專利名稱：：抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及其識(shí)別的抗原表位和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及單克隆抗體，尤其涉及抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體和抗O型FMDV的中和性單克隆抗體，本發(fā)明還涉及上述單克隆抗體所識(shí)別的中和表位，本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的單克隆抗體和中和表位在預(yù)防口蹄疫中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA，其基因組RNA全長(zhǎng)約8.5kb?？谔阋呤菄?yán)重危害偶蹄動(dòng)物的重要傳染病之一，該病引起幼畜死亡、產(chǎn)奶量下降、肉食減少、肉品下降、動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，由于貿(mào)易的限制和禁止而引起的損失更大，全世界每年由此造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)百億美元。2005年以來(lái)在我國(guó)江蘇、山東、甘肅、北京、河北等地爆發(fā)了Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登錄號(hào)EF149009)，由于在我國(guó)江蘇省首先分離，被稱作Asial型江蘇譜系。該譜系口蹄疫病毒在我國(guó)牛群中一經(jīng)流行，傳播趨勢(shì)迅猛，造成的損失極為嚴(yán)重。本世紀(jì)初O型口蹄疫病毒泛亞譜系在中國(guó)(0/Tibet/CHA/99，GenBank登錄號(hào)AJ539138)及周邊國(guó)家甚至歐洲(MasonPWetal.JGenVirol.2003，84(Pt6):1583-93)均有流行，給許多國(guó)家造成巨大損失。因此，積極開展Asial型和0型口蹄疫(FMD)的研究，對(duì)我國(guó)FMD的防控具有重要的意義?？谔阋卟《镜目乖Y(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株的口蹄疫病毒其抗原表位和抗原位點(diǎn)都不盡相同，存在廣泛的抗原變異。利用單抗逃逸突變株序列分析和交叉中和試驗(yàn)，已鑒定了一些不同血清型FMDV的抗原位點(diǎn)，相關(guān)的研究主要來(lái)自0、A、C和Asial型FMDV。中和性抗體在保護(hù)易感動(dòng)物抵抗口蹄疫病毒感染過(guò)程中起主導(dǎo)作用，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體的抗原位點(diǎn)主要位于各個(gè)血清型FMDV的VP1上，VP1的G-H環(huán)是病毒最重要的中和性抗原位點(diǎn)所在，該環(huán)中既存在線性表位，又存在構(gòu)象型表位。在O型FMDV的VP1蛋白中，G-H環(huán)133-157aa和C_末端200_213aa的線性表位組成重要的抗原位點(diǎn)1。Saiz等報(bào)道，F(xiàn)MDVA5亞型有2個(gè)中和性抗原位點(diǎn)，一個(gè)是線性表位，位于VP1的C_末端，關(guān)鍵殘基在198aa，另一個(gè)位于VP2的B_C環(huán)上，由2個(gè)表位組成，包括72aa和79aa。SantinaGraziolideng用大量單抗進(jìn)一步確定，Asial型FMDV存在4個(gè)中和性抗原位點(diǎn)位點(diǎn)1位于VP1的142aa，與0型VP1的144aa相對(duì)應(yīng)，在保守的RGD基序側(cè)翼；位點(diǎn)2位于VP2的B-C環(huán)區(qū)，包括67、72、74、77和79aa等多位殘基，而且與VP1的49aa和207aa相關(guān)聯(lián)；位點(diǎn)4位于VP3的B-B結(jié)節(jié)上，關(guān)鍵殘基為58aa和59aa，該位點(diǎn)與位點(diǎn)2相關(guān)聯(lián)；位點(diǎn)5位于VP3的C-末端，作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立位點(diǎn)被首次提出，218aa為關(guān)鍵性殘基。國(guó)外這些研究是用單克隆抗體壓力篩選或用合成肽掃描技術(shù)，只能確定表位相關(guān)氨基酸或肽段，不能精確確定表位的性質(zhì)和位置。我國(guó)已有Asial型和0型FMDV中和活性單克隆抗體的文章發(fā)表，然而尚未見到中和表位的研究報(bào)道，因此，這些已發(fā)表中和性單克隆抗體的功能性和價(jià)值尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一株能分泌抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；本發(fā)明目的之二是提供一株能分泌抗0型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；本發(fā)明目的之三是分別提供由上述中和性單克隆抗體所識(shí)別的亞洲1型FMDV中和表位氨基酸序列和0型FMDV中和表位氨基酸序列；本發(fā)明目的之四是將上述單克隆抗體或中和表位用于診斷或預(yù)防口蹄疫。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的—株能分泌抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.2692;保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；由該雜交瘤細(xì)胞系所分泌的抗亞洲1型FMD的中和性單克隆抗體，分類命名為3E11;—株能分泌抗0型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.2691;保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；由該雜交瘤細(xì)胞系所分泌的抗0型FMDV的中和性單克隆抗體，分類命名為8E8;由單克隆抗體3E11所識(shí)別的亞洲1型FMDV構(gòu)象型中和表位，該構(gòu)象表位的關(guān)鍵性氨基酸殘基是由亞洲1型麗的VP1蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149組成；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述構(gòu)象表位的模擬表位的氨基酸序列為GSLXXL(SEQIDNO:l)，其中，X選自任意一種氨基酸殘基；由單克隆抗體8E8所識(shí)別的0型FMDV的VP1蛋白中的一段線性中和表位序列，其氨基酸序列為GDLNVRT(SEQIDNO:2)或者為其衍生序列；其中，所述的衍生序列是對(duì)GDLNVRT中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行缺失和/或替換后所得到的任意一種的氨基酸序列，其中所述的缺失是將G缺失；所述的替換選自以下6種中的任意一種或一種以上進(jìn)行的組合(1)G用W替換；(2)L用A替換；(3)N用Q、A或W替換；(4)V用I或T替換；(5)R用L、K或A替換；(6)T用A替換；經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，上述的經(jīng)過(guò)缺失和/或替換后所得到的衍生序列與GDLVRT均具有相同的性能與用途。本發(fā)明技術(shù)方案的詳細(xì)描述本發(fā)明用純化的全病毒免疫BALB/c鼠制備抗Asial型FMDV江蘇譜系A(chǔ)sial/YS/CHA/05株、0型FMDV泛亞譜系O/YS/CHA/05株的單克隆抗體，各獲得一株具有強(qiáng)中和活性的單克隆抗體3E11和8E8。間接免疫熒光和Westernblot檢測(cè)表明，3E11識(shí)別Asial型FMDV—個(gè)構(gòu)象型優(yōu)勢(shì)中和表位，該單抗與一個(gè)親本變異株(144位由G突變?yōu)镾)無(wú)反應(yīng)，由此推斷VP1蛋白上144位Gly是單抗3E11識(shí)別表位的關(guān)鍵性氨基酸；8E8識(shí)別0型FMDV一個(gè)廣譜的線性中和表位。本發(fā)明進(jìn)一步利用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)篩選上述兩個(gè)單抗識(shí)別的模擬表位，發(fā)現(xiàn)一個(gè)表位基序GSLXXL(X代表20種氨基酸殘基任意一種)與單抗3E11具有結(jié)合活性，而單抗8E8的模擬表位基序?yàn)镚DLNVRT。鑒于兩個(gè)單抗的特性，用合成肽對(duì)單抗3E11識(shí)別的模擬表位基序的4個(gè)保守性氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變分析確定，這些氨基酸均為關(guān)鍵性氨基酸；同時(shí)合成Asial/YS/CHA/05株VP1蛋白G-H環(huán)的136153aa序列，該十八肽包含GSLXXL基序所有4個(gè)關(guān)鍵性氨基酸，肽ELISA檢測(cè)顯示與單抗3E11同樣具有結(jié)合活性，從而確定該構(gòu)象表位的關(guān)鍵性氨基酸殘基是由VP1蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149組成。