檢測(cè)雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的基因芯片以及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的基因芯片和試劑盒。本發(fā)明基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO：1～2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段，和/或SEQ ID NO：3～4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段。本發(fā)明試劑盒包括前述基因芯片與雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒基因的試劑。本發(fā)明基因芯片和檢測(cè)試劑盒可以準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，檢測(cè)快速，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】檢測(cè)雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的基因芯片以 及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的基因芯片以及試劑 盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國養(yǎng)禽業(yè)集約化程度的不斷提高，各類疾病的發(fā)生也呈逐年上升的趨勢(shì)。 我國禽病防治的總體水平不高，禽病的發(fā)生和危害仍然十分嚴(yán)重，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前危害 我國養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)的疾病達(dá)80余種，其中傳染病約占禽病總數(shù)的75%，危害嚴(yán)重。同時(shí)禽病 的發(fā)生也出現(xiàn)新的特點(diǎn)，如新的傳染病不斷出現(xiàn)；新發(fā)生禽病的種類增多；傳染病發(fā)病的 非典型化和病原出現(xiàn)新的變化；混合感染和復(fù)合癥使疾病更為復(fù)雜等。
[0003] 雞新城疫、雞傳染性支氣管炎這2種病在我國和許多國家地區(qū)廣泛流行，受病毒 侵襲的雞群會(huì)引起大批死亡，耐過的生長發(fā)育緩慢，淘汰率增高，并干擾其它疫苗的免疫 力，使雞易繼發(fā)感染其它疾病，而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。這3種病的共同特征都能引起呼 吸道癥狀，而且癥狀十分相似，在臨床診斷中很難準(zhǔn)確判斷，也極易與其它呼吸道病如禽流 感、慢性呼吸道病等相混淆?，F(xiàn)有的禽病檢測(cè)或監(jiān)測(cè)技術(shù)均存在不可克服的局限，如對(duì)疫病 的混合感染、隱性感染及疫苗毒和野毒的區(qū)分等，在檢測(cè)時(shí)均存在一定的困難。同時(shí)對(duì)于多 種疫病的混合感染需要同一種方法或不同方法多次進(jìn)行檢測(cè)，因此有必要加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物疫病 檢測(cè)或監(jiān)測(cè)新型技術(shù)的研究。
[0004] 目前，對(duì)這2種病的診斷一般采用病原分離鑒定和常規(guī)的血清學(xué)方法，但這些方 法存在操作繁雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性較差等不足。特別是當(dāng)雞群存在雞新城疫、雞傳染性支 氣管炎等多種病毒感染時(shí)，難以應(yīng)用這些傳統(tǒng)方法進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒別診斷，在一定程度 上影響了對(duì)這些疫病的有效防制。最近國內(nèi)外均建立了 PCR/RT-PCR檢測(cè)方法，以及多重 PCR檢測(cè)方法，但是還不能滿足更加快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)多種病原混合感染的要求。
[0005] 分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，特別是基因芯片有高通量、多樣性、微型化和自動(dòng) 化的特點(diǎn)，這些特性使它上面的信息能快速準(zhǔn)確地被讀出，對(duì)樣品的量要求很少，節(jié)約試劑 和成本，處理速度大大加快，在對(duì)各種病原體的檢測(cè)中，病原體基因的檢測(cè)和分析是最可信 的，而基因芯片技術(shù)能對(duì)各種病原體的RNA進(jìn)行定性和定量的分析，從而幫助臨床醫(yī)生對(duì) 感染的種類和感染的程度進(jìn)行分析。
[0006] 曹三杰，"雞新城疫、雞傳染性支氣管炎基因芯片的構(gòu)建及其檢測(cè)技術(shù)研究"，四川 農(nóng)業(yè)大學(xué)2004年博士論文公開了一種同時(shí)檢測(cè)雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的 基因芯片，其對(duì)雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的最低檢測(cè)濃度分別為0. 44ng/μ L 和0.87ι^/μ?，靈敏度低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異強(qiáng)、靈敏度高可檢測(cè)檢測(cè)雞新城疫病 毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的新的基因芯片和試劑盒。
[0008] 本發(fā)明檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的基因芯片，它包括固相 載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :1?2所示任意一個(gè)或者兩 個(gè)基因片段，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段。
[0009] 基因芯片，又叫DNA微陣列，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、 genomic DNA、多肽、抗體、抗原等）固著于娃片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜 等固相遞質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0010] 優(yōu)選地，它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID NO: 13所示的基因片段。
