專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)小病毒b19的診斷測(cè)試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及病毒診斷。具體而言，本發(fā)明涉及以核酸為基礎(chǔ)的用于準(zhǔn)確診斷細(xì)小病毒B19感染的試驗(yàn)和用于此試驗(yàn)的引物、探針。
背景技術(shù)：
人細(xì)小病毒B19是細(xì)小病毒科、Erythrovirus屬的成員，是一種小的22nm二十面體、無(wú)包膜病毒，為線性單鏈DNA分子，約有5600個(gè)核苷酸。其病毒基因組編碼3種主要的蛋白，VP1、VP2和NS1?？蓞⒁?jiàn)Shade等，J.Virol.(1986)，58921-936和本文的

圖1。VP1(83kDa)和VP2(59kDa)是衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白。這兩種蛋白分別在約第2444-4789位和約第3125-4789位核苷酸的重疊的開(kāi)放讀框中編碼。VP2構(gòu)成了衣殼的95％，較大的VP1蛋白僅占衣殼的5％。病毒的成熟構(gòu)型需要VP1。NS1(77kDa)是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，僅存在于感染細(xì)胞的核組分中，不存在于細(xì)胞質(zhì)和血清中的完整病毒粒子中。
細(xì)小病毒B19在正常的獻(xiàn)血者的血清中被首次發(fā)現(xiàn)，是已知人類(lèi)致病原細(xì)小病毒家族中的唯一成員。該病毒與廣泛的疾病表現(xiàn)有關(guān)。人細(xì)小病毒B19通常引起兒童無(wú)癥狀或輕度的自限性感染(self-limiting infection)。對(duì)于成年人，細(xì)小病毒B19會(huì)引起快速的、短暫的對(duì)稱(chēng)性多發(fā)性關(guān)節(jié)痛(symmetrical polyarthralgia)和關(guān)節(jié)炎。細(xì)小病毒B19與患潛在性溶血性疾病患者的短暫性再生障礙危象(TAC)相關(guān)。業(yè)已報(bào)道，在患急性白血病、先天性免疫缺陷、AIDS以及骨髓移植后的免疫力低下力低下患者中存在慢性B19感染和持久性貧血。細(xì)小病毒B19還與懷孕婦女的胎兒死亡相關(guān)。
在大多數(shù)國(guó)家中，B19病毒感染通常發(fā)生在孩童，大約50％的兒童到15歲時(shí)才會(huì)具有抗B-19抗體。在整個(gè)生命過(guò)程中，B19抗體可能會(huì)進(jìn)一步增加，老年個(gè)體中此值達(dá)到90％以上。
據(jù)信，在人細(xì)小病毒B19感染中，病毒的最初復(fù)制發(fā)生在呼吸道中。然后，病毒靶向骨髓中的細(xì)胞。這導(dǎo)致大規(guī)模的病毒復(fù)制，據(jù)報(bào)道為102-1014個(gè)粒子/ml的病毒血癥發(fā)生在感染后7-10天，但在癥狀發(fā)作之前。病毒血癥的停止與測(cè)到的特異性IgM抗體的檢測(cè)相一致，IgM的升高會(huì)持續(xù)2-3個(gè)月。IgM抗體出現(xiàn)幾天后可檢測(cè)到抗B19-IgG抗體，它將持續(xù)終生。
脂質(zhì)包膜的缺乏和有限的DNA含量使得細(xì)小病毒B19極能抵抗理化性滅活。尤其是在高濃度時(shí)，細(xì)小病毒B19能抵擋血制品的常規(guī)熱處理。并且，也有文獻(xiàn)報(bào)道，B19可通過(guò)溶劑-去污劑處理的因子VIII和蒸汽或干熱處理的因子VIII和IX制品的給予而傳播。
人細(xì)小病毒B19不能在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)，這使得該病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和分離非常困難。因而，多年來(lái)，唯一的抗原來(lái)源是病毒血癥患者獲得的血清。在解決這些問(wèn)題的嘗試中，已生產(chǎn)了用于血清學(xué)檢測(cè)的重組抗原?？蓞⒁?jiàn)Sisk和Berman，Biotechnology(1987)，51077-1080；美國(guó)專(zhuān)利6204044。也已采用免疫酶學(xué)IgM俘獲試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗B-19抗體和診斷近來(lái)的B19感染。但是，許多可獲得的商業(yè)化試劑的診斷性能都不相同。此外，基于IgM的診斷試驗(yàn)也不能檢測(cè)到感染時(shí)病毒血癥期中的病毒，而且，一旦合成IgM抗體，它們可在病毒血癥結(jié)束后幾個(gè)月中保留在循環(huán)中。
B19抗體在正常人群中的高度流行，以及高病毒血癥通常持續(xù)僅1周的事實(shí)，使得使用基于血清學(xué)的試驗(yàn)不切實(shí)際。此外，在免疫力低下患者中，血清學(xué)診斷可能是不可靠的。
已將基于核酸的雜交試驗(yàn)用于B19檢測(cè)，如斑點(diǎn)印跡和原位雜交。這些試驗(yàn)的檢測(cè)限度通常為1-0.1pg病毒DNA(～104-105病毒粒子)。PCR具有較高的靈敏度(～100基因組拷貝)。但是，DNA雜交技術(shù)費(fèi)時(shí)，并且用途有限，而PCR對(duì)于篩選大量的樣品也是不實(shí)用。
因此，仍需要開(kāi)發(fā)出一種可靠的診斷試驗(yàn)，用于檢測(cè)病毒血癥樣品中的細(xì)小病毒B19，以預(yù)防病毒通過(guò)血液和血漿衍生物或者通過(guò)人與人之間的親密接觸而傳播。
發(fā)明概述本發(fā)明的基礎(chǔ)是，發(fā)現(xiàn)了可用于核酸試驗(yàn)的獨(dú)特引物和探針，以及開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)可能受感染個(gè)體的生物學(xué)樣品中細(xì)小病毒B19 DNA的靈敏、可靠的核酸試驗(yàn)。本文所述的技術(shù)利用抽提的樣品DNA為模板，采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，以及用5′核酶試驗(yàn)測(cè)中(如TaqManTM技術(shù))進(jìn)行B19序列保守性基因組區(qū)域的擴(kuò)增。這些方法允許檢測(cè)病毒效價(jià)低至103病毒粒子/ml的病毒血癥樣品中的B19DNA。因此，可鑒別出被感染的樣品，并將其排除于輸血以及血制品之外。本文所述的探針和引物也可用于如標(biāo)準(zhǔn)雜交方法以及基于PCR的技術(shù)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和利用分支DNA-分子的試驗(yàn)中。
因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中的人細(xì)小病毒B19感染的方法。該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分離得到的細(xì)小病毒B19核酸與第一寡核苷酸反應(yīng)，該第一寡核苷酸含有第一引物，該第一引物含有與所述RNA靶序列的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第一引物還含有一DNA依賴(lài)性RNA聚合酶5′的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操作性連接于所述復(fù)合序列，所述反應(yīng)在能形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下進(jìn)行；(c)以所述RNA靶序列為模板，在延伸反應(yīng)中使所述第一引物延伸，產(chǎn)生與所述RNA靶序列互補(bǔ)的第一DNA引物延伸產(chǎn)物；(d)用能選擇性降解所述RNA靶序列的酶將所述第一DNA引物延伸產(chǎn)物從所述RNA靶序列中分離；(e)在形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下，用第二寡核苷酸處理所述DNA引物延伸產(chǎn)物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，該第二引物含有與所述DNA引物延伸產(chǎn)物的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列；(f)在DNA延伸反應(yīng)中延伸所述第二引物的3′末端，產(chǎn)生第二DNA引物延伸產(chǎn)物，從而產(chǎn)生DNA依賴(lài)性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和能識(shí)別所述啟動(dòng)子序列的DNA依賴(lài)性RNA聚合酶產(chǎn)生所述靶序列的多個(gè)RNA拷貝；和(h)使用步驟(g)的RNA拷貝，自身催化性地重復(fù)步驟(b)到步驟(g)，以擴(kuò)增所述靶序列。
在某些實(shí)施例中，該方法還包括
(i)在使探針與靶序列雜交形成探針靶標(biāo)復(fù)合物的條件下，將一標(biāo)記的寡核苷酸探針加到步驟(h)的產(chǎn)物中，其中，所述寡核苷酸探針與該靶序列的一部分互補(bǔ)；(j)檢測(cè)標(biāo)記物是否存在，作為靶序列存在與否的指示。
在另一實(shí)施例中，所述標(biāo)記物是吖啶酯(acridinium ester)。
在又一實(shí)施例中，用于上述方法的第一、第二引物以及探針衍生自人細(xì)小病毒B19基因組的VP1區(qū)域，如衍生自圖2A-2U或11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中的人細(xì)小病毒B19感染的方法。該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分離得到的細(xì)小病毒B19核酸與第一寡核苷酸反應(yīng)，該第一寡核苷酸含有第一引物，該第一引物含有與所述RNA靶序列的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第一引物還含有一DNA依賴(lài)性RNA聚合酶5′的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操作性連接于所述復(fù)合序列，所述第一引物含有衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z任一所示的多核苷酸序列的序列，所述反應(yīng)在能形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物形成和啟動(dòng)DNA合成的條件下進(jìn)行；(c)以所述RNA靶序列為模板，在延伸反應(yīng)中使所述第一引物延伸，產(chǎn)生與所述RNA靶序列互補(bǔ)的第一DNA引物延伸產(chǎn)物；(d)用能選擇性降解所述RNA靶序列的酶將所述第一DNA引物延伸產(chǎn)物從所述RNA靶序列中分離；(e)在形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下，用第二寡核苷酸處理所述DNA引物延伸產(chǎn)物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，該第二引物含有與所述DNA引物延伸產(chǎn)物的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第二引物衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(f)在DNA延伸反應(yīng)中延伸所述第二引物的3′末端，產(chǎn)生第二DNA引物延伸產(chǎn)物，從而產(chǎn)生DNA依賴(lài)性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和能識(shí)別所述啟動(dòng)子序列的DNA依賴(lài)性RNA聚合酶，產(chǎn)生所述靶序列的多個(gè)RNA拷貝；和(h)使用步驟(g)的RNA拷貝，自身催化性地重復(fù)步驟(b)到步驟(g)，以擴(kuò)增所述靶序列。
(i)在使探針與靶序列雜交形成探針靶標(biāo)復(fù)合物的條件下，將一吖啶酯標(biāo)記的寡核苷酸探針加到步驟(h)的產(chǎn)物中，其中，所述寡核苷酸探針與該靶序列的一部分互補(bǔ)，所述探針衍生自圖2A-2U中任一所示的多核苷酸序列；(j)檢測(cè)標(biāo)記物是否存在，作為靶序列存在與否的指示。
在又一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增靶細(xì)小病毒B19核苷酸序列的方法，該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，該核酸含有RNA靶序列；(b)加入一種或多種能與所述RNA靶序列雜交的引物，其中，所述一種或多種引物衍生自圖2A-2U和圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(c)加入相對(duì)于所述一種或多種引物而言能與所述RNA靶序列3′雜交的寡核苷酸探針；(d)用聚合酶延伸所述一種或多種引物。
在某些實(shí)施例中，步驟(a)的RNA靶序列被反轉(zhuǎn)錄，以提供cDNA。并且，該方法還可包括用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或不對(duì)稱(chēng)缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-AGLCR)擴(kuò)增所述cDNA。在另一實(shí)施例中，所述聚合酶是熱穩(wěn)定性聚合酶，例如(但不限于)Taq聚合酶或Vent聚合酶。在其它實(shí)施例中，所述聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段或T4 DNA聚合酶。
在上述各方法的某些實(shí)施例中，提供了一種內(nèi)部對(duì)照物。所述內(nèi)部對(duì)照物可從圖12的序列(SEQ ID NO92)獲得。在其它實(shí)施例中，所述內(nèi)部對(duì)照物含有SEQ IDNO90。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中人細(xì)小B19感染的方法，所述方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，所述核酸含有靶序列；(b)使分離得到的人細(xì)小病毒B19核酸與可檢測(cè)的標(biāo)記探針?lè)磻?yīng)，該探針與所述靶序列充分互補(bǔ)并能與之雜交，其中，所述探針衍生自圖2A-2U和圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列，且該反應(yīng)在形成探針/靶序列復(fù)合物的條件下進(jìn)行；(c)檢測(cè)標(biāo)記物存在與否，作為靶序列存在與否的指示。
在又一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，它含有圖2A-2U或圖11A-11Z中所述的任一核苷酸序列。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種如上所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列由圖2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L、2M、2N、2O、2P、2Q、2R、2S、2T、2U、11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K、11L、11M、11N、11O、11P、11Q、11R、11S、11T、11U、11V、11W、11X、11Y或11Z中所述的核苷酸序列組成。
在又一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，它含有圖3A-3C或4A-4C中所述的任一核苷酸序列。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種如上所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列由圖3A-3C或圖4A-4C中所述的序列組成。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸引物，它由被DNA依賴(lài)性RNA聚合酶識(shí)別的、操作性連接于人細(xì)小病毒B19特異性復(fù)合序列的啟動(dòng)子區(qū)域組成，長(zhǎng)約10-75個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施例中，該啟動(dòng)子區(qū)域是T7啟動(dòng)子，所述聚合酶是T7 RNA聚合酶。此外，人細(xì)小病毒B19特異性序列可衍生自人細(xì)小病毒B19基因組的VP1區(qū)域，如衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在又一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸引物，它由操作性連接于人細(xì)小病毒B19特異性復(fù)合序列的T7啟動(dòng)子組成，長(zhǎng)約10-75個(gè)核苷酸。其中，所述人細(xì)小病毒B19特異性復(fù)合序列衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸探針，該探針含有連接于吖啶酯標(biāo)記物的細(xì)小病毒B19特異性雜交序列，長(zhǎng)約10-50個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施例中，所述人細(xì)小病毒B19特異性雜交序列衍生自人細(xì)小病毒B19基因組的VP1區(qū)域，如衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在又一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，它含有本文所述一種或多種寡核苷酸引物以及進(jìn)行診斷試驗(yàn)的用法說(shuō)明書(shū)。在某些實(shí)施例中，所述試劑盒還含有一寡核苷酸探針，該探針含有連接于吖啶酯標(biāo)記物的細(xì)小病毒B19特異性雜交序列，其長(zhǎng)度約為10-50個(gè)核苷酸。
在結(jié)合以下詳細(xì)的描述以及附圖之后，對(duì)本發(fā)明上述這些方面以及其它方面的內(nèi)容將會(huì)更明了。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1是人細(xì)小病毒B19基因組圖，它描述該病毒的各編碼區(qū)域。其中描述了3個(gè)PCR片段，一個(gè)片段長(zhǎng)約700bp，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸；一個(gè)片段長(zhǎng)約370bp，它在該700bp片段之內(nèi)，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的細(xì)小病毒B19基因組的第3073-3442位核苷酸；還有一個(gè)片段長(zhǎng)約214bp，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的細(xì)小病毒B19基因組的第4728-4941位核苷酸。
圖2A到2U(SEQ ID NO1-21)描述從各種細(xì)小病毒B19分離物獲得的DNA序列，包括對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸的序列(圖1的700bp片段)。圖2A(SEQ ID NO1)是從分離物CH47-26獲得的相應(yīng)序列；圖2B(SEQ ID NO2)是從分離物CH48-29獲得的相應(yīng)序列；圖2C(SEQ ID NO3)是從分離物CH33-2獲得的相應(yīng)序列；圖2D(SEQ ID NO4)是從分離物CH33-3獲得的相應(yīng)序列；圖2E(SEQ ID NO5)是從分離物CH33-4獲得的相應(yīng)序列；圖2F(SEQ ID NO6)是從分離物CH42-7獲得的相應(yīng)序列；圖2G(SEQ ID NO7)是從分離物CH42-18獲得的相應(yīng)序列；圖2H(SEQID NO8)是從分離物CH42-19獲得的相應(yīng)序列；圖2I(SEQ ID NO9)是從分離物CH46-23獲得的相應(yīng)序列；圖2J(SEQ ID NO10)是從分離物CH1-1獲得的相應(yīng)序列；圖2K(SEQ ID NO11)是從分離物CH1-6獲得的相應(yīng)序列；圖2L(SEQ ID NO12)是從分離物CH2-8獲得的相應(yīng)序列；圖2M(SEQ ID NO13)是從分離物CH2-10獲得的相應(yīng)序列；圖2N(SEQ ID NO14)是從分離物CH2-11C獲得的相應(yīng)序列；圖2O(SEQ ID NO15)是從分離物CH5-13獲得的相應(yīng)序列；圖2P(SEQ ID NO16)是從分離物CH7-22獲得的相應(yīng)序列；圖2Q(SEQ ID NO17)是從分離物CH13-27獲得的相應(yīng)序列；圖2R(SEQ ID NO18)是從分離物CH14-33獲得的相應(yīng)序列；圖2S(SEQ ID NO19)是從分離物CH62-2獲得的相應(yīng)序列；圖2T(SEQ ID NO20)是從分離物CH64-2獲得的相應(yīng)序列；圖2U(SEQ ID NO21)是從分離物CH67-2獲得的相應(yīng)序列。
圖3A-3C(SEQ ID NO22)顯示圖1所示細(xì)小病毒B19克隆2-B1的大約4.7kbp的PCR片段的序列。該序列為長(zhǎng)4677個(gè)核苷酸的片段，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。該序列含有細(xì)小病毒B19全長(zhǎng)開(kāi)放讀框和額外的5′和3′非翻譯序列，該讀框編碼NS1、VP1和VP2。
圖4A-4C(SEQ ID NO23)顯示圖1所示細(xì)小病毒B19克隆2-B1的大約4.7kbp的PCR片段的序列。該序列為長(zhǎng)4677個(gè)核苷酸的片段，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。該序列含有細(xì)小病毒B19全長(zhǎng)開(kāi)放讀框和額外的5′和3′非翻譯序列，該讀框編碼NS1、VP1和VP2。
圖5A(SEQ ID NO24)和5B(SEQ ID NO25)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的NS1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
圖6A(SEQ ID NO26)和6B(SEQ ID NO27)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
圖7A(SEQ ID NO28)和7B(SEQ ID NO29)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP2核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
圖8A(SEQ ID NO30)和8B(SEQ ID NO31)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的NS1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
圖9A(SEQ ID NO32)和9B(SEQ ID NO33)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
圖10A(SEQ ID NO34)和10B(SEQ ID NO35)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP2核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
圖11A到圖11Z(SEQ ID NO62-87)描述從各種細(xì)小病毒B19分離物獲得的DNA序列，包括對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸的序列(圖1的700bp片段)。圖11A(SEQ IDNO62)是從分離物CH80-1獲得的相應(yīng)序列；圖11B(SEQ ID NO63)是從分離物CH81-3獲得的相應(yīng)序列；圖11C(SEQ ID NO64)是從分離物B19SCL1-4獲得的相應(yīng)序列；圖11D(SEQ ID NO65)是從分離物B19SCL2-1獲得的相應(yīng)序列；圖11E(SEQ ID NO66)是從分離物B19SCL3-1獲得的相應(yīng)序列；圖11F(SEQ ID NO67)是從分離物B19SCL4-3獲得的相應(yīng)序列；圖11G(SEQ ID NO68)是從分離物B19SCL5-2獲得的相應(yīng)序列；圖11H(SEQ ID NO69)是從分離物B19SCL6-2獲得的相應(yīng)序列；圖11I(SEQ ID NO70)是從分離物B19SCL7-3獲得的相應(yīng)序列；圖11J(SEQ ID NO71)是從分離物B19SCL8-2獲得的相應(yīng)序列；圖11K(SEQ ID NO72)是從分離物B19SCL9-1獲得的相應(yīng)序列；圖11L(SEQ ID NO73)是從分離物B19SCL9-9獲得的相應(yīng)序列；圖11M(SEQ ID NO74)是從分離物B19SCL10-2獲得的相應(yīng)序列；圖11N(SEQ ID NO75)是從分離物B19SCL11-1獲得的相應(yīng)序列；圖11O(SEQ ID NO76)是從分離物B19SCL12-1獲得的相應(yīng)序列；圖11P(SEQ IDNO77)是從分離物B19SCL13-3獲得的相應(yīng)序列；圖11Q(SEQ ID NO78)是從分離物B19SCL14-1獲得的相應(yīng)序列；圖11R(SEQ ID NO79)是從分離物B19SCL15-3獲得的相應(yīng)序列；圖11S(SEQ ID NO80)是從分離物B19SCL16-2獲得的相應(yīng)序列；圖11T(SEQ ID NO81)是從分離物B19SCL17-1獲得的相應(yīng)序列；圖11U(SEQID NO82)是從分離物B19SCL18-1獲得的相應(yīng)序列；圖11V(SEQ ID NO83)是從分離物B19SCL19-1獲得的相應(yīng)序列；圖11W(SEQ ID NO84)是從分離物B19SCL20-3獲得的相應(yīng)序列；圖11X(SEQ ID NO85)是從分離物B19SCL21-3獲得的相應(yīng)序列；圖11Y(SEQ ID NO86)是從分離物B19SCL22-11獲得的相應(yīng)序列；圖11Z(SEQ ID NO87)是從分離物B19SCL2-14獲得的相應(yīng)序列。
圖12(SEQ ID NO92)描述一示范性序列，從該序列可產(chǎn)生用于靶標(biāo)俘獲和擴(kuò)增的內(nèi)部對(duì)照物(IC)。
發(fā)明詳述除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和病毒學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋。參見(jiàn)，如《基礎(chǔ)病毒學(xué)》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編)；A.L.Lehninger，《生物化學(xué)》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，第二版，1989；《酶學(xué)方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)〔N.Gait編輯，1984〕；《分子克隆實(shí)用指南》(A Practical Guide to MolecularCloning)(1984)。
必須注意的是，如本說(shuō)明書(shū)中和權(quán)利要求書(shū)中使用的，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”、“該”包括復(fù)數(shù)，除非該內(nèi)容另有明確說(shuō)明。因此，“一種抗原”包括兩個(gè)或多個(gè)抗原的混合物等。
文中使用了下列氨基酸縮寫(xiě)丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H) 異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L) 賴(lài)氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P) 絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T) 色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y) 纈氨酸Val(V)I.定義在本發(fā)明的描述中，使用了下列術(shù)語(yǔ)，并如下定義。
術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物，并不限于產(chǎn)物的最小長(zhǎng)度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在該定義中。全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)及其片段都包括在該定義中。該術(shù)語(yǔ)還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。另外，為了本發(fā)明的目的，“多肽”指包括天然序列的修飾的蛋白質(zhì)，例如缺失、添加和取代(通常性質(zhì)保守)，只要蛋白質(zhì)保持了所需活性。這些修飾可以是精心設(shè)計(jì)的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可以是偶然的，例如通過(guò)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主的突變，或由于PCR擴(kuò)增引起的錯(cuò)誤。
細(xì)小病毒B19多肽是一種如上所定義的多肽，它衍生自B19基因組編碼的蛋白質(zhì)，如衍生自非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2以及形成病毒衣殼的蛋白VP1(長(zhǎng)約781個(gè)氨基酸)或VP2(長(zhǎng)約544個(gè)氨基酸)。代表性的NS1、VP1和VP2序列在圖5-10中有所描述。該多肽不需要以物理的方式從細(xì)小病毒B19獲得，但是可合成或重組產(chǎn)生。而且，該多肽可衍生自各種細(xì)小病毒B19株和分離物。在這些病毒株和分離物之間有一些保守區(qū)和可變區(qū)是已知的，并且，通常，衍生自這些區(qū)域的各表位的氨基酸序列將具有高度的序列同源性，例如，當(dāng)對(duì)兩條序列進(jìn)行排列對(duì)比時(shí)，氨基酸序列具有30％以上的同源性，較佳40％以上。因而，例如，術(shù)語(yǔ)“VP1”多肽指各種細(xì)小病毒B19株和分離物的天然VP1。許多細(xì)小病毒B19株和分離物的上述蛋白質(zhì)的完整基因型和序列也是已知的?？蓞⒁?jiàn)Shade等，J.Virol.(1986)，58921-936；Gallinella等，J.Virol.Methods(1993)，41203-211。此外，這些區(qū)域的細(xì)小病毒B19的表位也是已知的。例如，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5436127；和國(guó)際出版物WO 91/12269。
術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”和“突變蛋白”指參照分子的生物活性衍生物，或這些衍生物的保留所需活性(如在診斷檢測(cè)中具有免疫反應(yīng)性)的片段。通常，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”指具有天然多肽的序列和結(jié)構(gòu)、并與天然分子相比具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代(通常性質(zhì)保守)和/或缺失(只要這種修飾不破壞免疫活性)的化合物。術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”指具有一種或多種肽模擬物(“類(lèi)肽”)的肽，如國(guó)際出版物WO91/04282中所述。優(yōu)選此種類(lèi)似物或突變蛋白至少具有與天然分子相同的免疫活性。制備多肽類(lèi)似物和突變蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，以下將進(jìn)一步描述。
特別優(yōu)選的類(lèi)似物包括保守性取代，即這些取代發(fā)生在與它們的側(cè)鏈有關(guān)的一類(lèi)氨基酸中。具體而言，氨基酸一般被分成四類(lèi)(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性——賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無(wú)電荷極性—一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例如，有理由預(yù)測(cè)單獨(dú)用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸，或者用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸對(duì)氨基酸進(jìn)行類(lèi)似的保守性取代，將不會(huì)其對(duì)生物活性有重要影響。例如，感興趣的多肽可包括多達(dá)約5-10個(gè)保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多達(dá)約15-25個(gè)保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之間任何整數(shù)的取代，只要該分子的所需功能仍保持完整。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可結(jié)合本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲線圖，不難確定感興趣的分子中可耐受改變的區(qū)域。
