專利名稱：檢測靶序列的方法和組合物的制作方法
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測樣品中靶序列的方法和組合物。
II.背景技術(shù)經(jīng)常要對含有一種或多種靶序列的樣品進(jìn)行檢測是否存在(或定量)一種或多種靶序列。例如，在檢測癌癥和許多傳染性疾病，如AIDS和肝炎時(shí)，常規(guī)包括篩檢生物樣品中是否存在診斷性核酸序列。此外，檢測核酸序列的存在與否常用于法醫(yī)學(xué)、親子鑒定、遺傳學(xué)判斷和器官移植。
某生物的基因組中所含基因決定了該生物的遺傳構(gòu)成。而基因由編碼制造蛋白質(zhì)所需信息的長鏈脫氧核糖核酸(DNA)聚合物組成。生物的性質(zhì)、潛力和性狀常與該生物所產(chǎn)生的或不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的類型和數(shù)量有關(guān)。
基因如下產(chǎn)生蛋白質(zhì)。首先，編碼某蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)“X”的基因DNA，通過稱為“轉(zhuǎn)錄”的過程轉(zhuǎn)變?yōu)楹颂呛怂?RNA)。轉(zhuǎn)錄過程中，該基因進(jìn)行了單鏈互補(bǔ)的RNA拷貝。然后該RNA拷貝產(chǎn)生稱為蛋白質(zhì)X的信使RNA(mRNA)，通過細(xì)胞的生化機(jī)制制造出蛋白質(zhì)X，此過程稱為“翻譯”。從基本上說，細(xì)胞的蛋白質(zhì)制造機(jī)制結(jié)合該mRNA，“讀取”該RNA的密碼，并將其“翻譯”成蛋白質(zhì)X的氨基酸序列?？傊?，DNA被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，后者被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)X的量，通常主要取決于細(xì)胞中存在的蛋白質(zhì)X mRNA的量。而蛋白質(zhì)X mRNA的量，至少部分取決于基因X表達(dá)的程度。某特定基因是否表達(dá)，如果表達(dá)那么表達(dá)水平如何，可能對該生物體具有重要影響。
III.發(fā)明概述在某些實(shí)施方案中，提供了檢測樣品中至少一種靶核酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括形成一種連接反應(yīng)組合物，該組合物包含樣品和各靶核酸序列的連接探針組。在某些實(shí)施方案中，該探針組包括(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中3’引物特異性部分含有一序列。在某些實(shí)施方案中，各組中的探針當(dāng)在互補(bǔ)靶核酸序列上毗鄰彼此雜交時(shí)適合于連接在一起，各探針組中的一個(gè)探針還含有位于引物特異性部分與靶特異性部分之間的可尋址部分，其中該可尋址部分含有一序列。
在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括使該連接反應(yīng)組合物通過至少一輪連接來形成一種測試組合物，此輪連接中，毗鄰的雜交互補(bǔ)探針彼此連接形成一連接產(chǎn)物，其含有5’引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分。
在某些實(shí)施方案中，該方法還包括形成一種擴(kuò)增反應(yīng)組合物，該組合物含有測試組合物；聚合酶；標(biāo)記的探針，其中，所述標(biāo)記的探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)具有可檢測的第一信號值，且其中所述標(biāo)記的探針含有可尋址部分的序列，或含有與可尋址部分的序列相互補(bǔ)的序列；和至少一個(gè)引物組，所述引物組含有(i)至少一種第一引物，其含有連接產(chǎn)物5’引物特異性部分的序列，和(ii)至少一種第二引物，其含有與該連接產(chǎn)物3’引物特異性部分的序列互補(bǔ)的序列。
在某些實(shí)施方案中，該方法還包括使所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物經(jīng)歷至少一次擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，該方法還包括檢測擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后至少一種可檢測的第二信號值，其中第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間有閾值差異表明存在靶核酸序列；其中第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間無閾值差異表明不存在靶核酸序列，在某些實(shí)施方案中，提供了檢測樣品中至少一種靶核酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括形成一種連接反應(yīng)組合物，該組合物包含樣品和各靶核酸序列的連接探針組。在某些實(shí)施方案中，該探針組包括(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中3’引物特異性部分含有一序列。在某些實(shí)施方案中，各組中的探針當(dāng)在互補(bǔ)靶核酸序列上毗鄰彼此雜交時(shí)適合于連接在一起，各探針組中的一個(gè)探針還含有位于引物特異性部分與靶特異性部分之間的可尋址部分，其中該可尋址部分含有一序列。
在某些實(shí)施方案中，該方法還包括使所述連接反應(yīng)組合物通過至少一輪連接來形成一種測試組合物，此輪連接中，毗鄰的雜交互補(bǔ)探針彼此連接形成一連接產(chǎn)物，其含有5’引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分。
在某些實(shí)施方案中，該方法還包括形成一種擴(kuò)增反應(yīng)組合物，所述組合物包含測試組合物；聚合酶；標(biāo)記的探針，其中，所述標(biāo)記的探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)具有可檢測的第一信號值，且其中該標(biāo)記的探針含有可尋址部分的序列，或含有與可尋址部分的序列相互補(bǔ)的序列；和至少一個(gè)引物組，所述的引物組含有(i)至少一種第一引物，其含有連接產(chǎn)物5’引物特異性部分的序列，和(ii)至少一種第二引物，其含有與該連接產(chǎn)物3’引物特異性部分的序列互補(bǔ)的序列。
在某些實(shí)施方案中，該方法還包括使所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物經(jīng)歷至少一次擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，該方法還包括通過監(jiān)測至少一次擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后的至少一種信號來檢測是否存在靶核酸序列。
在某些實(shí)施方案中，提供檢測至少一種靶核酸序列的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，該試劑盒包含各靶核酸序列的連接探針組。在某些實(shí)施方案中，該探針組含有(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中3’引物特異性部分含有一序列。在某些實(shí)施方案中，各組中的探針當(dāng)在互補(bǔ)靶核酸序列上毗鄰彼此雜交時(shí)適合于連接在一起，各探針組中的一個(gè)探針還含有位于引物特異性部分與靶特異性部分之間的可尋址部分，其中該可尋址部分含有一序列。
在某些實(shí)施方案中，該試劑盒還含有標(biāo)記的探針，該探針含有可尋址部分的序列，或含有與該可尋址部分相互補(bǔ)的序列。
IV.附圖的簡要說明本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將會理解下面描述的附圖目的只是為了說明。這些附圖不以任何方式限制本發(fā)明。


圖1圖示了某些示范性實(shí)施方案的標(biāo)記的探針。
圖2(2A-2E)圖示了某些包括連接和引物延伸擴(kuò)增的實(shí)施方案的示范性實(shí)施方案，圖3(3A-A3F)說明本發(fā)明包括連接和PCR-為基礎(chǔ)的擴(kuò)增的示范性實(shí)施方案，其中示范性的靶序列是樣品中的mRNA。
圖4圖示了本發(fā)明某些實(shí)施方案的連接探針組。
各種探針含有與靶序列(“靶特異部分”，T-SP)互補(bǔ)的部分和與引物(“引物特異性部分”，P-SP)互補(bǔ)的部分或，與引物序列相同的的部分。各探針組中的至少一種探針還含有位于靶特異性部分與引物特異性部分(這里是第二探針)之間的可尋址部分(ASP)。
各探針組含有至少一種第一探針和至少一種第二探針，設(shè)計(jì)的第二探針能與第一探針(這里是探針A)3’末端毗鄰的并相對的第二探針(這里是探針Z)5’末端的靶位點(diǎn)雜交。
圖5描述了采用本發(fā)明的某些實(shí)施方案區(qū)分靶基因座中兩個(gè)潛在等位基因的方法。
圖5在(1)中顯示(i)靶特異性探針組含有二種第一探針(A和B)，它們具有相同的引物特異性部分(P-SP1)，相同的靶特異性部分，關(guān)鍵互補(bǔ)處(這里是探針A的3’末端的T和探針B的3’末端的C)除外，和不同的尋址部分((ASP-A)和(ASP-B))；以及一種第二探針(Z)，它含有靶特異性部分和引物特異性部分(P-SP2)。
圖5在(2)中顯示有三個(gè)探針與靶序列退火結(jié)合。探針A的靶特異性部分與含有關(guān)鍵核苷酸的3’靶區(qū)域完全互補(bǔ)。探針B的關(guān)鍵互補(bǔ)處與3’靶區(qū)域不互補(bǔ)。探針B的靶特異性部分因此在3’端含有一個(gè)堿基對錯(cuò)配。探針Z的靶特異性部分與5’靶區(qū)域完全互補(bǔ)。
圖5在(3)中顯示探針A和Z連接形成連接產(chǎn)物A-Z。探針B和Z由于探針B上關(guān)鍵性互補(bǔ)處的錯(cuò)配，未能連接在一起形成連接產(chǎn)物。
圖5在(4)中顯示使雙鏈分子變性釋放A-Z連接產(chǎn)物和未連接的探針B和Z。
圖6圖示了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。
圖6(A)在(1)中描述了一條靶序列和含有二種第一探針(A和B)的連接探針組，二種第一探針具有相同的引物特異性部分(P-SP1)、相同的靶特異性部分，除不同的關(guān)鍵互補(bǔ)處(這里是探針A的3’端的T，和探針B的3’端的G)外，和不同的尋址部分((ASP-A)和(ASP-B))；以及一種第二探針(Z)，它含有靶特異性部分和引物特異性部分(P-SP2)。
圖6(A)在(2)中描述了在退火條件下A和Z探針與靶序列發(fā)生雜交。
圖6(A)在(3)中描述了存在連接劑時(shí)第一和第二探針相連接形成連接產(chǎn)物。
圖6(A)在(4)中描述了使連接產(chǎn)物靶復(fù)合物變性，以釋放出一單鏈連接產(chǎn)物；加入一引物組(P1和P2)和兩個(gè)標(biāo)記探針(LBP-A和LBP-B)；并使引物P2與連接產(chǎn)物退火結(jié)合。
圖6(A)在(5)中描述了通過用聚合酶以模板依賴方式延伸P2引物來形成雙鏈核酸產(chǎn)物。
圖6B和6C在(6)至(11)中描述了其它擴(kuò)增輪次的情況。
圖7(7A-7C)描述了某些涉及三個(gè)雙等位基因座的實(shí)施方案。
圖8說明采用flap內(nèi)切核酸酶的某些實(shí)施方案。
V.某些示范性實(shí)施方案的詳細(xì)描述應(yīng)理解上面的概述和以下的詳細(xì)描述只是示范和說明性的，不是如權(quán)利要求書那樣限制本發(fā)明的范圍。此請求書中所用單詞包括復(fù)數(shù)，除非另有特定說明。此請求書中所用“或”指“和/或”除非另有說明。另外，所用的述語“包括”以及其它形式，如“包含”和“含有”不是限制性的。還有，述語如“元件”或“組分”包括含有一個(gè)單元的元件和組分二者，和所述元件和組分包括一個(gè)以上的亞單位，除非另有特定說明。
本文所用各節(jié)的題頭，目的只是組織文章而不構(gòu)成限制本發(fā)明于所述內(nèi)容。為此目的本請求書中所引用的文獻(xiàn)或文獻(xiàn)中的部分包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和論著，它們的內(nèi)容都納入本文作參考。為此目的美國專利申請系列號2000，5，30提交的09/584,905；2000，11，28提交的09/724,755；2001，12，5提交的10/011,933和2001，5，30提交的專利合作協(xié)議申請PGT/US01/17329它們的內(nèi)容納入本文作參考。
A.一些定義術(shù)語“核苷酸堿基”本文用于指取代的或未取代的芳香族環(huán)或多環(huán)。在某些實(shí)施方案中，芳香族環(huán)或多環(huán)含有至少一個(gè)氮原子。在某些實(shí)施方案中，核苷酸堿基能與一正確互補(bǔ)的核苷酸堿基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氫鍵。示范性的核苷酸堿基及其類似物包括但不限于天然產(chǎn)生的核苷酸堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，和天然產(chǎn)生的核苷酸堿基的類似物，如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-脫氮腺嘌呤、N6-Δ2-異戊基腺嘌呤(6iA)、N6-Δ2-異戊基-2-甲基硫代腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、7-甲基鳥嘌呤(7mG)肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘧啶、7-脫氮鳥嘌呤、2-硫基嘧啶、6-硫基鳥嘌呤、4-硫基胸腺嘧啶、4-硫基悄嘧啶、O6-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、吡唑基[3，4-D]嘧啶(見例如美國專利6,143,877和6,127,121及PCT發(fā)表的申請WO 01/38548)、乙烯腺嘌呤、吲哚類如硝基吲哚和4-甲基吲哚、及吡咯類如硝基吡咯。某些示范性核苷酸堿基可在例如Fasmam，1989，Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology，pp.385-394，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la.，和本文引用的參考文獻(xiàn)中找到。
術(shù)語“核苷酸”本文用于指一種化合物，它含有與糖類，如核糖、阿拉伯糖、木糖、吡喃糖或它們的類似物的C-1’碳連接的核苷酸堿基。所述糖可被置換或不置換。被置換的核糖包括但不限于那些其中有一個(gè)或多個(gè)碳原子，例如2’-碳原子被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或鹵原子所置換的核糖，其中各個(gè)R各為H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。示范性核糖包括但不限于2’-(C1-C6)烷氧基核糖、2’-(C5-C14)烷氧基核糖、2，3’-二脫氫核糖、2’-脫氧-3’-鹵代核糖、2’-脫氧-3’-氟核糖、2’-脫氧-3’-氯核糖、2’-脫氧-3’-氨基核糖、2’-脫氧-3’-(C1-C6)烷基核糖、2’-脫氧-3’-(C1-C6)烷氧基核糖、2’-脫氧-3’-(C5-C14)烷氧基核糖、核糖、2’-脫氧核糖、2’，3’-雙脫氧核糖、2’-鹵代核糖、2’-氟核糖、2’-氯核糖、和2’-烷基核糖，如2’-0-甲基，4’-α-端基異構(gòu)體核苷酸、1’-α-端基異構(gòu)體核苷酸、和2’-4’-和3’-4-連接的和其它“封閉的”或“LNA”，雙環(huán)糖類修飾(見例如PCT發(fā)表專利申請WO 98/2248、WO 98/39352和WO 99/14226)多核苷酸中的LNA糖類似物包括但不限于以下結(jié)構(gòu) 其中B是任何核苷酸堿基。
核糖的2’-和3’-部分的修飾包括但不限于氫、羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁基氧基、異丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、疊氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不限于天然的D光學(xué)異構(gòu)體及L光學(xué)異構(gòu)體形式(見例如Garbesi(1993)，Nucl.Acid Res.214159-65；Fujimori(1990)，J.Amer.Chem.Soc.1127435；Urata(1993)，Nucleic Acid Symposium Ser.No.2969-70)。當(dāng)核苷酸堿基是嘌呤，如A或G時(shí)，核糖結(jié)合在核苷酸堿基的N9-位。當(dāng)核苷酸堿基是嘧啶，如C、T或U時(shí)，戊糖結(jié)合在核苷酸堿基的N1-位，但假尿苷除外，其戊糖結(jié)合在尿嘧啶核苷酸堿基的C5位(見例如Kornberg和Baker，(1992)DNAReplication，第2版，F(xiàn)reemam.San Francisco，CA)。
核苷酸的一個(gè)或多個(gè)戊糖碳原子可被具有以下公式的磷酸酯取代 其中α是0-4的一個(gè)整數(shù)。某些實(shí)施方案中，α是2和磷酸酯結(jié)合在戊糖的3’-或5’-碳上。在某些實(shí)施方案中，核苷酸是其中堿基為嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶、或它們的類似物的那些核苷酸。“核苷酸5’-三磷酸”指5’-位具有三磷酯酯基團(tuán)的核苷酸，有時(shí)表示為“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”具體指出了核糖的結(jié)構(gòu)特征。三磷酸酯基團(tuán)可包含各個(gè)氧被硫取代，如α-巰基-核苷-5’-三磷酸。核苷酸化學(xué)物的綜述可見Shabarova，Z和Bogdanov，A.Advanced Organic Chemistry of NucleicAcids，VCH，New York，1994。
術(shù)語“核苷酸類似物”本文用于指核苷酸的戊糖和/或核苷酸堿基和/或一個(gè)或多個(gè)磷酸酯基被其各自類似物所取代的實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，示范性戊糖類似物是以上描述的那些。在某些實(shí)施方案中，核苷酸類似物具有上述核苷酸堿基的類似物。在某些實(shí)施方案中，示范性的磷酸酯類似物包括但不限于烷基磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、酰苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等，并可包含相關(guān)的抗衡劑。
也包括的“核苷酸類似物”定義中的是可以被聚合成多核苷酸類似物的核苷酸類似物單體，它們中的DNA/RNA磷酸酯和/或戊糖磷酸酯鍵被不同類型的核苷酸間連接鍵置換。示范性多核苷酯類似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的戊糖磷酸酯鍵被肽鍵所置換。
本文中的術(shù)語“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”可互換使用，指核苷酸單體的單鏈和雙鏈聚合物，包括通過核苷酸內(nèi)磷酸二酯鍵連接的2’-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，或核苷酸間類似物和相關(guān)抗衡離子，如H+、NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等。核酸也可完全由脫氧核糖核苷酸，完全由核糖核苷酸，或它們的組合物組成。核苷酸單體單元可含有上述任何核苷酸，包括但不限于天然產(chǎn)生的核苷酸和核苷酸類似物。核酸的大小通常從幾個(gè)單體單元，如5-40個(gè)，此時(shí)它們在專業(yè)內(nèi)稱為寡核苷酸，至數(shù)千個(gè)單體核苷酸單元。除非另有指出，無論何時(shí)提到核酸序列，應(yīng)理解核苷酸從左到右為5’-3’，“A”為脫氧腺嘌呤可其類似物，“C”為脫氧胞嘧啶可其類似物，“G”為脫氧鳥嘌呤或其類似物，“T”為胸腺嘧啶或其類似物，除非另有說明。
核酸包括但不限于基因組DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、獲自亞細(xì)胞器如線粒體或葉綠體的核酸、獲自微生物或DNA或RNA病毒的核酸，它們可存在生物樣品上或其中。
核酸可以由一種類型的糖部分組成，如RNA和DNA如此，或可以是不同糖部分組成的組合物，如RNA/DNA嵌合物如此。某些實(shí)施方案中，核酸是核糖多核苷酸和2’-脫氧核糖多核苷酸，結(jié)構(gòu)式如下 其中的各個(gè)B獨(dú)立為核苷酸的堿基部分，如嘌呤、7-脫氮嘌呤，嘧啶、或同類核苷酸；各m確定了各個(gè)核苷酸的長度，范圍可從零至數(shù)千，數(shù)萬或甚至更長；各R獨(dú)立選自氫、鹵素、-R”、-OR”和-NR”R”，其中各R”各為(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基，或兩個(gè)毗連的R一起形成一個(gè)鍵，因而該核糖是2’，3’-二脫氫核糖；各R’各為羥基或 這里α是0、1或2。
在上述核糖多核苷酸和2’-脫氧核糖多核苷酸的某些實(shí)施方案中，核苷酸堿基B共價(jià)連接于上述戊糖部分的c’-碳。