[0011] 本發(fā)明檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒，它包括前述的 基因芯片與擴(kuò)增雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒基因的試劑，其中，擴(kuò)增雞新 城疫病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物對(duì)；擴(kuò)增雞 傳染性支氣管炎病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO : 11?12所示 引物對(duì)。
[0012] 所述試劑盒還包括SEQ ID NO : 14?15所示引物對(duì)。
[0013] 所述引物對(duì)中，SEQ ID NO :5所示上游引物與SEQ ID NO :6所示下游引物的摩爾 比為1:10;SEQ ID N0:7、9、ll所示上游引物與SEQ ID N0:8、10、12所示下游引物的摩爾 比為1 :20。
[0014] 所述上游引物標(biāo)記有熒光染料。
[0015] 所述試劑盒還包含有膠體金。
[0016] 膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用 下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的 疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。
[0017] 本發(fā)明膠體金按照下述方法制備：取200mL滅菌超純水和2mLl % HAuC14混于 500ml大燒杯中，而后量取20mL分裝于編號(hào)1-10的10個(gè)50mL小燒杯中，使用加熱磁力 攪拌器將分裝的膠體金溶液依次加熱5min，快速加入1 %檸檬酸三鈉溶液，加入量分別為 0. ImT,, 0. 2mL, 0. 24mL, 0. 28mL, 0. 32mL, 0. 36mL, 0. 4mL, 0. 6mL, I. OmT,, I. 2mL。顏色由淺黃迅 速變?yōu)楹谏僮優(yōu)榧t色時(shí)，再持續(xù)攪拌IOmin停止，等溶液冷卻至室溫，用硝酸纖維薄膜過 濾，即可得到所需膠體金。
[0018] 本發(fā)明還提供SEQ ID NO :1或2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段，和/或SEQ ID NO :3或4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段在制備檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣 管炎病毒的基因芯片中的用途。
[0019] 優(yōu)選地，所述基因芯片還包括定位探針，定位探針是SEQ ID NO: 13所示的基因片 段。
[0020] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物對(duì)，與SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO :11?12所示引物對(duì)在制備同時(shí)擴(kuò)增雞傳染性支氣管炎 病毒和雞新城疫病毒的試劑中的用途。
[0021] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :1?2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段以及SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物對(duì)，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一個(gè)或 者兩個(gè)基因片段以及SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO :11?12所示引物對(duì)在制備檢 測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒中的用途；其中，引物對(duì)為擴(kuò)增試 齊[J ;SEQ ID NO :1?4為檢測(cè)探針。
[0022] 所述引物對(duì)中，SEQ ID NO :5所示上游引物與SEQ ID NO :6所示下游引物的摩爾 比為1:10;SEQ ID N0:7、9、ll所示上游引物與SEQ ID N0:8、10、12所示下游引物的摩爾 比為1 :20。
[0023] 本發(fā)明基因芯片可以有效檢測(cè)雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒，特異性 強(qiáng)，靈敏度高，兩種病毒樣品的最低檢測(cè)濃度為I. 8X IO4拷貝/ μ L(0. 2pg/μ L)，耗時(shí)短，檢 測(cè)快速，具有良好的應(yīng)用前景。
[0024] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1基因芯片的矩陣排列情況；
[0026] 圖2膠體金的影響結(jié)果；
[0027] 圖3特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0028] 圖4靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0029] 圖5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0031] 菌株：NDV LaSota株、IBV Η120株均購自中國獸藥監(jiān)察所，由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0032] 主要試劑與培養(yǎng)基：〇mega質(zhì)粒提取試劑盒，購于Omega生物技術(shù)公司；2XTaq PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒、天根DNA提取試劑盒和IOObp DNA Ladder ;Amp :取IgAmp溶解于IOmL滅菌超純水中濃度為lOOmg/mL ;液體LB培養(yǎng)基：胰 蛋白胨2. 0g，氯化鈉2. 0g，酵母浸出物l.Og，完全溶于180. OmL超純水后，用NaOH調(diào)節(jié) pH = 7. 2,定容到 200mL，高壓滅菌 30min，冷至 55°C 左右，IOOmLLB 加 IOOul 的 Amp，4°C 保存；固體LB培養(yǎng)基：向IOOmL的LB加 I. 5g的瓊脂粉，高壓滅菌后冷至55°C左右，加入 IOOuL 的 lOOmg/mL Amp，倒入平板中，4°C保存?zhèn)溆茫?0 XTAE :0. 5mol/L EDTA50. OmL，冰醋 酸28. 55mL，Tris 121. 0g，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH = 8. 0,定容到500mL。氨基基片：Biiicvu氨 基載玻片，點(diǎn)樣緩沖液：Baio?點(diǎn)樣緩沖液，均購自上海百傲生物工程有限公司。Cy3-dCTP 購于美國Amersham公司；IOOXDenhardt :牛血清白蛋白0. 2g，聚乙烯峨咯燒酮0. 2g，聚鹿 糖0. 2g，加到CldH2O IOmL中完全溶解；20 XSSC :檸檬酸鈉8. 82g，氯化鈉17. 53g，超純水 80.011^，恥0!1調(diào)？!1 = 7.0，定容到100.011^，41：保存；洗液1:2\550/0.1%505，洗液2 : 0· 2X SSC/0. 1 % SDS，洗液 3 :0· 16X SSC/0. 1 % SDS，洗液 4 :ddH20
