專(zhuān)利名稱(chēng)：帶隨機(jī)序列的莖環(huán)引物篩選微小rna的表達(dá)差異的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，是一種基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的分子生物學(xué)方法，特別 是涉及熒光定量的聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)。通過(guò)在莖環(huán)引物3’端引入8個(gè)隨機(jī)核苷酸序列 可以一次性逆轉(zhuǎn)錄所有的微小RNA(Hiicr0RNAs)，提高了 microRNAs檢測(cè)的效率。采用通用 引物的設(shè)計(jì)可以避免短片段核苷酸難以檢測(cè)的缺點(diǎn)，達(dá)到對(duì)microRNAs進(jìn)行相對(duì)定量的目 的。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，構(gòu)建簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的microRNAs篩選和microRNAs相對(duì)定量的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
microRNAs是機(jī)體對(duì)mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，成熟的microRNAs具有 這種調(diào)節(jié)功能。microRNAs在細(xì)胞發(fā)育、腫瘤的發(fā)生、疾病進(jìn)展等重要的生理、病理過(guò)程發(fā)揮 了重要的作用。不同個(gè)體中microRNAs表達(dá)譜也不同，表現(xiàn)為個(gè)體差異，可影響藥物治療效 果。microRNAs表達(dá)在個(gè)體的發(fā)育、腫瘤發(fā)生、疾病進(jìn)展等生理、病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作 用。microRNAs的檢測(cè)有可能成為診斷、治療和預(yù)后判斷的靶分子，在腫瘤、老年病、免疫性 疾病等常見(jiàn)疾病的病理過(guò)程和分子機(jī)制中有突出的研究?jī)r(jià)值。組織、細(xì)胞microRNAs的表達(dá)譜和差異表達(dá)檢測(cè)是研究microRNAs的基礎(chǔ)技術(shù)。通 過(guò)對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)顯著的microRNA表達(dá)差異，而分離出發(fā)揮重要作用 的靶microRNAs才能對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后進(jìn)行深入的研究。目前，在胰腺癌的研究中 發(fā)現(xiàn) miR-21、miR-let7e、miR-199a、miR-31、miR-30、miR-96、miR-29b 等與正常胰腺組織表 達(dá)差異顯著，進(jìn)一步的功能研究依賴快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的篩選技術(shù)和定量檢測(cè)技術(shù)。但是成 熟microRNAs僅有21-23個(gè)堿基片段，很難采用常規(guī)的核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行表達(dá)差異分析和定量檢測(cè)。通過(guò)芯片 技術(shù)可以區(qū)分大量的microRNAs表達(dá)差異，但是需要大量的標(biāo)本提取RNA。Q-PCR技術(shù)可以 定量檢測(cè)低拷貝的核酸片段，但是需要合成大量的莖環(huán)引物對(duì)每個(gè)microRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 使其在表達(dá)差異研究上不能最大程度的發(fā)揮效用。目前，還未開(kāi)發(fā)出準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉的microRNAs篩選技術(shù)和定量檢測(cè) 技術(shù)用于各種對(duì)microRNAs的研究。本發(fā)明基于Q-PCR技術(shù)，通過(guò)莖環(huán)引物3’端引入8個(gè) 隨機(jī)核苷酸，可以逆轉(zhuǎn)錄所有的成熟microRNA，并通過(guò)多條通用引物配套進(jìn)行Q-PCR分析， 對(duì)microRNAs進(jìn)行差異表達(dá)的篩選并可進(jìn)行相對(duì)定量的檢測(cè)，解決目前microRNAs分析的 技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有分子診斷技術(shù)中對(duì)microRNAs差異表達(dá)分析耗時(shí)長(zhǎng)、不 能高通量、對(duì)標(biāo)本要求高等缺陷，提供了一種莖環(huán)引物在3’端引入8個(gè)隨機(jī)核苷酸，可以逆 轉(zhuǎn)錄所有的成熟microRNA，并通過(guò)多條通用引物配套進(jìn)行Q-PCR分析，對(duì)microRNAs進(jìn)行 差異表達(dá)的篩選并可進(jìn)行相對(duì)定量的檢測(cè)。提高microRNAs篩選和檢測(cè)技術(shù)的效率和成功率。莖環(huán)引物包括來(lái)源于水稻序列的SEQ ID NO. 1，其3’端含有8個(gè)隨機(jī)核苷酸序列。莖 環(huán)引物內(nèi)包含多個(gè)通用引物位置包括SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種配套此引物進(jìn)行microRNAs篩選和定量檢測(cè)的特 定的逆轉(zhuǎn)錄程序和PCR反應(yīng)程序，達(dá)到快速分析的目的。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)楸戏胖?min， 5°C 5min, 10°C IOmin, 15°C 15min，30°C 30min，95°C 5min。