專利名稱：：羊草果聚糖水解酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及羊草果聚糖水解酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及羊草果聚糖水解酶及其編碼基因在培育抗逆性提高的植物和水解果聚糖P-2，l糖苷鍵中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：果聚糖(fructan)是由果糖組成的線型或/和分支型的多聚體,是約15%的被子植物的重要貯藏碳水化合物。隨著果聚糖代謝酶類的發(fā)現(xiàn)，果聚糖除了作為植物異養(yǎng)器官根、莖、籽粒和自養(yǎng)器官葉的短期或長期貯藏物外，還具有多種重要生理功能，如調(diào)節(jié)植物適應(yīng)低溫光合作用、調(diào)控植物蔗糖分配以及使植物適應(yīng)水分虧缺、高濃度C02、缺氧條件等。此外，果聚糖因高甜度和低熱值性而成為重要的保健用品，作為食用甜味劑和低熱值性食品原料。一般情況下低DP果聚糖不易被消化，可防止產(chǎn)生齲齒和增胖，并可糾正腸內(nèi)菌群失調(diào)等;高DP果聚糖具優(yōu)越的物理化學(xué)性能，可用作營養(yǎng)食品(代替脂肪)和非食物原料。然而植物中果聚糖的水解酶的活力一直是果聚糖有效降解的瓶頸。不同生物果聚糖的降解存在兩種形式的催化酶類，一類是果聚糖外水解酶(fructanexohydrolase，F(xiàn)EH),另一類是果聚糖內(nèi)水解酶(endo-inulinlase)。一般認(rèn)為高等植物果聚糖的降解由果聚糖外水解酶催化(NelsonandSpollen,1987)，該酶作用是將果聚糖多聚體末端果糖解離下來，釋放出自由果糖。目前，僅少數(shù)幾種植物FEH被克隆，分別是菊苣(C.intybus)1-FEHI(Claessensetal，1990)和1-FEHII(DeRooveretal，1999)、菊芋(H.tuberosus)1-FEH(Marxetal,1997a)、黑麥草(Loliumperenne)6-FEH(Marxetal,1997b)、具P(2—6)鍵特異性的燕麥(Avenasativa)FEH(HensonandLivingstone，1996)、P(2—1)特異性的大麥(H.Vulgare)FEH(HensonandLivingstone,1998)，盡管在黑麥草中得到了FEH，但知之甚少，對羊草中果聚糖代謝，果聚糖外水解酶FEH基因的研究尚屬空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種羊草果聚糖水解酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的羊草果聚糖水解酶，名稱為Lcl-FEH，來源于賴草屬羊草(Zej^^c/^'/7e/2sA(Trin.)Tzvel)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有羊草果聚糖水解酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列1所示的蛋白序列由600個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N)第72位-第76位氨基酸殘基為保守的NDPSG結(jié)構(gòu)域，第196位-第199位為FRDP結(jié)構(gòu)域，第251位-255位為WECPD結(jié)構(gòu)域。自氨基端第1位-第27位為定位信號(hào)肽。為了使(a)中的Lcl-FEH分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號(hào)肽序列，為了(a)中的Lcl-FEH便于純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的Lcl-FEH可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的Lcl-FEH的編碼基因可通過將序列表中序列2的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端連上信號(hào)肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述羊草果聚糖水解酶的編碼基因(Zc7-戶F扔也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述羊草果聚糖水解酶的d)NA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中序列2的5'端第1一1803位核苷酸序列；2)序列表中序列2的DNA序列；3)編碼序列表中序列l(wèi)所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列2是由2040個(gè)脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第1-1803位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在O.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有上述羊草果聚糖水解酶的編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了上述羊草果聚糖水解酶編碼基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明羊草果聚糖水解酶基因是能提高植物耐逆性的基因。對羊草幼苗進(jìn)行干旱、冷、高鹽、ABA、SA、堿等誘導(dǎo)，利用定量PCR方法檢測脅迫前后Zc7-7^F基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)證明，其本發(fā)明的羊草果聚糖水解酶蛋白可以水解菊粉、蔗果三糖等含有e2-l糖苷鍵的果聚糖，受干旱、冷、高鹽、ABA、SA、堿等誘導(dǎo)，可以參與羊草對多種逆境脅迫的響應(yīng)，可能提高植物的抗逆性。Lcl-FEH及其編碼基因?qū)τ谂囵B(yǎng)優(yōu)良的牧草品種特別是羊草品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為的羊草幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖2為Ac7-Z^F片段瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖3為Zc7-/^F3'端產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖4為5'端產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖5為PCR擴(kuò)增的Zc7-7^F全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖6為Zc7-7^F基因的組織表達(dá)結(jié)果。圖7為Zc卜/^F基因在不同非生物脅迫因子條件下的表達(dá)結(jié)果。圖8為純化酵母表達(dá)Zc7-Z^F融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果。圖9為酵母表達(dá)Zc7-/^F融合蛋白與羊草中果聚糖作用結(jié)果。圖10為載體p3301-BI121-Lc1-FEH結(jié)構(gòu)簡圖。圖11為載體p3301-BI121-Lcl-FEH酶切鑒定結(jié)果。圖12為載體p3301-BI121-Lcl-FEHPCR鑒定結(jié)果。圖13為轉(zhuǎn)基因水稻PCR鑒定結(jié)果。