當(dāng)用于多肽時(shí)，“分離的”指所修飾的分子與它天然存在于其中的整個(gè)生物體相分離和分開(kāi)，或者基本上不存在同一生物體的其它生物大分子?！胺蛛x的”多核苷酸指全部或部分沒(méi)有通常在天然條件下與其結(jié)合的序列的核酸分子；或者指一種以其天然形式存在但與異源序列結(jié)合的序列；或者指從染色體脫離下來(lái)的分子。
“衍生自”或“特異于”一指定序列的多核苷酸，指含有對(duì)應(yīng)于(即與之相同或互補(bǔ))所指定核苷酸序列某區(qū)域一段連續(xù)序列的多核苷酸序列，該連續(xù)序列長(zhǎng)至少約6個(gè)核苷酸、較佳至少約8個(gè)核苷酸、更佳至少約10-12個(gè)核苷酸、還更佳至少約15-20個(gè)核苷酸。該衍生的多核苷酸并不一定衍生自感興趣的核苷酸序列物理，它可以任何方式產(chǎn)生，包括但不限于化學(xué)合成、復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄，這取決于衍生獲得該多核苷酸的區(qū)域的堿基序列所提供的信息。同樣地，它可以是原始多核苷酸的有義取向或反義取向。
“同源性”指兩條多核苷酸或兩條多肽部分之間的相似性百分?jǐn)?shù)。兩條DNA或兩條多肽序列在確定的分子長(zhǎng)度內(nèi)，當(dāng)序列顯示有至少約50％，優(yōu)選至少約75％、更佳至少約80-85％、尤其佳至少約90％、最佳至少約95-98％序列相似性時(shí)，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指與特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。
通常，“同一性”指兩條多核苷酸或多肽序列上核苷酸和核苷酸或者氨基酸和氨基酸準(zhǔn)確相對(duì)應(yīng)。通過(guò)排列其序列，可比較兩個(gè)分子之間的序列信息，計(jì)算兩條對(duì)比序列之間匹配的準(zhǔn)確數(shù)量，將其除以最短序列的長(zhǎng)度，然后乘以100，即可測(cè)定同一性百分?jǐn)?shù)。
使用易于獲得的計(jì)算機(jī)程序可有助于同源性和同一性分析，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff編輯，5 Suppl.，3353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它采用了Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.，2482-489，1981)。可從Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，從GeneticsComputer Group，Madison，WI獲得)獲得測(cè)定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴(lài)于Smith和Waterman算法。采用制造者建議的和參照Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默認(rèn)參數(shù)可容易地使用這些程序。例如，可用Smith和Warerman的同源性算法的默認(rèn)計(jì)分表和6個(gè)核苷酸位置的間隔罰分(gap penalty)測(cè)定的核苷酸序列與參比序列的同源性百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明建立同源性百分?jǐn)?shù)的另一方法是采用版權(quán)屬于愛(ài)丁堡大學(xué)、由John F.Collins和Shane S.Sturrok開(kāi)發(fā)、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)發(fā)行的MPSRCH程序包?？刹捎眠@套程序包中的Smith-Waterman算法，其中，在計(jì)分表中使用默認(rèn)參數(shù)(例如，間隔開(kāi)放罰分＝12，間隔延伸罰分＝1，間隔＝6)。從這批數(shù)據(jù)產(chǎn)生的“匹配”值反映出“序列同源性”。計(jì)算序列間的同一性百分?jǐn)?shù)或相似性百分?jǐn)?shù)的其它合適的程序通常在本領(lǐng)域中是已知的，例如，另一種排列對(duì)比程序是BLAST，也使用默認(rèn)參數(shù)。例如，可使用下述默認(rèn)參數(shù)的BLASTN和BLASTP基因編碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾＝無(wú)；鏈＝兩；截留＝60；期望值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50個(gè)序列；排序＝HIGH SCORE；數(shù)據(jù)庫(kù)＝無(wú)冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http//www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST網(wǎng)址上可查到這些程序的詳細(xì)描述。
或者，在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定的雙鏈體條件下進(jìn)行多核苷酸雜交，接著用單鏈特異性核酸酶消化，然后測(cè)定消化片段的大小，從而測(cè)出同源性。在如(為具體的系統(tǒng)所定義的)嚴(yán)格條件下進(jìn)行的Southern雜交實(shí)驗(yàn)中，可鑒別基本同源的DNA序列。確定適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所掌握的知識(shí)之內(nèi)。例如，參見(jiàn)Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
“操作性連接”指元件的排列，其中所述組分被排成一定的構(gòu)形而執(zhí)行它們所需的功能。因而，給定的操作性連接于核酸序列的啟動(dòng)子能影響轉(zhuǎn)錄，對(duì)于編碼序列而言，當(dāng)存在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄因子等時(shí)，該啟動(dòng)子能使該編碼序列表達(dá)。該啟動(dòng)子不需要與該編碼序列鄰接，只要它能指導(dǎo)該序列轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)即可。因此，例如，與轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子一樣，不參與翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列可存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間；并且仍可認(rèn)為該啟動(dòng)子序列“操作性連接”于該編碼序列。
本文的用于描述核酸分子的“重組子”指基因組、cDNA、病毒、半合成或合成來(lái)源的多核苷酸，由于其來(lái)源或操作的緣故，該多核苷酸與與其天然相關(guān)的多核苷酸完全或部分不相關(guān)。用于蛋白質(zhì)或多肽的術(shù)語(yǔ)“重組子”指通過(guò)重組多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生的多肽。通常，克隆感興趣的基因，然后在轉(zhuǎn)化的生物體中表達(dá)(如下所述)。宿主生物體在表達(dá)條件下表達(dá)外源基因，從而產(chǎn)生該蛋白。
“控制元件”指幫助與其連接的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和/或反義的多核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、聚腺苷酸化信號(hào)、非翻譯區(qū)域(包括5′-UTR和3′-UTR)，適當(dāng)時(shí)還有前導(dǎo)序列和增強(qiáng)子，這些序列共同提供了編碼序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
“啟動(dòng)子”在本文中指能結(jié)合聚合酶并啟動(dòng)與之操作性連接的下游(3′方向)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)域。用于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列包括以高于背景值的可檢測(cè)水平啟動(dòng)感興趣基因的轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)量的堿基或元件。在該啟動(dòng)子序列中有轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)以及負(fù)責(zé)RNA或DNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。例如，啟動(dòng)子可以是被DNA依賴(lài)性RNA聚合酶(轉(zhuǎn)錄酶)識(shí)別在特定位點(diǎn)與核酸結(jié)合并開(kāi)始RNA轉(zhuǎn)錄的核酸序列。為了結(jié)合，這種轉(zhuǎn)錄酶通常需要在含有啟動(dòng)子序列及其互補(bǔ)序列的部分中為雙鏈的DNA，模板部分(將被轉(zhuǎn)錄的部分)不需要是雙鏈的。各種DNA依賴(lài)性RNA聚合酶可識(shí)別各種不同的啟動(dòng)子序列，它們?cè)诖龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄方面的效率可能明顯不同。當(dāng)RNA聚合酶與啟動(dòng)子序列結(jié)合以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子序列并是被轉(zhuǎn)錄的序列的一部分。因而，由此產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將不包括該序列。
當(dāng)RNA或DNA聚合酶與啟動(dòng)子序列結(jié)合并轉(zhuǎn)錄毗鄰的序列時(shí)，控制序列指導(dǎo)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄。
“DNA依賴(lài)性DNA聚合酶”是一種能從DNA模板合成互補(bǔ)性DNA拷貝的酶。例子大腸桿菌的DNA聚合酶I和噬菌體T7 DNA聚合酶。所有已知的DNA依賴(lài)性DNA聚合酶需要互補(bǔ)的引物，以啟動(dòng)合成。在適當(dāng)?shù)臈l件下，DNA依賴(lài)性DNA聚合酶可從RNA模板合成互補(bǔ)性DNA拷貝。
“DNA依賴(lài)性RNA聚合酶”或“轉(zhuǎn)錄酶”是能從具有(通常為雙鏈的)啟動(dòng)子序列的雙鏈或部分雙鏈的DNA分子合成多個(gè)RNA拷貝的酶。RNA分子(“轉(zhuǎn)錄子”)是以5′到3′方向合成，合成開(kāi)始于緊靠啟動(dòng)子下游的特定位置。轉(zhuǎn)錄酶的例子是大腸桿菌的DNA依賴(lài)性RNA聚合酶和噬菌體的T7、T3和SP6。
“RNA依賴(lài)性DNA聚合酶”或“反轉(zhuǎn)錄酶”是從RNA模板合成互補(bǔ)性DNA拷貝的酶。所有已知的反轉(zhuǎn)錄酶還具有從DNA模板制得互補(bǔ)性DNA拷貝的能力。因而，它們是RNA依賴(lài)性和DNA依賴(lài)性的DNA聚合酶。用RNA模板和DNA模板啟動(dòng)合成都需要啟動(dòng)子。
“RNA酶H”是降解RNA:DNA復(fù)合物的RNA部分的酶。這些酶可以是內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶除了具有它們的聚合酶活性外，通常還具有RNA酶H活性。但是，其它來(lái)源的RNA酶H并沒(méi)有相關(guān)的聚合酶活性。降解可導(dǎo)致RNA從RNA:DNA復(fù)合物中分離?；蛘?，RNA酶H可簡(jiǎn)單地在不同位置上將RNA切斷，將RNA的這些部分解鏈，或使酶能解旋該RNA的這些部分。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中包括任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，不論是核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸。此術(shù)語(yǔ)僅僅指分子的結(jié)構(gòu)。因而，此術(shù)語(yǔ)包括三鏈、雙鏈和單鏈DNA以及三鏈、雙鏈和單鏈RNA。它還包括修飾，如甲基化和/或加帽修飾，以及多核苷酸的未修飾形式。更具體而言，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、為嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的任何其它類(lèi)型的多核苷酸，含有非核苷酸骨架〔如多胺(如肽核酸(PNA)和聚嗎啉聚合物(商業(yè)上可從Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，asNeugene獲得)〕的其它聚合物，以及其它合成的序列特異性核酸聚合物，條件是這些聚合物含有核酸堿基(nucleobase)，它們的堿基配對(duì)和堿基堆積構(gòu)型(如在DNA和RNA中所看到的那樣)。并沒(méi)有試圖地區(qū)別“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之間的長(zhǎng)度，這些術(shù)語(yǔ)可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語(yǔ)包括，例如3′-脫氧-2′，5′-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3′P5′氨基磷酸酯、2′-O-烷基-取代的RNA、雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA、DNA:RNA雜交物、PNA與DNA或RNA之間的雜交物。這些術(shù)語(yǔ)還包括已知類(lèi)型的修飾，如本領(lǐng)域已知的標(biāo)記物；甲基化；“加帽”；一個(gè)或多個(gè)天然核苷酸被類(lèi)似物的取代；以及核苷酸之間的修飾，如不帶電的連接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶負(fù)電的連接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、帶正電的連接(如氨烷基氨基磷酸酯、氨烷基磷酸三酯)；含有側(cè)鏈部分的分子，如蛋白質(zhì)(包括核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴(lài)氨酸等)；具有嵌入劑如吖啶、補(bǔ)骨脂素等的分子，；含有螯合劑如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等的分子；含有烷基化劑的分子；具有修飾的連接(如α端基異構(gòu)的核酸等)的分子；以及多核苷酸或寡核苷酸的非修飾形式。尤其是，DNA是脫氧核糖核酸。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“靶核酸區(qū)域”或“靶核酸”指具有被擴(kuò)增“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是單鏈或雙鏈形式，可包括除了靶序列之外的其它不被擴(kuò)增的序列。術(shù)語(yǔ)“靶序列”指靶核酸的將被擴(kuò)增的具體核苷酸序列。靶序列可包括含于靶分子中的探針雜交區(qū)域，在所需條件下探針將與此區(qū)域形成穩(wěn)定的雜交物。“靶序列”還可包括寡核苷酸引物能與之復(fù)合、且以該靶序列為模板而被延伸的復(fù)合序列。當(dāng)靶核酸一開(kāi)始就是單鏈時(shí)，術(shù)語(yǔ)“靶序列”還指與存在于靶核酸中的“靶序列”互補(bǔ)的序列。如果“靶核酸”最初是雙鏈，則術(shù)語(yǔ)“靶序列”包括正鏈和負(fù)鏈。
術(shù)語(yǔ)“引物”或“寡核苷酸引物”在本文中指當(dāng)被放置在誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件下(即在核苷酸和誘導(dǎo)聚合反應(yīng)的制劑如DNA或RNA聚合酶的存在下，以及在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH、金屬濃度和鹽濃度的條件下)啟動(dòng)互補(bǔ)性DNA鏈的合成的寡核苷酸。引物較佳是單鏈的，以獲得最大的擴(kuò)增效率，但也可是是雙鏈的。如果是雙鏈，首先處理該引物，以在用其制備延伸產(chǎn)物之前將其鏈分離。這一變性步驟通常通過(guò)加熱實(shí)現(xiàn)，但也可使用堿處理，接著進(jìn)行中和。因此，“引物”與模板互補(bǔ)，并通過(guò)氫鍵或雜交作用與模板復(fù)合，形成引物/模板復(fù)合物，以啟動(dòng)由聚合酶執(zhí)行的合成。在DNA合成方法中，通過(guò)在其與模板互補(bǔ)的3′端加入共價(jià)聯(lián)接的堿基，從而使得該引物得以延伸。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“探針”或“寡核苷酸探針”指含有如上所述多核苷酸的結(jié)構(gòu)，該多核苷酸含有與靶核酸分析物中存在的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。探針的多核苷酸區(qū)域可由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸類(lèi)似物組成。當(dāng)在5′核酶試驗(yàn)(如TaqManTM技術(shù))中使用“寡核苷酸探針”時(shí)，該探針將含有至少一種熒光劑和至少一種猝滅劑。為了檢測(cè)任何擴(kuò)增的靶寡核苷酸序列，該探針將由反應(yīng)中使用的聚合酶的5′內(nèi)切核酸酶活性所消化。在本文中，寡核苷酸探針在毗鄰其5′端將具有足量的磷酸二酯鍵，這樣所使用的5′到3′核酶活性可有效地降解所結(jié)合的探針，以將熒光劑和猝滅劑分離。當(dāng)在TMA技術(shù)中使用寡核苷酸探針時(shí)，探針將如下位所述被適當(dāng)標(biāo)記。
易于理解，雜交序列并不需要具有優(yōu)異的互補(bǔ)性，以提供穩(wěn)定的雜交物。在許多情況下，當(dāng)少于約10％的堿基錯(cuò)配時(shí)，將形成穩(wěn)定的雜交物，而4個(gè)或多個(gè)核苷酸的成環(huán)可忽略不計(jì)。因此，在本文中，“互補(bǔ)”指在試驗(yàn)條件下寡核苷酸與其互補(bǔ)物(通常有約90％或更高的同源性)形成穩(wěn)定的雙倍體。
術(shù)語(yǔ)“雜交”指充分互補(bǔ)的核酸序列之間通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)形成復(fù)合物。當(dāng)引物與靶標(biāo)(模板)“雜交”時(shí)，這些復(fù)合物(或雜交物)足夠穩(wěn)定，以起到如DNA聚合酶啟動(dòng)DNA合成所需的引導(dǎo)作用。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合對(duì)”指相互間特異性結(jié)合的第一分子和第二分子，如能形成核酸雙鏈體的互補(bǔ)多核苷酸對(duì)。通過(guò)樣品中結(jié)合對(duì)的第一成員與第二成員(或者第二成員與第一成員)以比其它組分更高的親和力和特異性相結(jié)合，可以證明該樣品中該結(jié)合對(duì)的第一成員與其第二成員之間的“特異性結(jié)合”。結(jié)合對(duì)的各成員之間的結(jié)合通常是非共價(jià)的。除非本文另有明確指出，否則術(shù)語(yǔ)“親和分子”和“靶分析物”在本文中分別指結(jié)合對(duì)的第一成員和第二成員。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合分子”和“親和分子”在本文中可互換使用，指能通過(guò)化學(xué)或物理方法選擇性地與樣品中存在的可檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合的分子?！斑x擇性結(jié)合”指分子優(yōu)選與感興趣的靶標(biāo)結(jié)合，或者以大于與其它分子結(jié)合時(shí)的親和力與靶標(biāo)結(jié)合。例如，DNA分子將基本上與互補(bǔ)的序列結(jié)合，而不與無(wú)關(guān)的序列結(jié)合。
雙鏈DNA的“解鏈溫度”或“Tm”指雙鏈DNA由于加熱或堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂(如通過(guò)酸處理或堿處理等等)而有一半的螺旋結(jié)構(gòu)丟失時(shí)的溫度。DNA分子的Tm取決于其長(zhǎng)度和堿基組成。富含GC堿基對(duì)的DNA分子，其Tm高于富含AT堿基對(duì)的DNA分子。當(dāng)溫度低于其Tm時(shí)，DNA的分離的互補(bǔ)鏈自發(fā)地重新結(jié)合或退火形成雙鏈DNA。核酸雜交的最高速率出現(xiàn)在約25℃(低于Tm)?？墒褂孟率鲫P(guān)系估算TmTm＝69.3+0.41(GC)％(Marmur等，1962，J.Mol.Biol.，5109-118)。
在本文中，“生物學(xué)樣品”指分離得到的受檢者的組織和液體樣品，通常包括該受檢者產(chǎn)生的抗體。包括這種抗體的典型樣品在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于血液，血漿，血清，糞便排泄物，尿，骨髓，膽汁，脊髓液，淋巴液，皮膚樣品，皮膚、呼吸道、腸和泌尿生殖道的分泌物，眼淚，唾液，乳，血細(xì)胞，器官，活檢組織，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)組成物的樣品，包括但不限于用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞或組織產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基(conditioned media)，如重組細(xì)胞和細(xì)胞成分。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”和“可檢測(cè)的標(biāo)記物”在本文中指能被檢測(cè)的分子，包括但不限于放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、生色團(tuán)、酶、酶底物、輔酶、酶抑制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶液、配體(如生物素、親和素、鏈霉親和素或半抗原)等等。術(shù)語(yǔ)“熒光劑”指能顯示可檢測(cè)范圍內(nèi)的熒光的物質(zhì)或其部分。
II.實(shí)施本發(fā)明的方式在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明并非局限于特定的制劑或加工參數(shù)，顯然，它們是可以變化的。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施例，而并非對(duì)其限制。
雖然與本文所述類(lèi)似或相等的許多組合物和方法可用于實(shí)施本發(fā)明，但本文描述的是優(yōu)選的材料和方法。
如上所述，本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了用于準(zhǔn)確檢測(cè)生物學(xué)樣品中細(xì)小病毒B19感染的新穎引物和探針以及診斷方法。這些方法依賴(lài)于以核酸為基礎(chǔ)的靈敏檢測(cè)技術(shù)，這些檢測(cè)技術(shù)使得含有少量病毒的樣品中的細(xì)小病毒B19靶核酸序列得以鑒別。
具體而言，本發(fā)明者在本文中特征分析了細(xì)小病毒B19基因組中作為診斷試驗(yàn)靶標(biāo)的諸區(qū)域。從這些區(qū)域衍生得到的引物和探針對(duì)于生物學(xué)樣品中細(xì)小病毒B19感染的檢測(cè)非常有用。
上述細(xì)小病毒B19引物和探針可用在核酸中，用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中人細(xì)小病毒B19感染。具體而言，這些試驗(yàn)中使用的引物和探針較佳衍生自細(xì)小病毒B19基因組的長(zhǎng)約4.7kb的片段，該片段對(duì)應(yīng)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的第217-4678位核苷酸。本文的圖3A-3C和圖4A-4C描述了從兩個(gè)不同的細(xì)小病毒B19分離物獲得的此區(qū)域的核苷酸序列。如上述，此片段含有NS1、VP1和VP2編碼區(qū)域。
用于本發(fā)明試驗(yàn)的特別優(yōu)選的引物和探針是根據(jù)細(xì)小病毒B19基因組的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)的，以使得可對(duì)各種分離物引起的細(xì)小病毒B19感染進(jìn)行檢測(cè)。如本文所述，發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒B19基因組的高度保守區(qū)位于跨越第2936-3635位核苷酸〔相對(duì)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的細(xì)小病毒B19基因組的編號(hào)〕的區(qū)域中(700bp)。這個(gè)區(qū)域在該基因組的VP1區(qū)域內(nèi)。圖2A-2U顯示了從21種不同的細(xì)小病毒B19分離物獲得的此區(qū)域的序列。本文圖11A-11Z顯示了從其它26種分離物獲得的序列。序列比較顯示，各分離物的此區(qū)域具有約98-99.5％的序列同源性，使得該區(qū)域是個(gè)非常理想的靶序列。在引物和探針的設(shè)計(jì)中也能滿(mǎn)足要求的是在VP1中發(fā)現(xiàn)的370bp區(qū)域以及圖1所述的214bp片段，前一區(qū)域跨越第3073-3442位核苷酸〔相對(duì)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)的序列編號(hào)〕，后一片段出現(xiàn)在所述4.7kb片段的3′部分，跨越第4728-4941位核苷酸〔相對(duì)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)的序列編號(hào)〕。
使用在這些特殊區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒B19序列的部分作為PCR反應(yīng)引物，如本文以及美國(guó)專(zhuān)利4683195、4683202和4889818所述，以及根據(jù)本文所提供的序列，不難獲得其它分離物的4.7kb、700bp和370bp區(qū)域。獲得具有所需的序列的核苷酸序列的另一方法是，在常規(guī)自動(dòng)化多核苷酸合成儀中產(chǎn)生重疊合成寡核苷酸的退火性互補(bǔ)組，接著用適當(dāng)?shù)腄NA連接酶連接，并通過(guò)PCR擴(kuò)增連接的核苷酸序列?？蓞⒁?jiàn)，如Jayaraman等(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884084-4088。一旦制得或分離到序列，可將它們克隆到任何合適的載體或復(fù)制子中。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員已知道許多克隆載體，而選擇適當(dāng)?shù)目寺≥d體則成了問(wèn)題。合適的載體包括但不限于在與適當(dāng)?shù)目刂圃Y(jié)合時(shí)能進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體或病毒。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)以及下文實(shí)施例所述的技術(shù)，通過(guò)限制酶分析和聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳不難鑒別出重組的克隆。
用于本文試驗(yàn)的引物和探針衍生自這些序列，并不難用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成，如通過(guò)亞磷酰胺化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行的固相合成，如美國(guó)專(zhuān)利4458066和4415732、Beaucage等(1992，Tetrahedron，482223-2311)和第13號(hào)《應(yīng)用生物學(xué)系統(tǒng)用戶(hù)公告》(AppliedBiosystems User Bulletin，1987年4月1日)所述。其它化學(xué)合成方法包括，例如Narang等(Meth.Enzymol.，1979，6890)所述的磷酸三酯法，和Brown等(Meth.Enzymol.，1979，68109)所述的磷酸二酯法，或可采用這些相同的方法將聚(A)或聚(C)或者其它非互補(bǔ)核苷酸延伸物摻入探針中?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法使六乙基氧(hexaethylene oxide)延伸物與探針偶聯(lián)。Cload等，1991，J.Am.Chem.Soc.，113，6324-6326；Levenson等的美國(guó)專(zhuān)利4914210；Durand等，1990，Nucleic AcidRes.，186353-6359；和Horn等，1986，Tet.Lett.，274705-4708。通常，引物序列的長(zhǎng)度在10-75個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)，如15-60，20-40等，更通常是在18-40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，以及為所述范圍內(nèi)的任何長(zhǎng)度。典型的探針長(zhǎng)度在10-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)，如15-40、18-30等，和其長(zhǎng)度可為所述范圍內(nèi)的任何長(zhǎng)度。
此外，探針可與用于檢測(cè)的標(biāo)記物偶聯(lián)。有幾種已知的方法可用于衍生具有反應(yīng)性官能團(tuán)、且允許加入標(biāo)記物的寡核苷酸。例如，可采用幾種方法使探針生物素化，這樣，可通過(guò)親和素結(jié)合放射性、熒光性、化學(xué)發(fā)光性、酶或者電子致密的標(biāo)記物。例如，可參見(jiàn)Broken等，Nucl.Acids.Res.，1978，5363-384，此文獻(xiàn)公開(kāi)了鐵蛋白-親和素-生物素標(biāo)記物的使用；Chollet等，Nucl.Acids Res.，1985，131529-1541，此文獻(xiàn)公開(kāi)了通過(guò)氨烷基磷酰胺連接臂使寡核苷酸的5′端生物素化。也有幾種方法可用于合成氨基衍生的寡核苷酸，這類(lèi)寡核苷酸易于被熒光性的或衍生有氨基反應(yīng)性基團(tuán)的其它類(lèi)型的化合物(如異硫氰酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺等)標(biāo)記。例如，可參見(jiàn)Connolly，1987，Nucl.Acids Res.，153131-3139；Gibson等，1987，Nucl.Acids Res.，156455-6467；和Miyoshi等美國(guó)專(zhuān)利4605735。也有合成巰基衍生的寡核苷酸的方法，這類(lèi)寡核苷酸可與硫醇特異性標(biāo)記物反應(yīng)。例如，可參見(jiàn)Fung等的美國(guó)專(zhuān)利4757141；Connolly等，1985，Nucl.Acids.Res.，134485-4502和Spoat等，1987，Nucl.Acids Res.，154837-4848。Matthews等(Anal.Biochem.，1988，1691-25)提供了標(biāo)記DNA片段方法學(xué)的全面綜述。
例如，可通過(guò)將熒光分子連于探針的非連接末端，從而使探針被熒光標(biāo)記。選擇適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記物的指南可參見(jiàn)Smith等，Meth.Enzymol.，1987，155260-301；Karger等，Nucl.Acids Res.，1991，194955-4962；Haugland，1989，《熒光探針和研究化學(xué)手冊(cè)》(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals)(Molecular Probes.Inc.，Eugene，OR)。優(yōu)選的熒光標(biāo)記物包括熒光素及其衍生物〔如美國(guó)專(zhuān)利4318846和Lee等(Cytometry，1989，10151-164)所述〕、6-FAM、JOE、TAMRY、ROX、HEX-1、HEX-2、ZOE、TET-1或NAN-2等。
