專(zhuān)利名稱(chēng)：電子修復(fù)視網(wǎng)膜的人造突觸芯片界面的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制細(xì)胞生長(zhǎng)和刺激細(xì)胞的裝置。具體講，本發(fā)明涉及控制神經(jīng)元生長(zhǎng)以提供人造突觸和神經(jīng)元修復(fù)術(shù)的方法和裝置。
背景技術(shù)：
經(jīng)角膜進(jìn)入眼的光線通過(guò)晶狀體(進(jìn)一步聚焦光線)聚焦在視網(wǎng)膜(眼后部一薄層細(xì)胞)上。正常人的視力取決于視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)。視覺(jué)信號(hào)起源于視網(wǎng)膜中的光感受細(xì)胞，其能感知光線并對(duì)光線發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生信號(hào)，繼而在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中產(chǎn)生和發(fā)展成神經(jīng)信號(hào)。神經(jīng)細(xì)胞常常延伸出稱(chēng)為細(xì)胞突起的細(xì)胞部分，專(zhuān)用于接受信息和刺激或傳遞信息。例如傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的專(zhuān)門(mén)化伸長(zhǎng)突起稱(chēng)為神經(jīng)突。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)突攜帶從視網(wǎng)膜到腦的視覺(jué)信號(hào)。腦中神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步加工視覺(jué)信號(hào)，以提供正常人視力的完整視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)。此過(guò)程中任何一步紊亂均可導(dǎo)致視覺(jué)損傷或視覺(jué)缺失。
年齡相關(guān)性黃斑退變(AMD)是65歲以上人最常見(jiàn)的視覺(jué)缺失形式之一。目前對(duì)大多數(shù)AMD病人尚無(wú)有效的治療方法，此病常導(dǎo)致光感受器的永久性損傷，但不傷害大多數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)。與此相似，其它疾病如無(wú)色素沉著視網(wǎng)膜炎(RP)，由于喪失光感受器而引起視覺(jué)損傷和視覺(jué)缺失。
人視覺(jué)系統(tǒng)天生的能力是能夠通過(guò)各個(gè)光感受器來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)光線使其形成高分辨影象捕獲系統(tǒng)。世界上有幾個(gè)研究小組已進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)，測(cè)試在AMD致盲個(gè)體中用微電極陣列刺激視網(wǎng)膜細(xì)胞、視神經(jīng)束或視覺(jué)皮層是否能夠產(chǎn)生光幻視(即感覺(jué)光線)。微電極陣列產(chǎn)生的電場(chǎng)刺激了相當(dāng)大的含有無(wú)數(shù)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域。這些試驗(yàn)顯示用微電極陣列刺激神經(jīng)元，盲人的確可能識(shí)別諸如水平線或垂直線等簡(jiǎn)單模式。雖然這些試驗(yàn)證明視覺(jué)可有限性復(fù)原，但主要問(wèn)題尚待解決。由于大多數(shù)可得到的電極的尺寸大小和布局困難，采用了超長(zhǎng)距離(幾個(gè)細(xì)胞體直徑)的不精確電場(chǎng)刺激來(lái)使神經(jīng)元去極化。然而此種方法常常需要過(guò)度刺激，這可能是有害的，會(huì)導(dǎo)致受刺激區(qū)域炎癥，甚至發(fā)生膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)或神經(jīng)膠質(zhì)增生。因此這些方法的主要挑戰(zhàn)是構(gòu)建一個(gè)神經(jīng)界面來(lái)刺激局部定位的視網(wǎng)膜區(qū)域，各個(gè)神經(jīng)元，甚至具有特異性的神經(jīng)元的特化部分。
神經(jīng)元可以在人造基質(zhì)上生長(zhǎng)。然而生長(zhǎng)在人造基質(zhì)上的神經(jīng)元的突觸連結(jié)不能加以控制或精確引導(dǎo)向確定的部位，不能提供體內(nèi)所見(jiàn)的特異性刺激特征。