單抗8E8模擬表位基序與0/YS/CHA/05株VP1蛋白的146152位氨基酸序列存在高度同源，因而將146GDLQVLT152序列及其截短肽序列與GST融合表達(dá)并進(jìn)行Westernblot分析，確定147DLQVLT152是0型FMDVVP1上的一個(gè)線性B細(xì)胞表位；針對(duì)病毒VP1真實(shí)序列中146152aa肽(P-8E8)合成一系列定點(diǎn)誘變肽并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，結(jié)果顯示，氨基酸殘基D對(duì)于該表位活性最為關(guān)鍵，殘基V、L148、L151、Q和T對(duì)于表位活性起重要作用，而且殘基T不可缺失。鑒于上述兩個(gè)單抗在體外具有很高的中和滴度，本發(fā)明進(jìn)而用乳鼠保護(hù)試驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證上述兩個(gè)單克隆抗體對(duì)FMDV感染的免疫保護(hù)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)Asial型和0型FMDV的單克隆抗體3E11和8E8腹水的半數(shù)保護(hù)量(PD5。)分別為1995和2371;僅用8PD5。單抗3E11和11PD5。單抗8E8，就可完全保護(hù)乳鼠耐受致死劑量Asial型和0型FMDV的攻擊。被動(dòng)免疫的乳鼠在攻毒后體重增長(zhǎng)的百分率隨單抗?jié)舛鹊纳叨?，而且隨著單抗?jié)舛鹊纳撸槭蟮钠鹗妓劳鰰r(shí)刻后延、終點(diǎn)死亡時(shí)刻前移。通過(guò)體外中和試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物被動(dòng)免疫保護(hù)保護(hù)試驗(yàn)說(shuō)明，本發(fā)明的3E11單抗和8E8單抗具有良好的被動(dòng)免疫效果，這兩株單抗均能應(yīng)用于口蹄疫的緊急預(yù)防，可以對(duì)口蹄疫的被動(dòng)免疫起到良好的免疫效果；用這兩個(gè)單抗所識(shí)別的FMDV血清型的保護(hù)性抗原表位可以進(jìn)一步研究或開發(fā)出口蹄疫二價(jià)表位疫苗，對(duì)于口蹄疫的免疫預(yù)防將具有重要的意義。圖1ELISA方法篩選單抗3E11特異性親和的噬菌體；用相同蝕斑數(shù)的各噬菌體克隆加入用單抗3E11包被的微孔板中，并設(shè)同種抗體亞型的單抗4C6、含BSA的封閉液和原始月太庫(kù)(PhageLibrary,PL)作為對(duì)照。圖2合成肽P-S7及其突變肽與單抗3E11結(jié)合活性的檢測(cè)；包被鏈酶親和素，分別加入系列稀釋的生物素化短肽P-S7和隨機(jī)打亂肽P-S7-SCR，與3E11結(jié)合反應(yīng)后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，顯色并測(cè)定吸光值。圖3合成肽P-S7及其突變肽與單抗3E11結(jié)合活性的檢測(cè)；用合成肽P_S7競(jìng)爭(zhēng)抑制單抗3E11與病毒抗原的結(jié)合包被lug病毒抗原，加入合成肽與單抗3E11預(yù)混液，最后加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗。圖4合成肽P-S7及其突變肽與單抗3E11結(jié)合活性的檢測(cè)；合成肽定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)鑒定P-S7肽與單抗3E11相互作用的關(guān)鍵性氨基酸，以單抗3E11與未突變短肽P-S7反應(yīng)的0D4。5值為100%，計(jì)算其它短肽的結(jié)合率。圖5合成的18-aaG_H環(huán)十八肽與單抗3E11的結(jié)合活性；包被鏈酶親和素，加入系列稀釋的生物素化短肽AsialpG-H，與單抗3E11反應(yīng)，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，顯色后測(cè)定0D,吸光值。圖6ELISA方法篩選單抗8E8親和的噬菌體；以相同蝕斑數(shù)的各噬菌體克隆加入包5被有單抗8E8的微孔板中，設(shè)同種抗體亞型的單抗5F7、含1%BSA封閉液以及噬菌體肽庫(kù)(PhageLibrary,PL)作為對(duì)照。圖7陽(yáng)性噬菌體克隆的Westernblot分析。圖8表位及其截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE(a)和Westernblot分析(b)。圖9合成肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)；用合成的突變肽競(jìng)爭(zhēng)抑制單抗8E8與病毒結(jié)合。圖10合成肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)；肽濃度為lug/100ul，以P-8E8的抑制率為100%，計(jì)算各合成突變肽的相對(duì)抑制率。圖11合成肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)；用合成的突變肽競(jìng)爭(zhēng)抑制單抗8E8與病毒結(jié)合。圖12合成肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)；肽濃度為lug/100ul，以P-8E8的抑制率為100%，計(jì)算各合成突變肽的相對(duì)抑制率。圖13單抗3E11濃度與乳鼠存活率的關(guān)系；乳鼠經(jīng)10LD5。Asial/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗3E11(即不同中和抗體半數(shù)保護(hù)量)導(dǎo)致乳鼠存活率的差異。圖14單抗8E8濃度與乳鼠存活率的關(guān)系；乳鼠經(jīng)10LD5。0/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗8E8(即不同中和抗體半數(shù)保護(hù)量)導(dǎo)致乳鼠存活率的差異。圖15單抗3E11濃度與乳鼠存活時(shí)間的關(guān)系；乳鼠經(jīng)10LDs。Asial/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗3E11導(dǎo)致乳鼠死亡時(shí)間的差異。圖16單抗8E8濃度與乳鼠存活時(shí)間的關(guān)系；乳鼠經(jīng)10LD5。0/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗8E8導(dǎo)致乳鼠死亡時(shí)間的差異。圖17單抗3E11濃度與乳鼠體重增長(zhǎng)百分率關(guān)系；乳鼠經(jīng)10LD5。Asial/YS/CHA/05攻擊后不同濃度的單抗3E11導(dǎo)致乳鼠體重增長(zhǎng)百分率的的差異。圖18單抗8E8濃度與乳鼠體重增長(zhǎng)百分率關(guān)系；乳鼠經(jīng)10LD5。0/YS/CHA/05攻擊后不同濃度的單抗8E8導(dǎo)致乳鼠體重增長(zhǎng)百分率的差異。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)?！?、材料和方法1.病毒、細(xì)胞、菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口蹄疫病毒株Asial/YS/CHA/05屬于Asial型FMDV江蘇譜系，口蹄疫病毒0/YS/CHA/05株屬于0型泛亞譜系；乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pGEX-6p-l和受體菌BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存；清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠、SPF級(jí)BALB/c乳鼠購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.主要試劑融合劑PEG/DMS0(Mw，1450)、HAT鹽(50x)、HT鹽(50x)、HRP或FITC標(biāo)記的羊抗鼠lgG、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自SouthernBiotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸購(gòu)自Amresco公司；二甲基亞砜(DMSO)、鄰苯二胺(OPD)、PEG6000購(gòu)自Solarbio公司;Ph.D._12"1肽庫(kù)試劑盒購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司；HRP標(biāo)記抗的M13噬菌體抗體購(gòu)自于GEHealthcare公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、Pstl購(gòu)自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司；高糖DMEM干粉購(gòu)自GIBC0公司；進(jìn)口優(yōu)級(jí)胎牛血清(PAA)購(gòu)自西班牙Nalgene公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自加拿大JETBiochemical公司。3.鼠免疫與單克隆抗體的制備(1)將Asial型、0型FMDV細(xì)胞適應(yīng)毒接種于長(zhǎng)滿單層的BHK-21細(xì)胞，待75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變后收毒。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融三次，初步裂解細(xì)胞，釋放病毒。凍融后的病毒液以l:1000加入TritonX-100和4:10000加入甲醛裂解與滅活48h以上，取滅活過(guò)的病毒液lmL上BHK-21細(xì)胞盲傳三代，檢測(cè)是否滅活徹底。