術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”也可包括核酸類似物、多核苷酸類似物和寡核苷酸類似物。術(shù)語“核酸類似物”、“多核苷酸類似物”和“寡核苷酸類似物”可互換使用，本文用于指含有至少一個(gè)核酸類似物/或至少一個(gè)磷酸酯類似物和/或至少一個(gè)戊糖類似物。還包括在核酸類似物定義中的有其中的磷酯鍵和/或戊糖磷酯鍵被其它類型的連接鍵，如N-(2-氨基乙基)-甘氨酰胺鍵和其它酰胺鍵(見例如Nielsen等1991，Science 2541497-1500；WO 92/20702；美國專利5,719,262；美國專利5,698,685)；嗎啉代(見例如美國專利5,698,685；美國專利5,378,841；美國專利5,185,144)；氨基甲酸酯(見例如Stirchak & Summerton，1987，J.Org.Chem.52；4202)；亞甲基(甲基咪唑基)(見例如Vasseur等，1992，J.Am.Chem.Soc.1144006)；3’-硫代甲?；宜猁}(見例如Jones等1993，J.Org.Chem，582983)；氨基磺酸酯(見例如美國專利5,470,967)；2-氨基乙基甘氨酸，通常稱為PNA(見例如Buchadt，WO 92/20702；Nielsen，1991，Science.2541497-1500)；和其它鍵(見例如美國5,817,781；Frier & Altman，1997，Nucl.Acids.Res.254429和本文引用的參考文獻(xiàn))所置換。磷酸酯類似物包括但不限于(i)C1-C4烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii)C1-C6烷基磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；和(v)二硫代磷酸酯。
術(shù)語“退火”和“雜交”可互換使用，指一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸的堿基對相互反應(yīng)導(dǎo)致形成雙鏈體、三鏈體或其它高級結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，一級反應(yīng)是堿基特異性的，通過華生/克里克和Hoogsteen型氫鍵，如A/T和G/C。在某些實(shí)施方案中，堿基疊加和疏水性相互作用對雙鏈體的穩(wěn)定性也有貢獻(xiàn)。
“酶活性突變物或其變體”當(dāng)用于指酶，如聚合酶或連接酶時(shí)，意為某蛋白質(zhì)具有酶活性。例如但不限于DNA聚合酶的酶活性突變物或其變體是一種能催化適當(dāng)?shù)拿撗鹾塑杖姿嵋阅０逡蕾嚪绞椒植郊尤氲叫律鶧NA鏈中。酶活性突變物或其變體與“一般可接受的”序列或共有序列不同在于，酶至少有一個(gè)氨基酸突變，包括但不限于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、一個(gè)或多個(gè)氨基酸的加入、一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失和氨基酸本身的改變。然而這些變化，至少保留了某些催化活性。在某些實(shí)施方案中，這種變化涉及保守性氨基酸置換。保守性氨基酸置換可包括一種氨基酸被另一種具有類似疏水性、親水性、所帶電荷或芳香性的氨基酸置換。在某些實(shí)施方案中，保守性氨基酸置換可根據(jù)相似的親水性指數(shù)進(jìn)行。親水性指數(shù)要考慮氨基酸的親水性和電荷特征，在某些實(shí)施方案中可作為選擇保守性氨基酸置換的指南。親水性指數(shù)的描述見例如，Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。本領(lǐng)域知道可根據(jù)上述特征進(jìn)行保守性氨基酸置換。
氨基酸的變化包括但不限于糖基化、甲基化、磷酸化、生物素化，和任何在蛋白質(zhì)上加入不會導(dǎo)致氨基酸序列改變的共價(jià)和非共價(jià)基團(tuán)?！鞍被帷北疚挠糜谥溉魏翁烊换蚍翘烊坏陌被?，可通過酶促反應(yīng)或合成加入到多肽或蛋白質(zhì)中。
片段，例如但不限于，蛋白質(zhì)水解切割產(chǎn)物也包括在此術(shù)語中，只要能至少保留一些酶的催化活性。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員不難采用適當(dāng)?shù)谋娝苤囼?yàn)測定其催化活性。因此包括聚合酶催化活性的相應(yīng)試驗(yàn)，例如，可在適當(dāng)條件下測定某變體以模板依賴方式在在新生多核苷酸鏈中摻入rNTP或dNTP的能力。同樣，可包括連接酶催化活性的相應(yīng)試驗(yàn)，例如，其連接含有適當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的毗鄰雜交寡核苷酸的能力。此類試驗(yàn)的方案可在其它地方找到，見Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press(1989)(以后表示為“Sambrook等”)，Sambrook和Russell，Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Press(2000)(以后表示為“Sambrook Russell”)，Ausbel等，Current Protocols in Molecular Biology(1993)包括2001年4月增刊，John Wiley & Sons(herinafter“Ausbel等”)。
本發(fā)明的“靶”或“靶核酸序列”包括含有能通過探針鑒別的特異性核酸序列。靶可包括天然產(chǎn)生的或合成的分。
本發(fā)明的“探針”包括含有設(shè)計(jì)的能以序列特異性方式與某特定核酸序列，如靶核酸序列，上的互補(bǔ)區(qū)域雜交的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，探針的特異性部分可以是某特定序列特異性的，或者可以是簡并的，例如對一組序列有特異性。
本發(fā)明的“連接探針組”是設(shè)計(jì)能檢測至少一個(gè)靶序列的一組中的兩個(gè)或多個(gè)探針。如一非限制性實(shí)施方案，連接探針組可含有設(shè)計(jì)能與某靶序列雜交的兩個(gè)探針，當(dāng)這兩個(gè)探針與該靶序列毗鄰相互雜交時(shí)，它們就適合連接在一起。
當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，“適合連接”指至少一個(gè)第一靶-特異性探針，和至少一個(gè)第二靶特異性探針，各含有適合的反應(yīng)基團(tuán)。示范性的反應(yīng)基團(tuán)包括但不限于第一探針3’端的游離羥基和第二探針5’端的游離磷酸根基團(tuán)。反應(yīng)基團(tuán)的示范性配對，包括但不限于硫代磷酸酯基與甲苯磺酸酯基或碘；酯與酰肼；RC(O)S-；鹵烷基；或RCH2S與α-鹵?；?；硫代磷酰基和溴代乙酰胺基。示范性的反應(yīng)基團(tuán)，包括但不限于S-新戊酰氧基甲基-4-硫代胸腺嘧啶。此外，在某些實(shí)施方案中，第一和第二靶特異性探針與靶序列雜交，使第一靶特異性探針的3’-端與第二靶特異性探針的5’-端緊密毗鄰得以相連接。
術(shù)語“信號部分”本文用于指任何標(biāo)記、標(biāo)志，或可鑒定的部分。
“可檢測的不同信號”指可通過至少一種檢測方法彼此相鑒別的不同信號部分產(chǎn)生的可檢測信號。
術(shù)語“可檢測的信號值”指從某標(biāo)記測到的信號值。在某些實(shí)施方案中，可檢測的信號值是檢測到的某標(biāo)記的信號強(qiáng)度數(shù)量。因此，如果沒測到某標(biāo)記的可檢測信號值，其可檢測信號值為零(0)。在某些實(shí)施方案中，可檢測信號彈值是該信號的一種特征，而不是該信號強(qiáng)度量，例如該信號的光譜、波長、顏色或存在時(shí)間。
“可檢測的不同信號值”意為可通過至少一種檢測方法彼此相相鑒別的一種或多種可檢測信號值。
術(shù)語“標(biāo)記的探針”指，取決于某給定核酸序列存在與否而能提供可檢測的不同信號值的探針。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)某完整的標(biāo)記探針與一給定的核酸序列雜交時(shí)所提供的可檢測信號值，不同于當(dāng)該完整的標(biāo)記探針不與該給定的核酸序列雜交時(shí)所提供的信號值。因此，如果某給定核酸序列存在，該標(biāo)記探針提供的信號值不同于當(dāng)該給定核酸不存在時(shí)的值。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)標(biāo)記探針完整時(shí)其提供的可檢測信號值不同于當(dāng)該探針不完整時(shí)提供的值。在某些這類實(shí)施方案中，標(biāo)記探針保持完整除非某給定核酸序列不存在。在某些這類實(shí)施方案中，如果某給定核酸序列存在，該標(biāo)記探針被切割導(dǎo)致可檢測信號值不同于當(dāng)該探針完整時(shí)的值。
在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記探針是一種“相互反應(yīng)探針”。術(shù)語“相互反應(yīng)探針”指含有至少能彼此能相互反應(yīng)的二部分從而提供不同的可檢測信號值的探針，這取決于某給定核酸序列是否存在。能否測到相互反應(yīng)探針信號值的不同，這取決于所述二部分是否彼此足夠接近，或彼此相分開。在本文所述的方法中，所述二部分彼此緊密相鄰是否不同，這取決于給定的核酸是否存在。
在某些實(shí)施方案中，如果存在給定的核酸，相互反應(yīng)探針的二部分被進(jìn)一步移動分開。在某些實(shí)施方案中，相互反應(yīng)探針含有的二部分可通過一連接單元連接在一起，如果不存在該給定的核酸序列進(jìn)行此方法時(shí)所述二部分不連接。從含有連接在一起的二部分的相互反應(yīng)探針檢測到的信號值，不同于當(dāng)該二部分不連接時(shí)檢測到的相互反應(yīng)探針的信號值。
術(shù)語“信號值之間的域值差異”指當(dāng)樣品中存在靶核酸序列時(shí)所產(chǎn)生的第一檢測信號值與第二檢測信號值之間的一系列差異，但此種差異在該核酸序列不存在時(shí)不會產(chǎn)生。標(biāo)記探針的第一可檢測信號值，是當(dāng)該探針沒接觸某給定核酸序列時(shí)該探針的可檢測信號值。在采用含有該標(biāo)記探針的組合物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)和/或之后，檢測第二可檢測信號值。
術(shù)語“定量測定”，當(dāng)用于指某擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，指測定樣品中代表靶核酸序列的某特定序列的量或數(shù)量。例如但不限于，可檢測某標(biāo)記探針的信號強(qiáng)度。該信號的強(qiáng)度或量通常與擴(kuò)增產(chǎn)物的量相關(guān)。所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與連接和擴(kuò)增前靶核酸序列的量相關(guān)，因此，在某些實(shí)施方案中，可表明某特定基因表達(dá)的水平。
術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”本文用于指擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，包括但不限于引物延伸、聚合酶鏈反應(yīng)、RNA轉(zhuǎn)錄等。因此，示范性的擴(kuò)增產(chǎn)物可包括引物延伸產(chǎn)物、PCR擴(kuò)增子、RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等的至少一種。
本發(fā)明的“引物”指設(shè)計(jì)能與探針、連接產(chǎn)物、或擴(kuò)增產(chǎn)物的引物特異性部分，以序列特異性方式雜交的寡核苷酸，它起著擴(kuò)增反應(yīng)的引物作用。
“通用引物”如合適的話，能與一種以上的探針、連接產(chǎn)物、或擴(kuò)增產(chǎn)物的引物特異性部分雜交。
本發(fā)明的“連接劑”可包括能使核酸彼此連接的任何酶活性或化學(xué)(即非酶活性)制劑。
在此請求書中，說到一條序列與另一條序列相同或互補(bǔ)，包括兩序列完全相同或彼此互補(bǔ)的情況，和一條序列的一部分與另一條序列的一部分相同或互補(bǔ)的情況。此地，術(shù)語“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、引物、引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和寡核苷酸連接元件。
在此請求書中，說到一條序列與另一條序列互補(bǔ)，包括兩序列錯(cuò)配的情況。此地，術(shù)語“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、引物、引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和寡核苷酸連接元件。雖然錯(cuò)配，但二條序列在適當(dāng)條件下應(yīng)能選擇性彼此雜交。
術(shù)語“選擇性雜交”意為，對具體鑒定的諸序列而言，該鑒定序列的基本部分能與某給定的所需序列雜交，和該具體鑒定諸序列的基本部分不能與其它不需要的序列雜交。各句子中的“具體鑒定諸序列的基本部分”指具體鑒定諸序列整體中的一部分，不是指個(gè)某別具體鑒定序列的一部分。在某些實(shí)施方案中，“具體鑒定諸序列的某基本部分”指該具體鑒定諸序列的至少90％。在某些實(shí)施方案中，“具體鑒定諸序列的某基本部分”指該具體鑒定諸序列的至少95％。
在某些實(shí)施方案中，可能存在的錯(cuò)配數(shù)目視組合物的復(fù)雜性而不同。因此，在某些實(shí)施方案中，含整個(gè)基因組DNA的組合物可耐受的錯(cuò)配，比存在較少DNA序列的組合物少。例如在某些實(shí)施方案中，就給定數(shù)目的錯(cuò)配而言，當(dāng)所用的雜交條件對二組合物是相同時(shí)，與含較少DNA序列組合物中的不需要序列相比，某探針更可能與含有整個(gè)基因組DNA的組合物中不需要的序列雜交。因此，給定數(shù)目的錯(cuò)配可能適合于含較少DNA序列的組合物，而對于含整個(gè)基因組DNA的組合物而言，較少錯(cuò)配可能更優(yōu)。
在某些實(shí)施方案中，如果二序列的錯(cuò)配核苷酸不到20％，它們是互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，如果二序列的錯(cuò)配核苷酸不到15％，它們是互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，如果二序列的錯(cuò)配核苷酸不到10％，它們是互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，如果二序列的錯(cuò)配核苷酸不到5％，它們是互補(bǔ)序列。
在此請求書中，說到一條序列與另一條序列雜交或結(jié)合，包括兩條序列的整個(gè)部分彼此雜交或結(jié)合的情況。和只是一條或二條序列的一部分與另一序列的整個(gè)部分或一部分雜交或結(jié)合的情況。此地，術(shù)語“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、引物、引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和寡核苷酸連接元件。
在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“至較低的可檢測程度”，包括其中所述活性減少至少10倍的情況。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“至較低的可檢測程度”，包括其中所述活性減少至少100倍的情況。
在某些實(shí)施方案中，說到某組分可被或已被“基本上去除”指該組分的至少90％可被或已被去除。在某些實(shí)施方案中，說到某組分可被或已被“基本上去除”指該組分的至少95％可被或已被去除。
B某些組分在某些實(shí)施方案中，靶核酸序列可包括RNA和DNA。示范性的RNA序列包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA、病素RNA和RNA的變體，如剪接變體。示范性的DNA序列包括但不限于基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、核仁DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA。
在某些實(shí)施方案中，靶核酸序列包括但不限于cDNA、酵母菌人造染色體(YAC)、細(xì)菌人造染色體(BAC)、其它染色體外DNA和核酸類似物。示范性的核酸類似物包括但不限于LNA、PNA、PPG和其它核酸類似物。
已有各種方法可獲得用于本發(fā)明組合物和方法中的靶核酸序列。當(dāng)從生物基質(zhì)分離獲得靶核酸時(shí)，一些分離技術(shù)包括但不限于(1)乙醇沉淀后有機(jī)溶液抽提，如用酚/氯仿有機(jī)制劑(如Ausbel等編，Current Protocols in Molecular Biology，第一卷，第二章，第一節(jié)，John Wiley & Sons，New York(1993))，在某些實(shí)施方案中，采用自動DNA抽提儀，如購自Applied Biosystems(Foster City，CA)的34l型DNA抽提儀；(2)靜態(tài)吸收法(如Boom等，美國專利5,234,809；Walsh等，Biotechniques10(4)506-513，1991)；和(3)鹽引起的DNA沉淀法(如Miller等，Nucleic AcidResearch，16(3)9-10，1988)，這些沉淀方法通常稱為“鹽析”方法。在某些實(shí)施方案中，上述分離方法可用一酶消化步驟幫助去除樣品中不要的蛋白質(zhì)，如用蛋白激酶K，或其它類似蛋白酶。見美國專利申請系列號09/724,613。
在某些實(shí)施方案中，靶核酸序列可產(chǎn)生自任何活的、或曾經(jīng)是活的生物體，包括但不限于原核、真核生物、植物、動物和病毒。在某些實(shí)施方案中，靶核酸序列來源自細(xì)胞核，如基因組DNA，或可以是核外的核酸，如質(zhì)粒、線粒體核酸、各種RNA等。在某些實(shí)施方案中，如果生物體的核酸是RNA，則它可被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA靶核酸序列。另外，在某些實(shí)施方案中，存在的靶核酸序列可以是雙鏈或單鏈形式。
示范性的靶核酸序列包括但不限于擴(kuò)增產(chǎn)物、連接產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、引物延伸產(chǎn)物、甲基化DNA和切割產(chǎn)物。示范性的擴(kuò)增產(chǎn)物包括但不限于PCR和等溫(擴(kuò)增)產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，可使樣品中的核酸經(jīng)歷切割程序。在某些實(shí)施方案中，這類切割產(chǎn)物可以是靶序列。
不同的靶核酸序列可以是一個(gè)連續(xù)核酸的不同部分，或可以存在不同核酸上。一個(gè)連續(xù)核酸的不同部分可以或可以不重疊。
在某些實(shí)施方案中，靶核酸序列含有一個(gè)上游或5’區(qū)域、一個(gè)下游或3’區(qū)域、和位于上游區(qū)域或下游區(qū)域中的一個(gè)“關(guān)鍵核苷酸”(見圖4)。在某些實(shí)施方案中，該關(guān)鍵核苷酸可以是可被探針組檢測的核苷酸，并可能存在于多個(gè)等到位基因靶基因座中的，例如但不限于，一個(gè)多形性核苷酸。在某些實(shí)施方案中，存在一個(gè)以上的關(guān)鍵性核苷酸。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵性核苷酸位于上游區(qū)域，和一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵性核苷酸位于下游區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)以上的關(guān)鍵性核苷酸位于上游區(qū)域或下游區(qū)域。
普通技術(shù)人員知道，雖然通常將靶核酸序列描述為單鏈分子，但雙鏈分子的相反鏈包含的互補(bǔ)序列也可用作靶序列。
某些實(shí)施方案中的連接探針組，包含的兩個(gè)或多個(gè)探針含有靶特異性部分，設(shè)計(jì)這些部分能以序列特異性方式，與某特定靶核酸序列上的互補(bǔ)處域雜交(見例如，圖2中的探針2和3)。連接探針組中的探針也可含有引物特異性部分、可尋址部分、或這些附加組分的組合。在某些實(shí)施方案中，探針組分的任何一種可與其它探針組分重疊。例如但不限于，靶特異性部分可與引物特異性部分重疊。另外但不限于，可尋址部分可與靶特異性部分，或引物特異性部分，或二者重疊。
在某些實(shí)施方案中，連接探針組的至少一個(gè)探針含有位于靶特異性部分與引物特異性部分之間的可尋址部分(見例如，圖3探針23)。在某些實(shí)施方案中，探針的可尋址部分可含有與某標(biāo)記探針至少一部分相同或互補(bǔ)的序列。在某些實(shí)施方案中，探針的引物特異性部分可含有與某標(biāo)記探針至少一部分相同或互補(bǔ)的序列。在某些實(shí)施方案中，探針的可尋址部分不與靶序列、引物序列、或標(biāo)記探針互補(bǔ)部分以外的探針序列相互補(bǔ)。
