專利名稱：一種檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，具體涉及一種檢測IBV抗體的間接ELISA試劑盒，專用于雞 傳染性支氣管炎病毒抗體的快速檢測。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一種急性高度接觸性傳染病。IBV主要侵害雛雞的呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)及 腎，IBV對不同日齡的雞產生不同程度的危害。IBV往往引起混合感染(如新城疫、慢性呼 吸道病等)，并可繼發(fā)細菌性疾病如大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重對雞群的危害。因 該病引起禽產品質量下降所造成的損失，通常比死亡造成的損失還大，國內養(yǎng)雞業(yè)每年因 該病導致直接經濟損失達數億元人民幣。目前，該病呈世界分布，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大 傳染病之一。目前雞傳染性支氣管炎血清學診斷方法有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、瓊脂擴 散試驗、血凝抑制試驗、熒光抗體技術、中和試驗及膠體金技術等。其中瓊脂擴散試驗敏感 性、穩(wěn)定性差；膠體金技術的敏感度也不高；IBV未經處理前沒有血凝性，而此血凝抑制抗 原的制備工藝復雜；熒光抗體技術和中和試驗操作復雜，費時費力，不易做快速診斷。酶聯 免疫吸附試驗通過包被在微量滴定板上的IBV抗原可被抗體捕捉，加入酶標抗抗體結合 物和底物孵育后，樣品中如有IBV抗原存在，則表現出陽性的光密度。該法快速、易操作，較 容易進行大規(guī)模檢測，非常適用檢測較多數量的樣品。IBV核衣殼蛋白又稱核蛋白(N蛋白)，具有很好的抗原性和免疫原性，在細胞免疫 和體液免疫中起著重要作用。體外表達的N蛋白能引起免疫應答，能使免疫雞增速產生抗 IBV抗體，可誘導雞對IBV氣管感染的免疫保護作用。用N蛋白免疫雞后，可激活T輔助細 胞，同時可增強B淋巴細胞產生抗體的能力。加上N蛋白的具有高保守性，這使得N蛋白及 其抗體在IBV診斷方面顯示出優(yōu)勢。核蛋白占病毒總蛋白量大，而且核蛋白為非糖基化蛋 白，由于它能檢測群抗體應答，可以作為IBV群特異性診斷抗原。

發(fā)明內容
針對上述生產中實際存在的問題，發(fā)明人經過多次實驗，研制了一種檢測IBV抗 體的間接ELISA試劑盒，該試劑盒效價穩(wěn)定，便于存放，可以作為IBV群特異性診斷抗原。本發(fā)明檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒的包被抗原(IBV-N 重組蛋白)的獲得，包括以下步驟1)根據GenBank中已登錄的IBV-N基因序列(SEQ-I)，設計一對特異引物上游引物為5’-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3’ (SEQ-3) (EcoR V 位點)，下游引 物為 5，-CCTCGACACTCAAAGTTCATTCTCTCC-3’ (SEQ-4) (Sal I 位點)擴增片段大小為1230bp。2)通過RT-PCR方法對IBV的N基因進行擴增；以EcoR V和Ml I同時對IBV-N基因RT-PCR產物和pET-3h (+)載體進行酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶將二者進行 連接，16°C過夜，次日將連接產物轉化感受態(tài)細胞BL21，37°C溫箱培養(yǎng)16_20h ；挑取單菌落 擴大培養(yǎng)，提取質粒，用EcoRV、Sal I進行雙酶切鑒定；將陽性重組質粒測序，鑒定正確后 獲得陽性重組表達質粒pET-32a (+)-IBV-N。；3)將陽性重組表達質粒PET-3M⑴-IBV-N及空白載體pET_3h⑴分別轉 化BL21感受態(tài)細胞，于37°C培養(yǎng)，待OD6tltlnm值達到0. 5 0. 6時，加入IPTG至終濃度 為1. Ommol/L進行誘導表達，收集誘導表達后4h的菌體，超聲波破碎，離心后取上清進行 SDS-PAGE電泳和Wfestern blot鑒定；電泳結束后取下凝膠，先用雙蒸水洗滌，然后浸入4°C 預冷的250mmol/L的KCl溶液中顯色5 lOmin，最后用雙蒸水洗滌；將目的蛋白條帶切下， PBS洗滌2次，用研缽將其磨碎，反復凍融3次，8000r/min離心lOmin，吸取上清，SDS-PAGE 電泳進行純度鑒定；經SDS-PAGE驗證純化后的蛋白分裝，放-20°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的技術方案是一種檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑 盒，其特征是，包括上述純化的IBV-N重組蛋白作為抗原包被的ELISA板。