一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，包括：（1）miRNA檢測引物的設計：莖環(huán)引物包括兩部分，通用的莖環(huán)序列和與靶標miRNA3’端互補配對的特異引物序列，其中與靶標miRNA互補配對的堿基數(shù)為11bp；qPCR的下游引物針對通用的莖環(huán)序列，上游引物針對靶標miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火溫度相近；（2）將靶標miRNA反轉錄成cDNA；（3）定量PCR擴增并采用SYBR?Green?qPCR檢測法進行檢測。本發(fā)明的方法特異性好、靈敏性高，且只需合成一種下游引物，采用SYBR?Green?I熒光染料法，大大節(jié)約了成本。
【專利說明】—種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于miRNA的檢測方法領域，特別涉及一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法。
【背景技術】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是一類由大約22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，主要通過信使RNA的直接剪切或間接抑制翻譯在轉錄后水平調(diào)控靶基因的表達。MiCT0RNAs在個體發(fā)育的不同時期如細胞分化、增殖、凋亡等及不同組織中有不同的表達模式，表明其在發(fā)育和分化中起著重要的調(diào)控作用。
[0003]傳統(tǒng)的miRNA 檢測技術如 northern hybridization, microarray,對低豐度的miRNA 的擴增敏感性差。qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)法是檢測基因表達量最靈敏、可靠的方法，但常規(guī)的qRT-PCR技術難以檢測約22bp的miRNAs，為克服這個問題，開發(fā)了莖環(huán)引物逆轉錄法、poly-Α加尾法等。通過延長逆轉錄產(chǎn)物的長度，便于qPCR引物設計，以利于PCR產(chǎn)物擴增。
[0004]Chen等開發(fā)的Taqman探針qRT-PCR檢測法，采用基因特異的莖環(huán)引物，增強了RNA-DNA雜化雙鏈的熱穩(wěn)定性，及莖環(huán)引物所產(chǎn)生的空間約束，使逆轉錄具有較高的靈敏性和特異性。但此方法成本 較高，且Taqman探針只結合到逆轉錄產(chǎn)物的部分cDNA序列無法完全保證其特異性，亦無法通過融解曲線分析PCR反應的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，該方法特異性好、靈敏性高，且只需合成一種下游引物，采用SYBR Green I熒光染料法，大大節(jié)約了技術成本。
[0006]本發(fā)明的一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，包括:
[0007](I) miRNA檢測弓丨物的設計:
[0008]莖環(huán)引物包括兩部分，通用的莖環(huán)序列和與靶標miRNA3’端互補配對的特異引物序列，其中與靶標miRNA互補配對的堿基數(shù)為Ilbp ；
[0009]qPCR的下游引物針對通用的莖環(huán)序列，上游引物針對靶標miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火溫度相近；
[0010](2)采用步驟(1)設計的miRNA檢測引物將祀標miRNA反轉錄成cDNA ；
[0011](3)定量PCR擴增并采用SYBR Green qPCR檢測法進行檢測。
[0012]步驟(1)中所述的靶標miRNA 為 miR-SOS-SP-RT^miR-SOS-SP-RT2 或 miR-16-RT。
[0013]所述的miR-SOS-SP-RT1對應的miRNA檢測引物為:
[0014]PCR-F1: GCGAGCACCGTCAACACTTG; PCR-R1: TGGTGTCGTGGAGTCGGC.[0015]所述的miR-505-3P-RT2對應的miRNA檢測引物為:
[0016]PCR-F2: GCGAGCACCGTCAACACT, PCR-R2: TGGTGTCGTGGAGTCGGC.[0017]所述的miR-16-RT對應的miRNA檢測引物為:
[0018]PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT.[0019]步驟(3)中所述的PCR擴增中PCR反應終體系20yL包括:10yL2XSYBR GreenPCR master mix,0.4μ L ROX, 2.5 μ L cDNA 模板，3yL PCR 上下游引物 2 μ Μ, 4.1yL水，同時設陰性對照；PCR循環(huán)條件為95°C預變性2min，95°C變性15s，62°C延伸32s，共40個循環(huán)。
[0020]本發(fā)明基于莖環(huán)引物逆轉錄和SYBR Green qPCR檢測法，將Taqman探針改為SYBRGreen熒光染料(百泰克)，并通過優(yōu)化逆轉錄莖環(huán)引物的長度，建立改進的莖環(huán)引物RT-PCR實時定量檢測方法。