探針的序列特異性部分應(yīng)足夠長使能與適當(dāng)?shù)囊?、可尋址部分和靶序列中的互補(bǔ)序列特異退火結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，可尋址部分和靶特異性部分的長度是6-35個(gè)核苷酸中的任何數(shù)目。能提供序列特異性退火結(jié)合的探針設(shè)計(jì)的詳細(xì)描述可在Diffenbach和Dveksler PCR Primer，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，1995；和Kwok等，Nucl Acid Res.18999-1005(1999)中其它地方找到。
某些實(shí)施方案中的連接探針組包括能毗鄰雜交于同一靶核酸序列和至少一個(gè)第一探針和至少一個(gè)第二探針。某些實(shí)施方案，設(shè)計(jì)的連接探針組能使，第一探針的靶特異部分與下游靶區(qū)域雜交(見例如，圖2中的探針2)，和第二探針的靶特異部分與上游靶區(qū)域雜交(見例如，2中的探針3)。探針的序列特異部分應(yīng)足夠長，使能與適當(dāng)?shù)陌泻鸵?核酸)中的互補(bǔ)序列退火結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，探針組中的至少一個(gè)第一探針和至少一個(gè)第二探針之一還含有可尋址部分。
在適當(dāng)條件下，毗鄰雜交的探針可連接在一起形成連接產(chǎn)物，只要它們含有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)基團(tuán)，例如但不限于，游離的3’-羥基和5’-磷酸根基團(tuán)。
根據(jù)某些實(shí)施方案，一些連接探針組含有一個(gè)以上的第一探針或一個(gè)以上的第二探針，得以辨別靶序列之間有一個(gè)或多個(gè)核苷酸不同的序列(見圖5)。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，設(shè)計(jì)的連接探針組能使，第一探針的靶特異部分與下游靶區(qū)域雜交(見例如，圖4中的第一探針)，和第二探針的靶特異部分與上游靶區(qū)域雜交(見例如，圖4的第二探針)。在某些實(shí)施方案中，與關(guān)鍵核苷酸、“關(guān)鍵性互補(bǔ)處”或“關(guān)鍵性互補(bǔ)核苷酸”互補(bǔ)的核苷酸堿基，存在于靶特異性探針組第二探針的近端(見例如，圖4中第二探針的5’端(PC))。在某些實(shí)施方案中，第一探針可含有關(guān)鍵互補(bǔ)處和可尋址部分而第二探針不含有(見例如，圖5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在各種實(shí)施方案中，關(guān)鍵性核苷酸可位于靶序列中的任何地方，同樣關(guān)鍵性互補(bǔ)處可位于探針靶特異部分中的任何地方。例如根據(jù)各種料施例，關(guān)鍵性互補(bǔ)處可位于探針的3’端、探針的5’端或探針的3’端和5’端之間的任何地方。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)連接探針組的第一和第二探針與適當(dāng)?shù)纳嫌魏拖掠伟袇^(qū)域雜交時(shí)，和當(dāng)關(guān)鍵性互補(bǔ)處在一個(gè)探針的5’端或另一探針的3’端時(shí)，該關(guān)鍵性互補(bǔ)處與靶序列上的關(guān)鍵核苷酸堿基配對，與第一和第二探針雜交，可連接在一起形成連接產(chǎn)物(見例如，圖5(2)-(3))。在圖5(2)-(3)所示的實(shí)例中，關(guān)鍵核苷酸中的錯(cuò)配堿基，因而會干擾連接，即使二探針能與它們各自的靶區(qū)域完全雜交。
在某些實(shí)施方案中，可利用其它機(jī)制來避免在關(guān)鍵性互補(bǔ)處中不含有正確互補(bǔ)性核苷酸的探針相連接。例如，在某些實(shí)施方案中，可采用如果關(guān)鍵性核苷酸發(fā)生錯(cuò)配，則連接探針組中的探針與靶序列的雜交程度可測知較低的這種條件。因此，在這類實(shí)施方案中，這種不雜交的探針將不會與探針組中的其它探針相連接。
在某些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)連接探針組中的第一和第二探針具有相似的解鏈溫度(Tm)。當(dāng)某探針含有一關(guān)鍵性互補(bǔ)處時(shí)，在某些實(shí)施方案中，測到的含有關(guān)鍵靶核苷酸的關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針的Tm，比不含有該探針組中關(guān)鍵性互補(bǔ)處的其它探針低大約4-15℃。在某些這類實(shí)施方案中，含有關(guān)鍵性互補(bǔ)處的探針將設(shè)計(jì)也具有接近連接溫度的Tm。因此，具有錯(cuò)配核苷酸的探針將更容易在連接溫度下從靶上解離。因此連接溫度，例如在某些實(shí)施方案中，提供了辨別靶序列中多個(gè)潛在等位基因的另一種方法。
此外，在某些實(shí)施方案中，連接探針組在第一或第二探針的二端(如第一或第二探針的3’端或5’端)不含有關(guān)鍵互補(bǔ)處。而是，該關(guān)鍵互補(bǔ)處位于第一或第二探針的5’端和3’端之間的某處。在某些這類實(shí)施方案中，具有與其各自靶區(qū)域完全互補(bǔ)的靶特異性部分的探針，將能在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。相反，在靶特異部分中具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基的探針與其各自靶區(qū)域雜交的程度將測得較差。第一探針和第二探針二者必然能與靶序列雜交產(chǎn)生連接產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，可鑒別只有少數(shù)，如一個(gè)核苷酸不同的高度相關(guān)序列。例如，根據(jù)某些實(shí)施方案，可如下鑒別某雙等到位基因座中的兩個(gè)可能的等位基因?？蓪⒑性诳蓪ぶ凡糠趾完P(guān)鍵互補(bǔ)處上有所不同的二種(見例如，圖5(2)中的探針A和B)第一探針、一種第二探針(見例如，圖5(1)中的探針Z)和含有靶序列的樣品相混合。在適當(dāng)條件下所有三種探針將與靶序列雜交(見圖5(2))。然而，只有含雜交的關(guān)鍵互補(bǔ)處的第一探針將與雜交的第二探針相連接(見5(3))。因此，如果樣品中只存在一個(gè)等位基因，靶序列只產(chǎn)生一種連接產(chǎn)物(見例如，圖5(4)中的連接產(chǎn)物A-Z)。在雜合子個(gè)體的樣品中將形成二種連接產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，可發(fā)生含有與關(guān)鍵核苷酸不互補(bǔ)的關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針相連接，但可測得這種連接的程度，比含有與關(guān)鍵核苷酸互補(bǔ)的關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針相連接差。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，可采用許多不同的信號分子。例如，信號分子包括但不限于熒光團(tuán)、放射性同位素、生色原、酶、抗原、重金屬、染料、磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、和電化學(xué)檢測分子?？捎米餍盘柗肿拥氖痉缎缘臒晒鈭F(tuán)包括但不限于羅丹明、花菁3(Cy3)、花菁5(Cy5)、熒光素、VicTM、LizTM、TamraTM、5-FamTM、6-FamTM和德克薩斯紅(Molecular Probes)。(VicTM、LizTM、TamraTM、5-FamTM和6-FamTM均購自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。示范性的放射性同位素包括但不限于32P、35P和35S。信號分子還包括多組分間接報(bào)告系統(tǒng)的諸組分，如生物素/親和素、抗體/抗原、配體/受體、酶/底物等，其中某組分與系統(tǒng)中的其它組分本地作用而產(chǎn)生可檢測信號。使信號分子結(jié)合于寡核苷酸的方法的詳細(xì)方案可在其它地方找到，見G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA(1996)和S.L.Beaucage等，Current Protocol in Nucleic Acid Chemistry，John Wiley& Sons，New York，NY(2000)。
如上所述，術(shù)語“相互反應(yīng)探針”指含有至少能彼此相互反應(yīng)從而提供不同的可檢測信號值(取決于某給定核酸序列是否存在)的兩個(gè)部分的探針。在某些實(shí)施方案中，這兩個(gè)部分之一是信號部分，另一個(gè)是猝滅劑部分。從信號部分檢測到的信號值視猝滅劑部分是否充分靠近信號部分、或離開信號部分而不同。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)猝滅劑部分充分靠近信號部分時(shí)，猝滅劑部分減少了信號部分發(fā)出的可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)猝滅劑部分充分靠近信號部分時(shí)，猝滅劑部分使信號部分發(fā)出的可檢測信號值減少至零或接近零。
在某些實(shí)施方案中，相互反應(yīng)探針的二部分之一是信號部分，另一是供體部分。從信號部分檢測到的信號值視供體部分是否充分靠近信號部分、或離開該信號部分而不同。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)供體部分充分靠近信號部分時(shí)，供體部分增強(qiáng)了信號部分發(fā)出的可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)供體部分不充分靠近信號部分時(shí)，可檢測信號值是至零或接近零。
在采用供體部分和信號部分的某些實(shí)施方案中，可利用某些能量轉(zhuǎn)移熒光染料。供體(供體部分)和受體(信號部分)的某些非限制性示范對見例如，美國專利5,863,727；5,800,996和5,945,526中所述。利用供體和受體的這類組合也稱為FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)。
在某些實(shí)施方案中，相互反應(yīng)探針的二部分通過一連接元件，例如但不限于寡核苷酸而彼此相連。某些這類實(shí)施方案中，在進(jìn)行本文所述方法時(shí)，由于存在能與相互反應(yīng)探針雜交的序列影響到該二部分彼此靠近。在各種實(shí)施方案中，這二部分以該領(lǐng)域知道的不同方式結(jié)合該連接元件。例如，使二部分結(jié)合寡核苷酸的某些非限制性方案可在其它地方找到，見G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，San Diego，CA(1996)和S.L.Beaucage等，Current Protocol in Nucleic AcidChemistry，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)。在某些實(shí)施方案中，相互反應(yīng)探針含有一個(gè)以上的信號部分。在某些實(shí)施方案中，相互反應(yīng)探針含有一個(gè)以上猝滅劑部分。在某些實(shí)施方案中，相互反應(yīng)探針含有一個(gè)以上供體部分。
根據(jù)某些實(shí)施方案，相互反應(yīng)探針可以是5’-核酸酶探針，其含有通過一短寡核苷酸連接元件，與猝滅劑部分或供體部分相連接的信號部分。當(dāng)該5’-核酸酶探針完整時(shí)，猝滅劑部分或供體部分可影響信號部分發(fā)出的可檢測信號。根據(jù)某些實(shí)施方案，在擴(kuò)增反應(yīng)如PCR或其它一些鏈轉(zhuǎn)置換程序中，該5’核酸酶結(jié)合于一特定核酸序列，當(dāng)此探針被新聚合的鏈置換時(shí)，該特定核酸序列被5’核酸酶的至少一種聚合酶活性和另一種酶構(gòu)建物切割。
當(dāng)5’-核酸酶探針的寡核苷酸連接元件被切割時(shí)，當(dāng)信號部分進(jìn)一步與猝滅劑部分或供體部分分開時(shí)，信號部分發(fā)出的可檢測信號發(fā)生變化。在采用猝滅劑部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分進(jìn)一步與猝滅劑部分分開時(shí)信號值增加。在采用供體的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分進(jìn)一步與供體部分分開時(shí)信號值減少。
某些實(shí)施方案的5-’核酸酶探針的例子見圖1A，其中標(biāo)記的探針(LBP)含有猝滅劑部分(Q)和信號部分(S)。圖1A中能與相互反應(yīng)探針起反應(yīng)的核酸序列包括5’-引物特異性部分P-SPl、可尋址9ASP)和3’-引物特異性部分(P-SP2)。從該標(biāo)記探針檢測眼的信號因切割而增強(qiáng)。
在某些實(shí)施方案中，5-’核酸酶探針是一種5-’核酸酶熒光探針，其中的信號部分是熒光部分，猝滅劑部分是熒光猝滅劑部分。在標(biāo)準(zhǔn)置換過程中該探針被切斷時(shí)，熒光部分發(fā)出可檢測的熒光信號。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)該5-’核酸酶熒光探針與互補(bǔ)序列雜交被切斷前，可發(fā)射一定水平的信號，隨著被切斷信號水平增強(qiáng)。5-’核酸酶熒光探針的某些示范性實(shí)施方案的描述見例如美國專利5,538,848和作為TaqMan試驗(yàn)系統(tǒng)一部分的TaqMan探針分子所示范的(購自Applied Biosystems FosterCity，CA)。
根據(jù)某些實(shí)施方案，該相互反應(yīng)探針可以是“雜交依賴性探針”，其含有通過一寡核苷酸連接單元與猝滅劑部分或供體部分相連接的信號部分。當(dāng)該雜交依賴探針沒與某給定核酸序列結(jié)合時(shí)，它是單鏈的，寡核苷酸連接單元柔軟可彎曲，使猝滅劑部分或供體部分足夠接近信號部分，而影響信號部分的可檢測信號。在某些實(shí)施方案中，雜交依賴性探針的寡核苷酸連接元件設(shè)計(jì)為，當(dāng)它不與某給定核酸序列雜交時(shí)，它可折疊并自身雜交(見例如，圖1C)，例如，分子燈標(biāo)探針。見例如美國專利5,118,801；5,312,728和5,925,517。在某些實(shí)施方案中，雜交依賴性探針的寡核苷酸連接元件當(dāng)不與給定核酸序列雜交時(shí)，不會自身雜交(見圖1B)。
當(dāng)雜交依賴性探針與作為雙鏈核酸的某給定核酸雜交時(shí)，猝滅劑部分或供體部分與信號部分分開，從而改變了發(fā)出的可檢測信號。在利用猝滅劑部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分與猝滅劑部分進(jìn)上步分開時(shí)，信號值增強(qiáng)。在采用供體部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分與供體部分進(jìn)一步分開時(shí)，信號值減弱。
某些實(shí)施方案中的某些雜交依賴性探針的例子見圖1B和1C中的說明，其中標(biāo)記探針(LBP)包括猝滅劑部分(Q)和信號部分(S)。圖1B和1C中的與相互反應(yīng)探針起反應(yīng)的核酸含有5-’引物特異性部分P-SP1、可尋址部分(ASP)和3’-引物特異性部分(P-SP2)。
在某些雜交依賴性探針實(shí)施方案中，信號部分是熒光部分，猝滅劑部分是熒光猝滅劑部分。當(dāng)該探針與某特定核酸序列雜交時(shí)，熒光部分發(fā)射可檢測熒光信號。當(dāng)該探針不與某核酸序列雜交時(shí)，它是完整的，發(fā)生淬滅，檢測不到熒光或極弱。
雜交依賴性探針的某些示范性實(shí)例見美國專利5,723,591。
在某些實(shí)施方案中，雜交依賴性探針中采用的核酸，在擴(kuò)增反應(yīng)中其基本部分不被酶切斷?！半s交依賴性探針的基本部分不被切斷”指雜交依賴性探針總體成員中的一部分，設(shè)計(jì)該部分能與被擴(kuò)增的某給定核酸序列雜交，而不是指單個(gè)探針的一部分。在某些實(shí)施方案中，“雜交依賴性探針的基本部分不被切斷”意為該雜交依賴性探針的至少90％不被切斷。在某些實(shí)施方案中，該雜交依賴性探針的至少95％不被切斷。在某些實(shí)施方案中，對雜交依賴性探針的某些或所有的核酸可采用PNA。
在某些實(shí)施方案中，雜交依賴性探針中采用的核酸，在延伸反應(yīng)中該雜交依賴性探針的基本部分不與可尋址部分或可尋址部分的互補(bǔ)序列雜交。“不雜交的雜交依賴性探針的基本部分”指雜交依賴性探針總體成員中的一部分，設(shè)計(jì)該部分能與被擴(kuò)增的某給定核酸序列雜交，而不是指單個(gè)探針的一部分。在某些實(shí)施方案中，“不雜交的雜交依賴性探針基本部分”意為該雜交依賴性探針的至少90％不雜交。在某些實(shí)施方案中，該雜交依賴性探針的至少95％不雜交。
根據(jù)某些實(shí)施方案，相互反應(yīng)探針可以是“可切割的RNA探針”，其含有通過一短RNA連接元件與猝滅劑部分或供體部分相連接的信號部分。當(dāng)該可切割RNA探針完整時(shí)，猝滅劑部分或供體部分影響到信號部分發(fā)出的可檢測信號。根據(jù)某些實(shí)施方案，可切割RNA探針與某特定DNA序列結(jié)合，被RNA酶H，或具有相似活性的試劑切斷。
當(dāng)可切割RNA探針的RNA連接元件被切斷時(shí)，信號部分產(chǎn)生的可檢測信號因該信號部分與猝滅劑部分或供體部分進(jìn)一步分開而發(fā)生變化。在采用猝滅劑部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分與猝滅劑部分進(jìn)一步分開時(shí)信號值增強(qiáng)。在采用供體部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分與供體部分進(jìn)一步分開時(shí)信號值減弱。
在某些實(shí)施方案中，如果樣品中存在待測的特定核酸序列，核酸擴(kuò)增方法將導(dǎo)致含有可切割RNA探針能結(jié)合的特定DNA序列的DNA，比如果樣品中不存在該特定核酸序列時(shí)更多。在這類實(shí)施方案中，可憑借擴(kuò)增反應(yīng)期間和/或之后可切割RNA探針產(chǎn)生的信號確定樣品中存在該特定核酸。在某些實(shí)施方案中，可憑借擴(kuò)增反應(yīng)期間和/或之后可切割RNA探針產(chǎn)生的信號定量測定樣品中存在該特定核酸。
在某些實(shí)施方案中，該可切割RNA探針是一種可切割RNA熒光探針，其中信號部分是熒光部分，猝滅劑部分是熒光猝滅劑部分。當(dāng)該探針被切斷時(shí)，熒光部分發(fā)射出可檢測熒光信號。在某些實(shí)施方案中，可切割RNA探針在切割前當(dāng)與互補(bǔ)序列雜交時(shí)可發(fā)射一定水平的信號，并且該信號水平隨切斷而增強(qiáng)。
根據(jù)某些實(shí)施方案，相互反應(yīng)探針可以是“結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針”，其含有通過一短寡核苷酸連接元件與猝滅劑部分或供體部分相連接的信號部分。當(dāng)該結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針完整時(shí)，猝滅劑部分或供體部分影響著信號部分發(fā)出的可檢測信號。根據(jù)某些實(shí)施方案，如果該結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針與某特定核酸序列適當(dāng)雜交，該特定核酸序列與該結(jié)構(gòu)特異性核酸酶結(jié)合并被其切斷。
當(dāng)結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針的寡核苷酸連接元件被切斷時(shí)，信號部分產(chǎn)生的可檢測信號因該信號部分與猝滅劑部分或供體部分進(jìn)一步分開而發(fā)生變化。在采用猝滅劑部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分與猝滅劑部分進(jìn)一步分開時(shí)信號值增強(qiáng)。在采用供體部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)信號部分與供體部分進(jìn)一步分開時(shí)信號值減弱。
在某些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針是一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶熒光探針，其中信號部分是熒光部分，猝滅劑部分是熒光猝滅劑部分。當(dāng)該探針被切斷時(shí)，熒光部分發(fā)射出可檢測熒光信號。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針在切割前當(dāng)與互補(bǔ)序列雜交時(shí)可發(fā)射一定水平的信號，并且該信號水平隨切斷而增強(qiáng)。
在某些實(shí)施方案中，可采用含有基本上不能與可尋址部分雜交的flap的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針和采用作為結(jié)構(gòu)特異性核酸酶的flap內(nèi)切核酸酶(FEN)。一個(gè)示范性實(shí)施方案見圖8。圖8的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針包括不能與可尋址部分雜交的flap部分、能與可尋址部分雜交的雜交部分、和位于flap部分與雜交部分之間的FEN切割位點(diǎn)核苷酸。設(shè)計(jì)該FEN切割位點(diǎn)核苷酸與可尋址部分緊靠3’端能與該探針雜交部分的5’端核苷酸雜交的核苷酸相互補(bǔ)。該flap部分包括與其人結(jié)合的信號部分，和含有與其結(jié)合的猝滅劑部分或供體部分。