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司完成。實(shí)施例l、羊草果聚糖外水解酶基因Zc卜/SYcDNA全序列的獲得一、羊草果聚糖外水解酶基因Zc7-戶Sy全長cDNA序列的獲得1、植物材料總RNA的提取先以羊草ae7MAsc/&e/2w\s(Trin.)Tzvel(吉生一號(hào)，吉林省吉生羊草良種站))幼苗為材料，提取總RNA對其進(jìn)行W瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖l所示，所提取的RNA有兩條明顯的電泳條帶(泳道1和泳道2)，從上到下分別為28SRNA和18SRNA，表明獲得了純度較高的總RNA。2、羊草果聚糖外水解酶基因Lcl-FEH序列片段的克隆根據(jù)植物FEH的氨基酸殘基序列，尋找保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下LC1:CAGAATAACAAGTCCAAATGG;LC2:GCWGCGCTTTTGTACAAGAG。以步驟1提取的羊草幼苗RNA為模板，用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesizedKit試劑盒(Takara公司)并參照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)來合成其第一鏈cDNA，反應(yīng)體系為Oligo-dT(10pmol/ul)1u1，TotalRNA(《lug)2ul，dNTPMixture(10mmol/leach)l.Oyl，5XBuffer4.0yl，RNaseInhibitor(40U/u1)0.5u1，PrimeScriptRTase(200U/u1)0.5u1，RNase-freedistilledwater11u1;反應(yīng)條件為65°C5min，42°C45min,70°C15min。將合成的第一鏈cDNAIC存于-2(rC備用。再以獲得的第一鏈cDNA為模板，LC1，LC2引物配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4rain;94°C30s，55°C40s，72°C60s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為PCR產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長度約750bp的目的片段?；厥詹⒓兓a(chǎn)物，連接到PMD-18T(寶生物工程(大連)有限公司)載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR鑒定，對其進(jìn)行測序并對測序結(jié)構(gòu)進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果該片段長度為723bp，具有序列表中序列3的DNA序列，與植物中已知的FEH類基因的具有較高的同源性，表明該片段可能為羊草果聚糖外水解酶蛋白基因的部分序列。3、羊草果聚糖外水解酶基因Lcl-FEH5'端及3，端序列的克隆1)羊草果聚糖外水解酶基因Lcl-FEH3'端序列的克隆根據(jù)步驟2獲得的Lcl-FEH723bp的cDNA序列設(shè)計(jì)引物FEH3B:5，-GATGCCTTTGTGCCAGATAATG—3，。以步驟2獲得的第一鏈cDNA為模板，引物FEH3B與OligodTprimer5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACT17(數(shù)字下標(biāo)表示17個(gè)T)-3，配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min;94°C30s，52°C40s，72°C70s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為3'端產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長度約1300bp的目的片段?；厥詹⒓兓?'端產(chǎn)物，連接到PMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR鑒定，對其進(jìn)行測序并對測序結(jié)構(gòu)進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果該片段長度為1373bp，具有序列表中序列4的DNA序列，與植物中已知的FEH基因的3'端序列具有較高的同源性，表明該片段可能為羊草果聚糖外水解酶蛋白基因的3'端序列。2)羊草果聚糖外水解酶基因Lcl-FEH5'端序列的克隆根據(jù)步驟2獲得的Lcl-FEHcDNA序列設(shè)計(jì)引物FEH5A:5，-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3，；FEH3A:5，-CAATACCGCAAAGAAATCCG-3，。以步驟2獲得的第一鏈cDNA為模板，引物FEH5A與FEH3A配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min;94°C30s，54°C40s，72°C40s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖4所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為5'端產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長度約750bp的目的片段。回收并純化5'端產(chǎn)物，連接到PMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR鑒定，對其進(jìn)行測序并對測序結(jié)構(gòu)進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果該片段長度為753bp，具有序列表中序列5的DNA序列，與植物中已知的FEH基因的5'端序列具有較高的同源性，表明該片段可能為羊草果聚糖外水解酶蛋白基因的5'端序列。4、羊草果聚糖外水解酶蛋白基因全長cDNA序列的獲得利用步驟3獲得的長度為750bp的5'端序列和1300bp的3'端序列之間的重疊區(qū)，借助Contig軟件拼接得到的丄c7-/^F全長cDNA序列，該序列具有序列表中序列2的多核苷酸序列。序列表中的序列2由2040個(gè)堿基，自序列表中序列2的5'端第1-1803位核苷酸序列為編碼序列(0RF)，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中的序列l(wèi)由600個(gè)氨基酸殘基組成，根據(jù)全長cDNA序列的兩端序列設(shè)計(jì)全長引物，引物的序列如下引物l:5'-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3，(S，K,B是兼并堿基符號(hào)；其中S為G或C;K為G或T;B為G或C或T);引物2:5，-ATAGAAGTAAAAAGTACACTGACTCT-3，。以步驟1提取的羊草幼苗RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，加入引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行W瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖5所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為PCR產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長度約1800bp的特異片段?