此外，可采用以下所述的技術(shù)用吖啶酯(AE)標(biāo)記探針。目前的技術(shù)允許將AE標(biāo)記物置于探針內(nèi)的任何位置上。例如，可參見(jiàn)Nelson等(1995)，《用化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)吖啶酯》(Nonisotopic Probing，Blotting and Sequenceing，Krica L.J.(編)，Academic Press，San Diego，CA；Nelson等(1994)，《雜交保護(hù)檢測(cè)(HPA)在PCR中的應(yīng)用》(The Polymerase Chain Reaction，Mullis等(編)，Birkhauser，Boston，MA)；Weeks等，Clin.Chem.(1983)，291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)，342087-2090。可采用非核苷酸連接臂化學(xué)物直接將AE分子連接到探針上，該化學(xué)物允許將標(biāo)記物置于探針內(nèi)的任何位置上。例如，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5585481和5185439。
某些實(shí)施例加入了內(nèi)部對(duì)照物(IC)或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，將其作為靶標(biāo)俘獲和擴(kuò)增的對(duì)照。較佳的是，IC包含與靶序列不同的序列，能與用于分離樣品中的生物體特異性寡核苷酸的探針序列雜交，并能擴(kuò)增。IC的使用得以控制分離過(guò)程、控制過(guò)程以及檢測(cè)系統(tǒng)，并得以監(jiān)控試驗(yàn)的性能和定量測(cè)試樣品。從中可獲得IC的代表性序列顯示在圖12中。IC可以包含在任何合適的位點(diǎn)，例如，在裂解緩沖液中。在一個(gè)實(shí)施例中，IC包含M13 ssDNA，該DNA含有從細(xì)小病毒B19獲得的核苷酸序列和與探針雜交的獨(dú)特序列，例如，含有從VP1區(qū)域獲得的序列，其中，靶序列通過(guò)取代或刪除5-20個(gè)或更多個(gè)堿基(較佳是5-15個(gè)堿基，例如5，10或15個(gè)，或這些范圍之內(nèi)的任意數(shù)量的堿基)而被修飾。被取代或刪除的堿基較佳位于在靶序列的整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)，這樣僅有2條或3條連續(xù)的序列被替換。因而，例如，如果靶序列是CTACTTGCTGCGGGAGAAAAACACCT(SEQ ID NO91)，則在IC中該序列可以被取代成如AGCTAGACCTGCATGTCACTG(SEQ IDNO90)。
固相載體可另外包括對(duì)該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物(IC探針)特異的探針，從而當(dāng)使用該IC探針有利于捕獲。IC探針可任選地與不同于用于靶序列的可檢測(cè)標(biāo)記物的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)。在可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光團(tuán)的實(shí)施例中，可通過(guò)分光光度分析和檢測(cè)研究所設(shè)界限來(lái)定量測(cè)定IC。通常，通過(guò)用靶標(biāo)的固定IU進(jìn)行滴定(較佳是在較低端)，可確定不干擾靶標(biāo)檢測(cè)的IC拷貝數(shù)，并通過(guò)稀釋國(guó)際上接受的IU的樣品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于細(xì)小病毒B19的定量測(cè)定，可采用8000-125IU的八元組(eightmember panel)。
在另一實(shí)施例中，如本文所述，采用本文所述本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使IC與從樣品中分離的RNA混合。然后用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄該RNA，以提供DNA拷貝?？扇芜x地用標(biāo)記的引物擴(kuò)增cDNA序列(如采用PCR)。通常采用電泳的方法分離擴(kuò)增引物。測(cè)定放射活性的量(與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比)。然后與已知標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的信號(hào)相比計(jì)算出樣品中的mRNA量。
上述引物和探針可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中，用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的細(xì)小病毒B19感染。PCR是一種用于擴(kuò)增核酸分子或分子混合物中所含的所需靶核酸序列的技術(shù)。在PCR中，使用一對(duì)過(guò)量的引物與靶核酸的互補(bǔ)鏈雜交。聚合酶用該靶核酸為模板，分別延伸引物。延伸產(chǎn)物從起初的靶鏈上解離下來(lái)后自身變成靶序列。然后使新的引物雜交，并用聚合酶進(jìn)行延伸。重復(fù)該循環(huán)，以使靶序列分子的數(shù)量成幾何級(jí)數(shù)增加。用于擴(kuò)增樣品中靶核酸序列的PCR方法在本領(lǐng)域中是周知的，并在以下文獻(xiàn)中描述如，Innis等(編)，PCR Protocols(AcademicPress，NY 1990)；Taylor(1991)，《聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基本原理和自動(dòng)化》(PCRA Practical Approach，McPherson等(編)，IRL出版社，牛津)；Saiki等(1986)，Nature，324163；以及美國(guó)專(zhuān)利4683195、4683202和4889818。
具體而言，PCR使用相對(duì)短的寡核苷酸引物，該引物側(cè)接待擴(kuò)增的靶核苷酸序列，引物的3′端是面對(duì)面取向，各引物向?qū)Ψ窖由?。抽提得到多核苷酸樣品，將其變?較佳采用熱處理)，然后使其與過(guò)量的第一和第二引物(以摩爾計(jì))雜交。使用引物和模板依賴(lài)性多核苷酸聚合試劑或模板依賴(lài)性多核苷酸聚合試劑〔如能產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的酶，如大腸桿菌DNA聚合酶I，DNA聚合酶I的Klenow片段，T4 DNA聚合酶，從棲熱水生菌(Thermus aquaticus，Taq，可從各來(lái)源獲得，如Perkin Elmer)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus，United States Biochemicals)、Bacillus stereothermophilus(Bio-Rad)或Thermococcus litoralis(“Vent”聚合酶，NewEngland Biolabs)分離得到的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶〕，在4種脫氧核苷三磷酸(dNTP——dATP、dGTP、dCTP和dTTP)的存在下催化聚合作用。這將產(chǎn)生兩種“長(zhǎng)產(chǎn)物”，在它們的5′末端含有共價(jià)連接于新合成的原始鏈的互補(bǔ)鏈的各自引物。然后將反應(yīng)混合物返回到聚合條件，即，降低溫度、滅活變性劑，或者加入更多的聚合酶，從而啟動(dòng)另一輪循環(huán)。第二輪循環(huán)提供兩條原始鏈、第1輪的兩條長(zhǎng)產(chǎn)物、從原始鏈復(fù)制得到的兩條新的長(zhǎng)產(chǎn)物，以及從所述長(zhǎng)產(chǎn)物復(fù)制得到的兩條“短產(chǎn)物”。此短產(chǎn)物具有靶序列的序列，在其各端有引物。在每增加一輪循環(huán)中，產(chǎn)生另外兩條長(zhǎng)產(chǎn)物，短產(chǎn)物的數(shù)量等于前輪結(jié)束時(shí)留下的長(zhǎng)產(chǎn)物和短產(chǎn)物的數(shù)量。因而，含有靶序列的短產(chǎn)物的量在每一輪中呈指數(shù)增長(zhǎng)。較佳的是，用商業(yè)上可獲得的熱循環(huán)儀如Perkin Elmer進(jìn)行。
可通過(guò)將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后如上述進(jìn)行PCR(RT-PCR)，從而擴(kuò)增RNA?；蛘撸缑绹?guó)專(zhuān)利5322770所述，在兩個(gè)步驟中都使用單一的酶。也可將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著如Marshall等(1994，PCR Meth.App.，480-84)所述進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-AGLCR)。
熒光性5′核酶試驗(yàn)，又稱(chēng)為T(mén)aqManTM試驗(yàn)(Perkin-Elmer)是一種用于核酸靶標(biāo)的強(qiáng)大和通用的PCR檢測(cè)系統(tǒng)。因此，從本文所述細(xì)小病毒B19基因組衍生得到的引物和探針可用于TaqManTM分析中，用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中存在的感染。結(jié)合熱循環(huán)，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的產(chǎn)生進(jìn)行分析。該試驗(yàn)系統(tǒng)省去凝膠電泳分析，并能產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)，從而可測(cè)定靶標(biāo)的拷貝數(shù)。
可使用如具有內(nèi)源性5′核酶活性的AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶方便地進(jìn)行此熒光性5′核酶試驗(yàn)，將內(nèi)源性5′核酸酶能消化標(biāo)記了熒光報(bào)道染料和猝滅劑的內(nèi)部寡核苷酸探針〔參見(jiàn)，Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)，887276-7280；和Lee等，Nucl.Acids Res.(1993)，213761-3766)。通過(guò)測(cè)量擴(kuò)增循環(huán)中熒光產(chǎn)生的變化(隨著熒光探針被消化、染料和猝滅劑標(biāo)記物被釋放并引起與靶DNA的擴(kuò)增成正比例的熒光信號(hào)的增加)，可檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。
可檢測(cè)溶液中擴(kuò)增產(chǎn)物，或者使用固相載體。在此方法中，需設(shè)計(jì)能與所需的PCR產(chǎn)物內(nèi)的靶序列雜交的TaqManTM探針。該TaqManTM探針的5′端含有熒光報(bào)道染料。該探針的3′端被封閉，以防止探針延伸，并且該3′端含有將使5′熒光團(tuán)的熒光猝滅的染料。在隨后的擴(kuò)增過(guò)程中，如果在反應(yīng)中存在具有5′核酸外切酶活性的聚合酶，該5′熒光標(biāo)記物將被切下。5′熒光團(tuán)的切除導(dǎo)致熒光增加，這可被檢測(cè)到。
具體而言，構(gòu)建寡核苷酸探針，使其在未雜交時(shí)以至少單鏈的構(gòu)型存在，其中猝滅劑分子離該報(bào)道分子足夠近，以猝滅報(bào)道分子產(chǎn)生的熒光。當(dāng)與靶多核苷酸雜交時(shí)，寡核苷酸探針還具有至少一種構(gòu)型，即猝滅劑分子不位于離報(bào)道分子足夠近的地方，以不讓其猝滅報(bào)道分子產(chǎn)生的熒光。通過(guò)采用這些雜交和非雜交構(gòu)型，當(dāng)探針處于雜交和非雜交狀態(tài)時(shí)，它上面的報(bào)道分子和猝滅劑分子顯示不同的熒光信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果，可根據(jù)報(bào)道分子、猝滅劑分子或者它們的組合所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的變化，測(cè)定探針是否雜交或未雜交。此外，因?yàn)榭蓪⑻结樤O(shè)計(jì)成當(dāng)它未雜交時(shí)猝滅劑分子將猝滅報(bào)道分子，所以也可將探針設(shè)計(jì)成除非它被雜交或被消化否則報(bào)道分子顯示有限的熒光的形式。
因此，本發(fā)明涉及使用具有5′到3′核酶活性的核酸聚合酶、一種或多種能雜交到該靶B19序列上的引物、以及相對(duì)于所述引物能與該靶B19序列雜交的3端的探針擴(kuò)增靶細(xì)小病毒B19核苷酸序列的方法。在擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)寡核苷酸探針與靶序列雜交時(shí)，聚合酶將其消化，從而使報(bào)道分子與猝滅劑分子分離。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)報(bào)道分子的熒光，這些熒光對(duì)應(yīng)于所發(fā)生的核酸擴(kuò)增。報(bào)道分子較佳是熒光染料，猝滅劑分子較佳是若丹明染料。
雖然可改變引物和探針的長(zhǎng)度，但是可選擇探針序列，以使它們的解鏈溫度低于引物序列的解鏈溫度。因此，引物序列通常長(zhǎng)于探針序列。通常，引物序列長(zhǎng)約10-75個(gè)核苷酸，更通常在20-45個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。通常的探針長(zhǎng)度在10-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)，更通常在15-40個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
如果使用了固相載體，可以各種方法將寡核苷酸探針連接到固相載體上。例如，可通過(guò)使探針的3′端或5′端核苷酸與固相載體結(jié)合，從而使探針結(jié)合于固相載體上。更佳的是，通過(guò)使探針與固相載體遠(yuǎn)離的連接物將探針連接到固相載體上。通常，連接物長(zhǎng)至少15-30個(gè)原子，更佳在至少15-50個(gè)原子的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。所需的連接物長(zhǎng)度將取決于具體使用的固相載體。例如，當(dāng)使用高度交聯(lián)的聚苯乙烯作為固相載體時(shí)，6原子的連接物通常已足夠。
本領(lǐng)域已知各種各樣的連接物，它們可用于將寡核苷酸探針連接到固相載體上。連接物可由各種不顯著干擾靶序列與連接于固相載體上的探針雜交的化合物形成。連接物可以由均聚寡核苷酸形成，可通過(guò)自動(dòng)合成將所述寡核苷酸容易地加到連接物上。或者，可使用聚合物如功能化的聚乙二醇作為連接物。這類(lèi)聚合物比均聚的寡核苷酸優(yōu)選，因?yàn)樗鼈儾幻黠@干擾探針與靶寡核苷酸的雜交。特別優(yōu)選的是聚乙二醇。
較佳的是，在堿性以及高溫條件下除去堿基保護(hù)基團(tuán)的過(guò)程中，固相載體、連接物以及探針之間的連接鍵不被斷裂。優(yōu)選的連接鍵的例子包括氨基甲酸酯鍵和酰胺鍵。
用于固定寡核苷酸探針的固相載體的優(yōu)選類(lèi)型，包括可控制孔玻璃(poreglass)、玻璃板、聚苯乙烯、親和素包被的聚苯乙烯珠、纖維素、尼龍、丙烯酰胺凝膠和活化的葡聚糖。
關(guān)于TaqManTM試驗(yàn)、試劑以及其所用條件的詳細(xì)描述，可參見(jiàn)如Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，887276-7280；美國(guó)專(zhuān)利5538848、5723591和5876930。
也可將本文所述的細(xì)小病毒B19序列用作轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)控制(TMA)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。TMA提供了一種鑒別生物學(xué)樣品中存在的極少量靶核酸序列的方法。這些序列可以是采用直接的檢測(cè)方法難以或不可能檢測(cè)到的。具體而言，TMA是一種等溫的、自動(dòng)催化的靶核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，它可提供靶序列的10億以上的RNA拷貝。可定性地進(jìn)行該檢測(cè)，以準(zhǔn)確檢測(cè)生物學(xué)樣品中靶序列的存在與否。該檢測(cè)還可提供定量的測(cè)量，用于測(cè)量超過(guò)幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)靶序列的量。TMA提供一種自動(dòng)催化合成多個(gè)靶核酸拷貝而不需對(duì)反應(yīng)條件(如溫度、離子強(qiáng)度和pH)進(jìn)行重復(fù)操作的方法。
通常，TMA包括以下步驟(a)從懷疑被細(xì)小病毒B19感染的感興趣的生物學(xué)樣品中分離出核酸，包括RNA；(b)將其混合入反應(yīng)混合物中，該混合物含有(i)所述分離的核酸，(ii)第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，該第一引物具有與RNA靶序列(如果存在，比如正鏈)的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，該第二引物具有與RNA靶序列的互補(bǔ)序列(如果存在，比如負(fù)鏈)的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第一寡核苷酸還含有一相對(duì)于該復(fù)合序列的5′序列，它含有一啟動(dòng)子，(iii)反轉(zhuǎn)錄酶或RNA和DNA依賴(lài)性DNA聚合酶，(iv)能選制性降解RNA-DNA復(fù)合物的RNA鏈的酶(如RNA酶H)和(v)能識(shí)別該啟動(dòng)子的RNA聚合酶。
可將該反應(yīng)混合物的各組分逐步混合，或者一次性混合。在形成寡核苷酸/靶序列，包括DNA延伸和核酸合成條件(包括核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸)的條件下培育該反應(yīng)混合物一段時(shí)間，使其足以產(chǎn)生多個(gè)靶序列拷貝。有利的是，該反應(yīng)在適合于維持反應(yīng)組分(如組成的酶)的穩(wěn)定性而不需要改動(dòng)或操作擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)條件的情況下進(jìn)行。因此，該反應(yīng)可在熱基本上穩(wěn)定、和離子強(qiáng)度和pH基本上恒定的條件下進(jìn)行。該反應(yīng)常規(guī)上不需要變性步驟來(lái)將第一DNA延伸反應(yīng)所產(chǎn)生的RNA-DNA復(fù)合物分離。
合適的DNA聚合酶包括反轉(zhuǎn)錄酶，如鳥(niǎo)成髓細(xì)胞增多癥病毒(AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶(可從如Seikagaku America，Inc.獲得)和莫洛尼鼠類(lèi)白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶(可從如Bethesda Research Laboratories獲得)。
適合摻入引物中的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子序列是RNA聚合酶特異性識(shí)別的核酸序列(天然的、合成產(chǎn)生的或者是限制性消化的產(chǎn)物)，該聚合酶能識(shí)別并結(jié)合于該序列并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。該序列可任選地包含延伸到RNA聚合酶實(shí)際識(shí)別位點(diǎn)以外的核苷酸堿基，這些堿基可能賦予對(duì)降解過(guò)程的額外的穩(wěn)定性或易感性，或者賦予增加的轉(zhuǎn)錄效率。有用的啟動(dòng)子例子包括被某些噬菌體聚合酶(如從噬菌體T3、T7或SP6獲得的聚合酶)識(shí)別的啟動(dòng)子，或者從大腸桿菌獲得的啟動(dòng)子。這些RNA聚合酶可容易地從商業(yè)來(lái)源獲得，如從New EnglandBiolabs和Epicentre獲得。
適用于本文所述方法的一些反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶H活性，如AMV反轉(zhuǎn)錄酶。但是，即使當(dāng)使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶時(shí)，仍可以?xún)?yōu)選地加入RNA酶H，如大腸桿菌RNA酶H。可從Bethesda Research Laboratories容易地獲得RNA酶H。
這些方法產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄子均可作為模板，通過(guò)上述機(jī)制產(chǎn)生靶序列的額外拷貝。該系統(tǒng)是自身催化系統(tǒng)，且自身催化地進(jìn)行擴(kuò)增，不需要重復(fù)修改或改變反應(yīng)的條件，如溫度、pH、離子強(qiáng)度等。
可采用各種方法進(jìn)行檢測(cè)，包括直接測(cè)序、與序列特異性寡聚物雜交、凝膠電泳和質(zhì)譜。這些方法可利用異源的或同源的格式、同位素或非同位素標(biāo)記物以及根本不用標(biāo)記物。
一種優(yōu)選的檢測(cè)方法是使用靶序列特異性寡核苷酸探針，該探針衍生自上述4.7kbp、700bp、340bp和214bp片段。該探針可用于雜交保護(hù)試驗(yàn)(HPA)，在一個(gè)實(shí)施例中，可方便地用吖啶酯(AE，一種高化學(xué)發(fā)光的分子)標(biāo)記該探針。例如，可參見(jiàn)Nelson等(1995)，《用化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)吖啶酯》(Nonisotopic Probing，Blottingand Sequenceing，Krica L.J.(編)，Academic Press，San Diego，CA；Nelson等(1994)，《雜交保護(hù)試驗(yàn)(HPA)在PCR中的應(yīng)用》(The Polymerase Chain Reaction，Mullis等(編)，Birkhauser，Boston，MA)；Weeks等，Clin.Chem.(1983)，291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)，342087-2090?？刹捎梅呛塑账徇B接臂化學(xué)物質(zhì)直接將AE分子連接到探針上，該化學(xué)物允許將標(biāo)記物置于探針內(nèi)的任何位置上。例如，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5585481和5185439。通過(guò)與堿性過(guò)氧化氫反應(yīng)可觸發(fā)化學(xué)發(fā)光，該堿性過(guò)氧化氫產(chǎn)生激發(fā)的N-甲基吖啶酮，該酮發(fā)射光子，然后恢復(fù)到基態(tài)。此外，AE引起酯水解，產(chǎn)生非化學(xué)發(fā)光的甲基吖啶羧酸(methyl acridiniumcarboxylic acid)。
當(dāng)AE分子共價(jià)連接于核酸探針時(shí)，在溫和的堿性條件下快速水解。當(dāng)AE標(biāo)記的探針與靶核酸準(zhǔn)確互補(bǔ)時(shí)，AE水解的速度極大地減小。因而，可直接檢測(cè)溶液中雜交和未雜交的AE標(biāo)記的探針，而不需要進(jìn)行物理分離。
HPA通常由以下步驟組成(a)使AE標(biāo)記的探針與溶液中的靶核酸雜交約15-30分鐘。然后加入溫和的堿性溶液，偶聯(lián)于未雜交探針的AE被水解。這個(gè)反應(yīng)大約費(fèi)時(shí)5-10分鐘。檢測(cè)留下的與雜交物結(jié)合的AE，作為對(duì)所存在的靶數(shù)量的衡量。此步驟費(fèi)時(shí)約2-5秒。較佳的是，在與雜交步驟的溫度相同的溫度下進(jìn)行差分水解(differential hydrolysis)，通常是在50-70℃下進(jìn)行?；蛘撸稍谑覝叵逻M(jìn)行第二差分水解。這可使用較高的pH，例如在10-11范圍的pH，在此范圍內(nèi)，雜交的和未雜交的AE標(biāo)記探針之間的水解速率將產(chǎn)生較大的差異。關(guān)于HPA的詳細(xì)描述，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6004745、5948899和5283174。
關(guān)于TMA的詳細(xì)描述，可參見(jiàn)如美國(guó)專(zhuān)利5399491。在典型試驗(yàn)的一個(gè)實(shí)施例中，將懷疑含有細(xì)小病毒B19靶序列的分離的核酸樣品與含有緩沖液、鹽、鎂、核苷三磷酸、引物、二硫赤蘚糖醇和亞精胺的濃縮緩沖液混合。反應(yīng)任選地在約100℃培育約2分鐘，以使二級(jí)結(jié)構(gòu)變性。冷卻至室溫后，加入反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶和RNA酶H，使混合物在37℃培育2-4小時(shí)。然后可通過(guò)使產(chǎn)物變性、加入探針溶液、在60℃培育20分鐘、加入溶液來(lái)選擇性水解未雜交的探針、在60℃培育該反應(yīng)混合物6分鐘，并在發(fā)光計(jì)下測(cè)量殘余的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，從而對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的寡核苷酸分子還可用于核酸序列擴(kuò)增(NASBA)中。此方法是一種啟動(dòng)子指導(dǎo)的酶學(xué)方法，包括誘導(dǎo)特異的核酸在體外進(jìn)行連續(xù)的均一的和熱溫度的擴(kuò)增，以提供該核酸的RNA拷貝。用于進(jìn)行NASBA的試劑包括5′尾具有含有啟動(dòng)子的第一DNA引物、第二DNA引物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶、NTP和dNTP。采用NASBA，可從單鏈RNA或DNA或者雙鏈DNA產(chǎn)生大量的單鏈RNA。當(dāng)要擴(kuò)增RNA時(shí)，將ssRNA作為模板，通過(guò)延長(zhǎng)含有RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)的第一引物而合成第一DNA鏈。此DNA鏈進(jìn)而又可作為合成第二互補(bǔ)DNA鏈的模板，通過(guò)第二引物的延伸產(chǎn)生雙鏈活性RNA聚合酶啟動(dòng)子位點(diǎn)。而在RNA聚合酶的幫助下，該第二DNA鏈又可作為合成大量第一模板(ssRNA)的模板。NASBA技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，在以下文獻(xiàn)中有描述例如，歐洲專(zhuān)利329822、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 91/02814和美國(guó)專(zhuān)利6063603、5554517和5409818。
還可將本文所述的細(xì)小病毒B19序列用于利用分支DNA分子的核酸雜交和擴(kuò)增技術(shù)中。在一個(gè)基本的核酸雜交試驗(yàn)中，將單鏈分析物核酸雜交到標(biāo)記的單鏈核酸探針上，然后檢測(cè)所獲得的標(biāo)記的雙鏈體。已發(fā)展了此基本方案的各種改進(jìn)，以促進(jìn)待檢測(cè)的雙鏈體與外來(lái)物質(zhì)相分離，和/或擴(kuò)增要檢測(cè)的信號(hào)。擴(kuò)增信號(hào)的一個(gè)方法是使用擴(kuò)增多聚體，該多聚體是具有與分析物核酸或結(jié)合于該分析物的核酸的鏈特異性雜交的第一片段和特異性與標(biāo)記的探針雜交的第二片段的重復(fù)子(iteration)的多核苷酸。擴(kuò)增產(chǎn)物在理論上與所述第二片段的重復(fù)子的量成正比的。多聚體可以是直鏈的，也可以是分支的。兩種通常類(lèi)型的分支多聚體，即分叉型的和梳子型的，可用于這些技術(shù)。制備和使用分支核酸分子的方法在本領(lǐng)域中是已知的，在如美國(guó)專(zhuān)利5849481中有描述。
在本發(fā)明的另一方面，實(shí)施上述兩種或多種試驗(yàn)，以證實(shí)生物體的存在。例如，如果第一個(gè)試驗(yàn)使用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)來(lái)擴(kuò)增核酸，以進(jìn)行檢測(cè)，則采用如本文所述的PCR擴(kuò)增、RT PCR等進(jìn)行另一核酸測(cè)試試驗(yàn)(NAT)。因而，即使當(dāng)樣品中含有其它生物體如HIV和乙型肝炎病毒時(shí)，仍可特異性地和選擇性地檢測(cè)細(xì)小病毒B19。
不難明白，本文所述試驗(yàn)的設(shè)計(jì)將會(huì)有許多變化，而許多形式都是本領(lǐng)域已知的。以上描述僅僅提供了一個(gè)向?qū)В绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)不難修改上述方案。
上述試驗(yàn)的試劑，包括引物、探針、結(jié)合有探針的固相載體以及其它檢測(cè)試劑，可提供在試劑盒中，這類(lèi)試劑盒具有適當(dāng)?shù)恼f(shuō)明書(shū)和其它必需的試劑，以進(jìn)行上述試驗(yàn)。通常，在試劑盒分開(kāi)的容器中含有引物和探針的組合(已結(jié)合于固相基質(zhì)上，或者與將它們結(jié)合于基質(zhì)上的試劑分開(kāi))、對(duì)照制劑(陽(yáng)性的和/或陰性)、標(biāo)記的試劑(當(dāng)試驗(yàn)形式需要該試劑時(shí))和產(chǎn)生信號(hào)試劑(如酶底物，如果標(biāo)記物不直接產(chǎn)生信號(hào))。通常，試劑盒中將包括指導(dǎo)實(shí)施試驗(yàn)的說(shuō)明書(shū)(如書(shū)寫(xiě)的紙張、磁帶、VCR、CD-ROM等)，這取決于所用的具體的試驗(yàn)、其它的包裝試劑和材料(如洗滌緩沖液等)?？墒褂眠@些試劑盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)(如上面所述)。
III.實(shí)驗(yàn)以下是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅用于闡述性的目的，不能認(rèn)為它們以任何方式限定了本發(fā)明的范圍。
已作出努力來(lái)確保所使用數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差當(dāng)然應(yīng)允許存在。
在下述實(shí)施例中，從商業(yè)來(lái)源購(gòu)得酶，并根據(jù)制造商的建議使用。硝基纖維素濾紙等也從商業(yè)來(lái)源購(gòu)得。
除非另有說(shuō)明，否則，在DNA片段的分離中，所有的DNA操作都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。可參見(jiàn)，Sambrook等，同上?？蓮纳唐饭?yīng)商購(gòu)得限制酶、T4DNA連接酶、大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow片段和其它生物學(xué)試劑，并根據(jù)制造商的建議使用。在瓊脂糖凝膠上分離雙鏈DNA片段。
實(shí)施例1用于PCR的細(xì)小病毒B19核酸抽提物從商業(yè)來(lái)源獲得先前已通過(guò)IgM或PCR試驗(yàn)測(cè)定為人細(xì)小病毒B19陽(yáng)性的人血清樣品，并將其用于分離后面的PCR實(shí)驗(yàn)所用的DNA。樣品保存在-80℃，直至使用。
根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)以及下述考慮，使用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)從0.2毫升的血清中抽提DNA。將載體DNA加到裂解緩沖液中，以增強(qiáng)核酸結(jié)合和產(chǎn)率。具體而言，加入5.6μg/樣品的聚腺苷酸5′(Sigma，St.Louis，MO)或聚-dA(Roche，Indianapolis，IN)。此外，用200微升的AE緩沖液代替水洗脫細(xì)小病毒B19 DNA。
實(shí)施例2
采用PCR檢測(cè)細(xì)小病毒19核酸陽(yáng)性樣品采用兩種不同的PCR方法擴(kuò)增細(xì)小病毒B19片段。如下文詳細(xì)描述，一種方法用于擴(kuò)增大約700bp、370bp和214bp的片段(見(jiàn)圖1)。采用高保真度延伸PCR(Roche)擴(kuò)增大約4.7kb的片段。該大約700bp的片段對(duì)應(yīng)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸。所述約370bp的片段位于該700bp片段內(nèi)，對(duì)應(yīng)于第3073-3442位核苷酸。所述約4.7kb的片段是長(zhǎng)4677個(gè)核苷酸的片段，對(duì)應(yīng)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的第217-4893位核苷酸。
為了擴(kuò)增長(zhǎng)約700bp、370bp和214bp的片段，使用下表1所示的引物。