本發(fā)明經過優(yōu)化得到ELISA板的最佳制備條件為用pH8. 5的0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液作包被液，將雞傳染性支氣管炎N重組蛋白稀釋為20 μ g/mL,按100 μ L/ 孔加入ELISA反應板中，37 °C封閉池，4°C包被過夜，拍干，用1 %牛血清白蛋白(BSA) 37 °C封 閉2h，以含0. 05%吐溫-20pH7. 4的PBS洗滌，拍干，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保 護池，待其干燥后裝入含干燥劑的包裝袋中4°C保存。本發(fā)明一種檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征是，包 括上述IBV-N重組蛋白作為抗原包被的ELISA板5塊；樣品稀釋液200mL ；10X濃縮洗滌 液400mL (用前1 10稀釋)；酶結合物工作液50mL;顯色液A:50mL;顯色液B:50mL;終 止液:60mL ；陽性對照:2mL ；陰性對照2mL。上述中檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒中，樣品稀釋液為含 0. 05%吐溫-20的0. 05mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；10 X濃縮洗液為含0. 5%吐溫-20 的0. lmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；酶結合物工作液為Sigma公司生產的HRP-兔抗雞 IgG,作1 3000稀釋的稀釋液；顯色液A為0. 2mg/mL的四甲基聯苯胺(TMB)溶液，顯色液 B為含過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2mol/L硫酸溶液；陽性對照為經 雞傳染性支氣管炎重組蛋白免疫獲得的標準陽性血清(OD45tlnm ^ 1. 0)，加入1000U/mL的青 鏈霉素，無菌過濾；陰性對照為經篩選獲得的SPF雞標準陰性血清(OD45tlnm ^ 0. 200)，加入 1000U/mL的青鏈霉素，無菌過濾。本發(fā)明經過優(yōu)化得到最佳檢測方法(即檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接 ELISA試劑盒的最佳使用方法)為將待檢血清用樣品稀釋液作1 200稀釋，按IOOyL/ 孔加入抗體檢測板中，同時設陰性對照、陽性對照，37°C孵育30min ；棄去反應孔中的液體， 每孔加洗滌液300 μ L，洗滌5次，每次間隔lmin，拍干；每孔加100 μ L的酶結合物工作液， 37°C孵育30min ；洗滌5次，每次間隔lmin，拍干；依次加入50 μ L顯色液A和50 μ L顯色液 B，37°C避光孵育15min ；加50 μ L終止液，用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光度A值， 讀值計算并判定結果。判定標準為以待檢樣本OD45tlnm值與標準陰性OD45tlnm值的比值(P/ N)大于或等于2. 1，且待檢樣本OD45tlnm值大于0. 297判為陽性。本發(fā)明具有下列優(yōu)點
1.本發(fā)明選擇原核表達載體pET_32a(+)構建重組表達質粒進行融合表達并純 化，解決了 IBV全病毒純化困難的問題。2.本發(fā)明以基因工程表達的重組N蛋白為基礎制備而成；重組N蛋白為非全病毒 抗原，安全性好，不含無關雜蛋白，只與雞傳染性支氣管炎病毒陽性血清特異結合，不與其 它病毒陽性血清發(fā)生交叉反應。具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性。3.本發(fā)明檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，成本低廉、操作 簡便、快速，尤其適合批量樣品的檢測，大大提高了雞傳染性支氣管炎血清學診斷的效率。