[0033] 主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)，SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電子天平， Sartorius BP 310S;恒溫?fù)u床，Thermo Forma，美國產(chǎn)；梯度 PCR 儀，PX2，Thermo hybaid， 美國產(chǎn)；超純水儀，Milli Qplus，法國產(chǎn)；電泳儀，POWER Pac300，Bi〇-RAD，意大利產(chǎn)；凝膠 電泳成像系統(tǒng)，Bio-RAD，意大利產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)3K18型，Sigma，德國產(chǎn)；核酸蛋白檢測(cè) 儀，SmartSpaee TM 3010, Bio-RAD，意大利產(chǎn)；分子雜交儀，Thermo hybaid，美國產(chǎn)；晶芯? SmartArrayer 16基因芯片點(diǎn)樣儀，Capitalbio Corporation,北京博奧生物公司；真空抽 干機(jī)，SinBo,香港產(chǎn)；基因芯片雜交盒，北京博奧生物公司；晶芯? LuxScan IOK基因芯片 掃描儀，Capitalbio Corporation,北京博奧生物公司。
[0034] 實(shí)施例1本發(fā)明基因芯片的制備
[0035] 1、菌株
[0036] NDV LaSota 株、IBV Hl20 株。
[0037] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0038] 2. IPCR引物、檢測(cè)探針的制備
[0039] (1)設(shè)計(jì)病原特異性探針：通過對(duì)GenBnak中收錄的雞新城疫病毒、雞傳染性支氣 管炎病毒的核酸序列的比對(duì)分析，選定保守區(qū)域序列：NDV-F/HN、IBV-IBM/IBN。針對(duì)保守序 列設(shè)計(jì)檢測(cè)多對(duì)探針，從中挑選出特異性強(qiáng)的探針序列。
[0040] (2)設(shè)計(jì)探針序列的特異性引物：針對(duì)上述保守探針序列，利用生物信息學(xué)軟件 DNAman、Primer5. 0等設(shè)計(jì)特異性引物。特異性引物由上海生物工程公司合成。
[0041] (3)探針制備：用小量病毒/液體樣品DNA/RNA抽提試劑盒提取雞新城疫病毒、雞 傳染性支氣管炎病毒，利用上述特異性引物對(duì)兩種病原核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化濃度測(cè)定。
[0042] 反轉(zhuǎn)錄體系及條件（參照PrimeScript RT reagent Kit的方法）
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的基因芯片，其特征在于：它 包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :1?2所示任意一 個(gè)或者兩個(gè)基因片段，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID NO :13所示的基因片段。
3. -種檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒，其特征在于：它包 括權(quán)利要求1或2所述的基因芯片與雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒基因的試劑， 其中，擴(kuò)增雞新城疫病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示 引物對(duì)；擴(kuò)增雞傳染性支氣管炎病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO: 11?12所示引物對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：它還包括SEQ ID NO : 14?15所示引 物對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：它還包括膠體金。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述引物對(duì)中，SEQ ID NO :5所示上游 引物與SEQ ID NO :6所示下游引物的摩爾比為1 :10 ;SEQ ID NO :7、9、11所示上游引物與 SEQ ID NO :8、10、12所示下游引物的摩爾比為1 :20。 7. SEQ ID N0:1或2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段，和/或SEQ ID N0:3或4所示 任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段在制備檢測(cè)雞新城疫病毒和/或雞傳染性支氣管炎病毒的基 因芯片中的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因芯片還包括定位探針，定位探針 是SEQ ID N0:13所示的基因片段。 9. SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物對(duì)，與SEQ ID NO :9?10和/ 或SEQ ID NO :11?12所示引物對(duì)在制備同時(shí)擴(kuò)增雞新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒 的試劑中的用途。 10. SEQ ID NO :1?2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段以及SEQ ID NO :5?6和/或 SEQ ID NO :7?8所示引物對(duì)，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段以 及SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO : 11?12所示引物對(duì)在制備檢測(cè)雞新城疫病毒和 /或雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒中的用途；其中，引物對(duì)為擴(kuò)增試劑；SEQ ID NO :1?4 為檢測(cè)探針。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK104293982SQ201410515912
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】文心田, 曹三杰, 黃小波, 趙松, 文翼平, 伍銳, 鄧靜, 尹人杰, 張仙, 常曉霞 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)