如圖8實(shí)施方案中所顯示，設(shè)計(jì)寡核苷酸與可尋址部分3’端雜交，可尋址部分的該部分能與結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針的雜交部分相雜交。如果存在適當(dāng)?shù)目蓪ぶ凡糠郑現(xiàn)EN將切斷結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針，使信號部分與猝滅劑部分或供體部分分開。
根據(jù)某些實(shí)施方案，相互反應(yīng)探針可含有彼此毗鄰的能與某給定核酸序列雜交的兩個(gè)寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，這兩個(gè)寡核苷酸之一含有信號部分，另一個(gè)寡核苷酸含有猝滅劑部分或供體部分。當(dāng)二寡核苷酸與該給定核酸序列雜交時(shí)，猝滅劑部分或供體部分充分靠近信號部分，而影響信號部分發(fā)射的可檢測信號。
在采用供體部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)二寡核苷酸與給定核酸序列雜交時(shí)，信號值增強(qiáng)。在采用猝滅劑部分的某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)二寡核苷酸與給定核酸序列雜交時(shí)，信號值減弱。在某些實(shí)施方案中，信號部分是熒光部分某些實(shí)施方案的適當(dāng)標(biāo)記探針的其它例子是i-探針、蝎子探針、掩蔽探針和其它探針。示范但非限制性的探針論述見例如，Whitcombe等，Nat.Biotechnol.，1999.17(8)804-807(包括蝎子探針)；Thelwell等，Nucleic Acid Res.，2000，28(19)3752-3761(包括蝎子探針)；Afonina等，Biotechniques，2002，32(4)(包括掩蔽探針)；Li等，“基于特異性置換雜交的新類型同源核酸探針”，Nucleic Acid Res.，2002，30(2)E5；Kandimall等，Bioorg.Med.Chem.，2002，8(8)1911-1916；Isacsson等，Mol.Cell.Probes，2000，14(5)321-328；French等，Mol.Cell.Probes，2001，15(6)363-374；和Nurmi等，“一種在密封試管中檢測特異性聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的新標(biāo)記方法”，Nucleic Acid Res.，2000，28(8)E28。某些實(shí)施方案的示范性猝滅劑部分可以是購自Epoch Biosciences，Bothell，Washington的那些。
在某些實(shí)施方案中，可利用標(biāo)記探針和第一與第二可檢測信號值之間的域值差異來檢測樣品中是否存在靶核酸。在這類實(shí)施方案中，如果第一與第二可檢測信號值之間的差異與域值差異相同或比其大，即有域值差異，結(jié)論是存在靶核酸。如果第一與第二可檢測信號值之間的差異比域值差異小，即沒有域值差異，結(jié)論是不存在靶核酸。
可設(shè)置某些實(shí)施方案的域值差非限制性例子如下首先，在某些實(shí)施方案中，不能與互補(bǔ)序列雜交的標(biāo)記探針可具有數(shù)值為零的第一可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)形成含有標(biāo)記探針、和任何未連接的連接探針及含有擴(kuò)增前互補(bǔ)性可尋址部分的擴(kuò)增反應(yīng)組合物時(shí)，該可檢測信號值可增高到0.4。在某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)這種擴(kuò)增反應(yīng)組合物不包括含有互補(bǔ)性可尋址部分的任何連接產(chǎn)物時(shí)，該可檢測信號值在擴(kuò)增反應(yīng)中或之后可保持在0.4(換句話說，第二可檢測信號值為0.4)。在某些這類實(shí)施方案中，然而，當(dāng)這種擴(kuò)增反應(yīng)組合物包括含有互補(bǔ)性可尋址部分的連接產(chǎn)物時(shí)，該可檢測信號值在擴(kuò)增反應(yīng)中和/或之后可增加至2。(換句話說，第二可檢測信號值為2)。
因此，在某些這類實(shí)施方案中，可將第一與第二可檢測信號值之間的差異設(shè)置在正好約0.4-2之間的某個(gè)數(shù)值。例如，可將閾值差異設(shè)定在0.5-2之間的某處。
其次，在某些實(shí)施方案中，不能與互補(bǔ)序列雜交的標(biāo)記探針可具有數(shù)值為零的第一可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)形成含有標(biāo)記探針、和任何未連接的連接探針及含有擴(kuò)增前互補(bǔ)性可尋址部分的的擴(kuò)增反應(yīng)組合物時(shí)，該可檢測信號值可增高到0.4。在某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)這種擴(kuò)增反應(yīng)組合物不包括含有互補(bǔ)性可尋址部分的任何連接產(chǎn)物時(shí)，該可檢測信號值在擴(kuò)增反應(yīng)中和/或之后可增加至0.7(換句話說，第二可檢測信號值為0.7)。在某些這類實(shí)施方案中，然而，當(dāng)這種擴(kuò)增反應(yīng)組合物包括含有互補(bǔ)性可尋址部分的連接產(chǎn)物時(shí)，該可檢測信號值在擴(kuò)增反應(yīng)中和/或之后可增加至2。(換句話說，第二可檢測信號值為2)。
因此，在某些這類實(shí)施方案中，可將第一與第二可檢測信號值之間的差異設(shè)置在正好約0.7-2之間的某個(gè)數(shù)值。例如可設(shè)置該域值差異在0.8-2之間的某處。
第三，在某些實(shí)施方案中，不能與互補(bǔ)序列雜交的標(biāo)記探針可具有數(shù)值為零的第一可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)形成含有標(biāo)記探針、和任何未連接的連接探針及含有擴(kuò)增前互補(bǔ)性可尋址部分的的擴(kuò)增反應(yīng)組合物時(shí)，該可檢測信號值可增高到0.4。在某些這類實(shí)施方案中，當(dāng)這種擴(kuò)增反應(yīng)組合物不包括含有互補(bǔ)性可尋址部分的任何連接產(chǎn)物時(shí)，該可檢測信號值在擴(kuò)增反應(yīng)中和/或之后可線性增加(換句話說，第二可檢測信號值從第一可檢測信號值上線性增加)。在某些這類實(shí)施方案中，然而，當(dāng)這種擴(kuò)增反應(yīng)組合物包括含有互補(bǔ)性可尋址部分的連接產(chǎn)物時(shí)，該可檢測信號值在擴(kuò)增反應(yīng)中和/或之后可呈指數(shù)增長。(換句話說，第二可檢測信號值從第一可檢測信號值上指數(shù)增長)。
因此，在某些這類實(shí)施方案中，可在擴(kuò)增中的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)、和擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)測定可檢測信號值，以確定可檢測信號值是線性還是指數(shù)增長。在某些實(shí)施方案中，可在擴(kuò)增中的三個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定可檢測信號值，以確定可檢測信號值是線性還是指數(shù)增長。在某些實(shí)施方案中，如果這種增長是指數(shù)性，那么第一與第二可檢測信號值之間有域值差異。
在某些實(shí)施方案中，可采用對不同的可尋址部分具有特異性的不同標(biāo)記探針。在某些這類實(shí)施方案中，可采用含有不同序列和不同的可檢測信號部分的不同標(biāo)記探針。不同的可檢測信號部分包括但不限于能發(fā)射不同波長光的部分、能吸收不同波長光的部分、具有不同熒光衰減壽命的部分、具有不同光譜特征的部分、和具有不同放射活性衰減性能的部分。
根據(jù)某些實(shí)施方案，DNA雙螺旋小溝粘合劑可結(jié)合至少一種標(biāo)記探針。某些示范性小溝粘合劑，和使小溝粘合劑結(jié)合寡核苷酸的某些示范性方法論述可見美國專利5,801,155和56,084,102。某些示范性小溝粘合劑可從Epoch Bioscience，Bothell，Washington購得。
某些實(shí)施方案的引物組含有至少一種能與連接探針組至少一種探針的引物-特異性部分雜交的引物。在某些實(shí)施方案中，引物組含有至少一種第一引物和至少一種第二引物，其中，至少一種第一引物能與連接探針組的一種探針(或此探針的互補(bǔ)處)特異性雜交，和該引物組的至少一種第二引物能與同一連接探針組的第二探針(或此探針的互補(bǔ)處)特異性雜交。在某些實(shí)施方案中，引物組的第一和第二引物具有不同的雜交溫度，得以進(jìn)行基于溫度的不對稱PCR反應(yīng)。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，雖然以單數(shù)形式描述本發(fā)明的探針和引物，但該單數(shù)可包括復(fù)數(shù)的探針或引物，這也可從本文中知曉。例如，在某些實(shí)施方案中，連接探針組通常包括多種第一探針和多種第二探針。
設(shè)計(jì)序列特異性引物和探針的標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。設(shè)計(jì)能提供序列特異性退火的引物的詳細(xì)說明可在其它地方找到，見Diffenbach和Kwok，PCRPrimer，A Laboratory Manual，Coid Spring Harbor Press，1995，和Kwok等，(Nucl.Acid Res.，18999-1005，1990)。引物的序列特異性部分應(yīng)足夠長，使得能與適當(dāng)?shù)倪B接產(chǎn)物和擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列特異性退火。
根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明的引物組包括至少一種第二引物。在某些實(shí)施方案中，引物組中的第二引物設(shè)計(jì)能以序列特異性方式，與連接或擴(kuò)增產(chǎn)物的3’-引物特異性部分雜交(見例如，圖2C)。在某些實(shí)施方案中，引物組還包括至少一種第一引物。在某些實(shí)施方案中，引物組的第一引物設(shè)計(jì)能以序列特異性方式，與同一連接或擴(kuò)增產(chǎn)物的5’-引物特異性部分的互補(bǔ)處雜交。
某些實(shí)施方案可采用通用引物或引物組。在某些實(shí)施方案中，通用引物或通用引物組能在反應(yīng)中與適當(dāng)?shù)亩N或多種探針、連接產(chǎn)物、或擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。當(dāng)通用引物組用于某些擴(kuò)增反應(yīng)，例如但不限于PCR中時(shí)，對于廣泛范圍的模板濃度或獲得定性或定量結(jié)果。
某些實(shí)施方案包括連接試劑。例如，連接酶是一種酶促連接試劑，在適當(dāng)條件下，能在DNA或RNA分子中毗鄰核苷酸的3’-OH和5’-磷酸之間形成磷酸二酯鍵，或雜交。示范性的連接酶包括但不限于Tth K294R連接酶和Tsp AK16D連接酶。見例如，Luo等，Nucleic Acid Res.，1996，24(14)3071-3078；Tong等，Nucleic Acid Res.，1999，27(3)788-794；和發(fā)表的PCT申請No.WO 00/26381。溫度敏感性連接酶包括但不限于T4 DNA連接酶、T7 DNA連接酶和大腸桿菌連接酶。在某些實(shí)施方案中，溫度穩(wěn)定性連接酶包括但不限于Taq連接酶、Tth連接酶、Tsc連接酶和Pfu連接酶。某些溫度穩(wěn)定性連接酶可獲自嗜熱性或超嗜熱性生物，包括但不限于原核生物、真核生物或古生物。在某些實(shí)施方案中可采用某些RNA連接酶。在某些實(shí)施方案中，連接酶是RNA依賴性DNA連接酶，其可與RNA模板和DNA連接探針一起應(yīng)用。具有這種RNA依賴性DNA連接酶活性的連接酶的示范性但非限制性例子是T4 DNA連接酶。在某些實(shí)施方案中，連接試劑是“活化的”或還原試劑。
化學(xué)連接試劑包括但不限于活化劑、凝聚劑和還原劑，如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/半胱氨酸、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外光。在缺少連接試劑時(shí)自連接，即自發(fā)性連接也屬于本發(fā)明某些實(shí)施方案的范圍。化學(xué)連接方法的詳細(xì)方案和適當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的說明可在其它地方找到，見Xu等，Nucleic Acid Res.，1999，27857-81；Geyaznov和Letsinger，Nucleic Acid Res.1993，211403-08；Gryaznov等，Nucleic Acid Res.1994，222366-69；Kanaya和Yanagawa.，Biochemi stry 1986，257423-30；Luebke和Dervan.，Nucleic AcidRes.1992，203005-09；Sievers和von Kiedrowski.，Nature 1994，369221-24；Liu和Taylor.，Nucleic Acid Res.1999，263300-04；Wang和Kool.，Nucleic Acid Res.1994，222326-33；Purmal等，Nucleic Acid Res.1992，203713-19；Ashley和Kushlan.，Biochemistry.1991，302927-33；Chu和Orgel.，Nucleic Acid Res.1988，163671-91；Sokolova等，F(xiàn)EBS Letters.1988，232153-55；Naylor和Gilham.，Biochemistry.1966，52722-28和美國專利5,476,930。
在某些實(shí)施方案中，包括至少一種聚合2。在某些實(shí)施方案中，包括至少一種熱穩(wěn)定聚合酶。示范性的熱穩(wěn)定聚合酶包括但不限于Taq聚合酶、Pfx聚合酶、Pfu聚合酶、Vent聚合酶、Deep VentTM聚合酶、Pwo聚合酶、Tth聚合酶、UITma聚合酶、以及它們的酶活性突變體和變體。這些聚合酶的說明可在其它地方找到，見www URL:the-scientist.com/yr1998/jan/profile 1_980105.html；www URL:the-scientist.com/yr2001/jan/profile_010903.html；www URL:the-scientist.com/yr2001/sep/profile2_010903.html；論文The Sceintist12(1)17(1998/1/5)和論文The Sceintist15(17)1(2001/9/3)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可采用公開的探針、靶和引物序列的互補(bǔ)物，或它們的組合。例如但不是限制基因組DNA樣品可含有靶序列及其互補(bǔ)物。因此，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)基因組樣品變性時(shí)，樣品中存在的靶序列及其互補(bǔ)物成了單鏈序列。在某些實(shí)施方案中，可設(shè)計(jì)連接探針與適當(dāng)?shù)男蛄?，如靶序列或其互補(bǔ)物特異性雜交。
C.某些示范性組分方法本發(fā)明的連接包括酶促或化學(xué)方法，其中在毗鄰雜交于一模板的核酸序列的二相對末端之間形成核苷酸間連接鍵。此外，退火核酸序列二相對端應(yīng)適合于連接(連接的適合性是所用連接方法的涵數(shù))。核苷酸間連接鍵可包括但不限于磷酸二酯鍵形式。這類鍵的形成可包括但不限于DNA或RNA連接酶，如噬菌體T4 DNA連接酶、T4RNA連接酶、T7 DNA連接酶、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)連接酶、水生棲熱菌(Thermus aquqticus)(Taq)連接酶、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)連接酶。其它核苷酸間連接鍵包括但不限于適當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)之間，如α-鹵代芳基與硫代磷酸酯基團(tuán)之間的共價(jià)鍵形成，產(chǎn)生了硫代磷酯乙酰胺基，和硫代磷酸酯與甲苯磺?；蜻胚峄g的共價(jià)鍵形成，產(chǎn)生5’-硫代磷酸酯鍵或焦磷酸酯鍵。
在某些實(shí)施方案中，在適合的條件下，化學(xué)連接可自發(fā)生，如通過自連接?；蛘撸谀承?shí)施方案中，可采用“活化”或還原試劑?；罨蜻€原試劑的例子包括但不限于碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/半胱氨酸、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外光。某些實(shí)施方案的非酶促連接可利用排列探針各自3’端和5’端上的特異性反應(yīng)基團(tuán)。
在某些實(shí)施方案中，連接通常包括至少一輪連接，例如以下順序過程使適合連接的第一探針和第二探針的靶特異性部分與靶核酸序列上它們各自的互補(bǔ)處雜交；區(qū)小事將第一探針的3’端與第二探針的5’端相連接形成連接產(chǎn)物；和使核酸雙鏈體變性而使連接產(chǎn)物與靶核酸序列分離?？梢曰虿豢梢灾貜?fù)該循環(huán)，例如但不是限制，通過熱循環(huán)連接反應(yīng)而線性增加連接產(chǎn)物的量。
根據(jù)某些實(shí)施方案，可采用連接技術(shù)，例如缺口充填連接，包括但不限于缺口充填OLA和LCR、醇橋聯(lián)寡核苷酸連接和糾正連接。這些技術(shù)的說明可在其它地方找到，見美國專利5,185,243、發(fā)表的歐洲專利申請EP 320308和EP 439182，以及PCT專利申請WO 90/01069。
在某些實(shí)施方案中，通過使連接反應(yīng)組合物經(jīng)歷至少一輪連接，形成用于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的測試組合物。在某些實(shí)施方案中，連接后，將該測試組合物直接用于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)前，純化該測試組合物，導(dǎo)致該測試組合物中存在的所有組分在至少一輪連接后減少。例如，在某些實(shí)施方案中，可純化連接產(chǎn)物。
純化某些實(shí)施方案的連接產(chǎn)物，其過程包括去除至少某些未連接的探針、靶核酸序列、酶和/或連接反應(yīng)組合物經(jīng)過至少一輪連接產(chǎn)生的副產(chǎn)物。這類過程包括但不限于分子量/大小排阻法，如凝膠過濾層析或透析、序列特異性雜交提取法、親和俘獲技術(shù)、沉淀、吸附或其它核酸純化技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在某些實(shí)施方案中，先純化連接產(chǎn)物再擴(kuò)增可減少擴(kuò)增連接產(chǎn)物所需的引物量，從而減少檢測靶序列的費(fèi)用。另外，在某些實(shí)施方案中，純化連接產(chǎn)物再擴(kuò)增可減少擴(kuò)增時(shí)可能的副反應(yīng)，可減少雜交時(shí)未連接探針的競爭。
本發(fā)明某些實(shí)施方案的雜交提取法(HBP)，其過程中包括使與某探針至少一部分(或其互補(bǔ)處)，例如引物特異性部分，互補(bǔ)的核苷酸序列結(jié)合或固定于一固相或顆粒提取載體上(見美國專利6,124,092)。在某些實(shí)施方案中，使含有連接產(chǎn)物、靶序列和末連接探針的組合物接觸該提取載體。在適當(dāng)條件下，連接產(chǎn)物與載體上結(jié)合的序列發(fā)生雜交。除去組合物中末結(jié)合組分，除去連接反應(yīng)組合物組分中不與提取載體上序列互補(bǔ)的那些序列，純化得到連接產(chǎn)物。然后從載體是取下純化的連接產(chǎn)物，將它們與至少一個(gè)引物組混合形成第一擴(kuò)增反應(yīng)組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在某些實(shí)施方案中，利用提取載體上的不同互補(bǔ)序列增加HBP輪次，可去除所有或基本上所有的末連接探針，進(jìn)一步純化該連接產(chǎn)物。
本發(fā)明的擴(kuò)增包括線性或指數(shù)擴(kuò)增核酸序列的廣泛技術(shù)。示范性的擴(kuò)增技術(shù)包括但不限于PCR或采用引物延伸步驟的任何其它方法、轉(zhuǎn)錄或能產(chǎn)生至少一種RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的任何其它方法。擴(kuò)增的其它非限制性例子是連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。擴(kuò)增方法可包括熱循環(huán)或可在等到溫下進(jìn)行。術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”包括擴(kuò)增反應(yīng)、引物延伸反應(yīng)和RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)任何一輪的產(chǎn)物，除非文中另有說明。