圖1是IBV-N基因的PCR擴增電泳圖片，其中1、3為IBV的N基因PCR電泳圖片， 2 為 DNAMarker DL2000。圖2是IBV-N基因插入到pET_32a(+)載體得到的陽性重組質粒 pET-32a(+)-IBV-N的酶切鑒定圖片，其中1、3為質粒pET_32a(+)-IBV-N的酶切鑒定圖片， 2 為 DNAMarkerDL2000，4 為 DNAMarker DL15000。圖3是誘導表達蛋白的SDS-PAGE分析圖片，其中1為空載體誘導對照，2 6 為重組菌PET-3h (+) -IBV-N-BL21誘導4h的蛋白圖片，7為蛋白Marker，8為重組菌 PET-32a(+)-IBV-N-BL21 誘導 3h 的蛋白圖片，9 為重組菌 PET_32a (+)-IBV-N-BL21 誘導 2h 的蛋白圖片。圖4是誘導表達蛋白的純化SDS-PAGE圖片，圖片1為蛋白Marker，2 5為重組 菌PET-32a(+)-IBV-N-BL21誘導4h的蛋白純化圖片。圖5是pET-32a(+)-IBV_N表達產物的flfestern-blot分析圖片，其中1為誘導表 達蛋白，2為預染蛋白Marker，3為空載體誘導對照。
具體實施例方式1. IBV-N基因的擴增與表達載體的構建根據GenBank中已登錄的IBV-N基因序列(SEQ-I)，設計一對引物上游引物 5，-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3，(SEQ-3) (EcoR V 位點)，；下游引物5，-CCGTCGACAC TCAAAGTTCATTCTCTCC-3，(SEQ-4) (Sal I 位點)。以 IBV RNA 為模板 RT-PCR 擴增目的基因 N(如圖1所示)，用Trizol RNA提取試劑提取核酸，RNA11. 5μ L5 X RT Buffer (含 Mg2+)4. 0 μ LIOmM dNTP2. 0 μ LRNasin0. 5 μ L下游引物l.OyL將上述反應混合物于臺式離心機上稍作離心，然后在PCR儀上70°C IOmin后加入 反轉錄酶M-MLV 1.(^1^總體系為2(^0，后421301^11，94151^11后結束反應。以反轉 錄產物為模板，繼續(xù)進行PCR以擴增全序列目的片段PCR反應體系如下雙蒸水39. 5 μ L
在 PCR 儀上設置 94°C 3min，經 94°C 40s,50°C 60s, 72°C 2min，共 30 個循環(huán)，最后
于72°C延伸lOmin，結束反應。取5yL PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結 果，將大小為1230bp的目的基因回收。以EcoR V和Ml I同時對PCR擴增的N蛋白的目 的基因和pET-32a(+)載體進行酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶將二者進行連接，16°C 過夜，次日將連接產物轉化感受態(tài)細胞BL21，37°C溫箱培養(yǎng)16-20h。挑取單菌落擴大培養(yǎng)， 提取質粒，用EcoR V, Sal I進行雙酶切鑒定。將陽性重組質粒測序，鑒定正確后獲得陽性 重組表達質粒pET-3h (+) -IBV-N。(如圖2所示)。2.重組表達質粒的誘導表達將陽性重組表達質粒pET_3h (+) -IBV-N及空白載體pET_3h (+)分別轉化BL21 感受態(tài)細胞。陽性質粒菌于37°C培養(yǎng)，待OD6tltlnm值達到0. 5 0. 6時，加入IPTG至終濃度 為l.Ommol/L，進行誘導表達。收集不同誘導時間表達的菌體，超聲波破碎，離心后分別取 上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，并對表達產物進行ffestern-blot分析，一抗用雞抗IBV陽 性血清，二抗用辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗雞IgG，DAB顯色。結果表明重組蛋白以 可溶性蛋白形式存在于菌體裂解液上清中，分子量約為65. 5ku，與預期結果相符，以誘導后 4h表達量最大(如圖3所示)。Western-blot分析發(fā)現，表達的重組蛋白能夠與雞傳染性 支氣管炎陽性血清進行反應，具有良好的免疫學活性(如圖5所示)。3.重組蛋白的純化選用KCl顯色法將破碎好的重組菌進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后取下凝膠，先 用雙蒸水洗滌，然后浸入4°C預冷的250mmol/L的KCl溶液中顯色5 lOmin，最后用雙蒸 水洗滌。將目的蛋白條帶切下，PBS洗滌2次，用研缽將其研細，反復凍融3次，8000r/min 離心lOmin，吸取上清，SDS-PAGE電泳進行純度鑒定。結果只有一條65. 5ku的目的蛋白條 帶，表明KCl顯色法獲得了較純的目的蛋白(如圖4所示)。4.樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配制樣品稀釋液為含0. 05%吐溫-20的0. 