將經(jīng)凍融裂解后的培養(yǎng)液作9000rpm(Beckman高速離心機(jī)，JA-10轉(zhuǎn)子)、4。C離心90min，回收病毒液上清，棄去細(xì)胞沉淀。按病毒液上清的體積加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室溫?cái)嚢?h至完全溶解，4。C過(guò)夜沉淀。次日將上清9000rpm、4。C離心90min，棄上清，回收沉淀。用NET緩沖液于低溫下將沉淀輕輕重懸。將重懸的上清29000rpm、4t:離心2h，回收沉淀，于低溫下用適量的NET緩沖液輕輕重懸沉淀，充分混勻后分裝，_701:凍存?zhèn)溆?。將提純抗原用NET緩沖液進(jìn)行10倍、100倍、1000倍稀釋，用分光光度計(jì)測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度。(2)用純化的Asial型、0型FMDV抗原200iig/200uL加等體積弗氏完全佐劑，充分乳化后經(jīng)背部皮下注射6周齡雌性BALB/c小鼠；2周后進(jìn)行第2次免疫，佐劑為弗氏不完全佐劑；間隔2周后，以不加佐劑的等量抗原進(jìn)行第3次免疫。為剌激小鼠快速產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，于融合前3d采用尾靜脈和脾臟注射相結(jié)合的免疫方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，注射二倍量抗原。(3)細(xì)胞融合a)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備細(xì)胞融合前一天進(jìn)行飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備，眼科剪刀、眼科鑷子、平皿等試驗(yàn)用具用前高溫干熱滅菌，HAT完全培養(yǎng)液做無(wú)菌檢驗(yàn)。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常規(guī)方法分離陰性血清。拉頸脫臼處死小鼠，將其浸泡于75%酒精中，10min后移入超凈工作臺(tái)。將小鼠腹部向上固定在鼠架上，用鑷子提起腹正中部皮膚，眼科剪刀橫向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和鑷子上下撕開皮膚，充分暴露腹膜。用鑷子輕輕提起腹膜，將10mL注射器內(nèi)吸取的8-10mLHAT完全培養(yǎng)液注入腹腔，切勿剌破臟器和腸道，注射器不要拔出，在腹腔內(nèi)來(lái)回抽吸5-10次，然后用鑷子按摩兩側(cè)腹部30秒左右，再進(jìn)行抽吸，重復(fù)以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔內(nèi)液體。注意避開腸系膜及脂肪組織，以免堵塞針頭。將從2只鼠中取出的腹腔細(xì)胞加入55mLHAT培養(yǎng)液中，吹散混勻細(xì)胞，分裝于6塊96孔培養(yǎng)板，100iiL/孔。置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。b)骨髓瘤細(xì)胞的制備融合前36-48h，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合當(dāng)天，用15mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞從瓶壁上吹下，收集于50mL離心管中。1000rpm離心10min。將細(xì)胞沉淀重懸置20mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取少量骨髓瘤細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，備用。c)免疫脾細(xì)胞的制備融合前摘除小鼠眼球采血，制備陽(yáng)性血清。將小鼠拉頸脫臼致死，浸泡于75X酒精中，10min后放于超凈臺(tái)。無(wú)菌打開腹腔，分離結(jié)締組織并取出脾臟，將脾臟放入裝有滅菌尼龍網(wǎng)和盛有15mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，用滅菌玻璃注射器內(nèi)芯研磨脾臟，使脾細(xì)胞全部通過(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入平皿中。將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液大約至30mL，混勻。lOOOrpm離心8min，棄上清。將細(xì)胞沉淀懸于10mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，備用。d)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合取65mLHAT培養(yǎng)液，15mL基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液和lmL50%PEG于37。C水浴中預(yù)熱，另備盛有37。C水的200mL燒杯。按5份脾細(xì)胞數(shù)加1份骨髓瘤細(xì)胞數(shù)取相應(yīng)細(xì)胞懸液量，加入50mL玻璃離心管中，補(bǔ)加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液至30mL，混勻。1000rpm離心10min，棄上清，盡可能倒干。用手掌輕擊離心管底部，使沉淀細(xì)胞松散均勻呈糊狀。將離心管放入盛有37t:水的200mL燒杯中，一手均勻轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，另一手用lmL巴氏吸管吸取37°C50%PEG溶液lmL，lmin內(nèi)加完，靜置2min。隨后先慢后快地加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止反應(yīng)，37t:水浴靜置10min。1000rpm離心10min，棄上清，加入65mLHAT培養(yǎng)基，輕輕地吹散細(xì)胞，每孔0.lmL接種于已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的6塊96孔培養(yǎng)板，置37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后半量換液，8d后全換液，待克隆長(zhǎng)至孔底面積1/4-1/3時(shí)取上清進(jìn)行檢測(cè)并換HT培養(yǎng)液。4.抗體檢測(cè)ELISA用提純的病毒抗原包被于微孔板中，加入100uL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37t:溫育lh后洗滌，加入l:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，洗滌后加入底物0PD避光顯色10min，于波長(zhǎng)492nm測(cè)定吸光值。5.間接免疫熒光微孔板培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞至單層，接種口蹄疫病毒4X103TCID5。/well，出現(xiàn)CPE之前用冷無(wú)水乙醇進(jìn)行固定，加入50uL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37t:溫育40min后PBS洗滌三次，加入l:200稀釋的熒光素標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37t:溫育40min，洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察，以+號(hào)數(shù)目記錄熒光強(qiáng)度。6.微量細(xì)胞中和試驗(yàn)(1)病毒毒價(jià)的測(cè)定將病毒接種于單層細(xì)胞，37t:吸附lh后加入維持液，置溫箱培養(yǎng)；逐日觀察，待細(xì)胞病變(CPE)達(dá)75%以上，收獲病毒懸液凍融3次，以3000r/min離心10min，取上清液，定量分裝成lml小瓶置_701:保存?zhèn)溆?，選用的病毒必須是對(duì)細(xì)胞有較穩(wěn)定的致病力。取自_701:冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養(yǎng)板上作IO倍遞進(jìn)稀釋即10—、10—2，10—11……，每孔病毒懸液量為50iU，每個(gè)稀釋度作8孔，每孔加入100細(xì)胞懸液，每塊板的最后一行設(shè)8孔細(xì)胞對(duì)照，制備細(xì)胞懸液的濃度以使細(xì)胞在24h內(nèi)長(zhǎng)滿單層為度。把培養(yǎng)板置5%C02溫箱37t:培養(yǎng)，從48-72h逐日觀察細(xì)胞病變，記錄結(jié)果。按Reed和Muench兩氏法計(jì)算TCID5。。表1TCID50計(jì)算(接種劑量50ii1)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>距離比例=-56%-33%IgTCID5。=高于50%病毒稀釋度的對(duì)數(shù)-距離比例X稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)高于50%病毒稀釋度的對(duì)數(shù)為_6，距離比例為0.26，稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)為_1。IgTCID50=-6+0.26X(—1)=-6.3則TCID5。=10—63，50即病毒作10—6'3稀釋，每孔接種50iU，可使半數(shù)組織細(xì)胞管發(fā)生病變。