；厥詹⒓兓a(chǎn)物，連接到PMD-18T載體上，進(jìn)行菌液鑒定后，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果與上述拼接結(jié)果在擴(kuò)增部分完全相同，全長為1803bp，核苷酸序列為自序列表中序列2的5'端第1-1803位核苷酸序列，編碼氨基酸序列為序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。表明克隆的3'端和5'端片段屬于同一基因，將該具有自序列表中序列2的5'端第1-1803位核苷酸序列的基因命名為Zc7-尸j5F，將上述含有該Zc7-/^F基因的PMD-18T重組質(zhì)粒命名為PMD-Zch/^W，將Zc卜/^7編碼的蛋白命名為Lcl-FEH。實(shí)施例2、Zc7-7^F及其編碼蛋白Lcl-FEH的生物信息學(xué)分析一、Zc7-7^F基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析.利用DNAMAN對實(shí)施例1獲得的Zc7-/^5F的全長cDNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該序列全長1803bp(具有自序列表中序列2的5'端第1-1803位核苷酸序列)，編碼由600個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，氨基酸序列為序列表中序列1的氨基酸殘基序列，推測其分子量為66.8kDa，等電點(diǎn)pl值5.49。該蛋白含有三個(gè)典型的NDPNG，F(xiàn)RDP和[WEC(V/P)D]結(jié)構(gòu)域，自序列表中序列l(wèi)的氨基端(N)第72位-第76位氨基酸殘基為保守的NDPSG結(jié)構(gòu)域，第196位-第199位為FRDP結(jié)構(gòu)域，第251位-255位為WECPD結(jié)構(gòu)域。用Signal3P(http:〃爾.cbs.dtu.dK/services/SignalP)服務(wù)器分析Lcl-FEH具有由27個(gè)氨基酸殘疾組成的信號(hào)肽，即序列表中序列l(wèi)自氨基端(N端)第l位-第27位氨基酸殘基，表明它是FEH家族中的一員。二、Lcl-FEH與植物中其他已克隆的FEH類蛋白編碼氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析利用DN扁AN軟件對Lcl-FEH與植物中其他已克隆的FEH類蛋白的氨基酸序列(GeneBank登陸號(hào)分別為AJ508534、AJ509808、DQ073968、AJ508387)進(jìn)行同源性分析，并用MEGA3.1軟件對Lcl-FEH與植物中其他已克隆的FEH類蛋白的氨基酸序列玉米(Zea鵬^)INVl(GeneBank登陸號(hào)AF050129)、INV3(GeneBank登陸號(hào)AF050631)、；蠶豆(Kfcia/s力a)、INV2(GeneBank登陸號(hào)Z35162);胡蘿卜("a固"群&)INV1(GeneBank登陸號(hào)M58362)、INV2(GeneBank登陸號(hào):Q39692)、INV3(GeneBank登陸號(hào)Q39693);番茄(Zycoperw'co/escWe/7fMz)INV5(GeneBank登陸號(hào)AJ27304);煙草(7VYc。".觸z^ac鵬)INV(GeneBank登陸號(hào)X81834);擬南芥(^ra力油，'sz^Wi認(rèn))INV1(GeneBank登陸號(hào)X74514)、INV2(GeneBank登陸號(hào)Ul1033)、INV4(GeneBank登陸號(hào)AB049617)、INV3(GeneBank登陸號(hào)AB029310)、INV6(GeneBank登陸號(hào)AY060553)、甜菜(5e&raJ卵r^)6-FEH(GeneBank登陸號(hào):AJ277458)、和INV(GeneBank登陸號(hào)AJ278531);豌豆m"Vm7)INV(GeneBank登陸號(hào)AF063246);東亞市藜(67otc^oo^/zz)INV(GeneBank登陸號(hào)X81792);草莓(尸/^卵2^as朋/as^)INV(AF000521);菊苣(。'c力ar^;/zINV(GeneBank登陸號(hào)Y11124)、1-FEHIIa(GeneBank登陸號(hào)AJ29033);水稻(一a^"ra)INV(GeneBank登陸號(hào)AB154521);小麥(7^'"c咖aes"k咖)INV(GeneBank登陸號(hào)AF030420)、1-FEHwl(GeneBank登陸號(hào)AJ516025)、1-FEHw2(GeneBank登陸號(hào)AJ508387)、1-FEHw3(GeneBank登陸號(hào)AJ564996)、6&1FEH(GeneBank登陸號(hào)AB089269)、6-KEHwl(GeneBank登陸號(hào)AB089271)6-KEHw2(GeneBank登陸號(hào)AB089270);黑麥草(Zoh'MZ7pere/7/eL.)l-FEHa(GeneBank登陸號(hào)DQ016297))進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，同源性分析結(jié)果表明Lcl-FEH與單子葉植物小麥、大麥和黑麥草細(xì)胞壁類酵素酶同源性最高，分別為89%、87%和72%，表明Lcl-FEH與植物的胞壁類酵素酶同源性較高，而與液泡類酵素酶同源性分別為43%、49%，表明與液泡類酵素酶的同源性較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹分子結(jié)果表明Lcl-FEH蛋白在進(jìn)化過程中屬于IVc類與小麥、水稻和黑麥草的親緣關(guān)系較近。實(shí)施例3、Z"-Z^F基因的組織特異性表達(dá)分析分析Zc7-/^F的組織特異性表達(dá)模式，具體實(shí)驗(yàn)方法為分別提取羊草"ej^/sc力眾e/L^s(Trin.)Tzvel(吉生一號(hào)，吉林省吉生羊草良種站))幼苗(萌發(fā)以后生長8周的苗)的根、根莖、葉鞘、葉片四種組織的總RNA，及成苗(播種大田生長l年后的苗)根、根莖、葉片、花梗、莖第二節(jié)、開花期花序、灌漿期花序、乳熟期花絮利用引物3:TGAATGGCTACAGTGCTGC和引物4:CCAGTCCACCGTTATTGCC進(jìn)行RT-PCR分析，以/kz^'/2基因(擴(kuò)增引物為引物5:GCCAACAGAGAGAAGATGACC和引物6:ATAGAGGGAAAGCACCGCCT)作為內(nèi)標(biāo)，對cDNA模板進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，檢測其表達(dá)量，結(jié)果如圖6所示，圖6中的所示相對表達(dá)量是Zc7-/^F表達(dá)量與J"&基因表達(dá)量的比值。結(jié)果表明Zc7-Z^F基因在幼苗、成苗不同組織中的表達(dá)存在差異，以葉中表達(dá)量最低，根莖中表達(dá)較高。圖6中1為幼苗根、2為幼苗根莖、3為幼苗葉片、4為幼苗葉鞘、5為成苗根、6為成苗根莖、7為成苗葉片、8為花梗、9為莖第二節(jié)、IO為開花期花序、ll為灌漿期花序、12為乳熟期花序。實(shí)施例4、Zc7-y^^在不同非生物脅迫因子條件下的表達(dá)模式分析一、^^-/^#在不同非生物脅迫因子條件下的表達(dá)模式分析分析ZW-/^F在轉(zhuǎn)錄水平與不同非生物脅迫因子的關(guān)系，具體實(shí)驗(yàn)方法為將萌發(fā)后正常生長8周的羊草幼苗分別進(jìn)行低溫(4°C)、高鹽(300mMNaCl)、干旱(20%PEG)、脫落酸ABA(100I4O及水楊酸SA(10mM)、堿(75raMNa2C03)脅迫處理，并于處理不同時(shí)間O、1、3、7、19、11、13、15天，提取根莖的RNA。