因此，需要能夠改進(jìn)神經(jīng)刺激的特異性、優(yōu)選改進(jìn)低能輸送的神經(jīng)刺激的特異性以避免神經(jīng)膠質(zhì)增生和炎癥的方法和裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將微型模格(micropattern)模式化的神經(jīng)元生長(zhǎng)與顯微制作的刺激界面組合形成一種新穎神經(jīng)再生電極，該電極起著人造突觸作用。此裝置稱(chēng)為人造突觸芯片(ASC)。再生電極通過(guò)使神經(jīng)纖維再生進(jìn)入電極而制成。此人造突觸提供了使神經(jīng)細(xì)胞突起(神經(jīng)突)與化學(xué)或電子方式的神經(jīng)興奮相連接的顯微制作小孔(納米小孔)。此納米小孔模擬了真實(shí)突觸的長(zhǎng)度，強(qiáng)調(diào)了神經(jīng)元和刺激源之間的空間定位關(guān)系。
本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到開(kāi)發(fā)一種能保存單個(gè)神經(jīng)元高分辨力，一對(duì)一配準(zhǔn)和低能輸送的神經(jīng)界面的問(wèn)題可分成二部分首先，要使神經(jīng)元和刺激源處在一起；其次，要刺激神經(jīng)細(xì)胞本身。ASC直接將微型模格模式化的神經(jīng)元生長(zhǎng)與神經(jīng)刺激源組合在一起，提供了對(duì)所需神經(jīng)元細(xì)胞至少一部分的低能刺激(納米刺激)；因此，ASC不僅能有效地作為一種基質(zhì)在其上引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突生長(zhǎng)至刺激源，而且能有效地起著刺激源作用。
本發(fā)明涉及控制細(xì)胞突起生長(zhǎng)的裝置和方法，包括具有供細(xì)胞和細(xì)胞突起生長(zhǎng)的表面的基質(zhì)，和能有效控制細(xì)胞和細(xì)胞突起按所需方向生長(zhǎng)至該表面所需要部位的微型模格。所需部位可以是納米小孔、電接觸點(diǎn)或微型模格部件。微型模格中可包含趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓(surface contours)或/和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。此微型模格可通過(guò)使基質(zhì)表面與顯微接觸印刷印模相接觸來(lái)產(chǎn)生。具有這樣體現(xiàn)本發(fā)明特征的微型模格表面的裝置可通過(guò)使細(xì)胞與該表面接觸用于控制細(xì)胞突起的生長(zhǎng)，有效控制細(xì)胞突起按所需方式生長(zhǎng)。使細(xì)胞與微型模格表面接觸，引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)至該表面上所需部位，并提供所需部位對(duì)細(xì)胞突起的刺激，能有效地刺激神經(jīng)細(xì)胞的至少一部分。
接觸和刺激細(xì)胞的裝置可具有供接觸細(xì)胞至少一部分的表面，以及具有至少一個(gè)帶回路的電連續(xù)性接觸點(diǎn)。這種裝置能有效刺激細(xì)胞的至少一部分，特別適合刺激神經(jīng)突。例如此裝置可通過(guò)刺激神經(jīng)突、通過(guò)神經(jīng)突刺激細(xì)胞或刺激細(xì)胞體而用于刺激毗鄰電接觸點(diǎn)的細(xì)胞或細(xì)胞突起。
本發(fā)明還提供引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)至毗連回路接觸點(diǎn)部位的方法?？赏ㄟ^(guò)使能生出細(xì)胞突起的細(xì)胞與具有回路和微型模格的表面接觸，引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)至毗鄰接觸點(diǎn)的部位。此微型模格可包含趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓等因子和/或具有至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的此微型模格的生產(chǎn)方法，包括使表面與顯微接觸印刷印模相接觸。可通過(guò)將神經(jīng)調(diào)節(jié)劑輸送至細(xì)胞的至少一部分來(lái)引導(dǎo)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)，可引導(dǎo)生長(zhǎng)朝向的所需部位包括納米小孔、電回路接觸點(diǎn)和表面器件。