(2)中和試驗(yàn)動(dòng)物腹水中，含有多種蛋白質(zhì)成分對(duì)抗體中和病毒有輔助作用，如補(bǔ)體、免疫球蛋白和抗補(bǔ)體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應(yīng)因素，用于中和試驗(yàn)的血清或腹水須經(jīng)加熱56°C、30min滅活處理。取已滅活處理的單抗腹水，在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上，用不含血清的匿EM作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等等，每孔含量為50iU，每個(gè)稀釋度作4孔。取-7(TC冰箱保存的病毒液，將原始毒價(jià)稀釋至200TCID5。，50ul(與等量腹水混合，其毒價(jià)為100TCID5。)。如病毒價(jià)為10—63，50iU。所以應(yīng)將病毒作2X10—43稀釋。每孔加入50iU病毒液，封好蓋，置于37t:溫箱中和lh。在制備細(xì)胞懸液時(shí)，其濃度以在24h內(nèi)長(zhǎng)滿單層為度血清與病毒中和lh后取出，每孔加入100iil細(xì)胞懸液。置5%0)237°〇溫箱培養(yǎng)，自培養(yǎng)48h開始逐日觀察記錄，120h終判。為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次試驗(yàn)都必須設(shè)置下列對(duì)照。陽(yáng)性和陰性(sp2/0)腹水與待檢腹水進(jìn)行平行試驗(yàn)，陽(yáng)性腹水對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變，而陰性腹水對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變。每次試驗(yàn)每一塊板上都設(shè)立病毒對(duì)照，先將病毒作0.1、1、10、100、1000TCID5。稀釋，每個(gè)稀釋度作4孔，每孔加50ii1。然后每孔lOOiU細(xì)胞懸液。0.1TCIDTCIDs。應(yīng)不引起細(xì)胞病變，而且100TCID5。必須引起細(xì)胞病變，否則該試驗(yàn)不能成立。為檢查被檢腹水本身對(duì)細(xì)胞有無(wú)任何毒性作用，設(shè)立被檢腹水毒性對(duì)照是必要的。即在組織細(xì)胞中加入低倍稀釋的待檢腹水(相當(dāng)于中和試驗(yàn)中被檢腹水的最低稀釋度)。正常細(xì)胞對(duì)照即不接種病毒和待檢腹水的細(xì)胞懸液L。正常細(xì)胞對(duì)照應(yīng)在整個(gè)中和試驗(yàn)中一直保持良好的形態(tài)和生活特征，為避免培養(yǎng)板本身引起試驗(yàn)誤差，應(yīng)在每塊板上都設(shè)立這一對(duì)照。當(dāng)病毒回歸試驗(yàn)，陽(yáng)性、陰性、正常細(xì)胞對(duì)照相，腹水毒性對(duì)照全部成立時(shí)，才能進(jìn)行判定，被檢腹水孔出現(xiàn)100XCPE判為陰性，50X以上細(xì)胞出現(xiàn)保護(hù)者為陽(yáng)性；固定病毒稀釋腹水中和試驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算，是計(jì)算出能保護(hù)50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生細(xì)胞病變的腹水稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價(jià)。用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計(jì)算結(jié)果。表2固定病毒_稀釋血清法中和抗體效價(jià)計(jì)算<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[OO73]用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計(jì)算結(jié)果80%—50%距離比例=-=0.580%—20%IgPD5。=高于50%血清稀釋度的對(duì)數(shù)-距離比例X稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)IgPD50=-1.5—0.5X(—0.3)=_1.35則PD50=10—136，50ii1因10—135=1/22，S卩1:22的血清可保護(hù)50%細(xì)胞不產(chǎn)生病變，1:22就是該份血清的中和抗體效價(jià)。7.生物淘洗將腹水先經(jīng)辛酸-硫酸銨法粗提，然后用NAbProteinGSpinPurificationKit(PIERCE)進(jìn)行親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度后用于生物淘洗，用M13噬菌體展示隨機(jī)線性十二肽庫(kù)對(duì)單抗進(jìn)行表位作圖。生物淘洗參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行第1輪淘洗于微孔板中包被10ug單抗，第2、3輪分別包被5ug、lug，4t:過(guò)夜；0.05%TBST洗滌后，用10g/LBSA封閉，加入1.5X1011pfu/100uL展示十二肽的M13噬菌體，室溫輕搖lh，TBST洗滌10次后，用洗脫緩沖液將結(jié)合的噬菌體于室溫輕搖10min洗脫下來(lái)，加入緩沖液中和洗脫的噬菌體，接種大腸桿菌ER2738進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行回收并測(cè)定滴度，取1.5X10"pfu噬菌體進(jìn)入下一輪淘洗。第4輪淘洗采用ProteinG捕獲法進(jìn)行液相結(jié)合，單抗使用量為300ng。挑取單個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，用噬菌體親和捕獲ELISA鑒定其活性，最后對(duì)陽(yáng)性噬菌體的單鏈DNA進(jìn)行序列分析。8.噬菌體親和捕獲ELISA于96孔聚乙烯酶標(biāo)板中包被100ng單抗(每孔100uL，0.1M碳酸氫鈉pH8.6)，4°C過(guò)夜，設(shè)立重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立識(shí)別不同表位的來(lái)源于同一只小鼠制備的單克隆抗體，1%BSA封閉液為對(duì)照。室溫封閉2h后，用0.1%TBST稀釋噬菌體克隆至10fu/100uL，加入每孔，室溫輕搖反應(yīng)lh，用O.1XTBST洗六次后，加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗M13噬菌體抗體，用底物ABTS[2，2，-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonicacid)]顯色后于405nm測(cè)吸光度，以P/N>2.1作為待檢樣品的陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。9.噬菌體單鏈DNA模板的制備與測(cè)序在第3、4輪淘洗后，隨機(jī)挑選噬菌體克隆，分別接種到含lmL1:100稀釋的ER2738對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物，于37。C震蕩培養(yǎng)4.5h。12000rpm離心10min，各取500uL上清到新管中，每管加入200uLPEG/NaCl，混勻后，靜置10min，12000rpm離心10min，沉淀溶于100uL碘化鈉緩沖液中，再加入250uL無(wú)水乙醇，室溫靜置10min，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，自然干燥后，用30uL純水溶解，即可作為測(cè)序模板。測(cè)序由上海生物工程有限公司完成，測(cè)序引物為-96glII，序列為5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'。10.肽ELISA各種多肽由北京中科亞光有限公司合成，經(jīng)HPLC和MS分析鑒定，純度^95X。肽的生物素化采用PIERCE公司的生物素化試劑盒進(jìn)行。包被250ng鏈酶親和素的孔中分別加入200ng、100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng、3.125ng、l.56ng的生物素化肽，封閉后加入3Ell單抗100ng/100ul/孔，室溫輕搖反應(yīng)lh，0.05XTBST洗四次后加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(SIGMA)，用底物ABTS顯色后于405nm測(cè)吸光度。11.肽競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA酶標(biāo)板中包被病毒抗原lug/well，預(yù)先使系列稀釋的合成肽與單抗在封阻液中混合，37t:lh后4t:過(guò)夜，再加入各孔，37t:溫育20min，洗滌后加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗，用底物ABTS顯色后于405nm測(cè)吸光度。12.表位肽的GST融合表達(dá)人工合成編碼表位和截短表位DNA的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈，上游引入BamHI粘性延伸末端，下游引入終止密碼子以及Xhol粘性延伸末端，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好對(duì)該表位基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，序列見表3:表3表位及其截短突變體編碼DNA的互補(bǔ)寡核苷酸鏈<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(方框部分為引入的BamHI粘性末端，下劃線為引入的Xhol粘性末端)。