表1引物序列 PCR產(chǎn)物基因組區(qū)域VP-5 AGGAAGTTTGCCGGAAGTTC(SEQ ID NO36) 370bpVP1VP-3 GTGCTGAAACTCTAAAGGTG(SEQ ID NO37) 370bpVP1VP2-5 GACATGGATATGAAAAGCCTGAAG(SEQ ID NO38) 214bpVP1/VP2VP2-3 GTTGTTCATATCTGGTTAAGTACT(SEQ ID NO39) 214bpVP1/VP2K-1sp ATAAATCCATATACTCATT(SEQ ID NO40) 700bpVP1/VP2K-2sp CTAAAGTATCCTGACCTTG(SEQ ID NO41) 700bpVP1/VP2在此實(shí)驗(yàn)中，PCR在最終體積為100微升的溶液中進(jìn)行，使用到2微升純化的細(xì)小病毒B19 DNA(如上所述進(jìn)行純化)、0.2mM的各種脫氧核苷三磷酸和1.25Pfu單位的DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)。擴(kuò)增過(guò)程包括94℃變性2分鐘，37℃引物退火3分鐘，72℃延伸3分鐘，共進(jìn)行35輪。在該35輪中，分別94℃3分鐘預(yù)培育，以確保最初的變性，和72℃最后7分鐘培育，以確保所先前的和隨后的片段的完全延伸。將PCR產(chǎn)物在7％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，溴乙錠染色，UV源下觀察。使用QiaQuick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化擴(kuò)增的片段。
當(dāng)在聚丙烯酰胺凝膠上看不到700bp條帶時(shí)，進(jìn)行嵌套式PCR，以擴(kuò)增370bp的B19片段。將700bp DNA用于嵌套式PCR，其中使用到表1所示的引物。
如下采用高保真度延伸PCR(Roche)擴(kuò)增細(xì)小病毒B19的4.7kb片段。根據(jù)賣(mài)主的建議使用高保真度延伸PCR試劑盒(Roche)和引物Hicks-5(5′-CCCGCCYYAYGCAAAYGGGCAG3′)(SEQ ID NO42)和Hicks-3(5′TTGTGTTAGGCTGTCTTATAGG3′)(SEQ ID NO43)。擴(kuò)增條件是94℃1分鐘，50℃2分鐘，68℃4分鐘，進(jìn)行35或45輪。還包括在94℃進(jìn)行2分鐘的預(yù)培育，和在75℃進(jìn)行7分鐘的后培育。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，使用PCR純化試劑盒(Promega，Madison，WI)進(jìn)行純化。
實(shí)施例3細(xì)小病毒B19 DNA片段的克隆將PCR片段克隆到TOPO-TA載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，當(dāng)擴(kuò)增的DNA在其3′端含有一個(gè)的脫氧腺苷(A)時(shí)，極大地有利于將PCR產(chǎn)物克隆到載體中。因此，采用催化反應(yīng)加入3′(A)頭。反應(yīng)混合物含有1.25mM的dATP、0.5單位的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Boston，MA)，反應(yīng)在72℃進(jìn)行15分鐘。
使用Invitrogen的TA克隆試劑盒(TOPOTMTA CloningR試劑盒，具有One ShotTOP10 Electrocompetent Cells)，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，將PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中。在含有100μg/ml的氨芐青霉素、0.66mM IPTG和0.033％X-Gal的Luria肉湯平板上孵育細(xì)菌細(xì)胞。將大量的白色菌落接種到4毫升含有氨芐青霉素(100μg/ml)的Luria肉湯中，37℃搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)。用3毫升過(guò)夜培養(yǎng)物制備質(zhì)粒DNA，其中使用到QIAprep Miniprep試劑盒(QIAGEN)。用EcoRI(NewEngland and Biolabs)進(jìn)行限制酶分析，并如上所述進(jìn)行7％聚丙烯酰胺凝膠電泳或1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒別出重組的克隆。
為了測(cè)定這些克隆的DNA序列，如上所述制備重組克隆的大量的質(zhì)粒，并將DNA以0.2mg/ml懸浮在TE(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。使用AppliedBiosystems 373型(或377型)DNA測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)小病毒B19片段的核苷酸序列測(cè)定。
圖2A到2U(SEQ ID NO1-21)描述了從21種細(xì)小病毒B19分離物中得到的DNA序列，這些DNA序列已如上述被純化、擴(kuò)增和測(cè)序。這些序列對(duì)應(yīng)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)上述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸(即圖1所示的700bp片段)。圖2A(SEQ ID NO1)是從分離物CH47-26獲得的序列；圖2B(SEQ ID NO2)是從分離物CH48-29獲得的序列；圖2C(SEQ ID NO3)是從分離物CH33-2獲得的序列；圖2D(SEQ ID NO4)是從分離物CH33-3獲得的序列；圖2E(SEQ ID NO5)是從分離物CH33-4獲得的序列；圖2F(SEQ ID NO6)是從分離物CH42-7獲得的序列；圖2G(SEQ ID NO7)是從分離物CH42-18獲得的序列；圖2H(SEQ ID NO8)是從分離物CH42-19獲得的序列；圖2I(SEQ ID NO9)是從分離物CH46-23獲得的序列；圖2J(SEQ ID NO10)是從分離物CH1-1獲得的序列；圖2K(SEQ ID NO11)是從分離物CH1-6獲得的序列；圖2L(SEQ ID NO12)是從分離物CH2-8獲得的序列；圖2M(SEQ ID NO13)是從分離物CH2-10獲得的序列；圖2N(SEQ ID NO14)是從分離物CH2-11C獲得的序列；圖2O(SEQ ID NO15)是從分離物CH5-13獲得的序列；圖2P(SEQ ID NO16)是從分離物CH7-22獲得的序列；圖2Q(SEQ ID NO17)是從分離物CH13-27獲得的序列；圖2R(SEQ IDNO18)是從分離物CH14-33獲得的序列；圖2S(SEQ ID NO19)是從分離物CH62-2獲得的序列；圖2T(SEQ ID NO20)是從分離物CH64-2獲得的序列；圖2U(SEQ IDNO21)是從分離物CH67-2獲得的序列。
圖11A到圖11Z(SEQ ID NO62-87)描述從另外26種細(xì)小病毒B19分離物獲得的DNA序列，這些序列如上述被純化、擴(kuò)增和測(cè)序，包括對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸的序列(圖1的700bp片段)。圖11A(SEQ ID NO62)是從分離物CH80-1獲得的序列；圖11B(SEQ ID NO63)是從分離物CH81-3獲得的序列；圖11C(SEQ ID NO64)是從分離物B19SCL1-4獲得的序列；圖11D(SEQ ID NO65)是從分離物B19SCL2-1獲得的序列；圖11E(SEQ ID NO66)是從分離物B19SCL3-1獲得的序列；圖11F(SEQID NO67)是從分離物B19SCL4-3獲得的序列；圖11G(SEQ ID NO68)是從分離物B19SCL5-2獲得的序列；圖11H(SEQ ID NO69)是從分離物B19SCL6-2獲得的序列；圖11I(SEQ ID NO70)是從分離物B19SCL7-3獲得的序列；圖11J(SEQ ID NO71)是從分離物B19SCL8-2獲得的序列；圖11K(SEQ ID NO72)是從分離物B19SCL9-1獲得的序列；圖11L(SEQ ID NO73)是從分離物B19SCL9-9獲得的序列；圖11M(SEQ ID NO74)是從分離物B19SCL10-2獲得的序列；圖11N(SEQ ID NO75)是從分離物B19SCL11-1獲得的序列；圖11O(SEQ ID NO76)是從分離物B19SCL12-1獲得的序列；圖11P(SEQ ID NO77)是從分離物B19SCL13-3獲得的序列；圖11Q(SEQ ID NO78)是從分離物B19SCL14-1獲得的序列；圖11R(SEQ IDNO79)是從分離物B19SCL15-3獲得的序列；圖11S(SEQ ID NO80)是從分離物B19SCL16-2獲得的序列；圖11T(SEQ ID NO81)是從分離物B19SCL17-1獲得的序列；圖11U(SEQ ID NO82)是從分離物B19SCL18-1獲得的序列；圖11V(SEQ IDNO83)是從分離物B19SCL19-1獲得的序列；圖11W(SEQ ID NO84)是從分離物B19SCL20-3獲得的序列；圖11X(SEQ ID NO85)是從分離物B19SCL21-3獲得的序列；圖11Y(SEQ ID NO86)是從分離物B19SCL22-11獲得的序列；圖11Z(SEQ IDNO87)是從分離物B19SCL2-14獲得的序列。
序列比較揭示，各分離物之間的這700bp序列有大約98-99.5％的序列同源性。
圖3A-3C(SEQ ID NO22)顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的圖1所示的大約4.7kbp的PCR片段的序列。該序列為長(zhǎng)4677個(gè)核苷酸的片段，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。該序列含有細(xì)小病毒B19全長(zhǎng)開(kāi)放讀框和額外的5′和3′非翻譯序列，該讀框編碼NS1、VP1和VP2。測(cè)序的該片段在5′非編碼區(qū)含有一個(gè)額外的核苷酸，位于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所報(bào)道的B19序列的第367位到第368位核苷酸之間。
圖4A-4C(SEQ ID NO23)顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的圖1所示的大約4.7kbp的PCR片段的序列。該序列為長(zhǎng)4677個(gè)核苷酸的片段，對(duì)應(yīng)于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。該序列含有細(xì)小病毒B19全長(zhǎng)開(kāi)放讀框和額外的5′和3′非翻譯序列，該讀框編碼NS1、VP1和VP2。測(cè)序的片段在5′非編碼區(qū)含有額外的核苷酸，位于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所報(bào)道的B19序列的第367位和第368位核苷酸之間。
實(shí)施例4細(xì)小病毒B19 NS1、VP1和VP2重組蛋白的克隆和表達(dá)使用克隆于pCR2.1-TOPO(如上述)中的細(xì)小病毒B19的4.7kb片段擴(kuò)增編碼NS1、VP1和VP2的片段。具體而言，設(shè)計(jì)PCR引物(見(jiàn)下文)，以采用PCR擴(kuò)增細(xì)小病毒B19的NS1、VP1和VP2區(qū)域。為促進(jìn)這些區(qū)域被克隆到酵母表達(dá)載體中，根據(jù)需要在引物中引入XbaI、HindIII和SalI限制性位點(diǎn)。
用于克隆和擴(kuò)增細(xì)小病毒B19片段以在酵母中表達(dá)NS1、VP1和VP2重組蛋白的引物以上述獲得的序列為基礎(chǔ)，顯示如下NS1-5(有義引物)5’ATACTCTCTAGACAAAACAAAATGGAGCTATTTAGAGGGGTGCTTCAAGTTTCT3’(SEQ ID NO44)NS1-3(反義引物)5’GAGTATGTCGACTTACTCATAATCTACAAAGCTTTGCAATCCAGACAG3’(SEQ ID NO45)VP1-5SN(有義引物)5’ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGAGTAAAGAAAGTGGCAAATGGTGGGAAAGT3’(SEQ ID NO46)VPALL-3(反義引物)5’GAGTATGTCGACTTACAATGGGTGCACACGGCTTTTGGCTGTCCACAATTC3’(SEQ IDNO47)VP-25SN(有義引物)5’ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGACTTCAGTTAATTCTGCAGAAGCCAGCACT3’(SEQ ID NO48)合成、純化PCR引物，使其懸浮在300微升的dH2O中，測(cè)定它們?cè)?60nm的光密度。此反應(yīng)混合物含有0.25ng的模板、100pmol的各引物、10微升1.25mM的各dNTP和1單位的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Boston，MA)，最終體積為50微升。擴(kuò)增條件是94℃1分鐘、50℃2分鐘、68℃4分鐘，共35輪。還增加7分鐘75℃的后培育，以確保各片段完全延伸。用5微升等份在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以檢查PCR合成。然后電泳分離完整的PCR產(chǎn)物，使用PCR純化試劑盒(Promega)，根據(jù)賣(mài)主的推薦，從凝膠中純化得到具有所期望大小的片段。用適當(dāng)?shù)南拗泼?Roche)37℃消化大約0.8微克純化的PCR DNA 3小時(shí)，然后用Promega的PCR純化試劑盒進(jìn)一步純化所得產(chǎn)物。
將質(zhì)粒pBS24.1用于細(xì)小病毒B19重組蛋白的異源表達(dá)。這種酵母表達(dá)載體含有2μ序列和用于在酵母中自身復(fù)制的反向重復(fù)序列(IR)、用于確保轉(zhuǎn)錄終止的α-終止子，以及用于選擇的酵母leu2-d和URA3。復(fù)制的ColE1起點(diǎn)和β-內(nèi)酰胺酶基因也同樣存在，用于在大腸桿菌中繁殖和選擇〔Pichuantes等，1996，《異源基因產(chǎn)物在酵母中的表達(dá)》，“Protein EngineeringA Guide to Design andproduction”，第5章，J.L.Cleland和C.Craik編輯，Wiley-Liss，Inc.，紐約，N.Y.，第129-161頁(yè)〕。用BamHI/SalI消化質(zhì)粒pBS24.1，并在賣(mài)主推薦的條件下，用10單位的牛小腸堿性磷酸酶(Boheringer Manheim，Indianapolis，IN)去磷酸化。將經(jīng)消化和純化的PCR片段與BamHI/SalI消化的質(zhì)粒pBS24.1以及含有用BamHI/SfuI或BamHI/HindIII消化的酵母雜交啟動(dòng)子ADH2/GAPDH(Cousens等，Gene，1987，61265-275)的DNA片段混合，這取決于待克隆的PCR片段中存在的限制性位點(diǎn)。用Roche快速連接試劑盒及其方案進(jìn)行連接。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，選出在含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria肉湯平板中的轉(zhuǎn)化子。檢出分別轉(zhuǎn)化的幾個(gè)菌落，接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria肉湯中，37℃搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。
用1.5毫升培養(yǎng)物和QIAprep Miniprep試劑盒(QIAGEN)制備質(zhì)粒DNA。使用BamHI-SalI進(jìn)行分析限制酶分析，鑒別重組克隆。大規(guī)模制備重組質(zhì)粒，以進(jìn)行測(cè)序，確證克隆的細(xì)小病毒B19片段的核苷酸序列。
如下將具有所期望的NS1、VP1和VP2序列的酵母表達(dá)質(zhì)粒用于酵母轉(zhuǎn)化。用編碼NS1、VP1或VP2的質(zhì)粒DNA(如上所示克隆獲得)轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌AD3細(xì)胞〔Mat a，trp1+，ura3-52，prb1-1122，pep4-3，pr從-407c，[cir0]，∷pDM15(pGAP/ADR1∷G418R)]，leu2(ΔAD)〕。30℃培養(yǎng)48-72小時(shí)后，通過(guò)兩輪尿嘧啶缺陷平板篩選，以及接著的一輪亮氨酸缺陷平板篩選，可實(shí)現(xiàn)酵母重組子的選擇。然后使培養(yǎng)物在亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，接著在檢查重組蛋白表達(dá)之前在補(bǔ)充了2％葡萄糖的YEP中培養(yǎng)〔Pichuantes等，ProteinStruct.Funct.Genet.，1989，6324-337〕48小時(shí)。
圖5-10顯示了從兩種不同的分離物獲得的各種蛋白質(zhì)的序列。具體而言，圖5A(SEQ ID NO24)和5B(SEQ ID NO25)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的NS1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。圖6A(SEQ ID NO26)和6B(SEQ ID NO27)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。圖7A(SEQ ID NO28)和7B(SEQ ID NO29)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP2核苷酸和蛋白質(zhì)序列。圖8A(SEQ ID NO30)和8B(SFQ ID NO31)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的NS1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。圖9A(SEQ ID NO32)和8B(SEQ IDNO33)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP1核苷酸和蛋白質(zhì)序列。圖10A(SEQ ID NO34)和10B(SEQ ID NO35)分別顯示從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP2核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
實(shí)施例5使用TaqManTM檢測(cè)和定量測(cè)定細(xì)小病毒B19 DNA如下設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)細(xì)小病毒B19感染的靈敏診斷方法。具體而言，采用TaqManTMPCR技術(shù)檢測(cè)和定量測(cè)定細(xì)小病毒B19 DNA。定量PCR需要對(duì)核酸進(jìn)行有效的抽提。用于DNA抽提的血漿/血清的體積也會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。采用兩種方法從0.5毫升的血漿/血清中分離得到核酸。具體而言，通過(guò)(a)結(jié)合于硅石和(b)退火到靶特異性寡核苷酸，從而抽提得到DNA。
(a)通過(guò)結(jié)合于硅石分離核酸在高濃度的離液鹽(如異硫氰酸胍)存在下，核酸與硅石結(jié)合。在酸性pH的條件下，小尺寸的核酸能更有效地與硅石結(jié)合。在低鹽、堿性pH緩沖液和高溫條件下，結(jié)合的核酸能被有效地洗脫。用磁化硅石取代常規(guī)硅石可極大地促進(jìn)核酸分離的洗滌和洗脫步驟。使用磁性基底捕獲結(jié)合了核酸的硅石顆粒，從而勿需進(jìn)行常規(guī)硅石顆粒沉降所需的離心。
所使用的裂解緩沖液從Organon-Teknika(Durham，NC)購(gòu)得。這種裂解緩沖液含有異硫氰酸胍，用于使蛋白質(zhì)和滅活的RNA酶和DNA酶增溶。去污劑TritonX-100進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和核蛋白的增溶作用和分解作用，從而釋放出核酸。將裂解試劑酸化，以增強(qiáng)核酸結(jié)合，并用50微升的堿性洗脫緩沖液洗脫結(jié)合的核酸。在分離核酸后，如下所述進(jìn)行TaqManTMPCR，以確定細(xì)小病毒DNA的存在。
(b)通過(guò)退火到靶特異性寡核苷酸而分離核酸雖然使用磁化的硅石極大地促進(jìn)洗滌和洗脫步驟過(guò)程中的處理，使得這些處理變得快速和簡(jiǎn)單，但是核酸的分離仍然費(fèi)時(shí)和費(fèi)力。因此，使用磁珠從血漿或血清中一步俘獲特異性核酸靶標(biāo)的方法被加以采用。為了使這種方法可用于各種病毒核酸俘獲試驗(yàn)，使用偶聯(lián)于寡dT的通用磁珠。將具有長(zhǎng)14聚體寡dT的Sera-Mag磁性寡(dT)珠(Seradyn，Indianapolis，IN)和其3′端毗鄰于所使用的細(xì)小病毒特異性序列(在下面的序列的末端將指出)含有20聚A的俘獲寡核苷酸一同使用。
所使用的反義俘獲寡核苷酸衍生自所述700bp的片段，具體如下
VSPC1-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCTTAACAGCAATTTCTGATA(nt 3492-3514)(*)(SEQ ID NO49)VSPC2-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCCCTGTAGTGCTGTCAG(nt 3549-3568)(SEQ ID NO50)VSPC3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATACCCAAATAGGAAGTTCTG(nt 3639-3660)(SEQ ID NO51)VSPC4-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAATGCTGATTCTTCACTTGC(nt 3737-3759)(SEQ ID NO52)VSPC5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCTGTACCTCCTGTACCTA(nt 3789-3808)(SEQ ID NO53)VSPC6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCCTCTAAATTTTCTGGG(nt 3838-3857)(SEQ ID NO54)VSPC7-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCCTAATGTGTCAGGAACC(nt 3910-3929)(SEQ ID NO55)(*)核苷酸的編號(hào)是依照Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的編號(hào)將磁珠懸浮在Novagen裂解緩沖液(Madison，WI)中，然后分別或聯(lián)合測(cè)定一組7種俘獲寡核苷酸(上述VSPC1-VSPC7)，以俘獲從生物學(xué)評(píng)估和研究FDA中心(美國(guó)健康和人類(lèi)服務(wù)部，F(xiàn)DA-CBER)獲得的一組(標(biāo)準(zhǔn)品)中的細(xì)小病毒B19DNA。
(c)用洗滌緩沖液洗滌珠在俘獲后，用含有10mM Hepes緩沖劑(pH7.5，在0.3M NaCl中)和0.5％NP-40的緩沖液洗滌珠。在用裂解緩沖液處理血清、雜交、珠的磁性吸附以及除去裂解緩沖液后，將1.5毫升的洗滌緩沖液加到珠中。在常規(guī)的渦流震蕩、磁性吸附和去除洗滌緩沖液后，在0.5毫升相同的緩沖液中第二次洗滌珠，這樣，這些磁珠可被壓縮，以易于懸浮在含有Taqman試驗(yàn)所有試劑的100毫升通用PCR緩沖液中。將俘獲了DNA的珠轉(zhuǎn)移到TaqManTM平板中，用于如下所述的TaqManTMPCR檢測(cè)。如TaqManTM試驗(yàn)所檢測(cè)的那樣，幾種寡核苷酸組合在俘獲B19方面是有效的。
具體而言，采用TaqManTM技術(shù)擴(kuò)增俘獲的靶核酸，將其作為DNA擴(kuò)增子。另一選擇是將俘獲的靶標(biāo)擴(kuò)增為RNA。對(duì)此，擴(kuò)增的寡核苷酸由細(xì)小病毒B19特異性引物與T7啟動(dòng)子序列組成，以使用T7 RNA聚合酶產(chǎn)生RNA擴(kuò)增子。測(cè)定了從所述700bp序列(對(duì)應(yīng)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的細(xì)小病毒B19基因組的第2936-3635位核苷酸〕衍生得到的3個(gè)擴(kuò)增引物(如下所述VSA1-A3)的擴(kuò)增能力。所述引物如下有義鏈擴(kuò)增引物VSA1-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCATATACTCATTGGACTGT(nt 2942-2961)(SEQ ID NO56)VSA2-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAGAGCACCATTATAA(nt 3272-3288)(SEQ ID NO57)VSA3-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACAATGCCAGTGGAAA(nt 3317-3333)(SEQ ID NO58)VSP2-GTGCTGAAACTCTAAAGGT(反義引物 nt 3424-3442)(SEQ ID NO59)使用RNamplifire試劑盒(Qiagen)的試劑，以50拷貝的細(xì)小病毒DNA為靶標(biāo)(最終體積為20毫升)，檢驗(yàn)擴(kuò)增效率。使用VSP2為第二引物，分別或聯(lián)合測(cè)試了擴(kuò)增引物。如制造商推薦的那樣于42℃培養(yǎng)1小時(shí)后，將一等份擴(kuò)增材料稀釋100倍，用于TaqManTM試驗(yàn)，以評(píng)估擴(kuò)增引物的效率。兩種擴(kuò)增引物的組合，即VSA2和VSA3與VSP2，在產(chǎn)生RNA復(fù)制子方面非常有效。
使用含有上述4.7kb片段的質(zhì)粒DNA確定TaqManTM試驗(yàn)的靈敏度、PCR引物的適合性以及最佳反應(yīng)條件。這個(gè)片段包含VP1區(qū)以及NS1區(qū)和VP2區(qū)(參見(jiàn)圖1)。使用衍生自VP1區(qū)的PCR擴(kuò)增引物(如下所述)。序列的編號(hào)相當(dāng)于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的編號(hào)。X代表5′-熒光素亞磷酰胺，Z代表DABCYL-dT，兩者都是從Glen Research Corporation，Sterling VA獲得。序列右側(cè)所給出的數(shù)字指從細(xì)小病毒B19序列獲得的引物的核苷酸。
VSP1-GGAGGCAAAGGTTTGCA(有義引物nt 3334-3350)(SEQ ID NO60)VSP2-GTGCTGAAACTCTAAAGGT(反義引物nt 3424-3442)(SEQ ID NO59)VSPPR1-XCCCATGGAGATATTTAGATTZ(探針-nt 3379-3398)(SEQ ID NO61)Vpara 8TCCATATGACCCAGAGCACCA(nt 3262-3460)(SEQ ID NO88)Vpara 9TTTCCACTGGCATTGTGGC(反義引物-nt 3313-3331)(SEQ ID NO89)Vpara10X AGCTAGACCTGCATGTCACTG Z，其中，X是Fam，Z是Tamra(nt3286-3310)(SEQ ID NO90)采用分光光度法評(píng)估質(zhì)粒DNA的濃度，進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)@得5000-10拷貝/20微升。最終體積為50微升的反應(yīng)混合物含有20微升的樣品、1X Gold Taq擴(kuò)增緩沖液(Perkin Elmer)和3.2mM MgCl2、300μM的各種dNTP、1pmol各種擴(kuò)增引物、0.4pmol探針以及1單位AmpliTaq酶。反應(yīng)條件包括95℃反應(yīng)10分鐘，以激活酶，接著95℃30秒，或者在ABI 7700測(cè)序儀中在60℃在進(jìn)行45輪。
使用產(chǎn)生109bp PCR產(chǎn)物的引物對(duì)VSP1和VSP2、探針VSPPR1，可檢測(cè)到少至10拷貝/試驗(yàn)。由于樣品的體積在最終50微升體積中是20微升，這表明可抽提含有少至50個(gè)拷貝/毫升的細(xì)小病毒B19 DNA的血漿樣品，并被TaqManTM技術(shù)檢測(cè)。由于細(xì)小病毒是一種高效價(jià)病毒，因此可抽提50微升的血漿/血清并用于分析。
使用FDA-CBER細(xì)小病毒B19 DNA陽(yáng)性樣品(106拷貝/毫升)，采用TaqManTM技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，每次試驗(yàn)可檢測(cè)到少至50拷貝。在使核酸和免疫效價(jià)相關(guān)的嘗試中，定量測(cè)量了幾個(gè)抗體陽(yáng)性樣品中的病毒DNA負(fù)荷。
因此，本文公開(kāi)了新穎的人細(xì)小病毒B19序列和使用這些序列進(jìn)行進(jìn)行的檢測(cè)試驗(yàn)。從前述內(nèi)容可以理解，雖然為了闡述的目的，本文對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是在不偏離本文所述的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變。
序列表<110> 希龍公司<120> 細(xì)小病毒B19的診斷測(cè)試<130> 2301-17194.40<140>
<141>
<160> 92<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH47-26<400> 1ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaatttg 480tttttttcac ctttagagtt tcagcattta attgaaaact atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggagtacaag ttactgacag cactaccggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 2<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH48-29<400> 2ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaacaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgcc tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 3<211> 700<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH33-2<400> 3ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaacaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgct tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 4<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH33-3<400> 4ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaca 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgcc tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 5<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH33-4<400> 5ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgcc tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 6<211> 700<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH42-7<400> 6ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccaggcagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 7<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH42-18<400> 7ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 8<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH42-19<400> 8ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 9<211> 700
<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (76)<223> 人工序列的描述分離物CH46-23<400> 9attaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaancaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccaggcagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 10<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH1-1<400> 10ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 11<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH1-6<400> 11ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700