體現(xiàn)本發(fā)明特征的裝置可包括含有納米小孔的表面和可含有神經(jīng)調(diào)節(jié)劑如神經(jīng)遞質(zhì)、激素、離子、信使分子、核酸、核酸載體、藥物、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、脂質(zhì)體或其它生物活性物質(zhì)的存貯室。納米小孔有效地為從存貯室向細(xì)胞的至少一部分輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑提供了導(dǎo)管。輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的裝置可具有微型模格化的外表面，能有效引導(dǎo)上述細(xì)胞突起的生長(zhǎng)，這樣顯微制作的人造突觸芯片包括的顯微制作裝置具有納米小孔、能有效引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)使之接觸納米小孔的微型模格表面及連接于納米小孔的含神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的存貯室。
存貯室可直接接觸納米小孔，或可通過(guò)導(dǎo)管與納米小孔相連以將神經(jīng)調(diào)節(jié)劑輸送至納米小孔。泵或其它引流機(jī)制可操作性地連接于存貯室和/或?qū)Ч?，有效引?dǎo)液流，該液流例如可有效地幫助將神經(jīng)調(diào)節(jié)劑輸送至納米小孔。
神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的輸送可有效提供對(duì)細(xì)胞的刺激，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了對(duì)細(xì)胞突起的刺激，從而有效刺激細(xì)胞的至少一部分的方法。在本發(fā)明實(shí)施方式中，細(xì)胞刺激的方法包括刺激細(xì)胞突起，通過(guò)細(xì)胞突起刺激細(xì)胞和刺激細(xì)胞體。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種再生電極組裝體，其包括引導(dǎo)神經(jīng)突的裝置和有效接觸和刺激細(xì)胞的至少一部分的回路。引導(dǎo)神經(jīng)突的裝置可包括引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的裝置，輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑至細(xì)胞的至少一部分的裝置或二者兼有?；芈房砂ń佑|和刺激細(xì)胞的至少一部分、或細(xì)胞突起或細(xì)胞體的裝置。
引導(dǎo)神經(jīng)突延伸形成與回路定向接觸的這種能力，可用于治療神經(jīng)組織疾病。本發(fā)明的一個(gè)方面內(nèi)容是該裝置和方法提供了可能繞過(guò)視網(wǎng)膜光感受器和將數(shù)字照相機(jī)連接于視網(wǎng)膜單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)界面。以這種方式可繞過(guò)AMD和其它視覺(jué)缺失疾病中受損的細(xì)胞，將視覺(jué)信息送至大腦。這樣，這種人造突觸芯片為年齡相關(guān)性黃斑退變(AMD)、無(wú)色素沉著視網(wǎng)膜炎和其它光感受器視覺(jué)缺失疾病患者提供了恢復(fù)視覺(jué)功能的方法。本發(fā)明的裝置和方法提供的神經(jīng)修復(fù)術(shù)適合在病人神經(jīng)系統(tǒng)或體內(nèi)任何部位植入，用于治療脊髓損傷神經(jīng)病理，膀胱功能失調(diào)和其它神經(jīng)元性疾病。
本發(fā)明的方法可用于制備眼內(nèi)用裝置。供植入眼內(nèi)的本發(fā)明裝置包括接觸和刺激細(xì)胞的至少一部分的裝置和供植入眼內(nèi)的再生電極組裝體。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，這些裝置供植入眼內(nèi)包括視網(wǎng)膜、內(nèi)界膜和視網(wǎng)膜下腔等區(qū)域。
