人體血清凝血因子Ⅷ中的病毒過濾方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用血制品制造方法，具體是采用納米孔徑的過濾材料過濾除去人體 血清凝血因子VDI中的病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體血清凝血因子VDKF VID是指從人血衆(zhòng)中提取獲得的血液制品，臨床上主要用 于凝血因子VDI缺乏所致的凝血障礙糾正，主要是甲型血友病的治療。為確保產(chǎn)品的臨床使 用安全，產(chǎn)品生產(chǎn)過程必須進(jìn)行病毒去除/滅活步驟，主要的血源性病毒包括脂包膜病毒 例如乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒（HBV)，丙型肝炎病毒，艾滋病毒和人類T細(xì)胞白血病病 毒（HTLV-I);無包膜病毒，如肝炎病毒（HAV)以及細(xì)小病毒B19和TSE朊病毒導(dǎo)致變異型克 雅氏病（vCJD)。
[0003] 制造工藝必須平衡安全需求(病毒去除和/或滅活的需要）和提供高收率，合理的 成本和有效的高純度的最終產(chǎn)品，現(xiàn)在使用的領(lǐng)先病毒滅活/去除技術(shù)是巴氏滅菌法，干 熱處理，S/D處理和納米過濾，在凝血因子VDI制品上，則通用S/D和干熱滅活法，但S/D法和 干熱滅活法會(huì)導(dǎo)致凝血因子VID效價(jià)衰減12 -15%，甚至更高。
[0004] 納米過濾，也稱為"病毒過濾"，是基于使用的膜具有多層微孔結(jié)構(gòu)，可以通過尺寸 排阻清除病毒。該技術(shù)條件溫和并有效分離蛋白和病毒，包括包膜和無包膜病毒，可用于脆 弱的凝血因子VDI并保持完好的F VDI天然結(jié)構(gòu)。用10 - 35納米的過濾器能有效去除非脂包 膜細(xì)小病毒，如：HAV/豬細(xì)小病毒（PPV，一個(gè)耐受的病毒模型VTSE (分子大小約18-35nm)。 而凝血因子VDI分子較大，被認(rèn)為不能有效的穿過l〇-35nm的過濾器，而更大空隙的過濾器 (例如彡35nm)又不能有效去除HAV、B19和TSE 0
[0005] 采用10 - 50nm的過濾器將凝血因子VDI溶液進(jìn)行病毒過濾時(shí)，過濾速度非常緩慢， 且容易造成過濾器堵塞，使整個(gè)過濾中斷，而且過濾器的有效過濾載量非常小，達(dá)不到5L/ m 2。過濾速度小于lL/m2 *h，因此對(duì)于凝血因子VDI而言，工業(yè)上沒有采用過濾方法除去病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能使人血漿來源的人體血清凝血因子VDI溶液快速流 通過納濾材料的方法，由此實(shí)現(xiàn)采用納濾方法除去病毒的工業(yè)應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明在濃度為10 - 100IU/ml，pH為6. 0 - 8. 0的人體血清凝血因子VID水溶液中 添加濃度為50-500mmol/L的醫(yī)學(xué)上可接受的水溶性二價(jià)金屬鹽，溶液通過10-35納米孔 徑的過濾器除去病毒。
[0008] 本發(fā)明中，水溶性二價(jià)金屬鹽可以是鈣鹽、鋅鹽、亞錫鹽、銅鹽、二價(jià)錳鹽等，優(yōu)選 是水溶性鈣鹽或鋅鹽。水溶性鈣鹽包括氯化鈣、醋酸鈣、檸檬酸鈣、草酸鈣、酒石酸鈣、葡萄 糖酸鈣或乳酸鈣，優(yōu)選是氯化鈣。水溶性鋅鹽包括氯化鋅、硫酸鋅、醋酸鋅、檸檬酸鋅、草酸 鋅、酒石酸鋅、葡萄糖酸鋅或乳酸鋅，優(yōu)選是氯化鋅或硫酸鋅。
[0009] 鈣離子或鋅離子濃度優(yōu)選為200- 400mmol/L。
[0010] 溶液中還可加入氨基酸，其濃度為50-500mmol/L，優(yōu)選200-500mmol/L。氨基酸 優(yōu)選為L-精氨酸、L-組氨酸或L-賴氨酸的一種或以上。
[0011] 人體血清凝血因子VID水溶液中，人體血清凝血因子VID效價(jià)優(yōu)選為20- 70IU/ml。