<210> 12<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH2-8<400> 12ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 13<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH2-10<400> 13ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacag aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 14<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH2-11C<400> 14ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600
ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 15<211> 699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH5-13<400> 15ctaaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaaag aggcaaaggt ttgcactatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggcagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccaa tgtgttaggg caaggtcagg atactttag699<210> 16<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH7-22<400> 16ataaatccat gtactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaatttg 480tttttttcac ctttagagtt tcagcattta attgaaaact atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggagtacaag ttactgacag cactaccggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 17<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH13-27<400> 17ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaattctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgctaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag cgagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatc 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480
tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 18<211> 699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH14-33<400> 18ataaatccat atactcattg gactgtggca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggggga 240gtaatcctgt taaaagcatg tggagtgagg gggccacttt tagtgccaac tctgtaactt 300gtacattttc cagacagttt ttaattccat atgacccaga gcaccattat aaggtgtttt 360ctcccgcagc aagtagctgc cacaatgcca gtggaaaaga ggcaaaggtt tgcaccatta 420gtcccataat gggatactca accccatgga gatatttaga ttttaatgct ttaaatttat 480ttttttcacc tttagagttt cagcacttaa ttgaaaatta tggtagtata gctcctgatg 540ctttaactgt aaccatatca gaaattgctg ttaaagatgt tacagacaaa actggagggg 600gggtacaggt tactgacagc actacagggc gcctatgcat gttagtggac catgaataca 660agtacccata tgtgttaggg caaggtcagg atactttag699<210> 19<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH62-2<400> 19ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcaat taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacakttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ccagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggc cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 20<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH64-2<400> 20ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tcgcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420
agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatacttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 21<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH67-2<400> 21ataaatccat atactcattg gactgtggca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggg 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaaag aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaagatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtgga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 22<211> 4678<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的4.7kbp的PCR片段<400> 22cccgccttat gcaaatgggc agccatctta agtgttttac tataatttta ttggtcagtt 60ttgtaacggt taaaatgggc ggagcgtagg caaggactac agtatatata gcacagcact 120gccgcagctc tttctttctg ggctgctttt ttcctggact tacttgctgt tttttgtgag 180ctaactaaca ggtatttata ctacttgtta acatactaac atggagctat ttagaggggt 240gcttcaagtt tcttctaatg ttctggactg tgctaacgat aactggtggt gctctttact 300ggatttagac acttctgact gggaaccact aactcatact aacagactaa tggcaatata 360cttaagcagt gtggcttcta agcttgactt tactgggggg ccactagcag ggtgcttgta 420cttttttcaa gtagaatgta acaaatttga agaaggctat catattcatg tggttattgg 480ggggccaggg ttaaacccca gaaacctcac agtgtgtgta gaggggttat ttaataatgt 540actttatcac cttgtaactg aaaatctgaa gctaaaattt ttgccaggaa tgactacaaa 600aggcaaatac tttagagatg gagagcagtt tatagaaaac tatttaatga aaaaaatacc 660tttaaatgtt gtatggtgtg ttactaatat tgatggacat atagatacct gtatttctgc 720tacttttaga aagggagctt gccatgccaa gaaaccccgc atcaccacag ccataaatga 780tactagtact gatgctgggg agtctagcgg cacaggggca gaggttgtgc catttaatgg 840gaagggaact aaggctagca taaagtttca aactatggta aactggttgt gtgaaaacag 900agtgtttaca gaggataagt ggaaactagt tgactttaac cagtacactt tactaagcag 960tagtcacagt ggaagttttc aaattcaaag tgcactaaaa ctagcaattt ataaagcaac 1020taatttagtg cctactagca catttttatt gcatacagac tttgagcaag ttatgtgtat 1080taaaaacaat aaaattgtta aattgttact ttgtcaaaac tatgaccccc tattagtggg 1140gcagcatgtg ttaaagtgga ttgataaaaa atgtggcaag aaaaacacac tgtggtttta 1200tgggccgcca agtacaggga aaacaaactt ggcaatggcc attgctaaaa gtgttccagt 1260atatggcatg gttaactgga ataatgaaaa ctttccattt aatgatgtag caggaaaaag 1320cttggtggtc tgggatgaag gtattattaa gtctacaatt gtagaagctg caaaagccat 1380tttaggcggg caacccacca gggtagatca aaaaatgcgt ggaagtgtag ctgtgcctgg 1440agtacctgtg gttataacca gcaatggtga cattactttt gttgtaagcg ggaacactac 1500aacaactgta catgctaaag ccttaaaaga gcgcatggta aagttaaact ttactgtaag 1560atgcagccct gacatggggt tactaacaga ggctgatgta caacagtggc ttacatggtg 1620taatgcacaa agctgggacc actatgaaaa ctgggcaata aactacactt ttgatttccc 1680
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<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的4.7kbp的PCR片段<400> 23cccgccttat gcaaatgggc agccatctta agtgttttac tataatttta ttggtcagtt 60ttgtaacggt taaaatgggc ggagcgtagg caaggactac agtatatata gcacagcact 120gccgcagctc tttctttctg ggctgctttt ttcctggact tacttgctgt tttttgtgag 180ctaactaaca ggtatttata ctacttgtta acatactaac atggagctat ttagaggggt 240
gcttcaagtt tcttctaatg ttctggactg tgctaacgat aactggtggt gctctttact 300ggatttagac acttctgact gggaaccact aactcatact aacagactaa tggcaatata 360cttaagcagt gtggcttcta agcttgactt tactgggggg ccactagcag ggtgcttgta 420cttttttcaa gtagaatgta acaaatttga agaaggctat catattcatg tggttattgg 480ggggccaggg ttaaacccca gaaacctcac agtgtgtgta gaggggttat ttaataatgt 540actttatcac cttgtaactg aaaatctgaa gctaaaattt ttgccaggaa tgactacaaa 600aggcaaatac tttagagatg gagagcagtt tatagaaaac tatttaatga aaaaaatacc 660tttaaatgtt gtatggtgtg ttactaatat tgatggacat atagatacct gtatttctgc 720tacttttaga aagggagctt gccatgccaa gaaaccccgc atcaccacag ccataaatga 780tactagtact gatgctgggg agtctagcgg cacaggggca gaggttgtgc catttaatgg 840gaagggaact aaggctagca taaagtttca aactatggta aactggttgt gtgaaaacag 900agtgtttaca gaggataagt ggaaactagt tgactttaac cagtacactt tactaagcag 960tagtcacagt ggaagttttc aaattcaaag tgcactaaaa ctagcaattt ataaagcaac 1020taatttagtg cctactagca catttttatt gcatacagac tttgagcaag ttatgtgtat 1080taaagacaat aaaattgtta aattgttact ttgtcaaaac tatgaccccc tattagtggg 1140gcagcatgtg ttaaagtgga ttgataaaaa atgtggcaag aaaaacacac tgtggtttta 1200tggaccgcca agtacaggga aaacaaactt ggcaatggcc attgctaaaa gtgttccagt 1260atatggcatg gttaactgga ataatgaaaa ctttccattt aatgatgtag caggaaaaag 1320cttggtggtc tgggatgaag gtattattaa gtctacaatt gtagaagctg caaaagccat 1380tttaggcggg caacccacca gggtagatca aaaaatgcgt ggaagtgtag ctgtgcctgg 1440agtacccgtg gttataacca gcaatggtga cattactttt gttgtaagcg ggaacactac 1500aacaactgta catgctaaag ccttaaaaga gcgcatggta aagttaaact ttactgtaag 1560atgcagccct gacatggggt tactaacaga ggctgatgta caacagtggc ttacatggtg 1620taatgcacaa agctgggacc actatgaaaa ctgggcaata aactacactt ttgatttccc 1680tggaattaat gcagatgccc tccacccaga cctccaaacc accccaattg tcacagacac 1740cagtatcagc agcagtggtg gtgaaagctc tgaagaactc agtgaaagca gcttttttaa 1800cctcatcacc ccaggcgcct ggaacactga aaccccgcgc tctagtacgc ccatccccgg 1860gaccagttca ggagaatcat ctgtcggaag cccagtttcc tccgaagttg tagctgcatc 1920gtgggaagaa gccttctaca cacctttggc agaccagttt cgtgaactgt tagttggggt 1980tgattatgtg tgggacggtg taaggggttt acctgtctgt tgtgtgcaac atattaacaa 2040tagtggggga ggcttgggac tttgtcccca ttgcattaat gtaggggctt ggtataatgg 2100atggaaattt cgagaattta ccccagattt ggtgcgatgt agctgccatg tgggagcttc 2160taatcccttt tctgtgctaa cctgcaaaaa atgtgcttac ctgtctggat tgcaaagctt 2220tgtagattat gagtaaagaa agtggcaaat ggtgggaaag tgatgataaa tttgctaaag 2280ctgtgtatca gcaatttgtg gaattttatg aaaaggttac tggaacagac ttagagctta 2340ttcaaatatt aaaagatcat tataatattt ctttagataa tcccctagaa aacccatcct 2400ctttgtttga cttagttgct cgtattaaaa ataaccttaa aaactctcca gacttatata 2460gtcatcattt tcaaagtcat ggacagttat ctgaccaccc ccatgcctta tcatccagta 2520gcagtcatgc agaacctaga ggagaagatg cagtattatc tagtgaagac ttacacaagc 2580ctgggcaagt tagcgtacaa ctacccggta ctaactatgt tgggcctggc aatgagctac 2640aagctgggcc cccgcaaagt gctgttgaca gtgctgcaag gattcatgac tttaggtata 2700gccaactggc taagttggga ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc 2760ttttaaaaaa tataaaaaat gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta 2820ctttaaaagg tgcagctgcc cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg 2880cttacaacgc ctcagaaaaa tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca 2940ctggtgcagg aggggggggc agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt 3000ttagtgccaa ctctgtaact tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag 3060agcaccatta taaggtgttt tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg 3120aggcaaaggt ttgcaccatt agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag 3180attttaatgc tttaaattta tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt 3240atggaagtat agctcctgat gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg 3300ttacaaacaa aactggaggg ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca 3360tgttagtaga ccatgaatat aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcaa gatactttag 3420ccccagaact tcctatttgg gtatactttc cccctcaata cgcttactta acagtaggag 3480atgttaacac acaaggaatt tctggagaca gcaaaaaatt ggcaagtgaa gaatcagcat 3540tttatgtttt ggaacacagt tcttttcagc ttttaggtac aggaggtaca gcaactatgt 3600cttataagtt tcctccagtg cccccagaaa atttagaggg ctgcagtcaa cacttttatg 3660aaatgtacaa ccccttatac ggatcccgct taggggttcc tgacacatta ggaggtgacc 3720caaaatttag atctttaaca catgaagacc atgcaattca gccccaaaac ttcatgccag 3780ggccactagt aaactcagtg tctacaaagg agggagacag ctctagtact ggagctggaa 3840aagccttaac aggccttagc acaggtacct ctcaaaacac tagaatatcc ttacgccctg 3900ggccagtgtc tcagccgtac caccactggg acacagataa atatgtcaca ggaataaatg 3960ccatttctca tggtcagacc acttatggta acgctgaaga caaagagtat cagcaaggag 4020tgggtagatt tccaaatgaa aaagaacagc taaaacagtt acagggttta aacatgcaca 4080cctactttcc caataaagga acccagcaat atacagatca aattgagcgc cccctaatgg 4140
tgggttctgt atggaacaga agagcccttc actatgaaag ccagctgtgg agtaaaattc 4200caaatttaga tgacagtttt aaaactcagt ttgcagcctt aggaggatgg ggtttgcatc 4260agccacctcc tcaaatattt ttaaaaatat taccacaaag tgggccaatt ggaggtatta 4320aatcaatggg aattactacc ttagttcagt atgccgtggg aattatgaca gtaaccatga 4380catttaaatt ggggccccgt aaagctacgg gacggtggaa tcctcaacct ggagtgtatc 4440ccccgcacgc agcaggtcat ttaccatatg tactatatga ccccacagct acagatgcaa 4500aacaacacca cagacatgga tatgaaaagc ctgaagaatt gtggacagcc aaaagccgtg 4560tgcacccatt gtaaacactc cccaccgtgc cctcagccag gatgtgtaac taaacgccca 4620ccagtaccac ccagactgta cctgccccct cctataccta taagacagcc taacacaa 4678<210> 24<211> 2049<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的NS1<400> 24atactcttcg aacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt ttcttctaat 60gttctggact gtgctaacga taactggtgg tgctctttac tggatttaga cacttctgac 120tgggaaccac taactcatac taacagacta atggcaatat acttaagcag tgtggcttct 180aagcttgact ttactggggg gccactagca gggtgcttgt acttttttca agtagaatgt 240aacaaatttg aagaaggcta tcatattcat gtggttattg gggggccagg gttaaacccc 300agaaacctca cagtgtgtgt agaggggtta tttaataatg tactttatca ccttgtaact 360gaaaatctga agctaaaatt tttgccagga atgactacaa aaggcaaata ctttagagat 420ggagagcagt ttatagaaaa ctatttaatg aaaaaaatac ctttaaatgt tgtatggtgt 480gttactaata ttgatggaca tatagatacc tgtatttctg ctacttttag aaagggagct 540tgccatgcca agaaaccccg catcaccaca gccataaatg atactagtac tgatgctggg 600gagtctagcg gcacaggggc agaggttgtg ccatttaatg ggaagggaac taaggctagc 660ataaagtttc aaactatggt aaactggttg tgtgaaaaca gagtgtttac agaggataag 720tggaaactag ttgactttaa ccagtacact ttactaagca gtagtcacag tggaagtttt 780caaattcaaa gtgcactaaa actagcaatt tataaagcaa ctaatttagt gcctactagc 840acatttttat tgcatacaga ctttgagcaa gttatgtgta ttaaaaacaa taaaattgtt 900aaattgttac tttgtcaaaa ctatgacccc ctattagtgg ggcagcatgt gttaaagtgg 960attgataaaa aatgtggcaa gaaaaacaca ctgtggtttt atgggccgcc aagtacaggg 1020aaaacaaact tggcaatggc cattgctaaa agtgttccag tatatggcat ggttaactgg 1080aataatgaaa actttccatt taatgatgta gcaggaaaaa gcttggtggt ctgggatgaa 1140ggtattatta agtctacaat tgtagaagct gcaaaagcca ttttaggcgg gcaacccacc 1200agggtagatc aaaaaatgcg tggaagtgta gctgtgcctg gagtacctgt ggttataacc 1260agcaatggtg acattacttt tgttgtaagc gggaacacta caacaactgt acatgctaaa 1320gccttaaaag agcgcatggt aaagttaaac tttactgtaa gatgcagccc tgacatgggg 1380ttactaacag aggctgatgt acaacagtgg cttacatggt gtaatgcaca aagctgggac 1440cactatgaaa actgggcaat aaactacact tttgatttcc ctggaattaa tgcagatgcc 1500ctccacccag acctccaaac caccccaatt gtcacagaca ccagtatcag cagcagtggt 1560ggtgaaagct ctgaagaact cagtgaaagc agctttttta acctcatcac cccaggcgcc 1620tggaacactg aaaccccgcg ctctagtacg cccatccccg ggaccagttc aggagaatca 1680tctgtcggaa gcccagtttc ctccgaagtt gtagctgcat cgtgggaaga agccttctac 1740acacctttgg cagaccagtt tcgtgaactg ttagttgggg ttgattatgt gtgggacggt 1800gtaaggggtt tacctgtctg ttgtgtgcaa catattaaca atagtggggg aggcttggga 1860ctttgtcccc attgcattaa tgtaggggct tggtataatg gatggaaatt tcgagaattt 1920accccagatt tggtgcgatg tagctgccat gtgggagctt ctaatccctt ttctgtgcta 1980acctgcaaaa aatgtgctta cctgtctgga ttgcaaagct ttgtagatta tgagtaagtc 2040gacatactc 2049<210> 25<211> 671<212> PRT<213> 人工序列<220>
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1 5 10 15Cys Ala Asn Asp Asn Trp Trp Cys Ser Leu Leu Asp Leu Asp Thr Ser20 25 30Asp Trp Glu Pro Leu Thr His Thr Asn Arg Leu Met Ala Ile Tyr Leu35 40 45Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Asp Phe Thr Gly Gly Pro Leu Ala Gly50 55 60Cys Leu Tyr Phe Phe Gln Val Glu Cys Asn Lys Phe Glu Glu Gly Tyr65 70 75 80His Ile His Val Val Ile Gly Gly Pro Gly Leu Asn Pro Arg Asn Leu85 90 95Thr Val Cys Val Glu Gly Leu Phe Asn Asn Val Leu Tyr His Leu Val100 105 110Thr Glu Asn Leu Lys Leu Lys Phe Leu Pro Gly Met Thr Thr Lys Gly115 120 125Lys Tyr Phe Arg Asp Gly Glu Gln Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Met Lys130 135 140Lys Ile Pro Leu Asn Val Val Trp Cys Val Thr Asn Ile Asp Gly His145 150 155 160Ile Asp Thr Cys Ile Ser Ala Thr Phe Arg Lys Gly Ala Cys His Ala165 170 175Lys Lys Pro Arg Ile Thr Thr Ala Ile Asn Asp Thr Ser Thr Asp Ala180 185 190Gly Glu Ser Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Val Pro Phe Asn Gly Lys195 200 205Gly Thr Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gln Thr Met Val Asn Trp Leu Cys210 215 220Glu Asn Arg Val Phe Thr Glu Asp Lys Trp Lys Leu Val Asp Phe Asn225 230 235 240Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Ser Ser His Ser Gly Ser Phe Gln Ile Gln245 250 255Ser Ala Leu Lys Leu Ala Ile Tyr Lys Ala Thr Asn Leu Val Pro Thr260 265 270Ser Thr Phe Leu Leu His Thr Asp Phe Glu Gln Val Met Cys Ile Lys275 280 285Asn Asn Lys Ile Val Lys Leu Leu Leu Cys Gln Asn Tyr Asp Pro Leu290 295 300Leu Val Gly Gln His Val Leu Lys Trp Ile Asp Lys Lys Cys Gly Lys305 310 315 320Lys Asn Thr Leu Trp Phe Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Gly Lys Thr Asn325 330 335Leu Ala Met Ala Ile Ala Lys Ser Val Pro Val Tyr Gly Met Val Asn340 345 350