[0021]本發(fā)明的莖環(huán)引物在靶標miRNA存在的條件下，能夠高特異和高靈敏的結合到靶標miRNA上，得到延長的逆轉錄產(chǎn)物。qPCR中所使用的熒光染料SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒光信號實時檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。設計原理如圖1所示。
[0022]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的莖環(huán)引物如下:
[0023]莖環(huán)引物包括兩部分，通用的莖環(huán)序列和與靶標miRNA3’端互補配對的特異引物序列；
[0024]本發(fā)明中對Stem-1oop引物進行優(yōu)化，其中通用的莖環(huán)序列保持不變，將其互補配對的特異引物序列延長4bp。
[0025]qPCR的下游引物針對通用的莖環(huán)序列，為提高上游引物的退火溫度，在其5’末端的增加GC尾巴，以使上下游引物的退火溫度相近。
[0026]有益效果:
[0027](I)本發(fā)明的檢測miRNA的方法中，設計的PCR下游引物是針對莖環(huán)逆轉錄引物通用的莖環(huán)序列的，其可以通用，故只需合成一種下游引物，且采用SYBR Green I熒光染料法,大大節(jié)約了技術成本。
[0028](2)本發(fā)明引物具有良好的特異性，qPCR的融解曲線只有單一的峰。并且能夠很好的區(qū)分靶標miRNA和其前體，相同濃度下成熟miRNA和其前體可相差8個Ct值。
[0029](3)本發(fā)明引物具有良好的靈敏性，檢測范圍可以跨越7個濃度梯度，對低通量的miRNA具有較高的準確度和精確度。
[0030](4)本發(fā)明中miRNA的檢測方法可用于快速高效的檢測小鼠組織樣本中靶標miRNA的表達量差異，且可較好的適用于不同組織。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1本發(fā)明的stem-loop qRT-PCR原理示意圖；
[0032]圖2實施例1中引物序列；
[0033]圖3優(yōu)化引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
[0034]圖4優(yōu)化引物的PCR產(chǎn)物融解曲線；
[0035]圖5優(yōu)化引物可以區(qū)分成熟miR-505_3P和它的前體；[0036]圖6合成的miR-505_3P的擴增曲線；
[0037]圖7優(yōu)化后引物與優(yōu)化前引物的標準曲線；
[0038]圖8從不同組織中提取RNA樣本，利用本發(fā)明設計的引物檢測miR-505_3P的相對
表達量。
【具體實施方式】
[0039]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0040]實施例1
[0041 ] 1、miRNA檢測弓丨物的設計
[0042](I)莖環(huán)引物包括兩部分，通用的莖環(huán)序列和與靶標miRNA3’端互補配對的特異引物序列；優(yōu)化的莖環(huán)引物，將與靶標miRNA互補配對的堿基數(shù)從7bp增加到llbp。
[0043](2) qPCR的下游引物針對通用的莖環(huán)序列，上游引物針對靶標miRNA的5’端，5’末端的加了 8bp的尾巴，引物設計如圖2所示。
[0044]2、驗證引物的特 異性和靈敏性
[0045]( I)反轉錄
[0046]米用SuperScript II Reverse Transcriptase 試劑盒(Fermentas)進行反轉錄，反應終體系10 μ L包括:6.25 μ L DNase I處理的總RNA，0.5 μ L莖環(huán)引物(2 μ Μ)，0.5 μ LdNTP Mix(IOmM)。首先反應在 16°C 進行 15min 后，加入剩余體系(2 μ L5XRT buffer,0.5μ LRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/μ L), 0.25 μ L RNase inhibitor(20U/μ L))，反應程序為:35°C 60min, 80°C 15min。
[0047](2)實時定量PCR擴增
[0048]PCR 反應終體系 20 μ L 包括:10 μ L2 X SYBR Green PCR master mix, 0.4 μ L ROX,
2.5yL cDNA模板，3yL PCR上下游引物(2 μ M)，4.1 μ L 7jC，同時設陰性對照。PCR循環(huán)條件為95°C預變性2min，95°C變性15s，62°C延伸32s，共40個循環(huán)。電泳結果顯示，優(yōu)化后的引物只有單一的條帶，且陰性對照無引物二聚體條帶，如圖3所示。樣本融解曲線也只有在Tm值80°C左右有單一的峰，如圖4所示。
[0049]合成的成熟miRNA和前體模板稀釋到相同的濃度1.08X108/RT反應下，如圖5所示，只有miRNA前體存在時，所得到的Ct值比成熟的miRNA至少高8.3個Ct值，說明如果檢測的成熟miRNA和前體是在同一濃度下，其前體對成熟miRNA的檢測結果只有0.31%的影響。用總RNA代替合成的miRNA模板，結果顯示，前體的Ct值比成熟的miRNA高至少10個Ct值，表明在組織樣本中miRNA的前體是低豐度的。