在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增方法包括至少一輪擴(kuò)增，例如但不是限制，后續(xù)過程有使引物與擴(kuò)增反應(yīng)任何一輪的連接產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的引物特異性部分雜交；以模板依賴方式利用聚合酶合成核苷酸的另一條鏈；和使新形成的核酸雙鏈體變性分離此二鏈?？芍貜?fù)或不重復(fù)此循環(huán)。
某些擴(kuò)增技術(shù)的說明可在其它地方找到，見H.Ehelich等，Science，2521634-50，1991；M.Innis等，PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，New York，NY，1990；R.Favis等，Nature Biotechnology.18561-64，2000；和H.F.Rabenan等，Infection.2897-102，2000；Sambrook和Russell，Ausbel等。
本發(fā)明的引物延伸是一種擴(kuò)增過程，包括包括利用模板依賴性聚合酶，以5’→3’方向使退火結(jié)合于模板的引物延伸。根據(jù)某些實(shí)施方案，采用適當(dāng)?shù)木彌_液、鹽、pH、溫度和核苷酸三磷酸，包括其類似物和衍生物，該模板依賴性聚合酶，從退火引物的3’端開始，將與該模板鏈互補(bǔ)的核苷酸加入，產(chǎn)生一互補(bǔ)鏈。某些實(shí)施方案引物延伸的詳細(xì)說明可在其它地方找到，見Sambrook等；Sambrook和Russell；和Ausbel等。
某些實(shí)施方案的轉(zhuǎn)錄是一種擴(kuò)增過程，包括RNA聚合酶與單鏈或雙鏈模板上的啟動子相互反應(yīng)，以5’-3’方向產(chǎn)生RNA聚合物。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物還包括轉(zhuǎn)錄因子。RNA聚合酶包括但不限于T3、T7和SP6聚合酶，根據(jù)某些實(shí)施方案，它們可與雙鏈啟動子相互反應(yīng)。某些實(shí)施方案轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)說明可在其它地方找至到，見Sambrook等；Sambrook和Russell；和Ausbel等。
擴(kuò)增的某些實(shí)施方案可采用多重PCR，其中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列(見例如，H.Geada等，F(xiàn)orensic Sci Int.10831-37(2000)和D.G.Wang等，Science.2801077-82(1998))。
在某些實(shí)施方案中，采用不對稱PCR。根據(jù)某些實(shí)施方案，不對稱PCR包括含有(i)至少其中一種引物過量的一引物組；(ii)至少一組只含有第一引物或第二引物的引物組；(iii)至少一組含有在給定的擴(kuò)增條件下可導(dǎo)致一條鏈擴(kuò)增的引物，和含有另一條作廢引物的引物組；或(iv)至少一組符合以上(i)和(iii)所述的引物組。然后，當(dāng)擴(kuò)增連接產(chǎn)物時(shí)，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物一條鏈的過量(相對于其互補(bǔ)鏈)。
在某些實(shí)施方案中，可采用一條引物的解鏈溫度(Tm50)比另一條引物的Tm50高的引物組。此類實(shí)施方案叫非同步PCR(A-PCR)。見例如2001/6/5提交的美國專利申請系列號No.09/875,211。在某些實(shí)施方案中，第一引物的Tm50至少為4-15℃，不同于第二引物的Tm50.在某些實(shí)施方案中，第一引物的Tm50至少為8-15℃，不同于第二引物的Tm50。在某些實(shí)施方案中，第一引物的Tm50至少為10-15℃，不同于第二引物的Tm50。在某些實(shí)施方案中，第一引物的Tm50至少為10-12℃，不同于第二引物的Tm50。某些實(shí)施方案中，在至少一引物組中，至少一種引物的Tm50與至少一種第二引物的解鏈溫度相差至少約4℃、至少約8℃、至少約10℃、至少約12℃。
在某些A-PCR實(shí)施方案中，除了引物組中引物的Tm50不同外，該引物中的一條引物比另一條引物過量。在某些A-PCR實(shí)施方案中，引物的濃度至少為50mM。
在某些A-PCR實(shí)施方案中，在引物退火和鏈擴(kuò)增的前面幾輪中可采用常規(guī)PCR程序。在后幾輪中升高溫度，然而，可利用低Tm使引物無效，這樣只擴(kuò)增一條鏈。如此，在后面幾輪中降低Tm使引物無效導(dǎo)致了不對稱性擴(kuò)增。結(jié)果，當(dāng)擴(kuò)增連接產(chǎn)物時(shí)，產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈過剩(相對其互補(bǔ)物)。
根據(jù)A-PCR某些實(shí)施方案，通過改變第一期常規(guī)PCR循環(huán)的輪次數(shù)可控制擴(kuò)增水平。在這類實(shí)施方案中，通過改變前面常規(guī)輪次數(shù)，可改變進(jìn)入后面幾輪PCR時(shí)具有較低Tm的引物在較高溫度下失活的雙鏈數(shù)量。
在某些實(shí)施方案中，A-PCR方案包括采用一對引物，各自濃度至少50mM。在某些實(shí)施方案中，常規(guī)PCR用二條引物先擴(kuò)增20-30輪。在某些實(shí)施方案中，常規(guī)PCR進(jìn)行20-30輪擴(kuò)增后，提高退火溫度至66-70℃，在此較高退火溫度下進(jìn)行PCR5-40輪。在這類實(shí)施方案中，具有較低Tm的引物在較高退火溫度的5-40輪中失效。在這類實(shí)施方案中，在較高退火溫度的第二期PCR輪次中發(fā)生不對稱性擴(kuò)增。
在某些實(shí)施方案中，采用不對稱性重復(fù)擴(kuò)增。根據(jù)某些實(shí)施方案，不對稱性擴(kuò)增包括在第二擴(kuò)增過程中產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，第一次擴(kuò)增過程的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物可作為不對稱重復(fù)擴(kuò)增過程中的擴(kuò)增靶序列。在某些實(shí)施方案中，采用非同步PCR可實(shí)現(xiàn)不對稱重復(fù)擴(kuò)增，此法中前面幾輪常規(guī)PCR擴(kuò)增了二條鏈，后面幾輪在較高退火溫度下進(jìn)行，使引物組的一條引物失效。在某些實(shí)施方案中，第二次擴(kuò)增反應(yīng)組合物包括至少一組含有至少一種第一引物，或至少一種第二引物，但不含有二者的引物組。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，在某些實(shí)施方案中，即使引物組中的二引物存在的比例不相等，也可發(fā)生不對稱性重復(fù)擴(kuò)增。在某些不對稱重復(fù)擴(kuò)增方法中，通常只產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增子，因?yàn)榈诙U(kuò)增反應(yīng)組合物只含有各引物組的第一或第二引物，或引物中比例不相等的第一和第二引物。
在某些實(shí)施方案中，其它聚合本科也可能是第二擴(kuò)增反應(yīng)組合物的成分。在某些實(shí)施方案中，前面的擴(kuò)增組合物可能留有足夠的聚合酶來合成第二次擴(kuò)增產(chǎn)物。
優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員熟知的。例如，眾所周知可通過改變退火、聚合和變性的時(shí)間和溫度，以及改變反應(yīng)組合物中的緩沖液、鹽和其它試劑來優(yōu)化PCR。可通過設(shè)計(jì)所用的擴(kuò)增引物影響優(yōu)化。例如，引物長度及G-C∶A-T比例可改變引物延伸的效率，從而改變擴(kuò)增反應(yīng)。見James G.Wetmur，“Nucleic AcidHybrids，F(xiàn)ormation and Structure”，收于Molecular Biology and Biotechnology，pp.605-8(Robert A.Meyers編，1995)。
為了確定是否存在某特定序列，在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)中加入一標(biāo)記探針。根據(jù)某些實(shí)施方案，該標(biāo)記探針可表明是否存在某特定核酸序列(或其量)。這些探針包括但不限于5’-核酸酶探針、切割性RNA探針、結(jié)構(gòu)特異性核酸酶探針和雜交依賴性探針。在某些實(shí)施方案中，該標(biāo)記探針含有通過一連接元件，如通過一特定寡核苷酸，與淬滅性分子相連接的熒光染料。這類系統(tǒng)的例子描述例如見美國專利5,538,848和5,723,591。
根據(jù)某些實(shí)施方案的合適標(biāo)記探針的其它例子是i-探針、蝎子探針、掩蔽探針等。例如但不是限制Whitcombe等，Nat.Biotechnol.，1999.17(8)804-807(包括蝎子探針)；Thelwell等，Nucleic Acid Res.，2000，28(19)3752-3761(包括蝎子探針)；Afonina等，Biotechniques，2002，32(4)(包括掩蔽探針)；Li等，“基于特異性置換雜交的新類型同源核酸探針”，Nucleic Acid Res.，2002，30(2)E5；Kandimall等，Bioorg.Med.Chem.，2002，8(8)1911-1916；Isacsson等，Mol.Cell.Probes，2000，14(5)321-328；French等，Mol.Cell.Probes，2001，15(6)363-374；和Nurmi等，“一種在密封試管中檢測特異性聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的新標(biāo)記方法”，Nucleic Acid Res.，2000，28(8)E28。
在某些實(shí)施方案中，能在對射入光反應(yīng)中產(chǎn)生熒光信號的標(biāo)記探針量，通常與擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的核酸量有關(guān)。因此，在某些實(shí)施方案中，熒光信號的量與擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的量有關(guān)。在這類實(shí)施方案中，可通過測定熒光指示劑產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度，測定擴(kuò)增產(chǎn)物的量。根據(jù)某些實(shí)施方案，可采用一種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品來定量熒光信號所示的擴(kuò)增產(chǎn)物量。見例如美國專利5,736,333。
開發(fā)了一些裝置，它們利用含有熒光指示劑的組合物進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，可發(fā)射特定波長的光束，讀取熒光染料的強(qiáng)度和顯示每次循環(huán)后的熒光強(qiáng)度。這些裝置包括熱循環(huán)儀、光束發(fā)射儀和熒光信號檢測儀，見美國專利5,928,907；6,015,674和6,174,670，包括但不限于ABI Prism7700測序系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，California)和ABI GeneAmp5700測序系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，California)。
在某些實(shí)施方案中，這些功能各用分開的裝置進(jìn)行。例如，如果擴(kuò)增采用Q-β置換反應(yīng)，則該反應(yīng)不在熱循環(huán)儀中進(jìn)行，而可包括發(fā)射特定波長的光束、檢測熒光信號和計(jì)算并顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
在某些實(shí)施方案中，可采用聯(lián)合的熱循環(huán)和熒光檢測裝置來精確定量樣品中的靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，可檢測一輪或多輪熱循環(huán)期間和/之后的熒光信號，這樣得以伴隨反應(yīng)“實(shí)時(shí)”監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，可利用擴(kuò)增產(chǎn)物的量和擴(kuò)增輪次數(shù)來計(jì)算擴(kuò)增前樣品中存在多少靶核酸序列。
根據(jù)某些實(shí)施方案，可簡單地監(jiān)測在預(yù)定的能充分表明樣品中存在靶核酸序列的循環(huán)反應(yīng)輪次后的擴(kuò)增產(chǎn)物量。對于任何給定的樣品類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可不難確定所用的引物序列和反應(yīng)條件、需要多少輪才足夠檢測到給定靶多核苷酸的存在。
根據(jù)某些實(shí)施方案，一旦完成了預(yù)定的循環(huán)數(shù)可記錄擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性或陰性。在某些實(shí)施方案中，將結(jié)果直接電路轉(zhuǎn)移到數(shù)據(jù)庫中并列表。因此，在某些實(shí)施方案中，可用較少時(shí)間和勞動處理和分析大量的樣品。
根據(jù)某些實(shí)施方案，不同的標(biāo)記探針可鑒別不同的靶核酸序列。這種探針的非限制性例子是5’-核酸酶熒光探針，如TaqMan探針分子，其中的熒光分子通過一寡核苷酸連接元件，與熒光淬滅分子本連接。在某些實(shí)施方案中，5’-核酸酶熒光探針的寡核苷酸連接元件與可尋址部分或其互補(bǔ)處的特定序列相結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，不同的5’-核酸酶熒光探針，各有不同波長的熒光，可鑒別同一擴(kuò)增反應(yīng)中的不同擴(kuò)增產(chǎn)物。
例如，在某些實(shí)施方案中，可利用發(fā)射二種不同波長熒光(WLA和WLB)、對二種不同連接產(chǎn)物的二種不同可尋址部分(分別為A’和B’)特異的、二種5’-核酸酶熒光探針。如果樣品中存在靶核酸序列A’則形成連接產(chǎn)物A’；。如果樣品中存在靶核酸序列B’則形成連接產(chǎn)物B’。在某些實(shí)施方案中，即使樣品中不存在合適的靶核酸序列也可形成連接產(chǎn)物A’和/或B’，但可測到這種連接的程度，比樣品中存在相應(yīng)靶核酸序列時(shí)要低。擴(kuò)增后，可根據(jù)所測信號的波長確定樣品中存在的具體靶核酸序列。如此，如果只測到波長WLA的相應(yīng)可檢測信號值，即知道樣品含有靶核酸序列A，而不含有靶核酸序列B。如果測到二種波長WLA和WLB的相應(yīng)檢測信號，即知道樣品含有靶核酸序列A和靶核酸序列B二種。
D.檢測靶序列的某些示范性實(shí)施方案本發(fā)明涉及采用連接和擴(kuò)增反應(yīng)，檢測樣品中是否存在(或定量)靶核酸序列的方法、試劑和試劑盒。當(dāng)樣品中存在某特定靶核酸序列時(shí)，形成含有可尋址部分的連接產(chǎn)物。采用的標(biāo)記探針能根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)中是否存在互補(bǔ)序列而提供不同的可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)標(biāo)記探針含有與可尋址部分相同的，或與可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列。
在某些實(shí)施方案中，使一種或多種核酸，直接或通過中介，如逆轉(zhuǎn)錄mRNA產(chǎn)生的cDNA靶序列，經(jīng)歷連接和擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，起始的核酸為mRNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生至少一種cDNA，然后進(jìn)行至少一次連接反應(yīng)和至少一次擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，使DNA連接探針與靶RNA雜交，在連接反應(yīng)中采用RNA依賴性DNA連接酶，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?？捎脴?biāo)記探針檢測(或定量)連接產(chǎn)物和擴(kuò)增產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，對于待測的各靶核酸序列，將含有至少一種第一探針和至少一種第二探針的連接探針組，與樣品混合形成連接反應(yīng)組合物。在某些實(shí)施方案中，該連接組合物還含有連接試劑。在某些實(shí)施方案中，各連接探針組中的第一和第二探針適合連接在一起，并設(shè)計(jì)能與該靶核酸序列中存在的毗鄰序列雜交。當(dāng)樣品中存在該靶核酸序列時(shí)，第一和第二探針在適當(dāng)條件下與該靶核酸序列上的毗鄰區(qū)域雜交(見例如圖2A中探針2和3與靶核酸序列雜交)。圖2A中，描述了靶核酸序列(1)與第一探針(2)雜交，為闡述目的此地顯示第一探針含有5’-引物-特異性部分(25)、可尋址部分(4)和靶特異性部分(15a)；第二探針(3)含有連接用的3’引物特異性部分(35)、靶核酸特異性部分(15b)和游離的5’磷酸根基團(tuán)(“P”)。
在某些實(shí)施方案中，在合適條件下，該毗鄰雜交探針連接在一起形成連接產(chǎn)物(見例如，圖2B中的連接產(chǎn)物6)。圖2B描述第一探針(2)和第二探針(3)連接形成的連接產(chǎn)物(6)。顯示連接產(chǎn)物(6)含有5’-引物-特異性部分(25)、可尋址部分(4)和3’引物特異性部分(35)。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)例如，加熱變性含有靶核酸序列(1)和連接產(chǎn)物(6)的雙鏈體時(shí)，釋放出連接產(chǎn)物(6)。
在某些實(shí)施方案中，形成含有連接產(chǎn)物(6)、至少一個(gè)引物組7、聚合酶8和標(biāo)記探針26的擴(kuò)增反應(yīng)組合物(見例如圖2C)。所述實(shí)施方案中的標(biāo)記探針26是一種5’-核酸酶熒光探針，其含有通過寡核苷酸連接元件與熒光部分(F)相連接的猝滅劑部分(Q)，該探針含有與連接產(chǎn)物可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列。在第一輪擴(kuò)增中，含有與連接產(chǎn)物6的3’-引物-特異性部分35序列互補(bǔ)的序列的引物7，在存在DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTP)時(shí)，以模板依賴性方式，與該連接產(chǎn)物雜交并延伸。聚合酶的5’-核酸酶活性導(dǎo)致5’-核酸酶熒光探針被切斷，因此其熒光部分(F)不再受到猝滅劑部分(Q)的猝滅，而檢測到熒光信號。檢測到5’-核酸酶熒光探針發(fā)出的熒光信號表明樣品中存在靶核酸序列。
在某些實(shí)施方案中，如果樣品中不存在靶核酸序列，連接反應(yīng)中不會形成含有可尋址部分和5’及3’引物-特異性部分的連接產(chǎn)物。因此，標(biāo)記探針不會與連接產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)中也無標(biāo)記探針被切斷(一些標(biāo)記探針可能未連接的連接探針雜交)。這樣，擴(kuò)增反應(yīng)中或之后未測到可檢測信號表明，樣品中不存在靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，即使樣品中不存在相應(yīng)的靶核酸序列，也能形成連接產(chǎn)物，但可測到這種連接的程度，比樣品中存在相應(yīng)靶核酸序列時(shí)要低。在某些這類實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一適當(dāng)?shù)挠蛑挡町?，來區(qū)分含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品與不含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品。
某些實(shí)施方案可能與圖2A-2C所述的基本相同，除5’-核酸酶熒光探針的寡核苷酸連接元件含有連接產(chǎn)物的可尋址部分外(而不是與該可尋址部分相互補(bǔ)的序列)。見例如，圖2D-2E中的標(biāo)記探針27。
在第一輪擴(kuò)增中，含有與連接產(chǎn)物6的3’引物-特異性部分的序列相互補(bǔ)序列的第二引物7’，在存在DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTP)時(shí)，以模板依賴性方式，與連接產(chǎn)物6雜交并延伸。第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物，含有該連接產(chǎn)物5’引物特異性部分(25)的互補(bǔ)物，和該連接產(chǎn)物的可尋址部分(4)的互補(bǔ)物(見圖2D).。