其中低溫(4°C)處理是將植株置于4i:環(huán)境下放置；高鹽(處理液為濃度為300mMNaCl水溶液)、干旱(處理液為質(zhì)量百分濃度為20XPEG的水溶液)、脫落酸ABA(處理液為濃度為IOO剛脫落酸水溶液)及水楊酸SA(處理液為濃度為10raM的水楊酸水溶液)、堿(處理液為濃度為75mM的Na2C03水溶液)脅迫處理是各種處理液每天澆一次，每盆植株均勻澆入400ml，連續(xù)澆灌15天。分批取材后，進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)分析Zc7-戶2F基因在不同非生物脅迫因子條件下的表達(dá)模式，具體步驟如下分別提取上述不同處理的羊草幼苗的總RNA后按照大連寶生物公司SYBRPrimeScriptRT-PCRKit試劑盒操作說明書，用特異引物L(fēng)cl-FEHs(5，-TGAATGGCTACAGTGCTGC-3，)禾卩Lcl一FEHas(5，-CCAGTCCACCGTTATTGCC-3')擴(kuò)增FEH基因，同時(shí)用引物(5，-GCCAACAGAGAGAAGATGACC-3，)禾tlactinas(5，-ATAGAGGGAAAGCACCGCCT-3，)擴(kuò)增actin作為內(nèi)標(biāo)基因，定量PCR反應(yīng)程序先95°C，10秒，然后95°C5秒；60°C20秒40個(gè)循環(huán)。圖7縱坐標(biāo)表示的是處理羊草FEH基因表達(dá)量與正常條件下羊草FEH基因表達(dá)量的比，未處理?xiàng)l件下的比值設(shè)定為1。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明/^7在轉(zhuǎn)錄水平明顯受堿，ABA，SA及低溫脅迫誘導(dǎo)，隨著脅迫時(shí)間延長，表達(dá)量迅速增加，到達(dá)到最大值，之后表達(dá)水平逐漸降低，在鹽、干旱的誘導(dǎo)下的表達(dá)量迅速降低(圖7所示)。實(shí)施例5、Zc7-/^E7在pa^oi^s酵母表達(dá)及其水解活性分析分析Lcl-FEH蛋白對不同的底物水解活性，具體實(shí)驗(yàn)方法為用分別帶有EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)引物P1:5'-AGGAATTCATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3，(下劃線標(biāo)注的是fcoRI酶識(shí)別位點(diǎn))和P2:5'-CAGGTACCTCAAATTACTCCTCTTGTTTTG-3，(下劃線標(biāo)注的是I酶識(shí)別位點(diǎn))，用PCR的方法擴(kuò)增出得到Lcl-FEH的編碼框。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序表明，擴(kuò)增片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。將上述PCR獲得的擴(kuò)增片段用fcoRI和《mI進(jìn)行酶切，插入pPICZaB載體(購自Invitrogen)的EcoRI和Kpnl酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體，經(jīng)過酶切和測序驗(yàn)證，將經(jīng)驗(yàn)證表明含有序列表中序列2的核苷酸序列的正確的重組表達(dá)載體命名為pPICZaB-Lcl-FEH。用電擊法將pPICZaB-Lcl-FEH轉(zhuǎn)入P.pastorisX-33菌株(購自Invitrogen)得到可表達(dá)Lc1-FEH的工程菌株，各取轉(zhuǎn)化細(xì)胞200wL均勻涂布于含lOOmg/LZeocin的YPD(含1%(質(zhì)量百分含量)酵母提取物，2%(質(zhì)量百分含量)胰蛋白胨，2%(質(zhì)量百分含量)葡萄糖，每100ml加入2g瓊脂粉滅菌后得到的培養(yǎng)基)平板，30。C靜置培養(yǎng)，長出的菌落(Mut+(甲醇利用型菌)P.pastoris轉(zhuǎn)化子單菌落)即為轉(zhuǎn)入PPICZaB-Lcl-FEH的工程菌株，對這些菌落提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和測序檢測，將檢測表明正確的含有pPICZaB-Lcl-FEH的工程菌株命名為X-33-pPICZaB-Lcl-FEH。將X-33-pPICZaB-Lcl-FEH接種于25mLBMGY(含1%(質(zhì)量百分含量)的酵母提取物，2%(質(zhì)量百分含量)的胰蛋白胨，1%(質(zhì)量百分含量)的甘油，1.34%(質(zhì)量百分含量)的YNB((含有硫酸銨、無氨基酸的酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基，成分為3.4g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(無硫酸銨)(上海麥莎生物科技有限公司)+1(^硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌)和4X10、(質(zhì)量百分含量)的生物素的培養(yǎng)基)培養(yǎng)基，3(TC振蕩培養(yǎng)至OD腦為2-6，離心收集細(xì)胞，重懸于100-200mLB腿Y(含有1%(質(zhì)量百分含量)的酵母提取物，2%(質(zhì)量百分含量)的胰蛋白胨，0.5%(質(zhì)量百分含量)的甲醇，1.34%(質(zhì)量百分含量)的YNB(含有硫酸銨、無氨基酸的酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基，成分為3.4g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(無硫酸銨)(上海麥莎生物科技有限公司)+10§硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌)和4X10—5%(質(zhì)量百分含量)的生物素的培養(yǎng)基)中，繼續(xù)培養(yǎng)。每24h補(bǔ)加甲醇l次，至終濃度為lg/L。培養(yǎng)72小時(shí)后，進(jìn)行如下蛋白提取和檢測。同時(shí)，將P.pastorisX-33菌株(購自Invitrogen)進(jìn)行相同的培養(yǎng)，并進(jìn)行如下蛋白提取純化和檢測作為對照。按照LiesbetVanRiet等(LiesbetVanRiet,VinayNagaraj,WimVandenEnde，StefanClerens，AndresWiemkenandAndre'VanLaerel.2006.Purification,cloningandfunctionalcharacterizationofafructan6—exohydrolasefromwheat(Triticumaestiv咖L.)JournalofExperimentalBotany.57，213_223.)的方法純化蛋白，后進(jìn)行進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明，X-33-pPICZaB-Lcl-FEH表達(dá)得到66.8kDa大小的Lcl-FEH蛋白(圖8中泳道1)，而P.pastorisX-33菌株對照表達(dá)蛋白沒有該66.8kDa大小的Lcl-FEH蛋白(圖8中泳道2)。圖8中，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為X-33-pPICZaB-Lcl-FEH表達(dá)并純化得到的蛋白，泳道2為P.pastorisX-33菌株表達(dá)并純化得到的蛋白。