-TCAAACATCCACAAATCCACAACC-3Dj5-GTCTGACCGGGCTGTGTATGC-31217SspIAL6630005陽GCCCGCTCCCAAACTGAAC-3Fi5-CCTTTGGCTGCCTCACCTCAC-31169EcoRIAL6630005-GGCAAACCGCGCTTAGTCG-3X25-TGTCCCAGCACCGGCATACCT-31207HinflAL6630005-TTCATCCATCCATCTTCCACTCCT-3E25-CGTCTCAATCTACACCTCGTTC-31136XbaIAL6630005-GGTTTCTTTCTCCCTCGTCTTC-3Ai5-GTGAACAATTGCCCGATAAGC-31365CfoIAL6066475-TGCAATTGTGGACCGATGTG陽33、^rw候選基因的鑒定通過圖位克隆，i^"7基因被定位在30Kb的DNA區(qū)間內(nèi)，而繼續(xù)通過擴大定位群體進一步縮小目的基因所在區(qū)間已無必要。通過DNA測序的方法比對了多蘗矮桿突變體新泰矮和南京6的30Kb區(qū)間的DNA序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在界定區(qū)間內(nèi)的30KbDNA序列里，多蘗矮桿突變體新泰矮和南京6之間存在許多差異，其中包括堿基的插入、缺失、替換；同時參照比對多蘗矮桿突變體新泰矮與日本晴和9311已知的相應(yīng)的DNA序列以發(fā)現(xiàn)特異的(也不同于日本晴和9311)堿基變化。為了找出30KbDNA序列內(nèi)的0RFs，將此30KbDNA序列侯選區(qū)域的基因組序列和K0ME(http:〃cdna01.dna.affrc.go.jp/Cdna/)(KikuchiSetal.Collection,mapping,andannotationofover28，000cDNAclonesfromjaponicarice,science2003301:376-379)中的cDNA數(shù)據(jù)進行blastn分析，以找出該侯選區(qū)域基因組序列的0RFs;由于KOME內(nèi)的cDNA數(shù)據(jù)的非完全性，同時對侯選區(qū)域的基因組序列用GENSCAN軟件(http:/genes,mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測可能的編碼區(qū)(0RF)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該界定區(qū)間含有5個ORFs。DNA序列的比對和侯選區(qū)域基因組序列內(nèi)ORFs的鑒定結(jié)果表明大多數(shù)的DNA堿基變化發(fā)生在基因間區(qū)間和基因內(nèi)的內(nèi)含子上；有些發(fā)生在基因的外顯子上的DNA堿基變化造成同義突變；但多蘗突變體新泰矮中的fl5YT/^的0RF序列(序列4)的1787(對應(yīng)于序列2日本晴的cDNA序列的1823)處發(fā)生了胞嘧啶(cytosine)替換成胸腺嘧啶(thymine)(1787，C/T)，導(dǎo)致了該基因表達蛋白0SCCD7的596處的脯氨酸(prolin)(對應(yīng)于序列3日本晴的0SCCD7的599處脯氨酸)變成了亮氨酸(leucine)(596P/L)。根據(jù)該點DNA序列的差異，設(shè)計了dCAPS引物5-TCTCTTTGCTTCTTGACAGTATGC-3、5-CCAGAAACCATGGAATCCCCTT-3用以鑒定此點突變的特異性，分別以表4中的水稻品種基因組DNA為摸板，該對引物可擴增出150bp的PCR產(chǎn)物，野生型南京6的此PCR產(chǎn)物經(jīng)styI(識別位點CCWWGG)酶切后縮小到130bp;由于多蘗矮桿突變體新泰矮的堿基變化(1787，C/T)導(dǎo)致多蘗矮桿突變體新泰矮的PCR產(chǎn)物不能被styl酶切，仍保持150bp大小。結(jié)果表明所測試的19個野生型品種的PCR產(chǎn)物都能被styl酶切而變?yōu)?30bp，只有多蘗矮桿突變體新泰矮的PCR產(chǎn)物不能被styl酶切(圖2)，l-20為表4中的水稻品種號。這些結(jié)果說明與所測試的野生型品種比較，多蘗矮桿突變體新泰矮的該基因核苷酸的點突變是特異的，這也說明在野生型品種中該基因所表達的蛋白其596(秈稻)或599(粳稻)處的脯氨酸是固定不變的(表4)，該氨基酸在功能上是保守的。(cDNA克隆AK109771來自日本晴Nipponbare)。cDNA克隆AK109771表達蛋白0SCCD7(序列3)的BLAST分析結(jié)果表明，0SCCD7是擬南芥MAX3/CCD7(Genbank,AC007659)的同源蛋白，己有研究證實擬南芥的MAX3是一個胡蘿卜素裂解雙氧酶，該酶與一個新的抑制植物側(cè)枝發(fā)生的信號分子的合成有關(guān)。表4.dCAPS分析驗證0SCCD7表達蛋白5%或599P/L突變的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4、F7^候選基因M(X"7的分子特征通過比較日本晴的flSTO^的cDNA和其基因組DNA序列，發(fā)現(xiàn)fl5tH^共有7個外顯子(序列1的5'端起1-419，506-864，960-1088，1177-1308，1421-1693，1798-2198，2323-2626)，6個內(nèi)含子(序列1的5'端起420-505，865-959，1089-1176，1309-1420，1694-1797，2199-2322);其基因組全長為2626bp(序列l(wèi))，cDNA全長為2017bp(序列2)，其開放閱讀框架(0RF)為序列2自5'端第28至1857位共有1830堿基；該基因編碼蛋白長度為609個氨基酸(圖3，陰影框代表基因的外顯子，黑線代表基因內(nèi)的內(nèi)含子)。