cDNA 擴(kuò)增程序如下95°C預(yù)變性 3min后，進(jìn)行40-50個(gè)循環(huán)的95°C變性5sec，62°C退火延伸35sec (此步驟采集熒光值)；本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種用于microRNAs差異性表達(dá)篩查和microRNAs相 對(duì)定量檢測(cè)的試劑盒。試劑盒包括試劑A :3’端帶8個(gè)隨機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物；試劑B M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；試劑C :5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液；試劑D 通用引物A ；試劑E 通用引物B ；試劑 F 通用引物C ；試劑G =Taq DNA聚合酶；試劑H :2XPCR緩沖液組成。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一套用于對(duì)微小RNA(microRNAs)核苷酸片段進(jìn)行表達(dá)差異分析或進(jìn)行相對(duì)定量 檢測(cè)的引物。一條3’端引入8個(gè)隨機(jī)核苷酸的莖環(huán)引物SEQ ID N0.1針對(duì)所有成熟的 microRNAs，用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。此莖環(huán)引物內(nèi)包含3個(gè)配套的通用引物序列SEQ ID N0. 2、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4，用于定量 PCR 檢測(cè)。一種對(duì)微小RNA(microRNA)差異表達(dá)篩選和進(jìn)行相對(duì)定量的一套試劑盒，由下述 試劑組成試劑Α:5μΜ 3’端帶8個(gè)隨機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物，50μ L ；試劑B :20U/ μ L M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，50 μ L ；試劑C :5Χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，200 μ L含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT。試劑D :2μΜ通用引物A ImL ；試劑E :2μΜ通用引物B ImL ；
試劑F:2yM通用引物C ImL;試劑G :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶；試劑H :2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM R0X、1 XSYBR Green I dye、 2mMdNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)楸戏胖?min，5°C 5min, 10 °C IOmin, 15 °C 15min，30°C 30min, 95°C 5min。cDNA擴(kuò)增程序如下95°C預(yù)變性3min后，進(jìn)行40-50個(gè)循環(huán)的95°C變性5sec， 62°C退火延伸35sec (此步驟采集熒光值)；本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)考慮到microRNA大約有800多種，而且目前通過(guò)Q-PCR篩選microRNAs需要分別 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后才能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，使microRNAs篩選工作耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。通過(guò) 引物3’端引入8個(gè)隨機(jī)核苷酸的莖環(huán)引物可以一次性逆轉(zhuǎn)錄所有成熟的microRNAs，而且 莖環(huán)內(nèi)多個(gè)引物位點(diǎn)可在隨后定量PCR擴(kuò)增中能更好的與對(duì)側(cè)microRNAs特異性引物相匹 配，避免非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。使整個(gè)microRNAs差異表達(dá)的篩選更為簡(jiǎn)單，由于3 個(gè)通用引物的靈活搭配，可以更好的選擇microRNAs特異性引物使檢測(cè)更為特異。通過(guò)優(yōu) 化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，組成檢測(cè)靈敏、方便的試劑盒，為microRNAs研究提供可靠的檢測(cè)技術(shù)。



圖1為miR的篩選效果。圖2為miR-155的檢測(cè)效果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1一種對(duì)microRNAs進(jìn)行表達(dá)差異進(jìn)行篩選的試劑盒，試劑A :5 μ M 3’端帶8個(gè)隨 機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物，50 μ L ；試劑B :20υ/μ L M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，50 μ L ；試劑C :5Χ逆 轉(zhuǎn)錄緩沖液，200 μ L 含 dNTP 濃度為 5mM(包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl 濃度為 250mM,KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM, 50nM DTT ；試劑 D :2 μ M 通用引物 A ImL ；試劑 E :2 μ M通用引物B ImL ；試劑F :2 μ M通用引物C ImL ；試劑G :5U/μ L Taq DNA聚合酶；試 劑H :2XPCR緩沖液組成，包含 600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)，80mM Tris-HCl,80mM KCl，40mM(NH4)2SO4，6mM MgS04。實(shí)施例2一種配套此方法檢測(cè)microRNAs的逆轉(zhuǎn)錄操作程序。20 μ L體系中含 2 μ LmRNA (0. 