將兩條互補(bǔ)鏈直接退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA，插入pGEX-6p-l的BamHI和XhoI之間，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用Pstl酶切鑒定重組質(zhì)粒，分別命名(表l)。挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)并測(cè)序驗(yàn)證，然后1:100稀釋接種于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37t:震蕩培養(yǎng)至0D6。Qnm=0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmmol/L，37。C繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集菌體并用適量的PBS重懸，融合蛋白分別命名為GST-p7、GST-p7-lossG、GST-p7-lossT、GST-p7-lossLT和GST-p7-lossVLT。13.SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測(cè)SDS-PAGE電泳(15%Tris-glycine)分離GST-p7、GST-p7-lossG、GST-p7-lossT、GST-p7-lossLT和GST-p7-lossVLT融合蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上(90V，45min)，用5%脫脂乳-PBS封閉液于4t:封閉過(guò)夜，與單抗8E8于37t:溫育lh，與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG于室溫作用lh，DAB(6mg/10mL)顯色。14.FMDVLD50檢測(cè)4日齡乳鼠5-7窩，每窩4-6只，母鼠1只用于哺乳。用滅菌的PBS將Asial型和0型FMDV分別10倍梯度稀釋成10—\10—2、10—3……，每個(gè)稀釋度的FMDV于頸背部皮下注射乳鼠一窩，200u1/只，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照組。每天觀察，記錄乳鼠發(fā)病和死亡情況，按Reed-Muench方法計(jì)算口蹄疫病毒的毒力。表4WOO]LD5。的計(jì)算(接種劑量為0.2ml)病毒稀接種活鼠數(shù)死鼠數(shù)積累總計(jì)死亡比死亡率釋度鼠數(shù)活鼠死亡(%)10"450501515/15100l(T550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61710-85501000/100IO-95501500/150LD5。的計(jì)算按Reed和Muench氏法計(jì)算。高于50%的死亡分?jǐn)?shù)-50%83%-50%距離比例=-=-=0.5高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)-低于50%的死亡百分?jǐn)?shù)83%_17%LD5。的對(duì)數(shù)=高于50%病毒稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)本例高于50%病毒稀釋度的對(duì)數(shù)_6，距離比例為0.5，稱釋系數(shù)的對(duì)數(shù)為-1。代入上式LgLD50=-6+0.5X(-1)=-6.5則LD5。=10—65，0.2ml，即該病毒作10—"稀釋，接種0.2ml能使半數(shù)乳鼠發(fā)生死亡。15.乳鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)Asial型、0型單抗的被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)分別用5-8窩乳鼠，每窩含乳鼠4_6只，母鼠1只用作哺乳。3E11、8E8單抗腹水用滅菌PBS分別做2倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度腹腔注射乳鼠4-6只，200ul/只。間隔1小時(shí)后每組乳鼠分別在頸背部皮下注射致死劑量(10LD5。)的Asial型和0型FMDV(200u1/只)，同時(shí)設(shè)立單抗對(duì)照和PBS對(duì)照。注射后每天觀察乳鼠的發(fā)病、死亡情況。[cmo]二、試驗(yàn)結(jié)果(—)3E11單克隆抗體的制備及其識(shí)別表位的鑒定1.—株針對(duì)Asial型FMDV構(gòu)象型中和表位單克隆抗體的篩選和鑒定免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，用間接ELISA檢測(cè)和IFA驗(yàn)證，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為，以雜交瘤培養(yǎng)上清對(duì)FMDV抗原的0D492光吸收值與正常BALB/c小鼠血清、SP2/0細(xì)胞上清對(duì)FMDV抗原0D492值之比均大于2.1，且雜交瘤細(xì)胞上清對(duì)正常BHK-21細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果為陰性，判為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)篩選和三次有限稀釋法克隆，獲得3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1F5、3E11和4C6。用雜交瘤上清鑒定3株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的免疫球蛋白亞類，結(jié)果顯示，1F5重鏈類型為IgG2b，3E11和4C6重鏈類型為IgGl，3株單抗輕鏈均為k類型(表5)。與Asial/YS/CHA/05病毒株的中和試驗(yàn)顯示單抗1F5和4C6都未能達(dá)到1:32的稀釋比，判定為無(wú)中和活性；而3E11具有很強(qiáng)的中和活性，中和效價(jià)達(dá)到l:1024(表5)。我們對(duì)各株單抗進(jìn)行了全病毒W(wǎng)esternblot分析，均未見特異性反應(yīng)條帶，因此認(rèn)為，所獲得的3株單抗均識(shí)別構(gòu)象型表位。在研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)病毒抗原變異株，其VP1蛋白在144位由G突變?yōu)镾，基因組其它序列與親本株完全相同，此單一氨基酸殘基的突變卻導(dǎo)致單抗3E11與突變株失去反應(yīng)性(IFA和微量細(xì)胞中和試驗(yàn)均驗(yàn)證)，由此推斷，VP1蛋白144位氨基酸G是單抗3E11識(shí)別表位的一個(gè)關(guān)鍵性氨基酸。單抗3E11與Asial型FMDV江蘇譜系毒株均產(chǎn)生特異性熒光，而且中和滴度都很高，說(shuō)明該表位是Asial型FMDV保守的中和表位。表5.抗Asial型口蹄疫病毒單克降抗體生物學(xué)特性鑒定單抗抗體亞類間接免疫熒光試驗(yàn)中和試驗(yàn)Westernblot1F5IgG2b/K++++1:16-3E11IgGl/K++++1:1024—4C6IgGl/K++++1:4-2.單抗3E11識(shí)別的模擬表位基序?yàn)镚SLXXL為鑒定單抗3E11識(shí)別的構(gòu)象表位，本發(fā)明人利用一個(gè)展示隨機(jī)線性十二肽的噬菌體文庫(kù)對(duì)純化的單抗3E11進(jìn)行4輪生物淘洗，在第3、4輪共挑取42個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，用噬菌體親和捕獲ELISA鑒定其反應(yīng)活性，設(shè)立同一只鼠制備的同種抗體亞型的單抗4C6和封閉液BSA作為對(duì)照，以排除抗體恒定區(qū)以及BSA的干擾，最終獲得8個(gè)針對(duì)抗體可變區(qū)的陽(yáng)性噬菌體克隆(圖1)，其中噬菌體克隆S7、S12、S2、Sl和S6具有較高的親和力。對(duì)這些陽(yáng)性噬菌體克隆的單鏈DNA進(jìn)行序列分析，獲得8條不同的12肽序列(表6)。序列比對(duì)顯示，親和力較高的前4個(gè)噬菌體克隆均含有一個(gè)特征性序列GSLXXL(X代表20種氨基酸殘基任意一種)，將其暫定為單抗3E11識(shí)別的構(gòu)象型中和表位的基序。在該基序結(jié)構(gòu)13中有兩個(gè)亮氨酸(L)，它們之間的固定間隔為兩個(gè)氨基酸殘基，對(duì)其形成表位空間結(jié)構(gòu)可能起關(guān)鍵性的骨架支撐作用，雖然間隔氨基酸的種類尚無(wú)規(guī)律可循。將各噬菌體陽(yáng)性克隆與3E11單抗進(jìn)行Westernblot分析，均不呈現(xiàn)反應(yīng)條帶，該結(jié)果結(jié)合噬菌體ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，這4個(gè)展示在噬菌體表面的線性12肽在非變性的液相中能夠模擬形成單抗3E11所識(shí)別的構(gòu)象型表位，而在變性的線性狀態(tài)下則不能被識(shí)別。在陽(yáng)性噬菌體克隆S6，其3E11單抗識(shí)別表位基序中的第一個(gè)亮氨酸(L)被異亮氨酸(I)取代，雖然兩者均為性質(zhì)相近的疏水性脂肪族氨基酸、在側(cè)鏈上僅有一個(gè)甲基位置不同，然而這樣的替換還是使得該肽與3E11的結(jié)合能力有所下降(圖l)。在另外3個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆(S11、S18和S10)，沒有發(fā)現(xiàn)上述3E11識(shí)別的表位基序，也沒有找到明顯一致的序列，它們與單抗3E11結(jié)合的因素尚不清楚。