[0012] 本發(fā)明通過二價(jià)金屬鹽的極性吸附等作用，降低了凝血因子VDI的粒徑，可使凝血 因子VDI順利通過10 - 35nm孔徑的過濾器進(jìn)行病毒過濾，過濾器載量高于15L/m2,過濾速度 可超過6L/m2 · h，實(shí)現(xiàn)納濾方法除去病毒的工業(yè)應(yīng)用，通過透析可除去加入的金屬鹽，可恢 復(fù)凝血因子VDI的天然結(jié)構(gòu)。過濾過程凝血因子VDI效價(jià)的衰減低于10%，優(yōu)選情況下，凝血因 子VID效價(jià)的衰減低于6%，明顯優(yōu)于通用S/D和干熱滅活法。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 :不同鈣離子濃度的過濾速度 人體血清凝血因子VDI的制備方法：血漿離心分離后獲得冷沉淀，經(jīng)氫氧化鋁吸附或 PEG處理后，經(jīng)S/D病毒滅活后，層析，洗脫獲得含凝血因子VDI的蛋白質(zhì)水溶液。
[0014] 人體血清凝血因子VDI溶液按下表所列濃度配制，調(diào)節(jié)pH至6. 95,先測(cè)定凝血因子 VID溶液的效價(jià)，在室溫，操作壓力差2. 5bar下，依次通過200nm、50nm和20nm的過濾器串聯(lián) 過濾，對(duì)配制后的凝血因子VDI溶液進(jìn)行病毒過濾，測(cè)出過濾速度和過濾后凝血因子VDI效價(jià) 見下表：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人體血清凝血因子VDI中的病毒過濾方法，其特征在于，在濃度為10 - l〇〇IU/ml，pH 為6. 0 - 8. 0的人體血清凝血因子VID水溶液中添加濃度為50- 500mmol/L的醫(yī)學(xué)上可接受 的水溶性二價(jià)金屬鹽，溶液通過10 - 35納米孔徑的過濾器除去病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述病毒過濾方法，其特征在于，所述水溶性二價(jià)金屬鹽為水溶性 鈣鹽或鋅鹽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述病毒過濾方法，其特征在于，所述水溶性鈣鹽為氯化鈣、醋酸 鈣、檸檬酸鈣、草酸鈣、酒石酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述病毒過濾方法，其特征在于，所述水溶性鋅鹽為氯化鋅、醋酸 鋅、檸檬酸鋅、草酸鋅、酒石酸鋅、葡萄糖酸鋅或乳酸鋅。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述病毒過濾方法，其特征在于，所述水溶性鈣鹽或鋅鹽濃度為 200一400mmol/L〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述病毒過濾方法，其特征在于，所述人體血清凝血因子VDI水溶液 中，人體血清凝血因子VID的效價(jià)為20- 70 IU/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述病毒過濾方法，其特征在于，所述溶液中加入氨基酸，濃度為 50一500mmol/L〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述病毒過濾方法，其特征在于，所述氨基酸為L-精氨酸或其鹽酸 鹽、L-組氨酸或其鹽酸鹽、L-賴氨酸或其鹽酸鹽的一種或以上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述病毒過濾方法，其特征在于，所述氨基酸含量為200- 500mmol/L〇
【專利摘要】本發(fā)明公開一種能使人血漿來源的凝血因子Ⅷ溶液快速流通過納濾材料的方法，在濃度為10—100IU/ml，pH為6.0—8.0的人體血清凝血因子Ⅷ水溶液中添加濃度為50—500mmol/L的醫(yī)學(xué)上可接受的水溶性二價(jià)金屬鹽，溶液通過10—35納米孔徑的過濾器除去病毒，實(shí)現(xiàn)納濾方法除去病毒的工業(yè)應(yīng)用，通過透析除去加入的金屬鹽，可恢復(fù)凝血因子Ⅷ的天然結(jié)構(gòu)。過濾過程凝血因子Ⅷ效價(jià)的衰減低于10%，優(yōu)選情況下，凝血因子Ⅷ效價(jià)的衰減低于6%，明顯優(yōu)于通用S/D和干熱滅活法。
【IPC分類】C07K1-34, C07K14-755
【公開號(hào)】CN104804078
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510221518
【發(fā)明人】陳成坤, 黃錦程, 王文杰, 黃進(jìn)英, 蒙勇江, 管紅玲
【申請(qǐng)人】廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年5月5日