使該雙鏈引物延伸產(chǎn)物變性并經(jīng)受一輪或多輪聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反應(yīng)包括含有寡核苷酸連接元件的探針27，其含有連接產(chǎn)物的可尋址部分的序列(見圖2E)。在存在DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTP)時(shí)，以模板依賴性方式，使含有連接產(chǎn)物5’引物特異性部分的序列的引物，與含有互補(bǔ)于該5’引物特異性部分的序列的序列25’雜交，并延伸。見例如，圖2E。該聚合酶的5’-核酸酶活性導(dǎo)致5’-核酸酶熒光探針被切斷，因此其熒光部分(F)不再受到猝滅劑部分(Q)的猝滅，而檢測到熒光信號。檢測到5’-核酸酶熒光探針發(fā)出的熒光信號表明樣品中存在靶核酸序列。
在某些實(shí)施方案中，如果樣品中不存在靶核酸序列，連接反應(yīng)中不會形成含有可尋址部分和5’及3’引物-特異性部分的連接產(chǎn)物。因此不會形成含有這類連接產(chǎn)物可尋址部分互補(bǔ)物的擴(kuò)增產(chǎn)物。故擴(kuò)增反應(yīng)中，標(biāo)記探針不會結(jié)合連接產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物，標(biāo)記探針也不會被切斷。因此，擴(kuò)增反應(yīng)中或之后無可檢測信號表明，樣品中不存在靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，即使樣品中不存在相應(yīng)的靶核酸序列，也能形成連接產(chǎn)物，但可測到這種連接的程度，比樣品中存在相應(yīng)靶核酸序列時(shí)要低。在某些這類實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一適當(dāng)?shù)挠蛑挡町?，來區(qū)分含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品與不含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品。
在某些實(shí)施方案中，如圖2實(shí)施方案之一中，當(dāng)存在雙鏈分子擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，后面的擴(kuò)增循環(huán)可呈指數(shù)擴(kuò)增該分子。在某些實(shí)施方案中，通過測定熒光信號的強(qiáng)度水平，可定量測定樣品中靶核酸的量。
如圖3A所示，在某些實(shí)施方案中，采用mRNA來產(chǎn)生cDNA拷貝1’。此時(shí)cDNA作為與連接探針組中第一和第二探針雜交的靶核酸序列(見3B)。第一探針22含有5’引物特異性部分(25)和靶特異性部分15a；第二探針23含有靶特異性部分15b、可尋址部分4和3’引物特異性部分(35)。在適當(dāng)條件下。毗鄰雜交的二探針可形成含有5’引物特異性部分(25)、靶特異性部分15a和15b、可尋址4、和3’引物特異性部分(35)的連接產(chǎn)物28(見圖3C)。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)通過加熱使靶核酸序列1’和連接產(chǎn)物28形成的雙鏈體變性時(shí)，釋放出該連接產(chǎn)物。在存在適當(dāng)?shù)囊锝M和在合適條件下，3’引物與連接產(chǎn)物28的3’引物特異性部分(35)雜交。存在DNA聚合8時(shí)3’引物延伸產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物，其含有該連接產(chǎn)物5’引物特異性部分(25)的互補(bǔ)物(25’)和該連接產(chǎn)物可尋址部分(4)的互補(bǔ)物(4’)(見圖3D)。
使雙鏈引物延伸產(chǎn)物變性并經(jīng)受一輪或多輪加有標(biāo)記探針27的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(見圖3E)。所述實(shí)施方案中的探針27是一種5’-核酸酶熒光探針，其含有經(jīng)一寡核苷酸連接于熒光部分(F)的猝滅劑部分(Q)，該寡核苷酸含有連接產(chǎn)物可尋址部分的序列。含有連接產(chǎn)物5’引物特異性部分的序列有引物，在存在DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTP)時(shí)，以模板依賴性方式，與含有序列25’的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交并延伸，而序列25’與5’引物特異性部分的序列相互實(shí)補(bǔ)。此聚合酶的5’-核酸酶活性導(dǎo)致5’-核酸酶熒光探針被切斷，因此其熒光部分(F)不再受到猝滅劑部分(Q)的猝滅，而檢測到熒光信號。檢測到5’-核酸酶熒光探針發(fā)出的熒光信號表明樣品中存在靶核酸序列。
在某些實(shí)施方案中，如果樣品中不存在靶核酸序列，連接反應(yīng)中不會形成含有可尋址部分和5’及3’引物-特異性部分的連接產(chǎn)物。這樣不會形成含有連接產(chǎn)物互補(bǔ)物的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，標(biāo)記探針不會結(jié)合連接產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物，標(biāo)記探針在擴(kuò)增期間不會被切斷。這樣擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后無可檢測信號，表明樣品中不存在靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，即使樣品中不存在相應(yīng)的靶核酸序列，也能形成連接產(chǎn)物，但可測到這種連接的程度，比樣品中存在相應(yīng)靶核酸序列時(shí)要低。在某些這類實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一適當(dāng)?shù)挠蛑挡町?，來區(qū)分含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品與不含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品。
某些實(shí)施方案可能與圖3A-3E所述的基本上相同，除了5’-核酸酶熒光探針的寡核苷酸連接元件外，其含有與連接產(chǎn)物可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列(而非該可尋址部分的序列)。見例如，圖3F中的探針26。
在第一輪擴(kuò)增中，含有與連接產(chǎn)物28的3’引物-特異性部分35序列相互補(bǔ)序列的第二引物7’，在存在DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTP)時(shí)，以模板依賴性方式，與連接產(chǎn)物28雜交并延伸。此聚合酶的5’-核酸酶活性導(dǎo)致5’-核酸酶熒光探針被切斷，因此其熒光部分(F)不再受到猝滅劑部分(Q)的猝滅，而檢測到熒光信號。
在某些實(shí)施方案中，如果在連接反應(yīng)后從組合物中基本除去未連接的第二連接探針，檢測到第一輪擴(kuò)增的熒光信號，表明樣品中存在靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，連接反應(yīng)后，通過使組合物接觸固相載體上與第一連接探針上含有的、但第二連接探針上不含有的序列互補(bǔ)的核酸，可基本上除去未連接的第二探針?？稍谠摴滔噍d體上將雜交的連接產(chǎn)物和未連接的第一連接探針與未連接的第二連接探針相分離。
連接反應(yīng)后如果未能基本上除去組合物中的未連接的第二連接探針，檢測到第一輪擴(kuò)增的熒光信號，不一定表明樣品中存在靶核酸序列。在這類實(shí)施方案中，標(biāo)記探針可與未連接的第二連接探針和連接產(chǎn)物二者結(jié)合。聚合酶的5’-核酸酶活性也可導(dǎo)致與未連接的第二連接探針和連接產(chǎn)物二者結(jié)合5’-核酸酶熒光探針被切斷。這樣，檢測到的同樣信號不表明是否存在任何連接產(chǎn)物。
然而，在這類實(shí)施方案中，可利用后面幾輪擴(kuò)增來檢測靶核酸序列的存與否(或定量)。如果不存在連接產(chǎn)物，含有可尋址序列的序列量在后幾輪擴(kuò)增時(shí)不會增加。只有前面數(shù)量的未連接的第二連接探針會與標(biāo)記探針相互反應(yīng)產(chǎn)生信號。
相反，后幾輪擴(kuò)增涉及的組合物含有的連接產(chǎn)物，將導(dǎo)致含有可尋址部分的序列數(shù)量增加。這樣與擴(kuò)增產(chǎn)物相互反應(yīng)的標(biāo)記探針量也增加。因此，在某些實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一適當(dāng)?shù)挠蛑挡町悾瑏韰^(qū)分含有連接產(chǎn)物的樣品與不含有連接產(chǎn)物的樣品。在某些實(shí)施方案中，即使樣品中不存在相應(yīng)的靶核酸序列，也能形成連接產(chǎn)物，但可測到這種連接的程度，比樣品中存在相應(yīng)靶核酸序列時(shí)要低。在某些這類實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一適當(dāng)?shù)挠蛑挡町?，來區(qū)分含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品與不含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品。
可簡單地利用樣品中的靶DNA而不是RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，來改進(jìn)圖3所述的實(shí)施方案。也可利用RNA作為連接探針雜交的靶核酸序列來改進(jìn)圖3所述的實(shí)施方案。
在此種應(yīng)用中，無論采用擴(kuò)增反應(yīng)來測定標(biāo)記探針產(chǎn)生的信號值是否有域值差異，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的方式是如果樣品中含有待檢測的靶序列應(yīng)能產(chǎn)生這種域值差異。以下非限制性示范實(shí)施方案闡述這種概念。
在第一個(gè)示范實(shí)施方案中，采用的連接探針組包括含有5’引物特異性部分和靶特異性部分的第一探針；和含有靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分的第二探針。如果樣品中存在靶核酸，連接反應(yīng)中第一和第二探針連接在一起形成連接產(chǎn)物。該連接產(chǎn)物將含有5’引物特異性部分、兩個(gè)靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分。
在此實(shí)施方案中，形成的擴(kuò)增反應(yīng)組合物含有連接產(chǎn)物、含可尋址部分序列的5’-核酸酶熒光探針，和5’及3’引物特異性部分的一組相應(yīng)引物。5’-核酸酶熒光探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)，具有第一可檢測信號值。如果采用PCR作擴(kuò)增反應(yīng)，第一輪擴(kuò)增不會導(dǎo)致該輪擴(kuò)增時(shí)和/或之后第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間的域值差異。沒有檢測到域值差異是因?yàn)?’-核酸酶熒光探針具有與連接產(chǎn)物可尋址部分相同的序列，因而不會與該可尋址部分雜交。這樣在第一輪擴(kuò)增時(shí)5’-核酸酶熒光探針不會被切斷。
然而，擴(kuò)增第一輪產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物其3‘端含有可尋址部分的互補(bǔ)物，和5’引物特異性部分的互補(bǔ)物。這樣，5’-核酸酶熒光探針將與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交并在第二輪擴(kuò)增中被切斷。因此，在該示范實(shí)施方案中，第二輪擴(kuò)增導(dǎo)致該輪擴(kuò)增期間和/或之后，第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間的域值差異。因此，在這類實(shí)施方案中，用于測定信號值是否有域值差異的擴(kuò)增反應(yīng)包括至少二輪PCR擴(kuò)增。
在第二個(gè)示范實(shí)施方案中，采用的連接探針組包括含有5’引物特異性部分、可尋址部分和靶特異性部分的第一探針；和含有靶特異性部分和3’引物特異性部分的第二探針。如果樣品中存在靶核酸，連接反應(yīng)中第一和第二探針連接在一起形成連接產(chǎn)物。該連接產(chǎn)物含有5’引物特異性部分、可尋址部分、兩個(gè)靶特異性部分、和3’引物特異性部分。
在此實(shí)施方案中，形成的擴(kuò)增反應(yīng)組合物含有連接產(chǎn)物、含有與可尋址部分序列相互補(bǔ)序列的5’-核酸酶熒光探針，和5’及3’引物特異性部分的一組相應(yīng)引物。5’-核酸酶熒光探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)，具有第一可檢測信號值。如果采用PCR作擴(kuò)增反應(yīng)，第一輪擴(kuò)增將導(dǎo)致導(dǎo)致該輪擴(kuò)增時(shí)和/或之后第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間的域值差異。檢測到域值差異是因?yàn)?’-核酸酶熒光探針具有與連接產(chǎn)物可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列，因而會與該可尋址部分雜交。這樣在第一輪擴(kuò)增會導(dǎo)致5’-核酸酶熒光探針被切斷。因此，在此實(shí)施方案中，用于測定信號值是否有域值差異的擴(kuò)增反應(yīng)包括至少一輪PCR擴(kuò)增。
在第三個(gè)示范實(shí)施方案中，采用的連接探針組包括含有5’引物特異性部分和靶特異性部分的第一探針；和含有靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分的第二探針。如果樣品中存在靶核酸，連接反應(yīng)中第一和第二探針連接在一起形成連接產(chǎn)物。該連接產(chǎn)物含有5’引物特異性部分、兩個(gè)靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分。
在此實(shí)施方案中，形成的擴(kuò)增反應(yīng)組合物含有連接產(chǎn)物、含可尋址部分序列的雜交依賴性探針，和5’及3’引物特異性部分的一組相應(yīng)引物。該雜交依賴性探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)，具有第一可檢測信號值。在此實(shí)施方案中，采用PCR作擴(kuò)增反應(yīng)。
如果在第一輪擴(kuò)增前沒從擴(kuò)增反應(yīng)組合物中基本上除去未連接的探針，在第一輪期間和/或之后測不到域值差異。因?yàn)闇y不到域值差異而不能確定是否存在連接產(chǎn)物，第一輪擴(kuò)增可產(chǎn)生同樣數(shù)量的該雜交依賴性探針將與之雜交的擴(kuò)增產(chǎn)物。此實(shí)施方案中的未連接探針和連接產(chǎn)物將含有相同的3’引物特異性部分(其將在第一輪擴(kuò)增中啟動延伸)和相同的可尋址部分。因此第一輪擴(kuò)增后，當(dāng)雜交依賴性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物上的可尋址部分的互補(bǔ)物雜交時(shí)，相同的信號值將不能區(qū)分是否存在連接產(chǎn)物。
然而，可檢測信號值的域值差異，在擴(kuò)增連接產(chǎn)物時(shí)將導(dǎo)致后面幾輪擴(kuò)增中，具有與可尋址部分序列相互補(bǔ)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)增長。在這種后續(xù)擴(kuò)增中，如果不存在連接產(chǎn)物，這種擴(kuò)增產(chǎn)物因存在未連接的探針只呈線性增長。發(fā)生線性增長是因?yàn)椴幌襁B接產(chǎn)物，未連接的探針不含有5’引物特異性部分。
在第四個(gè)示范實(shí)施方案中，采用的連接探針組包括含有5’引物特異性部分和靶特異性部分的第一探針；和含有靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分的第二探針。如果樣品中存在靶核酸，連接反應(yīng)中第一和第二探針連接在一起形成連接產(chǎn)物。該連接產(chǎn)物含有5’引物特異性部分、兩個(gè)靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分。
在此實(shí)施方案中，形成的擴(kuò)增反應(yīng)組合物含有連接產(chǎn)物、含有與可尋址部分序列相互補(bǔ)序列的雜交依賴性探針，和5’及3’引物特異性部分的一組相應(yīng)引物。在此實(shí)施方案中，該雜交依賴性探針的基本部分在擴(kuò)增反應(yīng)輪次中不會被切斷?！安粫磺袛嗟碾s交依賴性探針的基本部分”，指設(shè)計(jì)能與某給定核酸序列雜交而被擴(kuò)增的雜交依賴性探針總體的一部分，而不是指單個(gè)探針的一部分。在某些實(shí)施方案中，“不會被切斷的雜交依賴性探針的基本部分”，指該雜交依賴性探針的至少90％不被切斷。在某些實(shí)施方案中，至少95％的雜交依賴性探針不會被切斷。該雜交依賴性探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)，具有第一可檢測信號值。在此實(shí)施方案中，采用PCR作擴(kuò)增反應(yīng)。
如果在第一輪擴(kuò)增前沒從擴(kuò)增反應(yīng)組合物中基本上除去未連接的探針，在第一輪期間和/或之后測不到域值差異。測不到域值差異是因?yàn)殡s交依賴性探針能與未連接的第二探針和連接產(chǎn)物二者雜交。第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物具有與連接產(chǎn)物可尋址部分序列相互補(bǔ)的序列。因此，雜交依賴性探針不會與第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。
然而，第二輪擴(kuò)增后將會產(chǎn)生可檢測信號值的域值差異，因?yàn)槿绻嬖谶B接產(chǎn)物，第二輪擴(kuò)增可導(dǎo)致含有可尋址部分序列的DNA增加。因此在此類實(shí)施方案中，用于測定信號值是否有域值差異的擴(kuò)增反應(yīng)包括至少二輪PCR擴(kuò)增。
根據(jù)某些實(shí)施方案，設(shè)計(jì)各連接探針組的第一和第二探針與直接側(cè)接靶序列的關(guān)鍵核苷酸序列相互補(bǔ)(見例如，見圖6(1)中的A、B和Z)。在圖6所示的實(shí)施方案中，連接探針組的第一探針A和B在關(guān)鍵互補(bǔ)處含有不同的核苷酸，和含有針對關(guān)鍵互補(bǔ)處中各不同核苷酸的不同尋址部分。形成的連接反應(yīng)組合物含有該探針組和樣品。
當(dāng)樣品中存在靶序列時(shí)，在合適條件下，第一和第二探針將與靶序列上的毗鄰區(qū)域雜交(見圖6(2))。在存在相應(yīng)的連接試劑關(guān)鍵互補(bǔ)處與靶序列堿基配對時(shí)，二毗鄰雜交的探針連接在一起形成連接產(chǎn)物(見圖6(3))。在某些實(shí)施方案中，如果第一探針的關(guān)鍵互補(bǔ)處與靶序列不堿基配對，不會形成含有錯(cuò)配探針的連接產(chǎn)物(見例如，圖6(2)-6(4)中的探針B。
在圖6(2)和6(3)中，第一探針B沒與靶雜交。在某些實(shí)施方案中，具有錯(cuò)配的末端關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針不能與第二探針連接，可能是由于具有錯(cuò)配的探針在所用條件下不能與靶雜交。在某些實(shí)施方案中，具有錯(cuò)配的末端關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針不能與第二探針連接，可能出現(xiàn)在具有錯(cuò)配的探針與靶雜交時(shí)關(guān)鍵互補(bǔ)處中的核苷酸與靶序列堿基不配對。
在某些實(shí)施方案中，經(jīng)受連接反應(yīng)的反應(yīng)物形成了測試組合物。在某些實(shí)施方案中，然后形成的擴(kuò)增反應(yīng)組合物含有該測試組合物、至少一個(gè)引物組、聚合酶和各種不同的第一探針的不同標(biāo)記探針(LBP-A和LBP-B)，其中，不同的標(biāo)記探針可提供不同的可檢測信號(見例如圖6(4))。所述實(shí)施方案中的標(biāo)記探針是不同的5’-核酸酶熒光探針，其含有通過不同寡核苷酸連接元件與可檢測的不同熒光部分(F)相連接的猝滅劑部分(Q)。不同的寡核苷酸連接元件含有的序列與不同的第一連接探針的不同尋址部分之一相互補(bǔ)。
在上述實(shí)施方案中，第一標(biāo)記探針(LBP-A)含有通過一寡核苷酸連接元件與猝滅劑部分(Q)連接的第一熒光部分(FA)，該連接元件含有與第一探針A的尋址部分(ASP-A)序列相互補(bǔ)的序列。在上述實(shí)施方案中，第二標(biāo)記探針(LBP-B)含有通過一寡核苷酸連接元件與猝滅劑部分(Q)連接的第F二熒光部分(FB)，該連接元件含有與第一探針B的尋址部分(ASP-B)序列相互補(bǔ)的序列。各個(gè)不同的標(biāo)記探針的熒光部分當(dāng)它們不被猝滅劑部分所猝滅時(shí)，可發(fā)射彼此不同的可檢測信號。