突變體在最后的外顯子上發(fā)生了單核苷酸的替代.(1787C/T)導(dǎo)致單氨基酸的變化(596，P/L);而在秈稻品種9311和多蘗矮桿突變體新泰矮以及南京6中，由于該基因第一個外顯子上都缺失了9個核苷酸GCCGCCGCC(自序列1的5'端第136位-144位堿基，自序列2的5'端第136位-144位堿基)(翻譯后缺失3個A，自序列3的氨基端第37位-39位氨基酸殘基)而使其cDNA序列長度變?yōu)?821bp，這9個核苷酸的變化可能是秈粳水稻亞種間的差異；另外，根據(jù)秈稻品種9311和南京6并沒有因為缺失這3個氨基酸而影響分蘗的發(fā)生說明突變體的多蘗矮化也不是由于該處氨基酸的缺失所致。提取水稻品種南京6的基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、EcoRV和Dral消化并轉(zhuǎn)膜，以flSZT"7的cDNA(序列2)為探針進行southern,結(jié)果如圖4所示，表明OStn7在水稻基因組中是以單拷貝形式存在。圖4中，Marker為DL2000。5、功能互補實驗為了進一步證實v^^M疾選基因的功能，進行了OSCO^在突變體內(nèi)的功能互補實驗。首先，對含有仍rr/^基因的BAC克隆AL663000進行酶譜分析，發(fā)現(xiàn)該BAC經(jīng)EcoRI完全酶切后能分離出一含有該基因的合適的DNA片段，該片段包含了該基因起始密碼子ATG上游的3679bp的DNA序列和該基因終止密碼子TGA后572bpPro14中花llPro矮Pro15LemontPro802Pro16C418Pro青Pro17KL908Pro63Pro18蘭勝ProPro19培矮64Pro10麗江Pro2002428Pro::桂輻葉恢3S新浙窄明1456789的DNA序列，共有6690bp大小。通過酶切、回收以及DNA片段的脫磷酸化后，將該基因片段用連接酶連到相同酶切和脫磷酸化后的雙元載體pC認BIA1301上，得到含有oszr";7(序列i)的質(zhì)粒pCambiai301-仍ro;7，通過電擊的方法將pCAMBIA1301-仍rC"7轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(^rotecfen'咖f娜e/a"'e"s)株系LBA4404中。利用多蘗矮桿突變體新泰矮的成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。結(jié)果得到4個獨立的T。株系T。-l，T。-2，T。-3和T。-4。對該T。株系利用潮霉素基因的引物(Pl:5，-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3，，P2:5，-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3，)PCR擴增潮霉素基因，利用dCAPS引物5-TCTCTTTGCTTCTTGACAGTATGC-3和5-ccagaaaccatggaatcccctt-3進行^7Z7/ttSZr"7內(nèi)特異的單核苷酸替代(1787C/t)區(qū)域的PCR擴增和限制內(nèi)切酶StyI的酶切分子鑒定，結(jié)果如圖5和圖6所示，圖5表明T。株系中擴增得到大小為852bp的潮霉素基因，圖6表明dCAPS引物在轉(zhuǎn)基因植株(2-5)基因組內(nèi)擴增的產(chǎn)物經(jīng)Styl酶切后出現(xiàn)150bp和130bp兩條DNA帶，而作為對照植株的突變體(l)的dCAPS擴增產(chǎn)物不能被Styl酶切仍然為150bp大?。怀泵顾鼗虻腜CR擴增和^W7/(^Ca7基因內(nèi)特異的單核苷酸替代的分子鑒定證實了外源基因仍rCZ^確實已整合到轉(zhuǎn)基因植株中。圖5中，l為對照，水，2-7為T。株系，8為陽性對照，pCAMBIA130卜AS"07";7，M為DL2000。圖6中，1為突變體對照，2-5為T。株系，M為DL2000。對t。轉(zhuǎn)基因植株進行形態(tài)觀察，結(jié)果表明t。轉(zhuǎn)基因植株的分蘗數(shù)恢復(fù)正常，株高也恢復(fù)正常(圖7，CK為多蘗矮桿突變體新泰矮)。在3個T。株系的各自L代中都分別有突變體和野生型植株的分離，其分離情況如表5。這些結(jié)果證實了表5.轉(zhuǎn)基因植株L代分離情況株系野生型多蘗矮稈型總和t廣l396154550tv218075255t廣322063283實施例2、#7Z/的表達分析為了研究^T/^在水稻中的表達模式，分別提取了水稻的葉、莖稈、穗和根等不同組織的RNA，以i77^7的cDNA(序列2)為探針進行Northern雜交，結(jié)果如圖8所示，表明^7"7在以上這些組織內(nèi)都有表達，但地上部分組織內(nèi)表達較強，根內(nèi)表達較弱。