[0050]將合成的miR-505-3P RNA模板10倍稀釋7個濃度梯度，如圖6、7，結果顯示，和原來的逆轉錄引物相比，優(yōu)化引物的CT值和RNA模板呈現(xiàn)了更好的線性，表明優(yōu)化的引物具有更高的效率和更靈敏的檢測范圍。
[0051]3、利用優(yōu)化引物對不同組織中的miRNA進行檢測
[0052]以2個品系(轉基因和C57BL/6)小鼠的丘腦、垂體、卵巢、肌肉和脂肪組織為樣本。分別取5、15、25、35日齡頸椎脫白處死，迅速取出下丘腦、垂體、卵巢、肌肉、脂肪樣本。具體依據(jù)TRIzoI提取試劑盒說明書提取總RNA。具體流程如下:
[0053]a.勻衆(zhòng)處理:將組織在液氮中磨碎,每50~IOOmg組織加入1ml TRIzol,用勻衆(zhòng)儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzoI體積10 %。
[0054]b.將勻漿樣品在室溫(15~30°C)放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
[0055]c.每使用Iml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
[0056]d.2-80C 10000Xg離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60 %。
[0057]e.把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用lmlTRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
[0058]f.2~8V 1000OXg離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
[0059]g.用75 %乙醇洗滌RNA沉淀。每使用Iml TRIzol至少加lml75 %乙醇。2~8°C不超過7500 Xg離心5分鐘，棄上清。
[0060]h.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5~10分鐘。加入25~200 μ I無RNase的水，用槍頭吸打幾次，55~60°C放置10分鐘使RNA溶解。
[0061]結果顯示，我們的方法可以檢測到120個不同組織中的HiiCT0RNA樣本，且發(fā)現(xiàn)在轉基因和C57BL/6小鼠的不同時間點下，相較于其他組織，在肌肉和脂肪組織中差異顯著，這與本實驗室在表型上觀測到的`數(shù)據(jù)是一致的，如圖7所示。
【權利要求】
1.一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，包括: (1)miRNA檢測引物的設計: 莖環(huán)引物包括兩部分，通用的莖環(huán)序列和與靶標miRNA3’端互補配對的特異引物序列，其中與靶標miRNA互補配對的堿基數(shù)為Ilbp ； qPCR的下游引物針對通用的莖環(huán)序列，上游引物針對靶標miRNA的5’端；在所述上游弓丨物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火溫度相近； (2)采用步驟(1)設計的miRNA檢測引物將祀標miRNA反轉錄成cDNA； (3)定量PCR擴增并采用SYBRGreen qPCR檢測法進行檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的靶標 miRNA 為 miR-SOS-SP-RT1、miR-505_3P-RT2 或 miR-16-RT。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于:所述的miR-SOS-SP-RT1對應的miRNA檢測引物為:
PCR-F1: GCGAGCACCGTCAACACTTG; PCR-R1: TGGTGTCGTGGAGTCGGC。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于:所述的miR-505-3P-RT2對應的miRNA檢測引物為:
PCR-F2:GCGAGCACCGTCAACACT, PCR-R2: TGGTGTCGTGGAGTCGGC。
5.根據(jù)權利要求2所述`的一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于:所述的miR-16-RT對應的miRNA檢測引物為:
PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種改進的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的PCR擴增中PCR反應終體系20 μ L包括:10 μ L2 X SYBR Green PCRmaster mix,0.4μ L ROX, 2.5 μ L cDNA 模板，3yL PCR 上下游引物 2 μ Μ, 4.I μ L水，同時設陰性對照；PCR循環(huán)條件為95°C預變性2min，95°C變性15s，62°C延伸32s，共40個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866009SQ201410067044
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權日:2014年2月26日
【發(fā)明者】薛慧慧, 肖君華, 周宇荀, 李凱 申請人:東華大學