快速檢測(cè)抗精惡唑禾草靈菵草的Ile-1781-Leu突變的分子檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于LAMP技術(shù)快速鑒定含有Ile-1781-Leu突變的抗精惡唑禾草靈的菵草基因型的分子檢測(cè)方法，可用于含有該種突變的菵草的早期預(yù)警和流行監(jiān)測(cè)。該檢測(cè)方法共分3個(gè)主要步驟，(1)分別提取待測(cè)樣品的基因組DNA；(2)設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行LAMP恒溫?cái)U(kuò)增；(3)在上述LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR?Green?I，觀察其顏色變化；也可在3.0％瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀察擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)結(jié)果鑒定是否為具有Ile-1781-Leu突變的菵草種群；如果LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯示黃色，這時(shí)電泳圖譜應(yīng)為梯狀條帶，判定為帶有Ile-1781-Leu突變的菵草種群；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為橙色，這時(shí)電泳圖譜無(wú)條帶擴(kuò)增，判定為不帶有Ile-1781-Leu突變的菵草種群。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了恒溫?cái)U(kuò)增，不需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過(guò)程，使檢測(cè)時(shí)間和成本大大降低。與普通PCR相比，本發(fā)明還具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】快速檢測(cè)抗精惡唑禾草靈茼草的I le-1781-Leu突變的分子檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)對(duì)抗精惡唑禾草靈茼草的Ile_1781_Leu突變進(jìn)行快速檢測(cè)的分子檢測(cè)方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，該方法利用一套(4種)特異性引物，以識(shí)別靶基因的六個(gè)特定區(qū)域。該技術(shù)原理是:在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60~65C范圍60min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。SYBRGreen I是一種熒光染料，根據(jù)反應(yīng)液中成分的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性(沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物)時(shí)為橙色，陽(yáng)性(有產(chǎn)物擴(kuò)增)時(shí)為黃色。LAMP方法的優(yōu)勢(shì)是在恒溫條件下進(jìn)行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)極快，一般在I小時(shí)內(nèi)完成；擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過(guò)肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過(guò)程；靈敏度高、特異性強(qiáng)；操作簡(jiǎn)便、快捷，極適于抗性雜草突變情況的快速診斷及檢測(cè)。
[0003]茼草(Beckmannia syzigachne Steud.)是一年生或越年生禾本科草本植物，廣布于世界各地；在我國(guó)東北、華北、西北、華東、西南等各省區(qū)的水邊濕地也有廣泛分布；茼草具有一個(gè)冬前出草高峰和一個(gè)春后出草次峰，小麥產(chǎn)量均隨著茼草密度的增加而顯著下降。20世紀(jì)90年代初，我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)的稻茬油菜田和小麥田中，茼草的發(fā)生量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從原來(lái)的次要雜草逐漸上升為麥田的主要雜草，給小麥生產(chǎn)帶來(lái)了新的危害。
[0004]AOPP類除草劑在抗性風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)中屬于高風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，一般連續(xù)使用6-10年，雜草就會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抗性。精噁唑禾草 靈(驃馬)屬于AOPP類除草劑，是防治麥田禾本科雜草的主導(dǎo)藥劑，自20世紀(jì)80年代上市以來(lái)，在小麥田大面積推廣應(yīng)用。在生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期單一使用精噁唑禾草靈，其用量逐年增加，藥效降低，雜草對(duì)精噁唑禾草靈逐漸產(chǎn)生抗性。許多農(nóng)民反映，在田間推薦劑量下，精噁唑禾草對(duì)茼草的防除效果不理想；張鎖榮等經(jīng)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)連續(xù)使用精噁唑禾草靈8年的茼草對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生了抗藥性。經(jīng)王金信等研究發(fā)現(xiàn)，在江蘇省丹陽(yáng)地區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)帶有Ile-1781-Leu突變的抗精惡唑禾草靈的茼草種群。為了能夠更好地控制田間抗性茼草種群的蔓延以及指導(dǎo)田間農(nóng)民的正確用藥，以LAMP為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)能快速檢測(cè)抗精惡唑禾草靈茼草的Ile-1781-Leu突變情況，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、成本低，靈敏性高等特點(diǎn)，從而大大提高了檢測(cè)效率。然而，經(jīng)檢索目前國(guó)內(nèi)外尚未對(duì)抗精惡唑禾草靈茼草的Ile-1781-Leu突變的LAMP快速分子檢測(cè)有相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是對(duì)于已有的抗精惡唑禾草靈茼草的Ile-1781-Leu突變的鑒定及檢測(cè)方法中存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、準(zhǔn)確性低的缺點(diǎn)，提供一種具有簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)省力、靈敏度高的檢測(cè)方法。根據(jù)含有Ile-1781-Leu突變的抗精惡唑禾草靈的茼草基因型，優(yōu)化反應(yīng)條件，能對(duì)含有該突變的茼草種子及葉片進(jìn)行檢測(cè)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)該突變情況在田間的存在，從而正確的指導(dǎo)田間用藥，及時(shí)控制含有該種突變的茼草種群的蔓延，可以減少農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)損失，具有很大的實(shí)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明所述的快速檢測(cè)該突變的分子生物學(xué)方法，步驟是:
[0007](I)在含有Ile-1781-Leu突變的抗精惡唑禾草靈的茼草的ACCase基因的CT區(qū)上設(shè)計(jì)I對(duì)外引物和I對(duì)內(nèi)引物，利用該引物在恒溫條件下，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
[0008]①ILAMP反應(yīng)所用的兩對(duì)引物分別是:
[0009]F3:5， -GGACTAGGTGTGGAGTGCT-3’
[0010]B3:5， -TGGGAGCTGTACACTTCC-3，
[0011]FIP: 5 ’ -CCGTCCAGTAACAAATGTAAGTGTAGTGCTGCTATTGCCAGTG-3’
[0012]BIP:5’ -CCTATCTTGCTCGACTTGGCATGTTCAGGGCAGAAAACC-3’
[0013]②LAMP反應(yīng)體系及其條件:
[0014](1)
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)抗精惡唑禾草靈茼草、日本看麥娘、看麥娘等抗性雜草的Ile-1781-Leu突變的分子檢測(cè)方法，其特征在于基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)對(duì)該突變進(jìn)行快速鑒定，該方法共分三步: (1)運(yùn)用引物的特異性進(jìn)行LAMP恒溫?cái)U(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)反應(yīng)體系及參數(shù): 反應(yīng)體系:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)抗精惡唑禾草靈茼草、日本看麥娘、看麥娘等抗性雜草的Ile-1781-Leu突變的分子檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(1)所述的用于LAMP反應(yīng)中的兩對(duì)引物具有特異性，所述的兩對(duì)引物分別是: (1)外引物對(duì):
F3:5’ -GGACTAGGTGTGGAGTGCT-3，
B3:5’ -TGGGAGCTGTACACTTCC-3’ (2)內(nèi)引物對(duì):
FIP:5’ -CCGTCCAGTAACAAATGTAAGTGTAGTGCTGCTATTGCCAGTG-3’
BIP:5’ -CCTATCTTGCTCGACTTGGCATGTTCAGGGCAGAAAACC-3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103820551SQ201410067111
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】董立堯, 潘浪, 李俊, 徐洪樂(lè) 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)