在某些恰當(dāng)?shù)柠}、緩沖液和核苷三磷酸中，使擴(kuò)增反應(yīng)組合物經(jīng)受至少一輪擴(kuò)增。在第一輪擴(kuò)增中，含有與連接產(chǎn)物3’引物特異性部分序列相互補(bǔ)序列的第二引物(P2)，以溫度依賴方式與連接產(chǎn)物雜交產(chǎn)生雙鏈分子。
也在第一輪擴(kuò)增中聚合酶的5’-核酸酶活性導(dǎo)致與連接產(chǎn)物可尋址部分雜交的標(biāo)記探針切斷(見例如，圖6(5)中的標(biāo)記探針LBP-A)。切斷導(dǎo)致熒光部分(FA)不再受到猝滅(Q)的猝滅和測到熒光信號彈。測到熒光(FA)發(fā)出的熒光信號，表明樣品中存在具有與連接產(chǎn)物關(guān)鍵互補(bǔ)處中核苷酸(T)相互補(bǔ)的關(guān)鍵核苷酸(A)的靶核酸序列。
在此實(shí)施方案中，樣品中的靶核酸序列不具有與探針B關(guān)鍵互補(bǔ)處核苷酸互補(bǔ)的關(guān)鍵核苷酸(C)。因此，在此實(shí)施方案中，不會形成含有探針B可尋址部分和3’引物特異性部分的連接產(chǎn)物。含熒光部分(FB)的標(biāo)記探針(LBP-B)不會結(jié)合連接產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增反應(yīng)期間標(biāo)記探針(LBP-B)也不會被切斷。因此在擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后無可檢測信號，表明樣品中沒有含關(guān)鍵核苷酸(C)的靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，可發(fā)生含關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針不與關(guān)鍵性核苷酸互補(bǔ)，但可測到這種連接發(fā)生的程度，比具有與關(guān)鍵性核苷酸相互補(bǔ)的關(guān)鍵互補(bǔ)處的探針的連接要低。在某些這類實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一適當(dāng)?shù)挠蛑挡町?，來區(qū)分含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品與不含有相應(yīng)靶核酸序列的樣品。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)5’-核酸酶探針與可尋址部分或可尋址部分的互補(bǔ)處雜交時(shí)，使猝滅劑部分與信號部分充分分開，從而可檢測到信號。在某些實(shí)施方案中，這種信號的可檢測信號值(切割前)，比5’-核酸酶探針切斷后的可檢測信號值低/因此，在某些這類實(shí)施方案中，可在可檢測信號值之間設(shè)定一域值差異，這樣在5’-核酸酶探針與某給定序列雜交生未被切斷時(shí)檢測到的信號值不會產(chǎn)生該設(shè)置的域值差異。然而，因5’-核酸酶探針被切斷而測到的信號值將會產(chǎn)生所設(shè)置的域值差異。
在某些實(shí)施方案中，后幾輪擴(kuò)增可產(chǎn)生指數(shù)性擴(kuò)增(見例如圖6(4)-(11))。此時(shí)每輪因標(biāo)記探針(LBP-A)的切斷而檢測到的信號值將增強(qiáng)，同時(shí)檢測到的標(biāo)記探針(LBP-B)的信號值將維持基本相同。
在某些實(shí)施方案中，通過例如但非限制，不對稱PCR、非同步PCR、引物延伸、或不對稱重復(fù)擴(kuò)增，來合成單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。不對稱PCR的示范實(shí)施方案中，加入含過量的至少一種第一引物或至少一種第二引物、但不是二者都過量的引物組，制備擴(kuò)增反應(yīng)組合物。因此，在某些實(shí)施方案中，過量引物與有限量引物的比例約為100∶1。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道某些實(shí)施方案的最優(yōu)引物量可憑經(jīng)驗(yàn)確定。在某些實(shí)施方案中，有限引物的量范圍約2-50nM，過量引物的量范圍約100-900nM。從經(jīng)驗(yàn)上說，在某些實(shí)施方案中，引物組中的一種引物濃度通常保持在每100微升擴(kuò)增反應(yīng)組合物5pmol以下。
由于在某些實(shí)施方案PCR反應(yīng)開始時(shí)最初存在的二引物都是基本上過量的，故二條鏈呈指數(shù)增長。然而在某些實(shí)施方案中，完成所有輪次的擴(kuò)增前有限引物已耗盡。后來幾輪擴(kuò)增中只擴(kuò)增了一鏈，從而產(chǎn)生了過量的單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。
例如但非限制，在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行約40-50輪擴(kuò)增后，用一步長延伸結(jié)束擴(kuò)增過程。在某些實(shí)施方案中，有限引物通常在第25輪擴(kuò)增時(shí)耗盡。后續(xù)擴(kuò)增輪中因?yàn)橐锝M中只存在一種引物。只產(chǎn)生一條鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記探針是不能在后續(xù)輪次中產(chǎn)生的、設(shè)計(jì)與模板鏈雜交的5’-核酸酶探針，因此后面的每輪將產(chǎn)生額外數(shù)量的信號。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記探針是一種雜交依賴性探針，設(shè)計(jì)與后續(xù)輪次中產(chǎn)生的模板鏈雜交，因此后面的每輪將產(chǎn)生額外數(shù)量的信號。
在某些示范性不對稱重復(fù)擴(kuò)增方案中，將含有雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的空氣干燥的第一擴(kuò)增組合物重懸在30微升0.1×TE緩沖液，pH8.0中。在0.2ml MicroAmp反應(yīng)試管中混合2ml該重懸擴(kuò)增產(chǎn)物與9微升無菌過濾的去離子水、18微升AmpliTaq Goldmix(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)、適當(dāng)量的標(biāo)記探針、和20-40pmol懸浮于1微升1×TE緩沖液中的至少一種第一引物或至少一種第二引物，來制備第二擴(kuò)增反應(yīng)組合物。
加熱該試管至95℃ 12分鐘，然后循環(huán)10輪(94℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 30秒)，然后25輪循環(huán)(89℃ 15秒，53℃ 15秒，72℃ 30秒)，再60℃而三45分鐘。如果在最初擴(kuò)增反應(yīng)前存在相應(yīng)的連接產(chǎn)物，那么在后面的重復(fù)擴(kuò)增過程中設(shè)計(jì)的標(biāo)離探針可檢測到信號變化。
例如，在某些實(shí)施方案中，可從含有5’引物特異性部分、可尋址部分、靶特異性部分的第一探針，和含有靶特異性部分和3’引物特異性部分的第二探針形成連接產(chǎn)物。引物組將包括含有5’引物特異性部分序列的第一引物，和含有與3’引物特異性部分序列相互補(bǔ)的序列的第二引物。標(biāo)記探針將含有與可尋址部分序列相互補(bǔ)的序列，第二引物將包括在過量的第一引物中。
在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)變成單鏈序列。將雙鏈核酸轉(zhuǎn)變成單鏈序列的方法包括但不限于熱變性、化學(xué)變性和外切核酸酶消化。合成單鏈核酸分子、或?qū)㈦p鏈核酸轉(zhuǎn)變成單鏈序列的詳細(xì)方案可在其它地方找到，見Ausbel等，Sambrook等，Novagen StrandaseTMproduct insert(Novaren，Madison，WI)；以及Sambrook和Russell。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通用引物、通用引物組，或二者。在某些實(shí)施方案中，對于任何數(shù)目的擴(kuò)增反應(yīng)和不同的靶序列，可采用一組通用引物組。
在某些實(shí)施方案中，對于一處以上基因座的二種不同等位基因選擇，可采用相同之處的二種不同可尋址部分。在某些這類實(shí)施方案中，可通過采用每個(gè)基因座的不同反應(yīng)組合物來鑒別不同的基因座。
因此在某些這類實(shí)施方案中，如果想測定三個(gè)不同雙等位基因基因座中，等位基因中的一個(gè)核苷酸差異，可采用三種不同的反應(yīng)組合物，其各具有對每個(gè)基因座二種選擇特異性的不同的連接探針組。圖7A-7C描述了某些這類實(shí)施方案，其中對于三個(gè)雙等位基因基因座，采用了三種不同的反應(yīng)組合物。圖7A-7C中，三種不同基因座各有一組不同的探針。各探針組對于每個(gè)基因座的二種不同等位基因，含有二種第一探針。各探針組的每種第一探針含有相同的5’引物特異性部分(P-SP(A))、與給定基因座一部分互補(bǔ)的靶特異性部分，并包括關(guān)鍵互補(bǔ)處中的不同核苷酸(對第一基因座為A或G；對第二基因座為T或G；對第三基因座為G或C)、和對應(yīng)于每個(gè)基因座二種等位基因核苷酸選擇之一的不同可尋址部分(AP1或AP2)。可利用三種不同探針組每一組二種第一探針上的相同可尋址部分(AP1和AP2)。對于每個(gè)不同的基因座，各探針組的每種第二探針含有相同的3’引物特異性部分(P-SP(Z))和不同的靶特異性部分。
在某些實(shí)施方案中，如圖7A-7C所示，對各基因座分別進(jìn)行連接反應(yīng)后，用相同的引物組(PA)和(PZ)，相同的二種標(biāo)記探針LBP-1(其含有與可尋址部分AP1序列相互補(bǔ)(或相同)的序列)和LBP-2(其含有與可尋址部分AP2序列相互補(bǔ)(或相同)的序列)，對每個(gè)基因座分別進(jìn)行三次擴(kuò)增反應(yīng)。另外，二種不同的標(biāo)記探針提供了二種不同的可檢測信號。
因此在此實(shí)施方案中，如果在所有三種反應(yīng)組合物中，擴(kuò)增導(dǎo)致二種標(biāo)記探針(LBP-1和LBP-2)可檢測信號值的域值差異，結(jié)論是所有這三個(gè)基因座的樣品是雜合子。擴(kuò)增反應(yīng)的另一可能結(jié)果如下第一擴(kuò)增組合物導(dǎo)致標(biāo)記探針LBP-1可檢測信號值的域值差異；第二擴(kuò)增反應(yīng)組合物導(dǎo)致標(biāo)記探針LBP-1和LBP-2可檢測信號值的域值差異；第三擴(kuò)增反應(yīng)組合物導(dǎo)致標(biāo)記探針LBP-1可檢測信號值的域值差異。這些結(jié)果的結(jié)論是具有(C)為關(guān)鍵核苷酸的基因座1樣品是純合子；基因座2是雜合子；具有(G)為關(guān)鍵核苷酸的基因座3是純合子。
在某些實(shí)施方案中，可在分別的反應(yīng)組合物中利用不同特異性的探針組，分析許多不同的靶序列。例如，可采用96孔板，用96種不同的連接探針組，對96種不同的靶核酸序列進(jìn)行分析。在某些實(shí)施方案中，可能想利用96種探針組之一，檢測一種靶核酸序列的存在與否(或定量)。在某些實(shí)施方案中，可利用相同的一組二種引物，相同的標(biāo)記探針，在不同的96孔之一中獲得96種不同靶序列的結(jié)果。
在某些實(shí)施方案中，可能想用96種不同的連接探針組，檢測96個(gè)不同基因座中二種不同等位基因的存在與否(或定量)。在某些實(shí)施方案中，各探針組含有二種第一探針和一種第二探針。在某些實(shí)施方案中，各探針組一種第一探針含有與給定基因座部分互補(bǔ)的靶-特異性部分，并在關(guān)鍵互補(bǔ)處中含有一個(gè)不同的核苷酸，和對應(yīng)于各基因座二種等位核苷酸選擇之一的二種不同可尋址部分之一在某些實(shí)施方案中，可96個(gè)探針組之一的二種探針之一的相同的二種可尋址部分。在某些實(shí)施方案中，各探針組的第二探針之一含有對各基因座的不同靶-特異性部分。在某些實(shí)施方案中，96個(gè)探針組之一的二種第一探針也可含有相同的引物特異性部分。在某些實(shí)施方案中，96個(gè)探針組之一的一種第二探針也可含有另一引物特異性部分。
在某些實(shí)施方案中，連接之后，可在96個(gè)不同的孔中，進(jìn)行96種不同的擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，可在96孔所有孔中采用相同的引物組和相同的標(biāo)記探針。一種標(biāo)記探針可含有與二種可尋址部分序列之一相互補(bǔ)(或相同)的序列，另一標(biāo)記探針可含有與該二種可尋址部分另一個(gè)序列相互補(bǔ)(或相同)的序列。可通過測定標(biāo)記探針可檢測信號值的變化，來檢測96孔各孔中存在的等位基因。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，在各種實(shí)施方案中，可設(shè)計(jì)連接探針組在第一探針或第二探針中任何位點(diǎn)含有一關(guān)鍵互補(bǔ)處。此外，在某些實(shí)施方案中，連接探針可含有多個(gè)關(guān)鍵互補(bǔ)處。
在某些實(shí)施方案中，采用的連接探針組含有對某給定基因座的多種第一探針，該給定基因座含有靶特異性部分，這些部分含有不同的關(guān)鍵互補(bǔ)處，每種不同的第一探針對于某給定基因座的靶特異性部分可具有相同的序列，除在關(guān)鍵互補(bǔ)處具有一個(gè)不同的核苷酸之外。在某些實(shí)施方案中，對某給定基因座每種第一探針的靶特異性部分可在關(guān)鍵互補(bǔ)處具有一個(gè)不同的核苷酸，對該關(guān)鍵處可具有不同長度的5’序列。在某些這類實(shí)施方案中，對該關(guān)鍵互補(bǔ)處的靶特異性5’序列可全部與毗鄰該關(guān)鍵性核苷酸的同一基因座核酸序列的一部分相互補(bǔ)，但可有不同的長度。例如，在這類實(shí)施方案中，有二種不同的第一探針，對該關(guān)鍵互補(bǔ)處的靶特異性部分的5’序列可以相同，除它們中的一個(gè)可在靶特異性部分的5’端含有一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸外。
在某些實(shí)施方案中，采用的連接探針組含有對某給定基因座的多種第二探針，該給定基因座含有靶特異性部分，這些部分含有不同的關(guān)鍵互補(bǔ)處，每種不同的第二探針對于某給定基因座的靶特異性部分可具有相同的序列，除在關(guān)鍵互補(bǔ)處具有一個(gè)不同的核苷酸之外。在某些實(shí)施方案中，對某給定基因座每種第二探針的靶特異性部分可在關(guān)鍵互補(bǔ)處具有一個(gè)不同的核苷酸，對該關(guān)鍵處可具有不同長度的3’序列。在某些這類實(shí)施方案中，對該關(guān)鍵互補(bǔ)處的靶特異性3’序列可全部與毗鄰該關(guān)鍵性核苷酸的同一基因座核酸序列的一部分相互補(bǔ)，但可有不同的長度。例如，在這類實(shí)施方案中，有二種不同的第二探針，對該關(guān)鍵互補(bǔ)處的靶特異性部分的3’序列可以相同，除它們中的一個(gè)可在靶特異性部分的3’端含有一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸外。
在某些實(shí)施方案中，用于檢測任何數(shù)目靶序列的連接探針數(shù)，是待測靶序列數(shù)乘以每個(gè)靶待測等位基因數(shù)加一(即靶序列數(shù)×[等位基因數(shù)+1])。因此，檢測三個(gè)雙等位基因序列，例如，要用9種探針(3×[2+1])。在某些實(shí)施方案中，檢測4個(gè)三等位基因序列要用16種探針(4×[3+1])，如此類推。
當(dāng)對個(gè)體的大量多種三等位基因基因座，或多個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因篩查時(shí)，在某些實(shí)施方案中減少引物和標(biāo)記探針的數(shù)量，因而減少費(fèi)用和操作數(shù)量的意義是不難明白的。在某些實(shí)施方案中，為了擴(kuò)增靶序列的連接產(chǎn)物，采用二種引物。一引物與連接產(chǎn)物的3’引物特異性部分序列相互補(bǔ)，一引物含有5’引物特異性部分的序列。利用一些常規(guī)方法，對不同的各連接產(chǎn)物可采用三種不同引物。因此采用一些常規(guī)方法，來擴(kuò)增某個(gè)體可能存在的三種雙等位基因基因座的連接產(chǎn)物，一種方法采用9種引物(3n，n＝3)。
相反，本發(fā)明的某些實(shí)施方案可有效減少這個(gè)數(shù)目至二種擴(kuò)增引物。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可采用少至二種通用引物來擴(kuò)增一種或多種連接或擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)榭稍O(shè)計(jì)探針具有共同的引物特異性部分，而含有不同的可尋址部分。在某些常規(guī)檢測方法中，含有100個(gè)可能的雙等位基因基因座的樣品可能需要200種引物，但在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中可能只要用2種通用引物。
另外，如果要用某些采用標(biāo)記探針的常規(guī)方法，對不同的各基因座的每個(gè)不同的等位基因，可采用不同的標(biāo)記探針。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可采用二種標(biāo)記探針來檢測一個(gè)或多全不同基因座的序列。例如，在某些常規(guī)方法中，可用200種不同的標(biāo)記探針來檢測100個(gè)雙等位基因基因座的200種可能的序列。采用本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可用二種標(biāo)記探針檢測100個(gè)雙等位基因基因座的200種可能的序列。
E.某些示范性應(yīng)用在某些實(shí)施方案中，當(dāng)已知樣品的幾種靶核酸序列的基因表達(dá)水平時(shí)，可編輯該樣品的基因表達(dá)圖并與其它樣品比較。例如但非限制，可獲得同一細(xì)胞群二等份細(xì)胞的樣品，其中一份培養(yǎng)在化學(xué)化合物或藥物中，另一份不。比較培養(yǎng)在區(qū)物中與在藥物中的細(xì)胞的基因表達(dá)圖，可能確定該藥物對特定靶基因表達(dá)的作用。
在某些實(shí)施方案中，可定量測定細(xì)胞中編碼某特定蛋白質(zhì)mRNA的量，以確定個(gè)體的具體病況。例如調(diào)節(jié)血糖水平的胰島素蛋白。個(gè)體產(chǎn)生的胰島素量可確定該個(gè)體是否健康。胰島素缺乏導(dǎo)致糖尿病，一種可致死疾病。糖尿病個(gè)體通常胰島素mRNA水平低下因而產(chǎn)生低水平的胰島素，而健康個(gè)體通常具有高水平的胰島素mRNA產(chǎn)生正常水平的胰島素。
通常由于基因的異常低表達(dá)的另一人類疾病是Tay-Sachs病。患Tay-Sachs病的兒童缺乏鞘脂清除所需的蛋白質(zhì)，或在該蛋白質(zhì)上有缺陷。因此這些兒童具有異常高水平的鞘脂導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病可引起死亡。
在某些實(shí)施方案中，用于鑒定和檢測由于基因過度或低下表達(dá)引起的其它遺傳疾病/病征。此外，可檢測癌癥和其它已知的涉及某些基因過度或低下表達(dá)所致疾病或病征。例如，患前列腺癌的病人通常產(chǎn)生異常高水平的前列腺特異性抗原(PSA)；據(jù)信腫瘤抑制性基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在許多類型癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。
采用核酸技術(shù)在某些實(shí)施方案中減少生物樣品的量，通?？商峁┳銐虻牟牧蟻硗瑫r(shí)檢測許多不同的疾病、病征和易感性。此外，有許多其它情況需要定量測定特定靶核酸的量，在某些情況下是細(xì)胞或器官中的mRNA量，此筆法有時(shí)稱為“基因表達(dá)圖”。當(dāng)知道具本細(xì)胞類型或組織中的特定靶核酸的量時(shí)，在某些病例，可開始編輯該細(xì)胞類型、組織或個(gè)體的基因表達(dá)圖。將個(gè)體的基因表達(dá)圖與已知的表達(dá)圖作比較，在某些病例中?？稍\斷某些疾病或病征?？赏ㄟ^評價(jià)某些病例的基因表達(dá)圖來鑒定將來產(chǎn)生某些疾病或病征的易感性或易患性。其中，基因表達(dá)圖的分析也可在某些病例中用于基因咨詢和預(yù)測。
F.某些示范性試劑盒在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了設(shè)計(jì)用來迅速行使某些方法的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，試劑盒子的作用是，通過裝配用于執(zhí)行該方法二種或多種組分，迅速執(zhí)行該感興趣的方法。在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包含預(yù)先測好單位劑量的組分以眼大程度減少終末用戶測定的需要。在某些實(shí)施方案中，試劑盒子可包含執(zhí)行本發(fā)明一種或多種方法的說明書。在某些實(shí)施方案中，試劑盒的諸組分已優(yōu)化而有利于彼此聯(lián)合操作。