上述研究表明，單抗3E11所識(shí)別的模擬表位是含有基序GSLXXL的短肽。為進(jìn)一步鑒定GSLxxL基序的結(jié)合性和功能性，選取親和力最高的S7噬菌體展示肽序列合成一系列突變肽并進(jìn)行結(jié)合活性分析。在肽ELISA試驗(yàn)中，單抗3E11與鏈酶親和素捕獲的生物素化肽P-S7呈現(xiàn)劑量依賴性結(jié)合，而氨基酸打亂的生物素化肽(P-S7-SCR)無(wú)結(jié)合活性(圖2)，這表明模擬肽S7與單抗3E11的結(jié)合是序列特異的；在競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)中，結(jié)合P-S7肽的單抗不再與抗原結(jié)合，而且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴方式，而打亂的P-S7-SCR肽不具有這種抑制活性(圖3)，這從免疫學(xué)角度證明了模擬肽S7與3E11結(jié)合的特異性；為確定3E11表位基序中每個(gè)保守氨基酸殘基對(duì)于表位活性的作用，用合成的突變肽進(jìn)行ELISA分析(圖4)，結(jié)果表明，在此模擬表位基序的4個(gè)保守氨基酸殘基對(duì)于該表位的抗原抗體識(shí)別均是關(guān)鍵性的，其中任何替換都會(huì)使P-S7肽失去與單抗3E11的結(jié)合活性。上述結(jié)果推測(cè)，在單抗3E11存在的情況下，這些線性肽段在溶液中可形成一定的構(gòu)型，使關(guān)鍵性氨基酸殘基在合適的空間位置與識(shí)別構(gòu)象型表位的單抗3E11發(fā)生相互作用；構(gòu)象型表位基序GSLXXL每個(gè)關(guān)鍵性氨基酸的改變都使得該肽段不能形成相應(yīng)構(gòu)型，從而失去結(jié)合活性；該表位基序兩個(gè)亮氨酸之間的2個(gè)氨基酸殘基的種類和性質(zhì)雖然可以變更，但其間距不變，說(shuō)明這兩個(gè)亮氨酸殘基的空間結(jié)構(gòu)對(duì)于線性肽的構(gòu)象表位形成是非常重要的。表6.陽(yáng)性噬菌體模擬表位肽的序列測(cè)定噬菌體克隆氨基酸序列a頻率S7HEIGSLAGLAMRS12AHFNGSLRSLTQS2IINTGSLLSLAHSlDTGSLVWLSqRSS6bHNHGSISALMHLSllDHDRLIRRTAqi1S18FHTLDNNIRNVN1S10FHDTSLLSHHLA114a基序氨基酸殘基用加粗和下劃線標(biāo)出。b陽(yáng)性噬菌體克隆S6與其它基序的不同是I取代了L，這兩種氨基酸之間的側(cè)鏈相似，在某些情況下可替換。表7.用于定點(diǎn)誘變研究的合成肽序列多肽名稱多肽序列eP-S7.........................H-E-I-G-S-L-A-G-L-A隱M-RP-S7-G-Sa..................H-E-I陽(yáng)g-S-L-A-G-L陽(yáng)A隱M-RP陽(yáng)S7-S-A...................H-E-I-G-A-L-A-G-L-A-M陽(yáng)RP-S7-1L-A..................H-E-I-G-S陽(yáng)A-A-G-L陽(yáng)A-M-RP陽(yáng)S7-2L-A..................H-E-I-G-S-L-A-G-A-A-M-RP-S7-SCR...................L-A-G-M-I-A-S-E-R-L隱H-GAsialpG-Hb................Y-G-E隱E-S-S-R-R-G-D-L-A隱A-L-A-R隱R-Va根據(jù)RGD突變株的變異而設(shè)計(jì)的G—S替換，其它基序氨基酸分別用丙氨酸(A)替換。bAsial/YS/CHA/05株VP1蛋白G-H環(huán)中的18-aa肽(136153aa)，包含3E11模擬表位所有的關(guān)鍵性氨基酸殘基。e合成肽突變位點(diǎn)氨基酸均加粗并加下劃線標(biāo)出，經(jīng)過(guò)HPLC和MS分析驗(yàn)證，純度均>95%。3.G-H環(huán)合成肽及其結(jié)構(gòu)模擬確定單抗3E11的識(shí)別表位如上所述，用FMDVRGD突變株已經(jīng)將3E11識(shí)別的構(gòu)象表位定位在病毒VP1蛋白G-H環(huán)中的RGD周圍，6144是該表位的一個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基。隨后，利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)結(jié)合合成肽定點(diǎn)誘變技術(shù)，確定了3E11識(shí)別的模擬表位基序?yàn)镚SLXXL(圖1，圖2，圖3，圖4，表6，表7)。將該基序氨基酸序列與病毒原序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在G-H環(huán)中該位置對(duì)應(yīng)的序列是GDLXXL，而不是GSLXXL。因此我們?cè)贕_H環(huán)中尋找S的蹤跡，發(fā)現(xiàn)在140、141位有連續(xù)兩個(gè)S，據(jù)此合成Asial/YS/CHA/05株VP1蛋白G-H環(huán)136153aa十八肽。用肽ELISA對(duì)系列稀釋的該十八肽G-H環(huán)(AsialpG-H)進(jìn)行結(jié)合活性檢測(cè)(圖5)，結(jié)果表明，短肽AsialpG-H以劑量依賴方式顯示其與單抗3E11的結(jié)合活性，說(shuō)明該18-aa肽包含所有單抗3E11識(shí)別表位的關(guān)鍵性氨基酸?？紤]到G-H環(huán)本身具有一定的可動(dòng)性或柔韌性，所以Ser14°或Ser141均有可能是單抗3E11識(shí)別表位的必需氨基酸；該十八肽包含的GxLXXL結(jié)構(gòu)與鑒定的表位基序在結(jié)構(gòu)上基本吻合，該表位的Ser氨基酸殘基可能是通過(guò)折疊靠近其它三個(gè)氨基酸殘基，形成該構(gòu)象表位。根據(jù)以上研究結(jié)果和分析確定，單抗3Ell識(shí)別的Asial型FMDV構(gòu)象型中和表位的關(guān)鍵性氨基酸殘基為Ser14°或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149。(二)8E8單克隆抗體的制備及其識(shí)別表位的鑒定1.—株針對(duì)O型FMDV線性中和表位單克隆抗體的篩選和鑒定FMDV0/YS/CHA/05株病毒免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA檢測(cè)和IFA驗(yàn)證，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)FMDV抗原的0D492光吸收值與正常BALB/c小鼠血清、SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)FMDV抗原0D492值之比均大于2.1，且雜交瘤細(xì)胞上清與正常BHK-21細(xì)胞不產(chǎn)生熒光反應(yīng)，判為陽(yáng)性?？贵w陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆，獲得1株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為8E8。免疫球蛋白亞類鑒定顯示，重鏈類型為IgGl，輕鏈為k類型。微量細(xì)胞中和試驗(yàn)表明，8E8具有很高的中和活性，腹水中和效價(jià)高達(dá)1:1024。用單抗8E8對(duì)全病毒進(jìn)行Westernblot分析，出現(xiàn)明顯的特異性反應(yīng)條帶，由此認(rèn)為，單抗8E8識(shí)別0型FMDV的一個(gè)線性表位。為確定中和性單抗8E8的血清型特異性和抗原反應(yīng)譜，用間接免疫熒光試驗(yàn)和微量細(xì)胞中和試驗(yàn)分析8E8與FMDV各分離株的反應(yīng)性，結(jié)果表明，單抗8E8與0型FMDV三個(gè)基因型的分離株均產(chǎn)生特異性熒光，而且中和滴度都很高，說(shuō)明該表位廣泛存在于0型FMDV的各種基因型毒株中，是0型FMDV保守的中和表位；相反，單抗8E8與Asial型FMDV無(wú)免疫熒光反應(yīng)，也不能中和Asial型FMDV毒株，說(shuō)明單抗8E8識(shí)別的表位在Asial型分離株中不存在。鑒于中和性單抗在研究FMDV生物學(xué)特性中的重要作用，本發(fā)明應(yīng)用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)進(jìn)行生物淘洗，旨在鑒定單抗8E8所識(shí)別的中和表位。2.單抗8E8識(shí)別的模擬表位基序?yàn)镚DLNVRT用展示隨機(jī)線性12肽的噬菌體文庫(kù)對(duì)純化的單抗8E8進(jìn)行4輪生物淘洗。在第3、4輪淘洗后共挑取24個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，用噬菌體親和捕獲ELISA檢測(cè)其反應(yīng)活性，同時(shí)設(shè)立同一只鼠制備的同種抗體亞型的單抗5F7、含0.1%BSA的PBS封閉液、噬菌體肽庫(kù)PhageLibrary(PL)作為對(duì)照(圖6)。在排除與抗體恒定區(qū)及BSA結(jié)合的噬菌體克隆后，最終獲得7個(gè)特異性針對(duì)單抗8E8可變區(qū)的陽(yáng)性噬菌體克隆。通過(guò)單鏈DNA序列分析，獲得6條不同的噬菌體展示的12肽序列，其中有一條序列重復(fù)出現(xiàn)一次(表8)。對(duì)此6條序列的噬菌體克隆進(jìn)行Westernblot檢測(cè)顯示，單抗8E8與各噬菌體克隆均發(fā)生結(jié)合反應(yīng)(圖7)，由此確定，單抗8E8識(shí)別的表位為線性表位。