5pg_l μ g)，3’端帶8個(gè)隨機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物2 μ L (終濃度為500ηΜ)，逆轉(zhuǎn) 錄緩沖液4 μ L(終濃度dNTP為ImM，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為40U，Tris-HCl濃度為50mM， KCl濃度為50mM，MgCl2濃度為4mM)。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)楸戏胖?min，5°C 5min, 10°C IOmin, 15°C 15min,30°C 30min,95°C 5min。逆轉(zhuǎn)錄完成后，試管內(nèi)加入180 μ L水，進(jìn)行10倍的稀 釋。實(shí)施例3 一種配套此方法檢測(cè)microRNAs的Q-PCR的操作程序。在96孔板的篩選程序中， 每孔體系為10 μ L。在10 μ L Q-PCR體系中，首先加入IyL稀釋后的cDNA和IyL microRNA 特異性引物(適應(yīng)于各種microRNAs，終濃度200nM)。其他試劑混合后共同加入，其中通用 引物A 10(^1^(終濃度2001^，根據(jù)情況可選8、0，0-卩0 500 μ L緩沖液(終濃度為300ηΜ R0X,ο. 5 X SYBR Green I dye, ImMdNTPs, 40mM Tris_HCl、40mM KCl, 20mm(NH4)2SO4, 3mm MgSO4)，Taq酶10 μ L (終濃度0. 05U/ μ L)，加入水290 μ L。混勻試劑后，每孔加入8 μ L混 合試劑，蓋上蓋子或貼膜后在ABI 7500上進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)cDNA擴(kuò)增及定量程序如下95°C預(yù) 變性3min后；進(jìn)行40-50個(gè)循環(huán)的95°C變性5sec，62°C退火延伸35sec (此步驟采集熒光 值)。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各PCR管的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)與內(nèi)對(duì)照進(jìn)行比較后得出結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用于微小RNA(Hiicr0RNA)篩選和相對(duì)定量的莖環(huán)引物。其特征是一條3’端帶 8個(gè)隨機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物SEQ ID NO. 1，可用于一次性逆轉(zhuǎn)錄所有microRNAs，通過(guò)熒光 定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Q-PCR)用于microRNA的表達(dá)差異分析和相對(duì)定量，莖環(huán)引物內(nèi)包含多 個(gè)高質(zhì)量的引物位置用于Q-PCR包括SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于微小RNA(microRNA)差異表達(dá)篩選和相對(duì)定量檢測(cè)，對(duì) microRNA進(jìn)行分析的PCR反應(yīng)程序，其特征在于設(shè)定特定的PCR反應(yīng)溫度和時(shí)間，達(dá)到快速 分析和結(jié)果特異的目的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)微小RNA(microRNA)差異表達(dá)篩選和相對(duì)定量的一套試劑 盒，其特征包括1，由下述試劑組成試劑A :5 μ M 3，端帶8個(gè)隨機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物，50 μ L ； 試劑 B :20U/ μ L M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，50 μ L ；試劑C :5Χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，200 μ L含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT。 試劑D :2 μ M通用引物A ImL ； 試劑E :2 μ M通用引物B ImL ； 試劑F :2 μ M通用引物C ImL ； 試劑G :5U/ μ L Taq DNA聚合酶；試劑 H :2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye，2mMdNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO40
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了帶隨機(jī)序列的莖環(huán)引物篩選微小RNA的表達(dá)差異,可用于對(duì)微小RNA(microRNAs)核苷酸片段進(jìn)行表達(dá)差異分析和進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)的一條帶隨機(jī)片段的莖環(huán)引物及多個(gè)配套的通用引物、反應(yīng)程序和試劑盒。試劑盒包括試劑A3’端帶8個(gè)隨機(jī)核酸序列的莖環(huán)引物；試劑BM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；試劑C5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液；試劑D通用引物A；試劑E通用引物B；試劑F通用引物C；試劑GTaq DNA聚合酶；試劑H2×PCR緩沖液組成。本發(fā)明所提供的整套試劑盒可對(duì)組織、細(xì)胞等多種標(biāo)本進(jìn)行microRNAs差異性表達(dá)進(jìn)行分析，同時(shí)也可用于microRNAs的相對(duì)定量分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108403SQ20101058774
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者陳必成 申請(qǐng)人:陳必成