恢復(fù)光感受器功能減退眼睛的視力的光敏組裝體，包括能以光激活信號(hào)對(duì)光線進(jìn)行有效反應(yīng)的光敏裝置、人造突觸芯片，有效供給光敏裝置能量的能源和該光敏裝置與人造突觸芯片之間的有效連接。植入光敏組裝體提供了恢復(fù)光感受器功能減退眼睛視力的方法，可通過(guò)在眼內(nèi)植入此光敏組裝體，引導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞突起生長(zhǎng)至該光敏組裝體和用該光敏組裝體產(chǎn)生的光激活信號(hào)刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)元來(lái)治療眼病。
本發(fā)明的裝置稱(chēng)為人造突觸芯片(ASC)，含有對(duì)視覺(jué)系統(tǒng)的高分辨力神經(jīng)界面，其摻入了微型模格模式化生長(zhǎng)的神經(jīng)元產(chǎn)生人造突觸。非常小的納米小孔保證了與單個(gè)細(xì)胞所需部分的接觸，并通過(guò)這些接觸將刺激朝向單個(gè)細(xì)胞，從而為將一回路連接于單個(gè)神經(jīng)元提供了具有高度空間分辨力的神經(jīng)界面。因此，不像原先刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)元只能賦予很差空間分辨力的方法，此種ASC的優(yōu)點(diǎn)是特異性和細(xì)胞水平刺激的控制，以提供影響細(xì)胞系統(tǒng)行為的新方法。此外，由于刺激源與神經(jīng)元直接接觸，ASC所用的刺激能量較先前本領(lǐng)域刺激物的能量低。因此，ASC提供了一種新類(lèi)型再生電極，其采用一種刺激的新式神經(jīng)界面，并采用現(xiàn)代表面科學(xué)方法來(lái)引導(dǎo)神經(jīng)元生長(zhǎng)，使得與體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)回路的連接成為可能。


圖1A顯示體現(xiàn)本發(fā)明特征的人造突觸芯片的透視圖。
圖1B是圖1A人造突觸芯片的平面圖。
圖1C是圖1A人造突觸芯片的剖視圖，取自沿平面1C-1C。
圖1D是圖1A人造突觸芯片的剖視圖，取自沿平面1C-1C，說(shuō)明具有電極的本發(fā)明圖1E是具有泵和存貯溶液庫(kù)及人造突觸芯片的系統(tǒng)的橫截面正視圖。
圖1F具水泵和人造突觸芯片的系統(tǒng)一部分的橫截面正視圖。
圖2A是體現(xiàn)本發(fā)明特征的人造突觸芯片的納米小孔的平視掃描電子顯微照片(SEM)。
圖2B是體現(xiàn)本發(fā)明特征的人造突觸芯片存貯器的平視SEM。
圖2C說(shuō)明視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在模板基質(zhì)上的模式化生長(zhǎng)。
圖2D說(shuō)明PC12細(xì)胞在氮化硅基質(zhì)上圍繞和復(fù)蓋5微米直徑小孔的生長(zhǎng)。
圖3是在表面上制備微型模格的體現(xiàn)本發(fā)明特征的印模的平視SEM。
圖4是在動(dòng)物中植入人造突觸芯片的系統(tǒng)，包括人造突觸芯片(ASC)，光敏裝置、ASC和光敏裝置之間通訊的裝置和動(dòng)力源。
圖5A說(shuō)明植入了ASC的動(dòng)物眼睛的剖視圖。
圖5B顯示圖5A眼睛和放置在眼中視網(wǎng)膜下腔的ASC的橫截面詳圖。
圖6A顯示流經(jīng)在人造雙層膜中形成的穿通本發(fā)明人造突觸芯片的納米小孔的α-溶血素通道的電流?？v軸顯示電流，橫軸為時(shí)間。插圖顯示時(shí)間軸放大尺寸所記錄的一小部分。
圖6B是所測(cè)定的流經(jīng)在人造雙層膜中形成的穿通本發(fā)明人造突觸芯片的納米小孔的α-溶血素通道電流的坐標(biāo)圖?？v軸顯示電流，橫軸為時(shí)間。
圖6C顯示流徑在人造雙層膜中形成的穿通本發(fā)明人造突觸芯片的納米小孔的兩條α-溶血素通道的電流?？v軸顯示電流，橫軸為時(shí)間。
圖7A是本發(fā)明裝置射流通道部分的示意性透視圖。
圖7B是本發(fā)明裝置射流通道部分與硅小孔部分連接在一起的示意圖，顯示該組合裝置的剖視圖。
圖8A說(shuō)明在體現(xiàn)本發(fā)明特征的基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，時(shí)間恰在含緩激肽生理溶液流入之前。
圖8B說(shuō)明在含緩激肽生理溶液流入開(kāi)始之后3秒種時(shí)在體現(xiàn)本發(fā)明特征的基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
圖8C說(shuō)明在含緩激肽生理溶液流入之后9秒種時(shí)在本發(fā)明基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