Trp Asn Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Val Ala Gly Lys Ser Leu355 360 365Val Val Trp Asp Glu Gly Ile Ile Lys Ser Thr Ile Val Glu Ala Ala370 375 380Lys Ala Ile Leu Gly Gly Gln Pro Thr Arg Val Asp Gln Lys Met Arg385 390 395 400Gly Ser Val Ala Val Pro Gly Val Pro Val Val Ile Thr Ser Asn Gly405 410 415Asp Ile Thr Phe Val Val Ser Gly Asn Thr Thr Thr Thr Val His Ala420 425 430Lys Ala Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Leu Asn Phe Thr Val Arg Cys435 440 445Ser Pro Asp Met Gly Leu Leu Thr Glu Ala Asp Val Gln Gln Trp Leu450 455 460Thr Trp Cys Asn Ala Gln Ser Trp Asp His Tyr Glu Asn Trp Ala Ile465 470 475 480Asn Tyr Thr Phe Asp Phe Pro Gly Ile Asn Ala Asp Ala Leu His Pro485 490 495Asp Leu Gln Thr Thr Pro lle Val Thr Asp Thr Ser Ile Ser Ser Ser500 505 510Gly Gly Glu Ser Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ser Ser Phe Phe Asn Leu515 520 525Ile Thr Pro Gly Ala Trp Asn Thr Glu Thr Pro Arg Ser Ser Thr Pro530 535 540Ile Pro Gly Thr Ser Ser Gly Glu Ser Ser Val Gly Ser Pro Val Ser545 550 555 560Ser Glu Val Val Ala Ala Ser Trp Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Pro Leu565 570 575Ala Asp Gln Phe Arg Glu Leu Leu Val Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp580 585 590Gly Val Arg Gly Leu Pro Val Cys Cys Val Gln His Ile Asn Asn Ser595 600 605Gly Gly Gly Leu Gly Leu Cys Pro His Cys Ile Asn Val Gly Ala Trp610 615 620Tyr Asn Gly Trp Lys Phe Arg Glu Phe Thr Pro Asp Leu Val Arg Cys625 630 635 640Ser Cys His Val Gly Ala Ser Asn Pro Phe Ser Val Leu Thr Cys Lys645 650 655Lys Cys Ala Tyr Leu Ser Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Tyr Glu660 665 670<210> 26<211> 2380<212> DNA<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP1<400> 26atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagtgatga 60taaatttgct aaagctgtgt atcagcaatt tgtggaattt tatgaaaagg ttactggaac 120agacttagag cttattcaaa tattaaaaga tcattataat atttctttag ataatcccct 180agaaaaccca tcctctttgt ttgacttagt tgctcgtatt aaaaataacc ttaaaaactc 240tccagactta tatagtcatc attttcaaag tcatggacag ttatctgacc acccccatgc 300cttatcatcc agtagcagtc atgcagaacc tagaggagaa gatgcagtat tatctagtga 360agacttacac aagcctgggc aagttagcgt acaactaccc ggtactaact atgttgggcc 420tggcaatgag ctacaagctg ggcccccgca aagtgctgtt gacagtgctg caaggattca 480tgactttagg tatagccaac tggctaagtt gggaataaat ccatatactc attggactgt 540agcagatgaa gagcttttaa aaaatataaa aaatgaaact gggtttcaag cacaagtagt 600aaaagactac tttactttaa aaggtgcagc tgcccctgtg gcccattttc aaggaagttt 660gccggaagtt cccgcttaca acgcctcaga aaaataccca agcatgactt cagttaattc 720tgcagaagcc agcactggtg caggaggggg gggcagtaat cctgtgaaaa gcatgtggag 780tgagggggcc acttttagtg ccaactctgt aacttgtaca ttttccagac aatttttaat 840tccatatgac ccagagcacc attataaggt gttttctccc gcagcaagta gctgccacaa 900tgccagtgga aaggaggcaa aggtttgcac cattagtccc ataatgggat actcaacccc 960atggagatat ttagatttta atgctttaaa tttatttttt tcacctttag agtttcagca 1020cttaattgaa aattatggaa gtatagctcc tgatgcttta actgtaacca tatcagaaat 1080tgctgttaag gatgttacgg acaaaactgg agggggggtg caggttactg acagcactac 1140agggcgccta tgcatgttag tagaccatga atataagtac ccatatgtgt tagggcaagg 1200tcaagatact ttagccccag aacttcctat ttgggtatac tttccccctc aatacgctta 1260cttaacagta ggagatgtta acacacaagg aatttctgga gacagcaaaa aattggcaag 1320tgaagaatca gcattttatg ttttggaaca cagttctttt cagcttttag gtacaggagg 1380tacagcaact atgtcttata agtttcctcc agtgccccca gaaaatttag agggctgcag 1440tcaacacttt tatgaaatgt acaacccctt atacggatcc cgcttagggg ttcctgacac 1500attaggaggt gacccaaaat ttagatcttt aacacatgaa gaccatgcaa ttcagcccca 1560aaacttcatg ccagggccac tagtaaactc agtgtctaca aaggagggag acagctctag 1620tactggagct ggaaaagcct taacaggcct tagcacaggt acctctcaaa acactagaat 1680atccttacgc cctgggccag tgtctcagcc gtaccaccac tgggacacag ataaatatgt 1740cacaggaata aatgccattt ctcatggtca gaccacttat ggtaacgctg aagacaaaga 1800gtatcagcaa ggagtgggta gatttccaaa tgaaaaagaa cagctaaaac agttacaggg 1860tttaaacatg cacacctact ttcccaataa aggaacccag caatatacag atcaaattga 1920gcgcccccta atggtgggtt ctgtatggaa cagaagagcc cttcactatg aaagccagct 1980gtggagtaaa attccaaatt tagatgacag ttttaaaact cagtttgcag ccttaggagg 2040atggggtttg catcagccac ctcctcaaat atttttaaaa atattaccac aaagtgggcc 2100aattggaggt attaaatcaa tgggaattac taccttagtt cagtatgccg tgggaattat 2160gacagtaacc atgacattta aattggggcc ccgtaaagct acgggacggt ggaatcctca 2220acctggagtg tatcccccgc acgcagcagg tcatttacca tatgtactat atgaccccac 2280agctacagat gcaaaacaac accacagaca tggatatgaa aagcctgaag aattgtggac 2340agccaaaagc cgtgtgcacc cattgtaagt cgacatactc 2380<210> 27<211> 781<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP1氨基酸<400> 27Met Ser Lys Glu Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala1 5 10 15Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val Thr Gly20 25 30Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser35 40 45Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala
50 55 60Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His65 70 75 80Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His Pro His Ala Leu Ser Ser85 90 95Ser Ser Ser His Ala Glu Pro Arg Gly Glu Asp Ala Val Leu Ser Ser100 105 110Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln Val Ser Val Gln Leu Pro Gly Thr115 120 125Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser130 135 140Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu145 150 155 160Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu165 170 175Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Val180 185 190Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His195 200 205Phe Gln Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys210 215 220Tyr Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala225 230 235 240Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala245 250 255Thr Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu260 265 270Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala275 280 285Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile290 295 300Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn305 310 315 320Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu325 330 335Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu340 345 350Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys rhr Gly Gly Gly Val Gln Val355 360 365Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr370 375 380Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu385 390 395 400
Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val405 410 415Gly Asp Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala420 425 430Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu435 440 445Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val450 455 460Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr465 470 475 480Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly485 490 495Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro500 505 510Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu515 520 525Gly Asp Ser Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser530 535 540Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val545 550 555 560Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile565 570 575Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala GLu Asp Lys580 585 590Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu595 600 605Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly610 615 620Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser625 630 635 640Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys645 650 655Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly660 665 670Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu675 680 685Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr690 695 700Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys705 710 715 720Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val725 730 735Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro740 745 750
Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro755 760 765Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu770 775 780<210> 28<211> 1699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP2<400> 28atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcactggtgc 60aggagggggg ggcagtaatc ctgtgaaaag catgtggagt gagggggcca cttttagtgc 120caactctgta acttgtacat tttccagaca atttttaatt ccatatgacc cagagcacca 180ttataaggtg ttttctcccg cagcaagtag ctgccacaat gccagtggaa aggaggcaaa 240ggtttgcacc attagtccca taatgggata ctcaacccca tggagatatt tagattttaa 300tgctttaaat ttattttttt cacctttaga gtttcagcac ttaattgaaa attatggaag 360tatagctcct gatgctttaa ctgtaaccat atcagaaatt gctgttaagg atgttacgga 420caaaactgga gggggggtgc aggttactga cagcactaca gggcgcctat gcatgttagt 480agaccatgaa tataagtacc catatgtgtt agggcaaggt caagatactt tagccccaga 540acttcctatt tgggtatact ttccccctca atacgcttac ttaacagtag gagatgttaa 600cacacaagga atttctggag acagcaaaaa attggcaagt gaagaatcag cattttatgt 660tttggaacac agttcttttc agcttttagg tacaggaggt acagcaacta tgtcttataa 720gtttcctcca gtgcccccag aaaatttaga gggctgcagt caacactttt atgaaatgta 780caacccctta tacggatccc gcttaggggt tcctgacaca ttaggaggtg acccaaaatt 840tagatcttta acacatgaag accatgcaat tcagccccaa aacttcatgc cagggccact 900agtaaactca gtgtctacaa aggagggaga cagctctagt actggagctg gaaaagcctt 960aacaggcctt agcacaggta cctctcaaaa cactagaata tccttacgcc ctgggccagt 1020gtctcagccg taccaccact gggacacaga taaatatgtc acaggaataa atgccatttc 1080tcatggtcag accacttatg gtaacgctga agacaaagag tatcagcaag gagtgggtag 1140atttccaaat gaaaaagaac agctaaaaca gttacagggt ttaaacatgc acacctactt 1200tcccaataaa ggaacccagc aatatacaga tcaaattgag cgccccctaa tggtgggttc 1260tgtatggaac agaagagccc ttcactatga aagccagctg tggagtaaaa ttccaaattt 1320agatgacagt tttaaaactc agtttgcagc cttaggagga tggggtttgc atcagccacc 1380tcctcaaata tttttaaaaa tattaccaca aagtgggcca attggaggta ttaaatcaat 1440gggaattact accttagttc agtatgccgt gggaattatg acagtaacca tgacatttaa 1500attggggccc cgtaaagcta cgggacggtg gaatcctcaa cctggagtgt atcccccgca 1560cgcagcaggt catttaccat atgtactata tgaccccaca gctacagatg caaaacaaca 1620ccacagacat ggatatgaaa agcctgaaga attgtggaca gccaaaagcc gtgtgcaccc 1680attgtaagtc gacatactc 1699<210> 29<211> 554<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B1獲得的VP2氨基酸<400> 29Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr Phe Ser20 25 30Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu Ile Pro Tyr35 40 45
Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys50 55 60His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile65 70 75 80Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn85 90 95Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly100 105 110Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val115 120 125Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser130 135 140Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro145 150 155 160Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile165 170 175Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val180 185 190Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu195 200 205Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr210 215 220Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu225 230 235 240Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu245 250 255Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp Pro Lys260 265 270Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro Gln Asn Phe275 280 285Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu Gly Asp Ser290 295 300Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr305 310 315 320Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro325 330 335Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile340 345 350Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln355 360 365Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu370 375 380Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln385 390 395 400
Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn405 410 415Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn420 425 430Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly435 440 445Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser450 455 460Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln465 470 475 480Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly Pro485 490 495Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr Pro Pro500 505 510His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr Ala Thr515 520 525Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu530 535 540Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu545 550<210> 30<211> 2049<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的NS1<400> 30atactcttcg aacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt ttcttctaat 60gttctggact gtgctaacga taactggtgg tgctctttac tggatttaga cacttctgac 120tgggaaccac taactcatac taacagacta atggcaatat acttaagcag tgtggcttct 180aagcttgact ttactggggg gccactagca gggtgcttgt acttttttca agtagaatgt 240aacaaatttg aagaaggcta tcatattcat gtggttattg gggggccagg gttaaacccc 300agaaacctca cagtgtgtgt agaggggtta tttaataatg tactttatca ccttgtaact 360gaaaatctga agctaaaatt tttgccagga atgactacaa aaggcaaata ctttagagat 420ggagagcagt ttatagaaaa ctatttaatg aaaaaaatac ctttaaatgt tgtatggtgt 480gttactaata ttgatggaca tatagatacc tgtatttctg ctacttttag aaagggagct 540tgccatgcca agaaaccccg catcaccaca gccataaatg atactagtac tgatgctggg 600gagtctagcg gcacaggggc agaggttgtg ccatttaatg ggaagggaac taaggctagc 660ataaagtttc aaactatggt aaactggttg tgtgaaaaca gagtgtttac agaggataag 720tggaaactag ttgactttaa ccagtacact ttactaagca gtagtcacag tggaagtttt 780caaattcaaa gtgcactaaa actagcaatt tataaagcaa ctaatttagt gcctactagc 840acatttttat tgcatacaga ctttgagcaa gttatgtgta ttaaagacaa taaaattgtt 900aaattgttac tttgtcaaaa ctatgacccc ctattagtgg ggcagcatgt gttaaagtgg 960attgataaaa aatgtggcaa gaaaaacaca ctgtggtttt atggaccgcc aagtacaggg 1020aaaacaaact tggcaatggc cattgctaaa agtgttccag tatatggcat ggttaactgg 1080aataatgaaa actttccatt taatgatgta gcaggaaaaa gcttggtggt ctgggatgaa 1140ggtattatta agtctacaat tgtagaagct gcaaaagcca ttttaggcgg gcaacccacc 1200agggtagatc aaaaaatgcg tggaagtgta gctgtgcctg gagtacccgt ggttataacc 1260agcaatggtg acattacttt tgttgtaagc gggaacacta caacaactgt acatgctaaa 1320gccttaaaag agcgcatggt aaagttaaac tttactgtaa gatgcagccc tgacatgggg 1380
ttactaacag aggctgatgt acaacagtgg cttacatggt gtaatgcaca aagctgggac 1440cactatgaaa actgggcaat aaactacact tttgatttcc ctggaattaa tgcagatgcc 1500ctccacccag acctccaaac caccccaatt gtcacagaca ccagtatcag cagcagtggt 1560ggtgaaagct ctgaagaact cagtgaaagc agctttttta acctcatcac cccaggcgcc 1620tggaacactg aaaccccgcg ctctagtacg cccatccccg ggaccagttc aggagaatca 1680tctgtcggaa gcccagtttc ctccgaagtt gtagctgcat cgtgggaaga agccttctac 1740acacctttgg cagaccagtt tcgtgaactg ttagttgggg ttgattatgt gtgggacggt 1800gtaaggggtt tacctgtctg ttgtgtgcaa catattaaca atagtggggg aggcttggga 1860ctttgtcccc attgcattaa tgtaggggct tggtataatg gatggaaatt tcgagaattt 1920accccagatt tggtgcgatg tagctgccat gtgggagctt ctaatccctt ttctgtgcta 1980acctgcaaaa aatgtgctta cctgtctgga ttgcaaagct ttgtagatta tgagtaagtc 2040gacatactc 2049<210> 31<211> 671<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的NS1氨基酸<400> 31Met Glu Leu Phe Arg Gly Val Leu Gln Val Ser Ser Asn Val Leu Asp1 5 10 15Cys Ala Asn Asp Asn Trp Trp Cys Ser Leu Leu Asp Leu Asp Thr Ser20 25 30Asp Trp Glu Pro Leu Thr His Thr Asn Arg Leu Met Ala Ile Tyr Leu35 40 45Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Asp Phe Thr Gly Gly Pro Leu Ala Gly50 55 60Cys Leu Tyr Phe Phe Gln Val Glu Cys Asn Lys Phe Glu Glu Gly Tyr65 70 75 80His Ile His Val Val Ile Gly Gly Pro Gly Leu Asn Pro Arg Asn Leu85 90 95Thr Val Cys Val Glu Gly Leu Phe Asn Asn Val Leu Tyr His Leu Val100 105 110Thr Glu Asn Leu Lys Leu Lys Phe Leu Pro Gly Met Thr Thr Lys Gly115 120 125Lys Tyr Phe Arg Asp Gly Glu Gln Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Met Lys130 135 140Lys Ile Pro Leu Asn Val Val Trp Cys Val Thr Asn Ile Asp Gly His145 150 155 160Ile Asp Thr Cys Ile Ser Ala Thr Phe Arg Lys Gly Ala Cys His Ala165 170 175Lys Lys Pro Arg Ile Thr Thr Ala Ile Asn Asp Thr Ser Thr Asp Ala180 185 190Gly Glu Ser Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Val Pro Phe Asn Gly Lys195 200 205Gly Thr Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gln Thr Met Val Asn Trp Leu Cys210 215 220Glu Asn Arg Val Phe Thr Glu Asp Lys Trp Lys Leu Val Asp Phe Asn