將獲得的純化蛋白用PH5.0醋酸鈉稀釋l-2倍后，加入不同的底物(蔗果三糖、蔗果四糖、細(xì)菌類果聚糖(WAKO)、菊粉、6-蔗果三糖，新蔗果三糖、蔗糖，至底物濃度為5mM，在30。C孵育進(jìn)行水解反應(yīng)，調(diào)節(jié)蛋白的含量及反應(yīng)時(shí)間使其水解反應(yīng)成線性階段，后在90。C加熱5min終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物分別用高效陰離子交換色譜儀CarboPacPA-1柱分析檢測產(chǎn)物。色譜儀按照洗脫的峰面積計(jì)算出產(chǎn)物果糖的含量，將其最適底物蔗果三糖水解后得到的果糖量定義為100%，其它底物水解后得到的果糖量與其相比值為其相對活性結(jié)果表2所示。同時(shí)將純化蛋白稀釋與羊草中分離的果聚糖按照Morvand等的方法(Morvand-BetrandA,Boucaud丄LeSaosJ，PrucThommeMP.2001.RolesofthefructansfromtheelongatingleafbasesintheregrowthfollowingdefoliationofLoliumperenneL.Planta213，109-120)制備，反應(yīng)48小時(shí)用高效陰離子交換色譜儀CarboPacPA-1柱分析檢測產(chǎn)物結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明Lcl-FEH蛋白能水解菊粉、蔗果三糖、蔗果四糖而對細(xì)菌類果聚糖、6-蔗果三糖、新蔗果三糖和蔗糖基本無水解作用(表2);能水解羊草中分離的6，l蔗果三糖，但對6，6蔗果三糖基本無水解作用(圖9)。因此表明Lcl-FEH蛋白能夠?qū)Ｒ凰?-2，l糖苷鍵，而對0-2，6糖苷鍵沒有水解作用。說明本發(fā)明的Lcl-FEH具有羊草果聚糖水解酶活性。表2.Zc7-Z^F融合蛋白與不同底物水解作用結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例6Zc7-月5F編碼蛋白的抗逆功能驗(yàn)證一、Lcl-FEH植物表達(dá)載體的構(gòu)建將PMD-Zc7-/^F用Wall和feci雙酶切，回收切下的約1800bp的含有Lcl-FEH的片段，將植物表達(dá)載體p3301-BI121(購自CAMBIA)用ZMLI和&cl雙酶切，回收11.4kb的片段，約1800bp的含有Lc卜FEH的片段和11.4kb的片段連接，得到含有Lcl-FEH完整讀碼框的高效植物雙元表達(dá)重組載體，將其命名為p3301-BI121-Lcl-FEH(結(jié)構(gòu)簡圖見圖10)。對構(gòu)建好的植物表達(dá)載體p3301-BI121-Lcl-FEH用XbalI和SacI進(jìn)行雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖ll所示，經(jīng)酶切獲得一條1800bp的條帶，表明目的片段已正確連接入表達(dá)載體中。圖11中，泳道M是分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為p3301-BI121-Lcl-FEH酶切鑒定電泳圖。同時(shí)用Lcl-FEH特異引物(引物1:5，-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3，；引物2:5，-ATAGAAGTAAAAAGTACACTGACTCT-3，)，以植物表達(dá)載體p3301-BI121-Lcl-FEH為模板(圖12中泳道l)，以連有Lc卜FEH基因的克隆載體pMD18-T質(zhì)粒(PMD-Zc7-便奶為對照(圖12中泳道2)，進(jìn)行PCR檢測，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖12所示，以植物表達(dá)載體p3301-BI121-Lcl-FEH為模板PCR擴(kuò)增出一條1800bp的條帶，進(jìn)一步證明Lc1-FEH基因片段已正確連接到載體中，獲得了插入序列的Lcl-FEH植物表達(dá)載體。圖12中，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道l為以植物表達(dá)載體p3301-BI121-Lcl-FEH為模板的PCR產(chǎn)物，泳道2為以PMD-Zc7-^F為模板的的PCR產(chǎn)物。二、Ad-Z^F轉(zhuǎn)基因水稻(轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lc1-FEH水稻)的獲得將步驟一構(gòu)建的植物表達(dá)載體p3301-BI121-Lcl-FEH通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(invitrogen公司)中，篩選重組菌株，將該重組菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定，將鑒定表明正確的含有p3301-BI121-Lcl-FEH的重組菌株命名為EHA-Lcl-FEH。水稻品種臺(tái)北309(6!o^ssaz^VaL.ssp.Japonica.cv.Taipei309，購自中國農(nóng)科院水稻研究所)種子在N6D培養(yǎng)基(ChuC.C，WangC.S，SunC.C,HsuC，YinK.C，ChuC.Y.1975.Establishmentofefficientmediumofanthercultureofricethroughtcomparativeexperimentsonnitrogensources.Sci.Sinica，18:659—668;中國科學(xué)院植物研究所)上黑暗培養(yǎng)2周后，切下愈傷組織，挑選致密的小塊，用EHA-Lcl-FEH菌液浸染，然后按照下述步驟進(jìn)行篩選和馴化培養(yǎng)1)將侵染后的愈傷組織接種于N6D培養(yǎng)基上25-28。C下暗培養(yǎng)3天。2)將步驟1)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有10mg/Lppt(除草劑)(sigma公司)的分化培養(yǎng)基(Hiei，Y.S.0hta，T.KomeriandT.Kumashiro.1994.EfficienttransformationofricemediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofthebounderiesofT-DNA.PlantJ.6:271-282;中國科學(xué)院植物研究所)上，26。C進(jìn)行分化培養(yǎng)，35天后，待小芽長至5cm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS)上，26。C生根培養(yǎng)，待小苗長至8-10cm左右進(jìn)行馴化后移栽到溫室即得到轉(zhuǎn)P3301-BI121-Lcl-FEH水稻。將轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株進(jìn)行PCR檢測，以Lcl-FEH特異引物(引物l:5，-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3，；引物2:5，-ATAGAAGTAAAAAGTACACTGACTCT-3，)為引物，以轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到約1800bp的含有Lcl-FEH基因的片段，即為檢測陽性。以相同PCR引物擴(kuò)增的野生型臺(tái)北309水稻和PMD-Zc7-Z^F質(zhì)粒為對照。