05mol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液(KH2PO4O. 2g， Na2HPO4 · Iffl2O 2. 9g，NaCl 8g，定容至 lOOOmL，再加 0. 5mL 吐溫-20) ；10X 濃縮洗滌液為 含 0. 5% 吐溫-20 的 0. lmol/L ρΗ7· 4 磷酸鹽緩沖液(KH2P042g，NaH2PO4 · 12H20 29g, NaCl 80g，定容至lOOOmL，再加5mL吐溫-20)；終止液為2mol/L硫酸溶液(取111. 2mL濃硫酸即 18mol/L，稀釋定容至 IOOOmL)。5.陽性對照和陰性對照的制備將用雞傳染性支氣管炎IBV-N重組蛋白免疫獲得的標準陽性血清(OD45tlnm彡1. 0)， 加入1000U/mL的青鏈霉素，無菌過濾，作為雞傳染性支氣管抗體間接ELISA檢測試劑中的 陽性對照；將篩選獲得的SPF雞標準陰性血清(OD45tlnm彡0. 200)，加入1000U/mL的青鏈霉 素，無菌過濾，作為雞傳染性支氣管炎抗體間接ELISA檢測試劑中的陰性對照。6.顯色液的配制
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顯色液A:稱取200mg四甲基聯苯胺(TMB)，用IOOmL無水乙醇或DMSO溶解后， 以雙蒸水定容至IOOOmL ；顯色液B 稱取21g檸檬酸(C6H8O7 · H2O)，28. 2g無水磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)，6. 4mL 0. 75%過氧化氫尿素，雙蒸水定容至IOOOmL,調pH值4. 5 5. 0。7.檢測雞傳染性支氣管炎抗體的間接ELISA反應條件的確定抗原和血清最佳工作濃度的確定采用方陣試驗確定。用包被緩沖液將N重組 蛋白稀釋成每孔 8 μ g/100 μ L，4 μ g/100 μ L，2 μ g/100 μ L，1 μ g/100 μ L，0. 5 μ g/100 μ L， 0. 25 μ g/100 μ L包被ELISA反應板，IBV陽性血清和陰性血清經大腸桿菌裂解液處理后分 別作 1 25，1 50，1 100，1 200，1 400，1 800 系列稀釋；進行間接 ELISA 測定。 TMB底物顯色，硫酸終止反應；測定光波長450nm的OD值。取陽性血清OD45tlnm在1. 0左右， 陰性血清OD45tlnm在0. 297左右，且陽性血清OD45tlnm/陰性血清OD45tlnm即P/N值大于2. 1的抗 原濃度和血清稀釋度為最佳工作濃度，結果如表1所示。從表1可以看出抗原最佳濃度為 20口8/1^，血清最佳稀釋濃度為1 200。表1抗原和血清最佳工作濃度的確定(OD45tlnm值)Tab IELISA for detecting the optimum work concentration of antigens and sera
權利要求
1.IBV-N重組蛋白，其特征是，通過以下制備方法獲得1)根據GenBank中已登錄的IBV-N基因序列，設計一對特異引物上游引物為 5’ -CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3，，下游引物為 5’ -CCGTCGACACTCAAAGTTCATTCTCTCC-3’擴增片段大小為1230bp ；2)通過RT-PCR方法對IBV的N基因進行擴增；以EcoRV和Ml I同時對IBV-N基因 RT-PCR產物和pET-32a(+)載體進行酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶將二者進行連接， 16°C過夜，次日將連接產物轉化感受態(tài)細胞BL21，37°C溫箱培養(yǎng)16_20h ；挑取單菌落擴大 培養(yǎng)，提取質粒，用EcoRV、Sal I進行雙酶切鑒定；將陽性重組質粒測序，鑒定正確后獲得 陽性重組表達質粒pET-32a(+)-IBV-N ；3)將陽性重組表達質粒pET-32a(+)-IBV-N及空白載體pET-32a(+)分別轉化BL21感 受態(tài)細胞，于37°C培養(yǎng)，待OD6tltlnm值達到0. 5 0. 6時，加入IPTG至終濃度為1. Ommol/L進 行誘導表達，收集誘導表達后4h的菌體，超聲波破碎，離心后取上清進行SDS-PAGE電泳和 Western blot鑒定；電泳結束后取下凝膠，先用雙蒸水洗滌，然后浸入4°C預冷的250mmol/ L的KCl溶液中顯色5 lOmin，最后用雙蒸水洗滌；將目的蛋白條帶切下，PBS洗滌2次， 用研缽將其磨碎，反復凍融3次，8000r/min離心lOmin，吸取上清，SDS-PAGE電泳進行純度 鑒定。