另外，在用含有HTD1和GUS融合蛋白編碼基因^7Z^....6ZS的載體轉(zhuǎn)化水稻得到的轉(zhuǎn)基因植株中，GUS的組織化學(xué)染色結(jié)果表明^T"7,;^/S基因的水稻植株的葉中脈，葉鞘，莖節(jié)，穗和根組織中GUS都有表達，其中各組織也進一步證實了^7^基因表達模式的Northern結(jié)果；同時，GUS的組織化學(xué)染色結(jié)果也揭示^T"7基因可能僅在植株的維管束內(nèi)表達(圖9)。序列表<160>4<210〉1〈211〉2626<212〉DNA〈213〉7乂稻屬7jC稻(^rz3〈400〉1aacgaccgaaggaggccaagtccaaagatggcaacacaagcgattgcaccgatgcacgcc60gccgtcgtgcaccgccaccacgttctaccaccccgccgctgcgtgcgccgccgtggcgtc120ttcgtccgcgcctcggccgccgccgccgccgccgccgccgagacggacacgctgtccgcg180gccttctgggactacaacctcctcttccggtcgcagcgcgacgagtgcctcgactccatc240ccgctccgcgtcaccgagggcgcgatcccgcccgacttcccggccggcacctactacctc300gccgggccgggcatcttctccgacgaccacggctccaccgtccaccccctcgacggccac360ggctac,ctccgctccttccgcttccggcccggcgaccgcaccatccactactccgcgcgg420taagtcgcgccgcgcgcatgcagcagcagcaggtttgtcagtgagagcgacagactgaca480gtgcacgcgtgagtgacgcatgcaggttcgtggagacggcggcgaagagggaggagagcc540gggacggcgcgtcgtggcggttcacgcaccgggggcccUctccgtgctgcagggcggga600agaaggtgggcaatgtgaaggtgatgaagaacgtggccaacaccagcgtgctgcggtggg660gcggccggctgctctgcctctgggagggcggccagccgtacgaggttgacccccggacgc720tcgagaccgtcggcccgttcgacctgctcggcctcgccgccgccgacgacaacaaggcaa780cgaacgcgtctgcagcacgacggccgtggctgcaggaggccggcctcgacgccgccgcgc840gcctgctgcgccctgttcttagcggtgcgtgacactgtaccggagcagcggcctccactt900cgatcgattcggaccgaactgatatgacgctggtgcgcgcgtgcgtgcgtgcggtgcagg960ggtgttcgacatgccgggcaagaggctgctggcgcactacaagatcgacccgcggcgggg1020gcgtctgctgatggtcgcctgcaacgccgaggacatgctcctcccgcgatcccacttcac1080tttctacggtcagctcgccatcgcctcgaccaaccacgcattttccattcgctcctccaa1140aaaaaaaaatcacattgaacggcgtttccatggcagagttcgacgcccacttcgacctcg1200tccagaagcgtgagttcgtcgtgccggaccacctcatgatccacgactgggccttcaccg1260acacccactacatcctcctcggcaacaggatcaagctcgacatccccggtaagg肌gaga1320<image>imageseeoriginaldocumentpage14</image><210〉2〈211〉2017〈212>c醒〈213〉7K稻屬7jC稻(ftrzas<3Z^'ra)<400〉2<image>imageseeoriginaldocumentpage14</image>gccttctgggactacaacctcctcttccggtcgcagcgcgacgagtgcctcgactccatc240ccgctccgcgtcaccgagggcgcgatcccgcccgacttcccggccggcacctactacctc300gccgggccgggcatcttctccgacgaccacggctccaccgtccaccccctcgacggccac360ggctacctccgctccttccgcttccggcccggcgaccgcaccatccactactccgcgcgg420ttcgtggagacggcggcgaagaggg鄉(xiāng)agagccgggacggcgcgtcgtggcggttcacg480caccgggggcccttctccgtgctgcagggcgggaagaaggtgggcaatgtgaaggtgatg540aagaacgtggccaacaccagcgtgctgcggtggggcggccggctgctctgcctctgggag600ggcggccagccgtacgaggttgacccccggacgctcgagaccgtcggcccgttcgacctg660ctcggcctcgccgccgccgacgacaacaaggcaacgaacgcgtctgcagcacgacggccg720tggctgcaggaggccggcctcgacgccgccgcgcgcctgctgcgccctgttcttagcggg780gtgttcgacatgccgggcaagaggctgctggcgcactaca卿tcgacccgcggcggggg840cgtctgctgatggtcgcctgcaacgccgaggacatgctcctcccgcgatcccacttcact900ttctacgagttcgacgcccacttcgacctcgtccagaagcgtgagttcgtcgtgccggac960cacctcatgatccacgactgggccttcaccgacacccactacatcctcctcggcaacagg1020atcaagctcgacatccccggatcgctgctggcattgacgggcactcacccgatgatcgcg1080gcgctggccgtggacccgagaaggcagtcgacgccggtgtacctgcttccgcgctxcccg1140gagaccgaggcgggcggccgcgactggagcgtgccgatcgaggcgccgtcgcagatgtgg1200tccgtgcacgtcggcaacgcgttcgaggaggcgaaccgccggggcggcctcgacgtccgg1260ctgcacatgtcaagctgctcctaccagtggttxcatttccacaggatgtttggttacaat1320tggcaccacaagaagctggacccgtcgttcatgaacgcggcgaagggaaaggagtggctg1380cctcgcctcgttcaggtggccatcgagctcgacaggacgggagagtgccggaggtgctca1440gtcaggaggctgtccgatcagcacgccaggccggcggacttcccggcgataaacccaagc1500tacgccaaccagaggaaccggttcgtctacgccggcgccgcgtccggctcccgcagattc1560ctcccgtacttcccgttcgacagcgtggtgaaggtcgacgtctccgatggatcggcgcgg1620tggtggtctaccgacgggcgcaagttcgtcggcgagccggtcttcgtcccgaccggcggc1680ggagaggatggtggctatgttcttcttgtagagtatgcagtctccaagcacagatgccgt1740ctagtggtgctggatgcaaagaagatagggacagagaatgcacttgtggcaaaactagag1800gtgccaaagaacctxacttttccaatgggattccatggtttctggggagatgaatgagca1860tagagcaagcatcagatccagtctaactctggagagaaattgtcttgaaaaggcaagaat1920tttgccixgtgtattgataaaagagagttttgtgataatctgtacatggtggagaggaat1980tatcaggggaaccaaataactactgtacatccagtct2017〈210〉3〈211〉609<212〉PRT〈213〉水稻屬水稻(flr7M〈400〉3MetAlaThrGinAlalieAlaProMetHisAlaAlaValValHisArg151015HisHisValLeu20SerAlaValArgAla35AlaAlaPheProProArgAlaLeuAsp65ProPheTyrSerGly145GlyThrGlyPheAla225AlaGlySer50GluProSerLeuAla130AlaGlySerGinAsp210SerAlaLysCysLeuAspAspPheAspArg115ArgSerLysValPro195LeuAsp100SerPro85HisAlaTrpSer70AlaGlyPheArgPheValGluTrpLysLeu180TyrLeuAlaArgVal165ArgGluGlyArgAsp55工leGlySerPheThr135ThrArgAla40TyrProThrThrArg120AlaHisPhe150GlyAsnValTrpValLeuGlyAspAla215ProGlyPro200AlaCysValArgArgArgGlyValPhe2530AlaAlaAlaAlaGluThrAspThr45AsnLeuLeuPheArgSerGinArg60LeuArgValThrGluGlyAlalie7580TyrTyrLeuAlaGlyProGlylie9095ValHisProLeuAspGlyHisGly105110ProGlyAspArgThrlieHisTyr125AlaLysArgGluGluSerArgAsp140ArgGlyProPheSerValLeuGin160LysAsnValAlaAsn175CysLeuTrpGluGly190GluThrValGlyPro205AlaAspAspAsnLysAlaThrAsn220LeuGinGluAlaGlyLeu235LeuSerGlyValPheAsp250155LysValMet170ArgLeuLeu185ArgThrLeuAlaAlaArgArgProTrp230ArgLeuLeuArgProVal245ArgLeuLeuAlaHisTyrLyslieAspProArgArgGlyArgAspAla240MetPro255LeuLeuMet275ThrHisPhe290GluPheArg305ThrAspThrHis260265ValAlaCysAsnAlaGluAspMetLeuLeu280285GluPheAspAlaHisPheAspLeu295300ProAspHisLeuMetlieHisAsp310315TyrlieLeuLeuGlyAsnArglieLys325330AlaTyrPheValVal270ProArgSerVaJGinLysTrpAlaPhe320LeuAsplie335ProGlySerLeuLeuAlaAlaLeuArgGlu385GluCysHisGluGly46—5ArgAsnSer370AlaAlaSerHisTrp450GluProArgVal355ProProAsnTyrLys435LeuCysAlaPheLeu340AspGluSerArgGin420LysProArgAspValArgGluMet390GlyPheAspLeuCys470ProProThrGinArg405TrpLeuAspProArgArgPhe485TyrLeuThrGlyThrHisProMetlie345350ArgGinSerThrProValTyrLeu360365AlaGlyGlyArgAspTrpSerVal375380TrpSerValHisValGlyAsnAla395GlyLeuAspValArgLeuHisMet410HisPheHisArgMetPheGlyTyr425430SerPheMetAsnAlaAlaLys440445ValGinValAlalieGluLeuAsp455460SerValArgArgLeuSerAspGin475lieAsnProSerTyrAlaAsn490AlaAlaGlyAlaAlaSerGlySerArgArgPheLeuAlaAlaLeuProProliePheGlu400SerSer415AsnTrpGlyLysArgThrHisAla480GinArg495500505510ProTyrPheProPheAspSerValValLysValAspValSerAspGly515520525SerAlaArgTrpTrpSerThrAspGlyArgLysPheValGlyGluPro530535540ValPheValProThrGlyGlyGlyGluAspGlyGlyTyrValLeuLeu545550555560ValGluTyrAlaValSerLysHisArgCysArgLeuValValLeuAsp565570575AlaLysLyslieGlyThrGluAsnAlaLeuValAlaLysLeuGluVal580585590ProLysAsnLeuThrPheProMetGlyPheHisGlyPheTrpGlyAsp595600605Glu〈210〉4〈211〉1821〈212〉DNA<213〉(Qr/zss"stira)〈400〉4atggcaacacaagcgattgcaccgatgcacgccgccgtcgtgcaccgccaccacgttcta60ccaccccgccgctgcgtgcgccgctgtggcgtcttcgtccgcgcctcggccgccgccgcc120gccgagacggacacgctgtccgcggccttctgggactacaacctcctcttccggtcgcag180cgcgacgagtgcctcgactccatcccgctccgcgtcaccgagggcgcgatcccgcccgac240ttcccggccggcacctactacctxgccgggccgggcatcttctccgacgaccacggctcc300accgtccaccccctcgacggccacggctacctccgctccttccgcttccggcccggcgac360cgcaccatccactactccgcgcggttcgtggagacggcggcgaaaagggaggagagccgg420gacggcgcgtcgtggcggttcacgcaccgggggcccttctccgtgctgcagggcaggaag480aaggtgggcaatgtgaaggtgatgaagaacgtggccaacaccagcgtgctgcggtggggc540ggccggctgctctgcctctgggagggcggccagccgtacgaggttgacccccggacgctc600gagaccgtcggcccgttcgacctgctcggcctcgccgccgccgacgacaacaaggcgacg660aacgcgtctgcagcacgacggccgtggctgcaggaggccggcctcgacgccgccgcgcgc720ctgctgcgccctgttcttagcggggtgttcgacatgccgggcaagaggctgctggcgcac780tacaagatcgacccgcgacgggggcgtctgctgatggtcgcctgcaacgccgaggacatg840ctcctcccgcgatcccacttcactttctacgagttcgacgcccacttcgacctcgtccag900aagcgtgagttcgtcgtgccggaccacctcatgatccacgactgggccttcaccgacacc960cactacatcctcctcggcaacaggatcaagctcgacatccccggatcgctgctggcattg1020acgggcactcacccgatgatcgcggcgctggccgtggacccgagaaggcagtcgacgccg1080gtgtacctgcttccgcgctccccggagaccgaggcgggcggccgcgactggagcgtgccg1140atcgaggcgccgtcgcagatgtggtccgtgcacgtcggcaacgcgttcgaggaggcgaac1200cgccggggcggcctcgacgtccggctgcacatgtcaagctgctcctaccagtggttccat1260ttccacaggatgtttggttacaattggcaccacaagaagctggacccgtcgttcatgaac1320gcggcgaagggaaaggagtggctgcctcgcctcgttcaggtggccatcgagctcgacagg1380acgggagagtgccggaggtgctcagtcaggaggctgtccgatcagcacgccaggccggcg1440gacttcccggcgataaacccaagctacgccaaccagaggaaccggttcgtctacgccggc1500gccgcgtccggctcccgcagattcctcccgtacttcccgttcgacagtgtggtgaaggtc1560gacgtctccgatggatcggcgcggtggtggtctaccgacgggcgcaagttcgtcggcgag1620ccggtcttcgtcccgaccggcggcggggaggatggtggctatgttcttcttgtagagtat1680gtagtctccaagcacagatgccatctagtggtgctggatgcaaagaagatagggacagag1740aatgcacttgtggcaaaactagaggtgccaaagaacctcacttttctaatgggattccat1800ggtttctggggagatgaatga182權(quán)利要求1、水稻分蘗相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№3；2)將序列表中SEQID№3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的水稻分蘗相關(guān)蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述水稻分蘗相關(guān)蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID他2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQIDN2:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDN2:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQIDNq:2限定的DNA序列具有90x以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述水稻分蘗相關(guān)蛋白的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNa:l的DNA序列；2)編碼序列表中SEQIDNs:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；.3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDN2:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQIDN2:1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。5、含有權(quán)利要求2、3或4所述水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因的表達載體，細胞系和宿主菌。6、擴增權(quán)利要求2、3或4所述水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因中任一片段的引物。7、權(quán)利要求2、3或4所述水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因在培育水稻品種中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求2、3或4所述水稻分蘗相關(guān)蛋白編碼基因中的15個或15個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸在選育水稻品種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的水稻分蘗相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№3；2)將序列表中SEQID№3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與水稻分蘗相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)τ诤侠砼渲盟局仓杲Y(jié)構(gòu)，進一步提高水稻產(chǎn)量具有重要的作用。文檔編號C12N15/29GK101392024SQ20081017220公開日2009年3月25日申請日期2005年3月31日優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日發(fā)明者張淑英,朱立煌,江光懷,潘學(xué)彪,翟文學(xué),鄒軍煌,陳增祥申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所