結(jié)果如圖13所示，結(jié)果共獲得陽性轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株6株。圖13中，泳道l為PMD-丄"-7^^質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為野生型水稻擴(kuò)增結(jié)果，泳道3-8為轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株的擴(kuò)增結(jié)果。三、Lcl-FEH轉(zhuǎn)基因水稻的抗逆性實(shí)驗(yàn)將步驟二獲得的6株P(guān)CR檢測陽性的轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株的種子播種于含10mg/Lppt(除草劑)(sigma公司)的1/4MS固體培養(yǎng)基平板(抗性平板)上，使其萌發(fā)，在抗性平板上26。C生長兩周后，將幼苗栽入土中，在溫室中培養(yǎng)兩周后，將水稻幼苗分成2組，一組置6C,光下低溫處理(脅迫組)4d，另一組置25'C光照培養(yǎng)作對照。同時(shí)將野生型水稻品種臺(tái)北309(0ryzasativaL.ssp.Japonica.cv.Taipei309)，購自中國農(nóng)科院水稻研究所)播種于1/4MS固體培養(yǎng)基上，使其萌發(fā)并于26。C生長兩周其余操作與轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株相同，作為野生型對照。1/4MS培養(yǎng)基含有MS培養(yǎng)基所含組分，其中，所含大量元素濃度為MS培養(yǎng)基的1/4，其余組分的濃度與MS培養(yǎng)基相同。將上述處理4d后的轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻植株或野生型對照植株分別測定各項(xiàng)生理指標(biāo)(葉綠素含量、根系活力和細(xì)胞膜透性)。葉綠素含量測定采用分光光度計(jì)比色法，80%丙酮提取色素；根系活力測定采用TTC法測根系脫氫酶活性；細(xì)胞膜透性采用DDS-307型電導(dǎo)率儀測定葉片細(xì)胞的外滲電導(dǎo)率(郝再彬，蒼晶，徐仲主編.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(M〕1哈爾濱哈爾濱出版社，2002,21)。各項(xiàng)指標(biāo)所反映的水稻幼苗的相對變化率是以25。C測定值(A)對6。C測定值(B)的表示，艮卩相對變化率=IA-BIX100%/A。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻幼苗經(jīng)6"處理四天沒有發(fā)生凍害現(xiàn)象，而野生型水稻對照植株經(jīng)6'C處理四天出現(xiàn)了黃葉。6個(gè)轉(zhuǎn)p3301-BI121-Lcl-FEH水稻株系(表3中轉(zhuǎn)基因水稻1-轉(zhuǎn)基因水稻6)幼苗的三個(gè)生理指標(biāo)均比野生型對照的相對變化率小，說明在低溫處理下轉(zhuǎn)基因植株的耐冷能力優(yōu)于對照，而對照植株則變化較大，的受冷后葉綠素含量、TTC還原強(qiáng)度均大幅下降同時(shí)外滲電導(dǎo)則大幅增加，結(jié)果如表3所示。上述實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明的Lcl-FEH可以增強(qiáng)植物的耐低溫能力，從而可作為植物耐冷基因工程候選基因加以應(yīng)用，用來改良植物的抗冷性狀。表3.低溫脅迫對水稻幼苗3種生理指標(biāo)的影響及其相對變化率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表<160〉5<210〉1<211〉600〈212>PRT〈213>羊草(丄eymwsc/n'"e"i7's(Trin.)Tzvel)〈400〉1MetAla1TyrValSerGlyLysAsp50GinSer65AsnGlyPheGlyTrplieAspGly130Vallie145lieAlaGinAlaThrSer35ProAsn20GlyTrp5LeuAlaPheLeuLeuProValLeuPhePhe10TyrPheLeuProGlyArgSerSerProAlaAlaLysAsnTyrlieAspGly115Cyslielie100LeuTrpTyrHis85ValTrp70GluSer55MetPhe40ThrThr25LeuAlaSerSerCysMetTyrAsnAspProPheTyrGinAlaGinTrpGlyHisGlyProAlaThrGlyThr■PheProGly150AsnSer135GlyLeu120ValSer105ValTyr90ValLysSer75AsnThr60GlyAla45AlaPro30ProGlySer15LeuCysLysAspPheHisPheProMetLeuAsnGlySerThrAspArgAspThrThrlieLeuLys165LysAlaAlaAsnAsnProValLeuAsplieAspArgSerAspArgPro170ProGin155TyrPro140HisSer125GlyLeu110SerGlyGinValLeuArgGluAspGluProGlyTyrPhe80Prolie95lieAsnAsplieLysProGinAsn160Trplie175MetAsn180PheArgAspProSerlieGlu195ArgMetAlaVal185ThrGlyTrplieLeuTrp210LeuLeu225ProLeuThr200GlyGluLeuAsnTyrLysSerTyrGly215AspPheLeuAsnSerPheAlaValLeu260GlyHis245ProGlu230AsnGlySerAsnTrp235TrpGly220ThrGluGly205TyrLysCyslieProGin275TyrAspLys290ProAspAsnVallie305GlyThrPheTyrGlyAsnAsnLysLeulieGlyMet250GlyLeuAspLeu190ProSerValProAlaLysHisVal295AspAla280TyrGly265LeuLysMetSerAspGlyAlaAlaAspHis240AspPhe255SerAlaAla270AspSerValArgAspArgAsp310SerAsnHisSerLeuLysArg300LeuVal285AspAlaPheValGlySerTyrGly340GlyAla325ValGlyLeuGlyLeuSer330GinTrp315ThrArgGlulieLeuGinLys355AspLeuAla370GluPheLeu385LysGlyAspLeuAspArgTrpAlaGlyGlyArg345HisThrlieProAspTyr320ArgGluArgAlaGly335MetlieThrLysAsn390GluGin375GluLeu360LeuLeuGinTrplieAlaLeuGin350ArgArg365ValAspPro380GlyLeuGluValGlulieAsp420TrpPhe405PheGluLeuAlalieAsnHisGin395AspThrPheGinlieLysGluVal410lieAspAspAlaAspAspProSerTrpLeuLeuAspProGluLysHisCysGlyGluValGlySer425GluAsp430GlulieTrpGlulieLeuAsn400AlaAsp415ProPhe435AlaSerValProGlyGlylie450455SerAspAsnMetGluGluHis465470LeuGinGluLysTyrMetVal485SerMetArgProGlyLeuGlu500PheAspLeuAlaLysGluArg515ArgSerAlaValGluSerPhe530535SerArgValTyrProAlaVal545550TyrAlaPheAsnAsnGlySer565AlaTrpThrMetArgLysAla580AlalieGinAsnArgGlyVal595440445GlyProPheGlyLeuVallieLeuAla460ThrGluValTyrPheArgValTyrLys475■LeuMetCysSerAspLeuArgArgSer490495LysProAlaTyrGlyGlyPhePheGlu505510LyslieSerLeuArgThrLeulieAsp520525GlyGlyArgGlyArgValCyslieThr540LeuAlaAspValGlyArgAlaHisMet555560AlaThrValArgValProGinLeuSer570575GinValAsnValGluLysGlyTrpSer585590lie600<210〉2<211〉2040<212〉DNA<213〉羊草c/n."m^(Trin.)Tzvel)<400〉2atggcgcaagcgtgggccttcctcctcccggtcctcttcttcggctcctacgtaacaaacGOctcttcctccccacctatgcatccagccccctctgcagcggcagtggaggcagatccttc120ctctgcgcacaggctccaaaggacaaggacccctxtcctgccagcaccatgtacaagacc180gccttccactttcagtctgccaagaactggatgaacgatccatctggaccaatgtacttc240aatggcatctacc^tg^ttctaccagtata^cctc^cggtcccatttt300gtttggggccattcggtttcaacagacctcatxa^ctggattgggcttggacccgcatta360gtscgggatacctcaagtgacatagacggttgctggaccggctcagtcaccattctgcct420ggtggta羅cggtcatcatatacactggtggcgacatagatcaacatca480atcgcgtttccca^aaccggtctgatccgtacctgagggaatggstc^agcagcc8at540aacccggtgctxcgaccggaCg雄C3gggatg^ctcgsttgagttcagggatccgaca600accggttggatcggaccggatggactgtgg鄉(xiāng)Mggcagttggtggtgagctgaatggc660tacagtgctgcacttttgtac^gagtg￡i3gactttctgaattggacaaaagttgatcac720ccactgtattcaca^aatggatccaatatgtgggsgtgtccggatttctttgcggtattg780ccgggcaataacggtggactggacctgtccgcagcgatcccaca^ggcgccaagcatgcc840gcgtggattccgttgacaagtacttgattgggg"tgtatgatctcaaacgt■gatgcctttgtgccagata3tgtcatagatgaccgtcggctgtggctgaggstagattat960ggcactttctatgcttca^tcattcttcgactcgagaaagggcaggaggatcatatggg1020gttggtctaggg卿c卿tagcccttcagatgatcttgcaa^aaggttgggctggactc1080catacaatccccaggagaatttggttagccgatg3tggC8agcagttgttacaatggcca1140gttgatgagatcgagttccttcg^c3aatgaaMcaaccagagctcaac1200^gggagatctatttgagatca3gg^gttgacacttttcaggctgstgtaga^tagst1260tttgagctggcgtccatcgatgacgccgatccttttgatccttcctggcttttggacccc1320gagaagcattgtgggg犯gtgggtgcatcggttcctggtggtataggtccatttggactt1380gttattctggcctccgacaaC3C3Ctg￡lggtgtatttcagagtctax:dag1440ttac3ggaaaagtacatggtactaatgtgctctgatctaagaaggtcttcC3tg￡lgaCCa1500ggactgg卿aaccagcctatggaggcttctttgaatttg1560atatccctcagaactctgattgatcggtcggcggtgg卿gcttcggcggc叫g(shù)ggt鄉(xiāng)1620gtttgcatcacgtctagagtttatccggcggtgctcgctgacg"tcggcagggcccacatg1680tatgccttcaac^tgga^gtgccacggtcagggtgccacagctcagcgcatggaccatg1740aagtga^tgtgg卿agggttggagtgctattcaaaacag1800tgattttctcgattcttttagcactgcctggcagaaataaggacattcaa1860cagg^a^aatggcctgtcatttctttgatctctagtattcatatattgtagttacttct1920tagtaagcccttcccatctcagtaatctacttgtatcaatttttatag肌gtaaa^agta1980cactgactct2040〈210〉3<211〉723〈212〉DNA〈213〉羊草(丄e戸wsc/7z7e服^(Trin.)Tzvel)〈400〉33gtcc33atggacctataccaccaggaaccgatgcacccacttccccaca60atgcttctcggggtccaiaaagccagg鄉(xiāng)gatcaa犯ggatcggcgtcatcgatggacgc120cagctca^atctatctctacatcagcctgaaaagtgtcaacttccttga180atxtcccttgttgagctctagt:ccttgatggttgatttcatttgttcgaagga^ctcaat240ctcatcaactggccattgtaacaactgcttgccatcatcggctaaccaaattctcctggg300gattgt3tggagtccagcccaaccttttgcaagatcatctg肌gggctgrtctgtxtccct360agaccasccccatatgatcctcctgccctttctcgagtcgttga^gcata420gaaag"tgccataatctatcctcagccacagccgacggtcatcta"tgacattatctggcac480cgtttgagatcatacaccccaatcaagtacttgtcaacggaatccacgct540C3tttta^gagCELtgcUggcgccttgtgggatcgctgcggac3ggt;ccagtccaccgtt600attgcccggcaataccgcaasgaaatccgg3cactcccacatattggatccattatgtga660acacagtgggtgatca3Cttttgtccaattcaga^agtct"tcactcttgt720tgc723〈210〉4〈211〉1373<212〉墜〈213〉羊草(丄e，wsc/2/"m^(Trin.)Tzvel)<400〉4attgcagcgcctgtattcacggc^taacggcctttgtgcactttctatgtggtctagggacaalccccagatg卿ttgggagatctatgagctggcgtaagcattgtgattctggcctcagg^a3gtctggaga^ctccctcagaatgcatcacgtgccttcaacaaaggcacaagttttctcgatga^aa^tagttttgtacaaat^tgggLl:cgtggaictggatggattccgtcagat3atg1:cttcaaaatcagaca^t3ggg卿eLt1:tgagttccttcg"ttgagatc犯ccatcgatgaggg鄉(xiāng)tgggccgacaacatacatggtactcagcctatggctctgattgactagagtttaatgg卿tgctg犯tgtggatctt"ttatxacctgtxatttgagtga卿tcaatatgtggcct'gtccgcatgaca^gtax:c^t3gatgacattcttcgaccccttcagatgttagccgatgg^gttgaccgccgatccttgcatcggttggaagagcacaatgtgctctaggtttcttttcggtcggcgtccggcggtgcacggtcagggaagggttggttcatgagcactttgatctctt"tctgaat1:gagtgtccgggcgatcccac"ttgattggggcgtcggctgtt:cg卿aggggatcttgcaagatggcaagcatcaaccatcacttttcaggtttgatccttcctggtggtaactg郷tgtgaatttgatcgtggagagctctcgctgacggtgccacagcagtgctattcctgcctggcatagtattcatggacaaaagtatttctttgc^ggcgccaatgtatgatctggctg郷atgcaggsggata鄉(xiāng)ttgggcagttgttacactgatgt3gacctggct"ttttaggtccattatttcagagtggtcttccatttgca犯ggatcggcggcagtcggcagggctcagcgcatgaaaacagaggga^ataaggaatattgtagttgatcacccaggtattgccggcatgcccttca^cgtgatagattatggccatatggggttggactccatatggccagttgctca^caaggatagattttgg3CCCCg3gtggacttgttctac^gttag,ccaggagggtagggttccacatgtatgsccatg8ggagtaatttgacattcaacagtactacttag60120180240300360420■540600660720780840■96010201080114012001260taagcccttxccatctcagttacttgtatcaatttttata13201373〈210>5<211>753<212>DNA<213〉羊草c/n'wera/s(Trin.)Tzvel)〈400〉5atggcgc卿cgtgggccttcctcctcccggtcctcttcttcggctcctaCgt^C3^C60ctcttcctccccacctatgcatccagccccctctgcagcggcsgtgg郷cagatccttc120ctctgcgcacaggctccaaaggacaaggacccctctcctgccagcaccat180gccttccactttcagtctgccaagaactggatgaacgatccatctggaccaatgtactlx240aatggcatctaccatg犯ttctaccagtst^cctcaacggtcccatttt300gtttggggccattcggtttcaacagacctcatxaactggattgggcttggacccgcatta360gtacggg由cctcaagtgacatagacggttgctggaccggctcagtcaccattctgcct420ggtggta犯ccggtcatcatatacactggtggcgacatagatcaacatcaggtsca^aac■atcgcgtttccc^^accggtctgatccgtacctgagggaatggatcaaagcagccaat540aacccggtgctccgaccggacgaaccagggatga^ctcgattgagttcagggatccgaca600accggttggatcggaccgga"tggactgtgg鄉(xiāng)atggcagttggtggtgsgctg組ggc660tacagtgctgcacttttgtaca^gagtgaagactttctgaattggaca^gtagttgatcac720ccactgtattcacataatggatccaatatgtgg75權(quán)利要求1、一種羊草果聚糖水解酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中序列1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中序列1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-2，1糖苷鍵水解酶功能的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的羊草果聚糖水解酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述羊草果聚糖水解酶的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中序列2的5'端第1一1803位核苷酸序列；2)序列表中序列2的DNA序列；3)編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、含有權(quán)利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶編碼基因的重組表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6、含有權(quán)利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶編碼基因的宿主菌。7、權(quán)利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶編碼基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求1所述的羊草果聚糖水解酶在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述提高植物耐逆性為提高植物抗冷性，所述植物為農(nóng)作物，優(yōu)選為水稻。10、權(quán)利要求1所述的羊草果聚糖水解酶及其編碼基因在水解具有P-2，1糖苷鍵的果聚糖中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種羊草果聚糖水解酶及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，一種羊草果聚糖水解酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中序列1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中序列1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-2，1糖苷鍵水解酶功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的耐低溫蛋白的編碼基因可轉(zhuǎn)入植物中提高植物抗逆性。該基因?qū)τ谥参锬湍娣肿訖C(jī)制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義，并為改良作物的耐逆性提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。文檔編號(hào)C12N1/21GK101412990SQ20081017218公開日2009年4月22日申請日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者劉公社,李曉峰,王麗娟,齊冬梅申請人:中國科學(xué)院植物研究所