225 230 235 240Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Ser Ser His Ser Gly Ser Phe Gln Ile Gln245 250 255Ser Ala Leu Lys Leu Ala Ile Tyr Lys Ala Thr Asn Leu Val Pro Thr260 265 270Ser Thr Phe Leu Leu His Thr Asp Phe Glu Gln Val Met Cys Ile Lys275 280 285Asp Asn Lys Ile Val Lys Leu Leu Leu Cys Gln Asn Tyr Asp Pro Leu290 295 300Leu Val Gly Gln His Val Leu Lys Trp Ile Asp Lys Lys Cys Gly Lys305 310 315 320Lys Asn Thr Leu Trp Phe Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Gly Lys Thr Asn325 330 335Leu Ala Met Ala Ile Ala Lys Ser Val Pro Val Tyr Gly Met Val Asn340 345 350Trp Asn Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Val Ala Gly Lys Ser Leu355 360 365Val Val Trp Asp Glu Gly Ile Ile Lys Ser Thr Ile Val Glu Ala Ala370 375 380Lys Ala Ile Leu Gly Gly Gln Pro Thr Arg Val Asp Gln Lys Met Arg385 390 395 400Gly Ser Val Ala Val Pro Gly Val Pro Val Val Ile Thr Ser Asn Gly405 410 415Asp Ile Thr Phe Val yal Ser Gly Asn Thr Thr Thr Thr Val His Ala420 425 430Lys Ala Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Leu Asn Phe Thr Val Arg Cys435 440 445Ser Pro Asp Met Gly Leu Leu Thr Glu Ala Asp Val Gln Gln Trp Leu450 455 460Thr Trp Cys Asn Ala Gln Ser Trp Asp His Tyr Glu Asn Trp Ala Ile465 470 475 480Asn Tyr Thr Phe Asp Phe Pro Gly Ile Asn Ala Asp Ala Leu His Pro485 490 495Asp Leu Gln Thr Thr Pro Ile Val Thr Asp Thr Ser Ile Ser Ser Ser500 505 510Gly Gly Glu Ser Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ser Ser Phe Phe Asn Leu515 520 525Ile Thr Pro Gly Ala Trp Asn Thr Glu Thr Pro Arg Ser Ser Thr Pro530 535 540Ile Pro Gly Thr Ser Ser Gly Glu Ser Ser Val Gly Ser Pro Val Ser545 550 555 560Ser Glu Val Val Ala Ala Ser Trp Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Pro Leu565 570 575
Ala Asp Gln Phe Arg Glu Leu Leu Val Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp580 585 590Gly Val Arg Gly Leu Pro Val Cys Cys Val Gln His Ile Asn Asn Ser595 600 605Gly Gly Gly Leu Gly Leu Cys Pro His Cys Ile Asn Val Gly Ala Trp610 615 620Tyr Asn Gly Trp Lys Phe Arg Glu Phe Thr Pro Asp Leu Val Arg Cys625 630 635 640Ser Cys His Val Gly Ala Ser Asn Pro Phe Ser Val Leu Thr Cys Lys645 650 655Lys Cys Ala Tyr Leu Ser Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Tyr Glu660 665 670<210> 32<211> 2380<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP1<400> 32atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagtgatga 60taaatttgct aaagctgtgt atcagcaatt tgtggaattt tatgaaaagg ttactggaac 120agacttagag cttattcaaa tattaaaaga tcattataat atttctttag ataatcccct 180agaagaccca tcctctttgt ttgacttagt tgctcgtatt aaaaataacc ttaaaaactc 240tccagactta tatagtcatc attttcaaag tcatggacag ttatctgacc acccccatgc 300cttatcatcc agtagcagtc atgcagaacc tagaggagaa gatgcagtat tatctagtga 360agacttacac aagcctgggc aagttagcgt acaactaccc ggtactaact atgttgggcc 420tggcaatgag ctacaagctg ggcccccgca aagtgctgtt gacagtgctg caaggattca 480tgactttagg tatagccaac tggctaagtt gggaataaat ccatatactc attggactgt 540agcagatgaa gagcttttaa aaaatataaa aaatgaaact gggtttcaag cacaagtagt 600aaaagactac tttactttaa aaggtgcagc tgcccctgtg gcccattttc aaggaagttt 660gccggaagtt cccgcttaca acgcctcaga aaaataccca agcatgactt cagttaattc 720tgcagaagcc agcactggtg caggaggggg gggcagtaat cctgtgaaaa gcatgtggag 780tgagggggcc acttttagtg ccaactctgt aacttgtaca ttttccagac aatttttaat 840tccatatgac ccagagcacc attataaggt gttttctccc gcagcaagta gctgccacaa 900tgccagtgga aaggaggcaa aggtttgcac cattagtccc ataatgggat actcaacccc 960atggagatat ttagatttta atgctttaaa tttatttttt tcacctttag agtttcagca 1020cttaattgaa aattatggaa gtatagctcc tgatgcttta actgtaacca tatcagaaat 1080tgctgttaag gatgttacaa acaaaactgg agggggggtg caggttactg acagcactac 1140agggcgccta tgcatgttag tagaccatga atataagtac ccatatgtgt tagggcaagg 1200tcaagatact ttagccccag aacttcctat ttgggtatac tttccccctc aatacgctta 1260cttaacagta ggagatgtta acacacaagg aatttctgga gacagcaaaa aattggcaag 1320tgaagaatca gcattttatg ttttggaaca cagttctttt cagcttttag gtacaggagg 1380tacagcaact atgtcttata agtttcctcc agtgccccca gaaaatttag agggctgcag 1440tcaacacttt tatgaaatgt acaacccctt atacggatcc cgcttagggg ttcctgacac 1500attaggaggt gacccaaaat ttagatcttt aacacatgaa gaccatgcaa ttcagcccca 1560aaacttcatg ccagggccac tagtaaactc agtgtctaca aaggagggag acagctctag 1620tactggagct ggaaaagcct taacaggcct tagcacaggt acctctcaaa acactagaat 1680atccttacgc cctgggccag tgtctcagcc gtaccaccac tgggacacag ataaatatgt 1740cacaggaata aatgccattt ctcatggtca gaccacttat ggtaacgctg aagacaaaga 1800gtatcagcaa ggagtgggta gatttccaaa tgaaaaagaa cagctaaaac agttacaggg 1860tttaaacatg cacacctact ttcccaataa aggaacccag caatatacag atcaaattga 1920gcgcccccta atggtgggtt ctgtatggaa cagaagagcc cttcactatg aaagccagct 1980gtggagtaaa attccaaatt tagatgacag ttttaaaact cagtttgcag ccttaggagg 2040atggggtttg catcagccac ctcctcaaat attcttaaaa atattaccac aaagtgggcc 2100aattggaggt attaaatcaa tgggaattac taccttagtt cagtatgccg tgggaattat 2160
gacagtaacc atgacattta aattggggcc ccgtaaagct acgggacggt ggaatcctca 2220acctggagtg tatcccccgc acgcagcagg tcatttacca tatgtactat atgaccccac 2280agctacagat gcaaaacaac gccacggaca tggatatgaa aagcctgaag aattgtggac 2340agccaaaagc cgtgtgcacc cattgtaagt cgacatactc 2380<210> 33<211> 781<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP1氨基酸<400> 33Met Ser Lys Glu Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala1 5 10 15Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val Thr Gly20 25 30Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser35 40 45Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala50 55 60Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His65 70 75 80Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His Pro His Ala Leu Ser Ser85 90 95Ser Ser Ser His Ala Glu Pro Arg Gly Glu Asp Ala Val Leu Ser Ser100 105 110Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln Val Ser Val Gln Leu Pro Gly Thr115 120 125Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser130 135 140Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu145 150 155 160Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu165 170 175Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Val180 185 190Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His195 200 205Phe Gln Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys210 215 220Tyr Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala225 230 235 240Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala245 250 255Thr Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu260 265 270
Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala275 280 285Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile290 295 300Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn305 310 315 320Ala Leu Asn Leu Phe Glu Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu325 330 335Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu340 345 350Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asn Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val355 360 365Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr370 375 380Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu385 390 395 400Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val405 410 415Gly Asp Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala420 425 430Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu435 440 445Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val450 455 460Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr465 470 475 480Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly485 490 495Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro500 505 510Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu515 520 525Gly Asp Ser Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser530 535 540Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val545 550 555 560Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile565 570 575Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys580 585 590Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu595 600 605Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly610 615 620
Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser625 630 635 640Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys645 650 655Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly660 665 670Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu675 680 685Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr690 695 700Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys705 710 715 720Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val725 730 735Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro740 745 750Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro755 760 765Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu770 775 780<210> 34<211> 1699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP2<400> 34atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcactggtgc 60aggagggggg ggcagtaatc ctgtgaaaag catgtggagt gagggggcca cttttagtgc 120caactctgta acttgtacat tttccagaca atttttaatt ccatatgacc cagagcacca 180ttataaggtg ttttctcccg cagcaagtag ctgccacaat gccagtggaa aggaggcaaa 240ggtttgcacc attagtccca taatgggata ctcaacccca tggagatatt tagattttaa 300tgctttaaat ttattttttt cacctttaga gtttcagcac ttaattgaaa attatggaag 360tatagctcct gatgctttaa ctgtaaccat atcagaaatt gctgttaagg atgttacaaa 420caaaactgga gggggggtgc aggttactga cagcactaca gggcgcctat gcatgttagt 480agaccatgaa tataagtacc catatgtgtt agggcaaggt caagatactt tagccccaga 540acttcctatt tgggtatact ttccccctca atacgcttac ttaacagtag gagatgttaa 600cacacaagga atttctggag acagcaaaaa attggcaagt gaagaatcag cattttatgt 660tttggaacac agttcttttc agcttttagg tacaggaggt acagcaacta tgtcttataa 720gtttcctcca gtgcccccag aaaatttaga gggctgcagt caacactttt atgaaatgta 780caacccctta tacggatccc gcttaggggt tcctgacaca ttaggaggtg acccaaaatt 840tagatcttta acacatgaag accatgcaat tcagccccaa aacttcatgc cagggccact 900agtaaactca gtgtctacaa aggagggaga cagctctagt actggagctg gaaaagcctt 960aacaggcctt agcacaggta cctctcaaaa cactagaata tccttacgcc ctgggccagt 1020gtctcagccg taccaccact gggacacaga taaatatgtc acaggaataa atgccatttc 1080tcatggtcag accacttatg gtaacgctga agacaaagag tatcagcaag gagtgggtag 1140atttccaaat gaaaaagaac agctaaaaca gttacagggt ttaaacatgc acacctactt 1200tcccaataaa ggaacccagc aatatacaga tcaaattgag cgccccctaa tggtgggttc 1260tgtatggaac agaagagccc ttcactatga aagccagctg tggagtaaaa ttccaaattt 1320agatgacagt tttaaaactc agtttgcagc cttaggagga tggggtttgc atcagccacc 1380tcctcaaata tttttaaaaa tattaccaca aagtgggcca attggaggta ttaaatcaat 1440
gggaattact accttagttc agtatgccgt gggaattatg acagtaacca tgacatttaa 1500attggggccc cgtaaagcta cgggacggtg gaatcctcaa cctggagtgt atcccccgca 1560cgcagcaggt catttaccat atgtactata tgaccccaca gctacagatg caaaacaaca 1620ccacagacat ggatatgaaa agcctgaaga attgtggaca gccaaaagcc gtgtgcaccc 1680attgtaagtc gacatactc 1699<210> 35<211> 554<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述從細(xì)小病毒B19克隆2-B6獲得的VP2氨基酸<400> 35Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly Glyl 5 10 15Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr Phe Ser20 25 30Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu Ile Pro Tyr35 40 45Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys50 55 60His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile65 70 75 80Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn85 90 95Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly100 105 110Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu lle Ala Val115 120 125Lys Asp Val Thr Asn Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser130 135 140Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro145 150 155 160Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile165 170 175Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val180 185 190Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu195 200 205Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr210 215 220Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu225 230 235 240Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu245 250 255Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp Pro Lys260 265 270
Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro Gln Asn Phe275 280 285Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu Gly Asp Ser290 295 300Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr305 310 315 320Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro325 330 335Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile340 345 350Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln355 360 365Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu370 375 380Gln Gly Leu ASh Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln385 390 395 400Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn405 410 415Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn420 425 430Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly435 440 445Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser450 455 460Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln465 470 475 480Tyr Ala Val Gly lle Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly Pro485 490 495Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr Pro Pro500 505 510His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr Ala Thr515 520 525Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu530 535 540Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu545 550<210> 36<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP-5<400> 36
aggaagtttg ccggaagttc 20<210> 37<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP-3<400> 37gtgctgaaac tctaaaggtg 20<210> 38<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP2-5<400> 38gacatggata tgaaaagcct gaag24<210> 39<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP2-3<400> 39gttgttcata tctggttaag tact24<210> 40<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物K-1sp<400> 40ataaatccat atactcatt 19<210> 41<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物K-2sp<400> 41ctaaagtatc ctgaccttg 19<210> 42<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Hicks-5
<400> 42cccgccttat gcaaatgggc ag 22<210> 43<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Hicks-3<400> 43ttgtgttagg ctgtcttata gg 22<210> 44<211> 54<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物NS1-5<400> 44atactctcta gacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt ttct 54<210> 45<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物NS1-3<400> 45gagtatgtcg acttactcat aatctacaaa gctttgcaat ccagacag 48<210> 46<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP1-5SN<400> 46atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagt 55<210> 47<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VPALL-3<400> 47gagtatgtcg acttacaatg ggtgcacacg gcttttggct gtccacaatt c 51<210> 48<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP2-5SN<400> 48atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcact 55<210> 49<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC1<400> 49aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atccttaaca gcaatttctg ata 43<210> 50<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC2<400> 50aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cgccctgtag tgctgtcag39<210> 51<211> 42<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC3<400> 51aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tatacccaaa taggaagttc tg42<210> 52<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC4<400> 52aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taaaatgctg attcttcact tgc 43<210> 53<211> 40<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC5<400> 53aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tgctgtacct cctgtaccta 40<210> 54<211> 40<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述VSPC6<400> 54aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agccctctaa attttctggg 40<210> 55<211> 40<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC7<400> 55aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctcctaatgt gtcaggaacc 40<210> 56<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSA1<400> 56aattctaata cgactcacta tagggagaag gccatatact cattggactg t 51<210> 57<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSA2<400> 57aattctaata cgactcacta tagggagaag gccagagcac cattataa 48<210> 58<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSA3<400> 58aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacaatgcc agtggaaa 48<210> 59<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSP2<400> 59gtgctgaaac tctaaaggt 19<210> 60<211> 17<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSP1<400> 60ggaggcaaag gtttgca17<210> 61<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (1)<223> 其中“c”在5’被熒光素亞磷酰胺修飾<220>