在某些實(shí)施方案中，提供了可檢測樣品中至少一種靶核酸序列的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含各靶序列的連接探針組，該探針組含有(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中該5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中該3’引物特異性部分含有一序列。各組中的探針當(dāng)彼此毗鄰雜交于互補(bǔ)的靶序列上時(shí)適合連接在一起。各探針組的一種探針還含有位于引物特異性部分和靶特異性部分之間的可尋址部分，其中該可尋址部分含有一序列。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含含有可尋址部分序列，或含有與該可尋址部分序列相互補(bǔ)序列的標(biāo)記探針。
在某些實(shí)施方案中，該試劑盒包含的標(biāo)記探針當(dāng)不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)，具有第一可檢測信號值，可至少在擴(kuò)增反應(yīng)期間和之后測定該標(biāo)記探針的第二可檢測信號值。在某些實(shí)施方案中，第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間有域值差異表明存在靶核酸序列，第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間無域值差異表明不存在靶核酸序列。
在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含引物。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含至少一個(gè)引物組，該引物組含有(i)含有至少一種第一探針的5’引物-特異性部分序列的至少一種第一引物，和(ii)含與有至少一種第二探針的3’引物特異性部分序列相互補(bǔ)序列的至少一種第二引物。
在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種其它組分，包括但不限于至少一種聚合酶、至少一種轉(zhuǎn)錄酶、至少一種連接試劑、寡核苷酸三磷酸、核苷酸類似物、反應(yīng)緩沖液、鹽、離子和穩(wěn)定劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種純化連接產(chǎn)物的試劑，包括但不限于至少一種透析膜、層析用化合物、載體和寡核苷酸。
以下實(shí)施方案目的只是描述，不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1下表1屬于整個(gè)以下實(shí)施例1表1試驗(yàn)1的探針組第一探針-CYC(1)5’TTGCCTGCTCGACTTAGATCAAAGGAGACGCGGCTGCTTTCAGCCTCAT3’(SEQ.ID NO1)第一探針-RNA(1)5’TTGCCTGCTCGACTTAGAGGGTCACAGTAGGTGGTGCTTTCAGCCTCAC3’(SEQ ID NO2)第二探針(1)5’P-GGGGATAGTGGCTGCATCACTGGATAGCGACGT3’(SEQ ID NO3)試驗(yàn)2的探針組第一探針-CYC(2)5’TTGCCTGCTCGACTTAGATCAAAGGAGACGCGGCAGTGGTTTTCCAACG3’(SEQ.ID NO4)第一探針-RNA(2)5’TTGCCTGCTCGACTTAGAGGGTCACAGTAGGTGGACAGTGGTTTTCCAACA3’(SEQ ID NO5)第二探針(2)5’P-TGAACACACCGGGTATCACTGGATAGCGACGT3’(SEQ ID NO6)PCR引物正向引物 5’TTGCCTGCTCGACTTAGA3’(SEQ ID NO7)反向引物 5’ACGTCGCTATCCAGTGAT3’(SEQ ID NO8)TaqMan探針序列親環(huán)蛋白 5’CCGCGTCTCCTTTGA3’-MGBNFQ(用VIC標(biāo)記)(SEQ ID NO9)RNA酶P 5’CCACCTACTGTGACCC-MGBNFQ(用FAM標(biāo)記)(SEQ ID NO10)(MGB＝小溝粘合劑，NFQ＝非熒光猝滅劑，二者包括在購自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA的TaqMan探針上)
A.連接探針在這些實(shí)施例中，各靶核酸序列的連接探針組含有設(shè)計(jì)院能與相應(yīng)靶核酸序列毗鄰雜交的第一和第二連接探針。在適當(dāng)條件下這些毗鄰雜交探針連接形成連接產(chǎn)物。
此說明性實(shí)施例采用二種不同的連接探針組來檢測兩個(gè)雙等位基因基因座。測定了三個(gè)不同的基因組DNA樣品。表1顯示所用的二探針組。表1還顯示用于這些樣品的二種Taqman探針。連接探針包括表1斜體字所示的靶特異性部分。如表1粗體字所示，連接探針也包括通用的引物-特異性部分的序列(各探針組中第一探針的5’端18個(gè)核苷酸，和各探針組第二探針3’端的18個(gè)核苷酸)。如表1下劃線字母所示，各連接探針組中前面二種探針也包括相同的二種不同可尋址部分，它們與二種TaqMan探針的不同序列互補(bǔ)。
采用常規(guī)自動化DNA合成化學(xué)方法合成了這些連接探針。
B.示范的連接反應(yīng)(寡核苷酸連接試驗(yàn)“OLA”)在分開的反應(yīng)容器中用表1所示二種不同連接探針組之一進(jìn)行連接反應(yīng)。形成連接反應(yīng)組合物前各組分物質(zhì)的濃度見下表2。
表2
將Taq連接酶用1×OLA緩沖液2組合物物稀釋至2.0單位/μL。Taq連接酶的量足夠形成以下OLA試劑貯存液。按下表3中所示形成OLA試劑的常用工作貯存液。以下諸組分的量根據(jù)一次10μL OLA反應(yīng)的量。根據(jù)所需的OLA反應(yīng)次數(shù)，可制備OLA試劑的具體貯存液量。
表3
對于采用表1二種探針組之一的各反應(yīng)，將表30LA反應(yīng)組合物貯液7μL與給定探針組2.0μ混合，采用表2中的OLA探針組濃度，1.0μL基因組DNA采用表2的基因組DNA濃度。OLA反應(yīng)的最終試驗(yàn)組分濃度見下表4。
表4
對于這些樣品，在三個(gè)不同基因組DNA樣品的不同反應(yīng)物中，加入表1的二種不同探針組之一。因此，有6種不同的反應(yīng)體積，每種有探針組和基因組DNA樣品的不同組合物。三個(gè)基因組DNA樣品獲自Coriell Cell Repositories(Camden，NJ)，例命名如下NA17103，NA17212和NA17247。在連接反應(yīng)組合物中加入各基因組DNA樣品前，用DNA酶消化使基因組DNA片段化。
采用ABI9700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems Foster City，CA)，如下表5所示，使連接反應(yīng)容器經(jīng)歷反應(yīng)條件。反應(yīng)容器保持在冰上直到轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀。當(dāng)熱循環(huán)儀達(dá)到第一保溫溫度90℃時(shí)，將OLA反應(yīng)試管從冰上轉(zhuǎn)移到熱度循環(huán)儀。
表5
C.示范的擴(kuò)增反應(yīng)將表1的正向和反向引物與用VIC和FAM標(biāo)記的二種TaqMan探針相混合，形成10×引物/標(biāo)記探針組合物，它們的最終濃度如下正向引物 9μM反向引物 9μMTaqMan(VIC) 2μMTaqMan(FAM) 2μM每次PCR反應(yīng)容器含有以下成分12.5μL---2×TaqMan通用PCR Mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。PCR Mix包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCI2、尿苷-N-葡萄糖按酶、和AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems Foster City，CA)；2.5μL-上述10×引物/標(biāo)記探針組合物；8μL-水2μL-OLA反應(yīng)體積，上述實(shí)施例18的連接反應(yīng)后。
因此，每次PCR反應(yīng)的總PCR反應(yīng)體積是25μL。每次PCR反應(yīng)體積和反應(yīng)條件見下表6，采用ABI7700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
表6
在試驗(yàn)1中，用FAM標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生的信號表明，對應(yīng)于第一探針-RNA(1)的等位基因，其基因組DNA NA17103是純合子，在關(guān)鍵互補(bǔ)處的核苷酸是“C”。因此，試驗(yàn)1對基因座的分析正確確定了基因組DNA NA17103是純合子，其關(guān)鍵核苷酸是“G”。
在試驗(yàn)1中，用VIC標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生的信號表明，對應(yīng)于第一探針-CYC(1)的等位基因，其基因組DNA NA17212是純合子，在關(guān)鍵互補(bǔ)處的核苷酸是“T”。因此，試驗(yàn)1對基因座的分析正確確定了基因組DNA NA17212是純合子，其關(guān)鍵核苷酸是“A”。
在試驗(yàn)1中，用FAM和VIC標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生的信號表明，對應(yīng)于第一探針-CYC(1)和第一探針-RNA(1)二者的等位基因，其基因組DNA NA17247是雜合子。因此，試驗(yàn)1對基因座的分析正確確定了基因組DNA NA17247是雜合子，其關(guān)鍵核苷酸是“G”和“A”。
在試驗(yàn)2中，用FAM標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生的信號表明，對應(yīng)于第一探針-RNA(2)的等位基因，其基因組DNA NA17103是純合子，在關(guān)鍵互補(bǔ)處的核苷酸是“A”。因此，試驗(yàn)2對基因座的分析正確確定了基因組DNA NA17103是純合子，其關(guān)鍵核苷酸是“T”。
在試驗(yàn)2中，用FAM和VIC標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生的信號表明，對應(yīng)于第一探針-CYC(2)和第一探針-RNA(2)的等位基因，其基因組DNA NA17212是雜合子。因此，試驗(yàn)2對基因座的分析正確確定了基因組DNA NA17212是雜合子，其關(guān)鍵核苷酸是“T”和“C”。
在試驗(yàn)2中，用VIC標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生的信號表明，對應(yīng)于第一探針-CYC(2)的等位基因，其基因組DNA NA17247是純合子，在關(guān)鍵互補(bǔ)處的核苷酸是“G”。因此，試驗(yàn)2對基因座的分析正確確定了基因組DNA NA17247是純合子，其關(guān)鍵核苷酸是“C”。
也進(jìn)行了其它試驗(yàn)采用與試驗(yàn)1和2相同的物質(zhì)濃度和熱循環(huán)條件，但采用了不同的探針組來檢測不同基因座的兩個(gè)等位基因存在與否。這些試驗(yàn)的一些產(chǎn)生了假陰性信號。結(jié)論是這些探針組的第二探針有缺陷，它抑制了相應(yīng)的連接。
雖然參考某些應(yīng)用、方法和組合物對本發(fā)明作了描述，但顯然可不脫離本發(fā)明范圍作出各種變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中至少一種靶核酸序列的方法，其特征在于，所述方法包括形成一種含有樣品和各靶核酸序列連接探針組的連接反應(yīng)組合物，所述探針組包括(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中所述5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中所述3’引物特異性部分含有一序列；其中，各組中的探針當(dāng)在互補(bǔ)靶核酸序列上毗鄰彼此雜交時(shí)適合連接在一起，且各探針組中的一個(gè)探針還含有位于引物特異性部分與靶特異性部分之間的可尋址部分，其中所述可尋址部分含有一序列；使所述連接反應(yīng)組合物通過至少一輪連接以形成測試組合物，其中，毗鄰的雜交互補(bǔ)探針彼此連接以形成一連接產(chǎn)物，其含有5’引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分；形成一擴(kuò)增反應(yīng)組合物，其中含有測試組合物；聚合酶；標(biāo)記的探針，其中所述標(biāo)記的探針當(dāng)其不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)具有可檢測的第一信號值；其中所述標(biāo)記的探針含有可尋址部分的序列或含有與可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列；和至少一個(gè)引物組，所述引物組含有(i)至少一種第一引物，其含有連接產(chǎn)物5’引物特異性部分的序列，和(ii)至少一種第二引物，其含有與該連接產(chǎn)物3’引物特異性部分的序列互補(bǔ)的序列；使所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物經(jīng)歷至少一次擴(kuò)增反應(yīng)；以及檢測擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后至少一種可檢測的第二信號值，其中第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間有閾值差異表明存在靶核酸序列，而其中第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間無閾值差異表明不存在靶核酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述標(biāo)記的探針是5’核酸酶探針。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述5’核酸酶探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)猝滅劑部分。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述至少一個(gè)信號部分含有至少一個(gè)熒光部分。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述5’核酸酶探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)供體部分。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述標(biāo)記探針是雜交依賴性探針。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述雜交依賴性含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)猝滅劑部分。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述至少一個(gè)信號部分包括至少一個(gè)熒光部分。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述雜交依賴性探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)供體部分。
10.一種檢測樣品中至少一種靶核酸序列的方法，其特征在于，所述方法包括形成一種含有樣品和各靶核酸序列連接探針組的連接反應(yīng)組合物，所述探針組包括(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中所述5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中所述3’引物特異性部分含有一序列；其中，各組中的探針當(dāng)在互補(bǔ)靶核酸序列上毗鄰彼此雜交時(shí)適合連接在一起，且各探針組中的一個(gè)探針還含有位于引物特異性部分與靶特異性部分之間的可尋址部分，其中所述可尋址部分含有一序列；使所述連接反應(yīng)組合物通過至少一輪連接以形成測試組合物，其中，毗鄰的雜交互補(bǔ)探針彼此連接以形成一連接產(chǎn)物，其含有5’引物特異性部分、靶特異性部分、可尋址部分和3’引物特異性部分；形成一擴(kuò)增反應(yīng)組合物，其中含有測試組合物；聚合酶；標(biāo)記的探針，其中所述標(biāo)記的探針含有可尋址部分的序列或含有與可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列；和至少一個(gè)引物組，所述引物組含有(i)至少一種第一引物，其含有連接產(chǎn)物5’引物特異性部分的序列，和(ii)至少一種第二引物，其含有與該連接產(chǎn)物3’引物特異性部分的序列互補(bǔ)的序列；使所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物經(jīng)歷至少一次擴(kuò)增反應(yīng)；以及通過監(jiān)測至少一輪擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后的至少一種信號來檢測是否存在靶核酸序列。
11.一種檢測樣品中至少一種靶核酸序列的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含各靶核酸序列的連接探針組，該探針組包含(a)至少一種第一探針，其含有靶特異性部分和5’引物特異性部分，其中所述5’引物特異性部分含有一序列；和(b)至少一種第二探針，其含有靶特異性部分和3’引物特異性部分，其中所述3’引物特異性部分含有一序列，其中所述各組中的探針當(dāng)在互補(bǔ)靶核酸序列上彼此毗鄰雜交時(shí)適合于連接在一起，且各探針組中的一個(gè)探針還含有位于引物特異性部分與靶特異性部分之間的可尋址部分，其中所述該可尋址部分含有一序列；和標(biāo)記的探針，所述標(biāo)記探針含有可尋址部分的序列，或含有與該可尋址部分的序列互補(bǔ)的序列。
12.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述標(biāo)記探針當(dāng)不與互補(bǔ)序列雜交時(shí)具有第一可檢測信號值，以及在擴(kuò)增反應(yīng)期間和之后至少一種可檢測到第二可檢測信號值，其中第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間有域值差異，表明存在靶核酸序列，而第一可檢測信號值與第二可檢測信號值之間無域值差異，表明不存在靶核酸序列。
13.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中，所述標(biāo)記的探針是5’核酸酶探針。
14.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中，所述5’核酸酶探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)猝滅劑部分。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中，所述至少一個(gè)信號部分包括至少一個(gè)熒光部分。
16.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中，所述5’核酸酶探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)供體部分。
17.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中，所述標(biāo)記探針是一種雜交依賴性探針。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述雜交依賴性探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)猝滅劑部分。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中，所述到少一個(gè)信號部分包括至少一個(gè)熒光部分。
20.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述雜交依賴性探針含有至少一個(gè)信號部分和至少一個(gè)供體部分。
21.如權(quán)利要求11所述的試劑盒還包含至少一個(gè)引物組，該引物組貪有(i)至少一種第一引物，其含有至少一種第一探針的5’引物特異性性部分的序列，和(ii)至少一種第二引物，其含有與至少一種第二探針的3’引物特異性部分的序列互補(bǔ)的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用連接和擴(kuò)增技術(shù)檢測靶核酸序列存在與否(或定量靶核酸序列)的方法和試劑盒。本發(fā)明還涉及使用可尋址部分和標(biāo)記探針的方法、試劑和試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK1688718SQ03824619
公開日2005年10月26日 申請日期2003年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月19日
發(fā)明者A·愛丁 申請人:阿普里拉股份有限公司