對(duì)此6條12肽進(jìn)行序列比對(duì)(表8)顯示，氨基酸殘基G(Gly)在6條序列中出現(xiàn)4次；殘基D(Asp)在6條序列中均展示，推測(cè)是單抗8E8識(shí)別表位的一個(gè)關(guān)鍵性氨基酸殘基；殘基L(Leu)在6條序列中出現(xiàn)5次；殘基N(Asn)在6條序列中也出現(xiàn)5次，噬菌體P23在此位置展示一個(gè)具有相同酰胺基側(cè)鏈的Q(Gln)，在理論上Q可替換N而不影響表位氨基酸的化學(xué)性質(zhì)；殘基V(Val)在6條序列中出現(xiàn)3次，而噬菌體P14在該位置展示一個(gè)具有相似側(cè)鏈的I(lie)，一般可以替換而不影響其功能；殘基R(Arg)在6條序列中出現(xiàn)3次，性質(zhì)相似的K(Lys)在此位置出現(xiàn)兩次，因此將該位置的氨基酸殘基定為R;殘基T(Thr)也是6條序列均展示的氨基酸殘基。綜合以上分析認(rèn)為，一個(gè)以GDLNVRT為基序的特征性序列是單抗8E8識(shí)別的模擬表位。表8與單抗8E8結(jié)合的噬菌體展示肽序列16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a0型O/YS/CHA/05株FMDVVPl的140160氨基酸序列。b各噬菌體展示肽所包含的單抗8E8識(shí)別基序的保守性氨基酸殘基均用底紋標(biāo)出。3.單抗8E8識(shí)別的真實(shí)表位是147DLQVLT152單抗8E8具有很強(qiáng)的中和活性，因此它所識(shí)別的表位應(yīng)該位于病毒的中和抗原位點(diǎn)。在已鑒定的0型口蹄疫病毒中和性抗原位點(diǎn)中，最重要的均位于VP1蛋白的G-H環(huán)。據(jù)此我們將6條噬菌體展示序列與O/YS/CHA/05毒株VPl蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)噬菌體展示的模擬表位基序GDLNVRT與病毒G-H環(huán)中的146GDLQVLT152序列存在高度的同源性；同時(shí)，我們對(duì)此7肽模擬表位的氨基酸排列(表8)做進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，在PI噬菌體克隆展示的模擬表位中G被W置換，P3噬菌體展示的模擬肽從D147開始、G146位出現(xiàn)空缺，但兩者與單抗8E8都具有高水平的結(jié)合活性(圖6)，由此我們推測(cè)，VP1蛋白上的^DLQVLT1526肽是單抗8E8識(shí)別的病毒表位基序的最小單位。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將146GDLQVLT152、147DLQVLT152、146GDLQVL151、146GDLQV15°和146GDLQ149序列與GST在大腸桿菌中融合表達(dá)，獲得GST-p7、GST-p7-lossG、GST-p7-lossT、GST-p7-lossLT和GST-p7_lossVLT，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Westernblot活性檢測(cè)(圖8)表明，單抗8E8與GST_p7、GST-p7-lossG發(fā)生特異性結(jié)合，而與其它融合肽以及GST對(duì)照不反應(yīng)。這些結(jié)果顯示，G^對(duì)于表位與單抗8E8的識(shí)別和結(jié)合不是需要的，而1152對(duì)于該表位的活性是必需的，由此確定，1470LQVL1~152是單抗8E8識(shí)別的最短序列，是0型FMDVVPl蛋白的一個(gè)線性中和表位。4.單抗8E8識(shí)別表位的關(guān)鍵氨基酸為了進(jìn)一步深入了解單抗8E8識(shí)別表位中各個(gè)氨基酸殘基在與單抗結(jié)合過(guò)程中所起的作用，針對(duì)病毒VP1蛋白真實(shí)序列中146152aa肽(P-8E8)合成一系列定點(diǎn)誘變肽，P-8E8作為陽(yáng)性對(duì)照，其隨機(jī)打亂肽(P-8E8-SCR)作為陰性對(duì)照，詳見表9。定點(diǎn)誘變肽是將P-8E8分別用兩種疏水性氨基酸和一種親水性氨基酸進(jìn)行替換，疏水性質(zhì)的氨基酸包括側(cè)鏈較短的丙氨酸(A)和空間阻位較大、側(cè)鏈為芳香基團(tuán)的色氨酸(W);親水性質(zhì)的氨基酸為精氨酸(R)。采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定這些突變肽與單抗8E8的結(jié)合活性，用0D艦吸光值繪制曲線(圖9，圖11)，當(dāng)合成肽的使用濃度為lug/100ul時(shí)，以P-8E8的抑制率為100%，計(jì)算每條突變肽針對(duì)0型FMDV抗原的相對(duì)于P-8E8的抑制率(圖10，圖12)，通過(guò)計(jì)算各突變肽在此濃度下抑制率的變化評(píng)價(jià)這些氨基酸殘基在表位活性中所起的作用。對(duì)噬菌體展示的6條模擬肽序列進(jìn)行比對(duì)分析可見，在單抗8E8識(shí)別表位的基序中，氨基酸殘基D、Q和T相對(duì)保守(表8)。為深入分析這3個(gè)氨基酸殘基在8E8識(shí)別表位構(gòu)成中所起的作用，我們首先合成了3條突變肽P-8E8-D-A、P-8E8-Q-A和P-8E8_T_A(表9)，分別用A(Ala)置換這3個(gè)保守的殘基。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果(圖9)顯示，與合成肽P-8E8結(jié)合的單抗8E8不再與0型FMDV抗原結(jié)合，這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴方式，而突變肽P-8E8-D-A與隨機(jī)打亂肽P-8E8-SCR—樣幾乎不具有抑制活性。這表明，8E8識(shí)別表位的氨基酸殘基D對(duì)于抗原-抗體的識(shí)別和/或結(jié)合作用是絕對(duì)需要的。突變肽P-8E8-Q-A和P-8E8-T-A仍與單抗發(fā)生結(jié)合(圖9)，但兩者的抑制率均有下降(圖10)，突變肽P-8E8-Q-A抑制率(46.4%)的變化程度大于P-8E8-T-A(75.4%)，說(shuō)明殘基Q和T均為該表位的重要氨基酸。雖然丙氨酸(A)可以模擬蘇氨酸(T)的大部分功能，致使突變肽P-8E8-T-A仍與單抗8E8結(jié)合，但缺失突變分析(圖8)表明，在T被刪除后表位的活性完全喪失，說(shuō)明該表位中殘基T或該位置其它殘基的存在對(duì)于該表位的活性是必需的。在上述定點(diǎn)誘變分析的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步合成了6條突變肽，包括P-8E8-G-W、P-8E8-V-W、P-8E8-Q-W、P-8E8-L148-A、P-8E8-L151-A和P-8E8_L151-R(表9)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果(圖11)顯示，突變肽P-8E8-G-W同P-8E8—樣，以劑量依賴方式與單抗結(jié)合，該結(jié)果結(jié)合上述的G"6缺失突變分析(圖8)結(jié)論性地表明，該表位的活性無(wú)需甘氨酸(G)的存在。突變肽P-8E8-V-W幾乎不具有抑制活性，其抑制率與隨機(jī)打亂肽P-8E8-SCR的抑制率一樣在接近零的水平上；可是，在篩選模擬肽(表8)時(shí)，V的出現(xiàn)頻率僅為3/6，與V性質(zhì)相似的I出現(xiàn)1次(1/6)，而與V性質(zhì)不同的T出現(xiàn)2次(2/6)，這提示V在該表位中是重要的氨基酸殘基，雖然用W替換后表位活性完全消失，但用I和T替換對(duì)表位活性無(wú)重要影響，說(shuō)明V與D殘基不同，對(duì)于該表位不是絕對(duì)需要的。突變肽P-8E8-Q-W同P-8E8-Q-A—樣也保留部分活性與單抗結(jié)合，兩者的抑制率分別為39.2%和46.4%。突變肽P-8E8-L148-A和P-8E8-L^-A雖然仍保留與單抗8E8的結(jié)合活性(圖ll)，但二者的抑制率明顯下降(圖12)，突變?cè)绿玃-8E8-L148-A為32.3%而P-8E8_L151-A為30.9%，說(shuō)明殘基L148和L151與Q一樣也是該表位的重要氨基酸。與殘基L148和L151突變肽相比較，突變肽P-8E8-Q-A、P-8E8-Q-W和P-8E8-T-A的抑制率(46.4%、39.2%和75.4%)較高(圖10，圖12)，說(shuō)明該表位中氨基酸殘基Q(無(wú)論用A或W替換)和T對(duì)表位活性的影響相對(duì)于氨基酸殘基L148和L151較小，兩個(gè)疏水性氨基酸殘基L148和L151在表位中與單抗的結(jié)合能大于兩個(gè)親水性氨基酸殘基Q和T提供的結(jié)合能。突變肽P_8E8-L151-R能夠模擬P-8E8的全部功能與單抗結(jié)合，說(shuō)明在單抗8E8識(shí)別的模擬表位基序中R可完全代替L151發(fā)揮作用。概括起來(lái)，本發(fā)明鑒定的單抗8E8識(shí)別表位為六肽147DLQVLT152，其中殘基D147為關(guān)鍵氨基酸，殘基V、L148、L151、Q149和T152為重要氨基酸，并且該表位中T152位置的氨基酸殘基對(duì)于表位活性是必需的。表9用于本發(fā)明的合成肽及其氨基酸序列18多肽名稱多肽序列bP-8E8a146G-D-L-Q-V-L-T152P-8E8-D-AG-A-L-Q-V-L-TP-8E8-Q-AG隱D-L-4隱V-L-TP-8E8-T-AG-D-L-Q-V-L-AP隱8E8隱G隱WW-D-L-Q-V-L-TP-8E8-V-WG-D-L-Q-W-L-TP-8E8-Q-WG-D-L-W-V-L-TP-8E8-L148-AG-D-4-Q-V-L-TP-8E8-L151-AG-D-L-Q-V-A-TP-8E8-L151-RG-D-L-Q-V隱g-TP-8E8-SCRQ陽(yáng)T國(guó)G-L-V國(guó)L-Da0/YS/CHA/05株VP1的146152aa肽。b突變位點(diǎn)氨基酸均加粗并用下劃線標(biāo)出，部分殘基用丙氨酸(A)、色氨酸(W)及精氨酸(R)替換。