<221> misc_feature<222> (20)<223> 其中“t”在3’被DABCYL修飾<220>
<223> 人工序列的描述引物VSPPR1<400> 61cccatggaga tatttagatt 20<210> 62<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH80-1<400> 62ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaatttg 480tttttttcac ctttagagtt tcagcattta attgaaaact atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggagtacaag ttactgacag cactaccggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 63<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物CH81-3<400> 63ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240
agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tcgcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatacttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 64<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL1-4<400> 64ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 65<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL2-1<400> 65ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 66<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL3-1<400> 66ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180
tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 67<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL4-3<400> 67ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 68<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL5-2<400> 68ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 69<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL6-2<400> 69ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120
cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 70<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL7-3<400> 70ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 71<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL8-2<400> 71ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag gttttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 72<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL9-1<400> 72
ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcaat taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ccagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 73<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL9-9<400> 73ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 74<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL10-2<400> 74ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 75<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL11-1
<400> 75ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttat 700<210> 76<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL12-1<400> 76ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtgact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtccgataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtgcaag ttactgacag cagtacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 77<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL13-3<400> 77ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtgcatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 78<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL14-1<400> 78ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 79<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL15-3<400> 79ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 80<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL16-2<400> 80ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttat 700<210> 81<211> 700<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL17-1<400> 81ataaatccat atacttattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 82<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL18-1<400> 82ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 83<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL19-1<400> 83ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 84<211> 700<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL20-3<400> 84ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 85<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL21-3<400> 85ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 86<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL22-11<400> 86ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcggg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 87<211> 700<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分離物B19SCL2-14<400> 87ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatctag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 88<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Vpara8<400> 88tccatatgac ccagagcacc a 21<210> 89<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Vpara9<400> 89tttccactgg cattgtggc 19<210> 90<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (1)<223> 其中“a”在5’被Fam修飾<220>
<221> misc_feature<222> (21)<223> 其中“g”在3’被Tamra修飾<220>
<223> 人工序列的描述引物Vpara10<400> 90agctagacct gcatgtcact g 21<210> 91<211> 26
<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述靶序列<400> 91ctacttgctg cgggagaaaa acacct 26<210> 92<211> 681<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述內(nèi)部對(duì)照物序列<400> 92gaattcactt gtacattttc cagacaattt ttaattccat atgacccaga gcaccattat 60acagtgacat gcaggtctag ctctgccaca atgccagtgg aaaggaggca aaggtttgca 120ccattagtcc cataatggga tactcaaccc catggagata tttagatttt aatgctttaa 180atttattttt ttcaccttta gagtttcagc acttaattga aaattatgga agtatagctc 240ctgatgcttt aactgtaacc atatcagaaa ttgctgttaa ggatgttacg gacaaaactg 300gagggggggt gcaggttact gacagcacta cagggcgcct atgcatgtta gtagaccatg 360aatataagta cccatatgtg ttagggcaag gtcaagatac tttagcccca gaacttccta 420tttgggtata ctttccccct caatacgctt acttaacagt aggagatgtt aacacacaag 480gaatttctgg agacagcaaa aaattggcaa gtgaagaatc agcattttat gttttggaac 540acagttcttt tcagctttta ggtacaggag gtacagcaac tatgtcttat aagtttcctc 600cagtgccccc agaaaattta gagggctgca gtcaacactt ttatgaaatg tacaacccct 660tatacggatc ccgctgtcga c 68權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中人細(xì)小病毒B19感染的方法，其特征在于，該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分離得到的細(xì)小病毒B19核酸與第一寡核苷酸反應(yīng)，該第一寡核苷酸含有第一引物，該第一引物含有與所述RNA靶序列的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第一引物還含有DNA依賴(lài)性RNA聚合酶5′的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操作性連接于所述復(fù)合序列，所述反應(yīng)在能形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下進(jìn)行；(c)以所述RNA靶序列為模板，在延伸反應(yīng)中使所述第一引物延伸，產(chǎn)生與所述RNA靶序列互補(bǔ)的第一DNA引物延伸產(chǎn)物；(d)用能選擇性降解所述RNA靶序列的酶將所述第一DNA引物延伸產(chǎn)物從所述RNA靶序列中分離；(e)在形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下，用第二寡核苷酸處理所述DNA引物延伸產(chǎn)物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，該第二引物含有與所述DNA引物延伸產(chǎn)物的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列；(f)在DNA延伸反應(yīng)中延伸所述第二引物的3′末端，產(chǎn)生第二DNA引物延伸產(chǎn)物，從而產(chǎn)生DNA依賴(lài)性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和能識(shí)別所述啟動(dòng)子序列的DNA依賴(lài)性RNA聚合酶產(chǎn)生所述靶序列的多個(gè)RNA拷貝；和(h)使用步驟(g)的RNA拷貝，自身催化性地重復(fù)步驟(b)到步驟(g)，以擴(kuò)增所述靶序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(i)在使探針與靶序列雜交形成探針靶標(biāo)復(fù)合物的條件下，將一標(biāo)記的寡核苷酸探針加到步驟(h)的產(chǎn)物中，其中，所述寡核苷酸探針與該靶序列的一部分互補(bǔ)；(j)檢測(cè)標(biāo)記物是否存在，作為靶序列存在與否的指示。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物是吖啶酯。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物以及所述探針衍生自人細(xì)小病毒B19基因組的VP1區(qū)域。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物以及所述探針衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(b)中提供內(nèi)部對(duì)照物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部對(duì)照物衍生自圖12的SEQ ID NO92的序列。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部對(duì)照物含有SEQ IDNO90。
9.一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中人細(xì)小病毒B19感染的方法，其特征在于，該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分離得到的細(xì)小病毒B19核酸與第一寡核苷酸反應(yīng)，該第一寡核苷酸含有第一引物，該第一引物含有與所述RNA靶序列的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第一引物還含有DNA依賴(lài)性RNA聚合酶5′的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子操作性連接于所述復(fù)合序列，所述第一引物含有衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z任一所示的多核苷酸序列的序列，所述反應(yīng)在能形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下進(jìn)行；(c)以所述RNA靶序列為模板，在延伸反應(yīng)中使所述第一引物延伸，產(chǎn)生與所述RNA靶序列互補(bǔ)的第一DNA引物延伸產(chǎn)物；(d)用能選擇性降解所述RNA靶序列的酶將所述第一DNA引物延伸產(chǎn)物從所述RNA靶序列中分離；(e)在形成寡核苷酸/靶序列復(fù)合物和啟動(dòng)DNA合成的條件下，用第二寡核苷酸處理所述DNA引物延伸產(chǎn)物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，該第二引物含有與所述DNA引物延伸產(chǎn)物的3′末端部分充分互補(bǔ)而能與其復(fù)合的復(fù)合序列，其中，所述第二引物衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(f)在DNA延伸反應(yīng)中延伸所述第二引物的3′末端，產(chǎn)生第二DNA引物延伸產(chǎn)物，從而產(chǎn)生DNA依賴(lài)性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和識(shí)別所述啟動(dòng)子序列的DNA依賴(lài)性RNA聚合酶產(chǎn)生所述靶序列的多個(gè)RNA拷貝；和(h)使用步驟(g)的RNA拷貝，自身催化性地重復(fù)步驟(b)到步驟(g)，以擴(kuò)增所述靶序列；(i)在使探針與靶序列雜交形成探針靶標(biāo)復(fù)合物的條件下，將吖啶酯標(biāo)記的寡核苷酸探針加到步驟(h)的產(chǎn)物中，其中，所述寡核苷酸探針與該靶序列的一部分互補(bǔ)，所述探針衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(j)檢測(cè)標(biāo)記物是否存在，作為靶序列存在與否的指示。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該方法還包括在步驟(b)提供內(nèi)部對(duì)照物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部對(duì)照物衍生自圖12的SEQ ID NO92序列。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部對(duì)照物含有SEQ IDNO90。
13.一種擴(kuò)增靶細(xì)小病毒B19核苷酸序列的方法，其特征在于，該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，該核酸含有RNA靶序列；(b)加入一種或多種能與所述RNA靶序列雜交的引物，其中，所述一種或多種引物衍生自圖2A-2U和圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(c)加入相對(duì)于所述一種或多種引物而言能與所述RNA靶序列3′雜交的寡核苷酸探針；(d)用聚合酶延伸所述一種或多種引物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，步驟(a)所述的RNA靶序列被反轉(zhuǎn)錄，以提供cDNA。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或不對(duì)稱(chēng)缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-AGLCR)擴(kuò)增所述cDNA。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是熱穩(wěn)定性聚合酶。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述熱穩(wěn)定性聚合酶是Taq聚合酶或Vent聚合酶。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，或者T4 DNA聚合酶。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(b)中提供內(nèi)部對(duì)照物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部對(duì)照物衍生自圖12的SEQ ID NO92序列。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部對(duì)照物含有SEQ IDNO90。
22.一種多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，該核苷酸序列含有圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的核苷酸序列。
23.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2A所示的核苷酸序列組成。
24.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2B所示的核苷酸序列組成。
25.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2C所示的核苷酸序列組成。
26.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2D所示的核苷酸序列組成。
27.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2E所示的核苷酸序列組成。
28.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2F所示的核苷酸序列組成。
29.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2G所示的核苷酸序列組成。
30.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2H所示的核苷酸序列組成。
31.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2I所示的核苷酸序列組成。
32.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2J所示的核苷酸序列組成。
33.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2K所示的核苷酸序列組成。
34.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2L所示的核苷酸序列組成。
35.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2M所示的核苷酸序列組成。
36.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2N所示的核苷酸序列組成。
37.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2O所示的核苷酸序列組成。
38.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2P所示的核苷酸序列組成。
39.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2Q所示的核苷酸序列組成。
40.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2R所示的核苷酸序列組成。
41.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2S所示的核苷酸序列組成。
42.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2T所示的核苷酸序列組成。
43.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖2U所示的核苷酸序列組成。
44.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11A所示的核苷酸序列組成。
45.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11B所示的核苷酸序列組成。
46.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11C所示的核苷酸序列組成。
47.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11D所示的核苷酸序列組成。
48.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11E所示的核苷酸序列組成。
49.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11F所示的核苷酸序列組成。
50.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11G所示的核苷酸序列組成。
51.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11H所示的核苷酸序列組成。
52.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11I所示的核苷酸序列組成。
53.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11J所示的核苷酸序列組成。
54.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11K所示的核苷酸序列組成。
55.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11L所示的核苷酸序列組成。
56.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11M所示的核苷酸序列組成。
57.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11N所示的核苷酸序列組成。
58.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11O所示的核苷酸序列組成。
59.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11P所示的核苷酸序列組成。
60.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11Q所示的核苷酸序列組成。
61.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11R所示的核苷酸序列組成。
62.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11S所示的核苷酸序列組成。
63.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11T所示的核苷酸序列組成。
64.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11U所示的核苷酸序列組成。
65.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11V所示的核苷酸序列組成。
66.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11W所示的核苷酸序列組成。
67.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11X所示的核苷酸序列組成。
68.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11Y所示的核苷酸序列組成。
69.如權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖11Z所示的核苷酸序列組成。
70.一種多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，該核苷酸序列含有圖3A-3C或圖4A-4C任一所示的核苷酸序列。
71.如權(quán)利要求70所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖3A-3C所示的核苷酸序列組成。
72.如權(quán)利要求70所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由圖4A-4C所示的核苷酸序列組成。
73.一種寡核苷酸引物，其特征在于，它由被DNA依賴(lài)性RNA聚合酶識(shí)別的、操作性連接于人細(xì)小病毒B19特異性復(fù)合序列的啟動(dòng)子區(qū)域組成，長(zhǎng)約10-75個(gè)核苷酸。
74.如權(quán)利要求73所述的寡核苷酸引物，其特征在于，所述啟動(dòng)子區(qū)域是T7啟動(dòng)子，所述核酶是T7 RNA聚合酶。
75.如權(quán)利要求73所述的寡核苷酸引物，其特征在于，所述人細(xì)小病毒B19特異性序列衍生自人細(xì)小病毒B19基因組的VP1區(qū)域。
76.如權(quán)利要求75所述的寡核苷酸引物，其特征在于，所述人細(xì)小病毒B19特異性序列衍生自圖2A-2U任一所示的多核苷酸序列。
77.一種寡核苷酸引物，其特征在于，它由操作性連接于人細(xì)小病毒B19特異性復(fù)合序列的T7啟動(dòng)子組成，長(zhǎng)約10-75個(gè)核苷酸，其中，所述人細(xì)小病毒B19特異性復(fù)合序列衍生自圖2A-2U或圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸。
78.一種寡核苷酸探針，其特征在于，它含有連接于吖啶酯標(biāo)記物的細(xì)小病毒B19特異性雜交序列，長(zhǎng)約10-50個(gè)核苷酸。
79.如權(quán)利要求78所述的寡核苷酸探針，其特征在于，所述人細(xì)小病毒B19特異性雜交序列衍生自人細(xì)小病毒B19基因組的VP1區(qū)域。
80.如權(quán)利要求79所述的寡核苷酸探針，其特征在于，所述人細(xì)小病毒B19特異性雜交序列衍生自圖2A-2U或11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
81.一種診斷檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求73所述的寡核苷酸引物和進(jìn)行診斷檢測(cè)的用法說(shuō)明書(shū)。
82.如權(quán)利要求81所述的診斷檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括寡核苷酸探針，該探針含有連接于吖啶酯標(biāo)記物的細(xì)小病毒B19特異性雜交序列，其長(zhǎng)度約為10-50個(gè)核苷酸。
83.一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中人細(xì)小病毒B19感染的方法，其特征在于，該方法包括(a)分離懷疑含有人細(xì)小病毒B19 DNA的生物學(xué)樣品中的核酸，其中，所述核酸含有靶序列；(b)使分離得到的人細(xì)小病毒B19核酸與可檢測(cè)的標(biāo)記探針?lè)磻?yīng)，該探針與所述靶序列充分互補(bǔ)并能與其雜交，其中，所述探針衍生自圖2A-2U和圖11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列，且所述反應(yīng)在能形成探針/靶序列復(fù)合物的條件下進(jìn)行；(c)檢測(cè)標(biāo)記物存在與否，作為靶序列存在與否的指示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了衍生自細(xì)小病毒B19基因組保守區(qū)的人細(xì)小病毒B19引物和探針。還公開(kāi)了采用所述引物和探針的核酸試驗(yàn)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1636071SQ02812816
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者S·皮謝安特斯, V·夏瑪拉 申請(qǐng)人:希龍公司