2.一種檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征是，包括權利要 求1所述的IBV-N重組蛋白作為抗原包被的ELISA板。
3.如權利要求2所述的檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征 是，所述ELISA板的制備為用ρΗ8· 5的0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液作包被液，將雞傳染 性支氣管炎N重組蛋白稀釋為20 μ g/mL,按100 μ L/孔加入ELISA反應板中，37°C封閉2h， 4°C包被過夜，拍干，用牛血清白蛋白37°C封閉2h，以含0. 05%吐溫-20pH7. 4的PBS洗 滌，拍干，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護池。
4.如權利要求2或3所述的檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒， 其特征是，還包括樣品稀釋液、10X濃縮洗滌液、酶結合物工作液、顯色液A、顯色液B、終止 液、陽性對照和陰性對照。
5.如權利要求4所述的檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征 是，所述樣品稀釋液為含0. 05%吐溫-20的0. 05mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述10X 濃縮洗液為含0. 5%吐溫-20的0. lmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述酶結合物工作液為 Sigma公司生產的HRP-兔抗雞IgG，作1 3000稀釋的稀釋液；所述顯色液A為0. 2mg/L 的四甲基聯苯胺溶液，顯色液B為含過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；所述終止液 為2mol/L硫酸溶液；所述陽性對照為經雞傳染性支氣管炎重組蛋白免疫獲得的標準陽性 血清，其OD45tlnm ^ 1. 0，然后加入1000U/mL的青鏈霉素，經無菌過濾后獲得；陰性對照為經 篩選獲得的SPF雞標準陰性血清，其OD45tlnm ( 0. 200，加入1000U/mL的青鏈霉素，經無菌過 濾后獲得。
6.如權利要求5所述的檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特 征是，所述試劑盒包括以下組分=IBV-N重組蛋白作為抗原包被的ELISA板5塊；樣品稀 釋液200mL ；10X濃縮洗滌液400mL ；酶結合物工作液50mL ；顯色液A :50mL ；顯色液B 50mL ；終止液:60mL ；陽性對照2mL ；陰性對照2mL。
7.如權利要求5或6所述的檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒的 使用方法，其特征是，將待檢血清用樣品稀釋液作1 200稀釋，按100 μ L/孔加入抗體 檢測板中，同時設陰性對照、陽性對照，37°C孵育30min ；棄去反應孔中的液體，每孔加洗滌 液300 μ L，洗滌5次，每次間隔lmin，拍干；每孔加100 μ L的酶結合物工作液，37°C孵育 30min ；洗滌5次，每次間隔lmin，拍干；依次加入50 μ L顯色液A和50 μ L顯色液B，37°C避 光孵育15min ；加50 μ L終止液，用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光度A值；以待檢樣 本0D450nm值與標準陰性0D450nm值的比值大于或等于2. 1，且待檢樣本0D450nm值大于 0. 297判為陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒。該試劑盒含有IBV-N重組蛋白作為抗原包被的ELISA板。IBV-N重組蛋白通過以下方法獲得根據IBV-N基因序列，設計一對特異引物，然后通過RT-PCR方法對IBV的N基因進行擴增，將N基因定向插入到pET-32a(+)表達載體，篩選獲得陽性重組表達質粒pET-32a(+)-IBV-N，并將該質粒轉化置BL21感受態(tài)細胞，再經ITPG誘導表達，獲得IBV-N重組蛋白。該試劑盒成本低廉、操作簡便、快速，尤其適合批量樣品的檢測，大大提高了雞傳染性支氣管炎血清學診斷的效率。
文檔編號C12N15/09GK102093999SQ20101058721
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權日2010年12月14日
發(fā)明者亓麗紅, 劉濤, 宋敏訓, 王莉莉, 秦卓明, 艾武, 黃兵 申請人:山東省農業(yè)科學院家禽研究所