(三)3E11和8E8單克隆抗體在體內(nèi)外的免疫保護(hù)性1.乳鼠攻毒劑量的確定單層BHK-21細(xì)胞接種病毒后，每天觀察接種病毒的96孔培養(yǎng)板3次，3_5天后測(cè)定，Asial型FMDVAsia/YS/CHA/05株TCID50為7.0，0型FMDVO/YS/CHA/05株TCID50為7.25。用滅菌PBS以IO倍梯度系列稀釋這兩個(gè)毒株，分別稀釋成10—5、10—6、10—7禾P10—8，對(duì)Asia/YS/CHA/05和O/YS/CHA/05毒株進(jìn)行半數(shù)致死量(LD5。)測(cè)定，陰性對(duì)照組注射滅菌的PBS，24h內(nèi)死亡鼠被視為接種意外死亡。由此確定，Asial型FMDVAsia/YS/CHA/05株和0型FMDVO/YS/CHA/05株的LD5。分別為10—6/0.2ml和10—7/0.2ml(表10、11)。為選取合適的Asial型和0型FMDV攻毒劑量，用以上檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)，選擇能夠使乳鼠全部死亡的Asial型和0型FMDV的最高稀釋度作為乳鼠的攻毒劑量，由此確定這兩個(gè)毒株最適合的乳鼠攻毒劑量均為10LDs。/200ul/只。表10Asial/YS/CHA/05LD5。的測(cè)定病毒攻毒劑量乳鼠存活稀釋(TCI謂/ml)數(shù)/總數(shù)l(T5200/0.20/410—620/0.22/410—72/0.24/410-80.2/0.24/4對(duì)照組PBS/0.26/6表110/YS/CHA/05LD5。的測(cè)定乳鼠病毒稀釋攻毒劑量(TCID5。/ml)存活數(shù)/總數(shù)lO—5356/0.20/410—635.6/0.20/410—73.56/0.22/40.356/0.24/4對(duì)照組PBS/0.26/62.單抗3E11、8E8的體外中和活性應(yīng)用微量中和試驗(yàn)對(duì)單抗的中和抗體半數(shù)保護(hù)量進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)所設(shè)的病毒對(duì)照、腹水對(duì)照及細(xì)胞對(duì)照均正常，說(shuō)明此試驗(yàn)成立。結(jié)果表明，Asial型FMDV單抗3E11和0型FMDV單抗8E8具有很好的中和活性，保護(hù)50%BHK-21細(xì)胞不產(chǎn)生CPE的單抗腹水中和抗體半數(shù)保護(hù)量(PD5。)分別為1995和2371。3.單抗3E11、8E8對(duì)乳鼠的免疫保護(hù)作用在乳鼠體內(nèi)驗(yàn)證單抗3E11和8E8的免疫保護(hù)效力，攻毒后每天觀察乳鼠的死亡情況，PBS對(duì)照組乳鼠正常死亡，單抗對(duì)照組乳鼠未見異常。單抗3E11實(shí)驗(yàn)組中各組的單抗?jié)舛确謩e為2、4、8、16、31和62PDs。，各組乳鼠的Asial型FMDV的攻毒劑量均為100)5。，試驗(yàn)結(jié)果(圖13)表明，乳鼠的保護(hù)率隨著單抗?jié)舛鹊纳叨饾u升高，當(dāng)單抗3E11稀釋為8倍的中和抗體半數(shù)保護(hù)量時(shí)(8PD5。)，可完全保護(hù)乳鼠耐受致死劑量的Asial型FMDV攻擊。單抗8E8實(shí)驗(yàn)組中各組的單抗?jié)舛确謩e為3、5、11和21PDs。，各組乳鼠的0型FMDV攻毒劑量也為10LDs。，試驗(yàn)結(jié)果如圖14，單抗?jié)舛扰c乳鼠的保護(hù)率之間呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)單抗8E8濃度為11PD5。時(shí)，可完全保護(hù)乳鼠耐受致死劑量的0型FMDV攻擊。使用不同的單抗?jié)舛葘?duì)乳鼠存活時(shí)間有不同的影B向，隨著單抗?jié)舛鹊纳?，乳鼠的起始死亡時(shí)刻后延、終點(diǎn)死亡時(shí)刻前移。當(dāng)單抗3E11的濃度為2PD5。時(shí)，乳鼠起始死亡時(shí)刻和終點(diǎn)死亡時(shí)刻分別為攻擊病毒后第42h和128h;當(dāng)單抗3E11濃度為4PD5。時(shí)，乳鼠起始死亡時(shí)刻和終點(diǎn)死亡時(shí)刻分別為攻擊病毒后第55h和68h(圖15)。在單抗8E8試驗(yàn)組中，單抗?jié)舛葹?PD5。時(shí)，乳鼠起始死亡時(shí)刻和終點(diǎn)死亡時(shí)刻分別為攻擊病毒后第72h、117h;當(dāng)單抗?jié)舛葹?PD5。時(shí)，乳鼠起始死亡時(shí)刻和終點(diǎn)死亡時(shí)刻分別為攻擊病毒后第84h、96h(圖16)。單抗使用濃度與乳鼠的體重增長(zhǎng)百分率呈一定的比例關(guān)系(圖17、18)，各組乳鼠體重增長(zhǎng)百分率的變化在攻擊病毒后的前4天比較明顯，隨著單抗?jié)舛鹊纳?，?duì)乳鼠的保護(hù)效果增強(qiáng)，乳鼠的體重生長(zhǎng)也趨于正常。序列表〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所〈120〉抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及其識(shí)別的抗原表位和應(yīng)用〈130>KLP0805620〈160〉2〈170>PatentInversion3.5〈210〉1〈211〉6〈212>PRT〈213〉Footandmouthdisease〈400〉1GlySerLeuXXLeu15〈210〉2〈211>7〈212〉PRT〈213〉Footandmouthdisease〈400>2GlyAspLeuAsnValArgThr1權(quán)利要求一株能分泌抗亞洲1型口蹄疫病毒的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其微生物保藏號(hào)是CGMCC2692。2.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體。3.權(quán)利要求2所述單克隆抗體所識(shí)別的亞洲1型口蹄疫病毒VP1蛋白的構(gòu)象型中和表位，其特征在于該構(gòu)象型中和表位的關(guān)鍵性氨基酸殘基是由亞洲1型口蹄疫病毒的VP1蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149組成。4.按照權(quán)利要求3所述的構(gòu)象型中和表位，其特征在于所述構(gòu)象型模擬表位的氨基酸序列為GSLXXL，其中，X選自任意一種氨基酸殘基。5.—株能分泌抗O型口蹄疫病毒的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其微生物保藏號(hào)是:CGMCC2691。6.由權(quán)利要求5所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體。7.權(quán)利要求6所述的單克隆抗體識(shí)別的0型口蹄疫病毒的VP1蛋白的線性中和表位，其特征在于該線性中和表位的氨基酸序列為SEQIDN0:2所示。8.由權(quán)利要求7所述的線性中和表位所衍生的氨基酸序列，其特征在于是對(duì)權(quán)利要求7所述的線性中和表位中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行缺失和/或替換后所得到的任意一種的氨基酸序列；其中所述的缺失是將G缺失；所述的替換選自以下6種氨基酸殘基替換情況中的任意一種或一種以上進(jìn)行的組合(l)G用W替換；(2)L用A替換；(3)N用Q、A或W替換；(4)V用I或T替換；(5)R用L、K或A替換；(6)T用A替換。9.權(quán)利要求2或6所述的單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑或藥物中的用途。10.權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)想型中和表位在制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑、疫苗或藥物中的用途。11.權(quán)利要求7或8所述的線性中和表位在制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑、疫苗或藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及其識(shí)別的抗原表位和應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。所述能分泌抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.2692；所述能分泌抗O型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.2691。本發(fā)明還公開了上述兩個(gè)單克隆抗體所分別識(shí)別的亞洲1型FMDVVP1蛋白的構(gòu)象型中和表位和O型FMDVVP1蛋白的線性中和表位的氨基酸序列。體外中和試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)說(shuō)明，本發(fā)明的兩種單克隆抗體均具有良好的被動(dòng)免疫效果，均能應(yīng)用于口蹄疫的緊急預(yù)防，可對(duì)口蹄疫的被動(dòng)免疫起到良好的免疫效果。文檔編號(hào)C12N5/20GK101724605SQ20081017125公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月30日優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日發(fā)明者于力,周國(guó)輝,張春媛,趙磊申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所