圖1顯示體現(xiàn)本發(fā)明特征的人造突觸芯片10。圖1A為透視圖，圖1B為ASC的平面圖，ASC的細(xì)胞接觸表面包括基質(zhì)12，可用與細(xì)胞附著和生長(zhǎng)相容的任何材料制備。例如玻璃、陶磁、硅、硅化合物及其混合物、聚酰亞胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙交酯、特氟隆(Teflon)或其它聚合物是合適的材料。優(yōu)選實(shí)施例中，基質(zhì)12包含聚酰亞胺。
基質(zhì)12上的微型模格14能有效引導(dǎo)和指導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞突起生長(zhǎng)與基質(zhì)12接觸?？蓪⑽⑿湍８?4蝕刻入基質(zhì)12中，可沉積在基質(zhì)12上或與基質(zhì)12整合。在優(yōu)選實(shí)施例中，微型模格14可通過(guò)顯微接觸印刷法制備在基質(zhì)12上。微型模格14可包含生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子、神經(jīng)突或細(xì)胞體的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的特異性抗體，或能有效指導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長(zhǎng)或細(xì)胞或細(xì)胞突起附著的其它分子或原子。
基質(zhì)12下方是支持層16。宜用硅形成的中間層18毗鄰于支持層，在其下面。底層20位于中間層18之下面，這樣中間層18夾在支持層16和底層20之間。本發(fā)明的實(shí)施方式中，支持層16和底層20用氮化硅形成。
硅和氮化硅提供了穩(wěn)定的中間層和基質(zhì)層，可用到處可得到的制作工具和知識(shí)來(lái)產(chǎn)生和形成。硅裝置生產(chǎn)的技術(shù)是高度可重復(fù)的，在亞微米水平上是精確的。此外，硅元件較高程度控制小孔的幾何形狀和位置，包括產(chǎn)生小孔陣列的能力。
本發(fā)明的裝置和方法可用于引導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞突起的生長(zhǎng)，以及調(diào)節(jié)或刺激此種細(xì)胞和細(xì)胞突起。“細(xì)胞突起”是細(xì)胞從胞體延伸出來(lái)的伸長(zhǎng)部分，可以是軸突、樹(shù)突、神經(jīng)突、生長(zhǎng)錐或細(xì)胞的其它延伸生長(zhǎng)部分。“神經(jīng)突”是神經(jīng)細(xì)胞的伸長(zhǎng)部分或突起，常為神經(jīng)細(xì)胞在基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)形成其引導(dǎo)部分?！吧L(zhǎng)錐”是神經(jīng)突的特化尖端，引導(dǎo)細(xì)胞向此尖端方向生長(zhǎng)或運(yùn)動(dòng)。術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)突”本文用于特指所有的神經(jīng)細(xì)胞突起，包括軸突、樹(shù)狀突、神經(jīng)突和生長(zhǎng)錐。
神經(jīng)突可以不同方向在不同時(shí)間從細(xì)胞伸出和縮回，它們生長(zhǎng)的方向和速度可能受到基質(zhì)、環(huán)境中和沿基質(zhì)的化學(xué)成分梯度、電場(chǎng)、激素的影響和其它物理、化學(xué)和生物學(xué)的影響。如本文所用，細(xì)胞突起如神經(jīng)突的生長(zhǎng)包括伸長(zhǎng)和移動(dòng)，是這些細(xì)胞突起的正?；顒?dòng)，可自發(fā)發(fā)生或可人工誘導(dǎo)或增強(qiáng)。這種生長(zhǎng)可用本發(fā)明的裝置和方法引導(dǎo)。
圖1A顯示細(xì)胞突起在本發(fā)明裝置上的定向生長(zhǎng)。顯示細(xì)胞26和細(xì)胞突起(神經(jīng)突28和其尖端的生長(zhǎng)錐30)與基質(zhì)12和微型模格14相接觸。神經(jīng)突28和生長(zhǎng)錐30在基質(zhì)12上所延伸的路徑受到微型模格14的引導(dǎo)，將神經(jīng)突28和生長(zhǎng)錐30導(dǎo)向凹部22和小孔24?；|(zhì)12中的凹部22導(dǎo)向小孔24，小孔24形成穿通支持層16的通道。如圖1B所示，凹部22的底面32由支持層16所形成，無(wú)覆蓋的基質(zhì)12。支持層16中的小孔邊緣34圍繞小孔24，限定了穿過(guò)支持層16的通道。雖然圖1A中只顯示了一個(gè)細(xì)胞和一根神經(jīng)突，應(yīng)理解有許多細(xì)胞、神經(jīng)突和生長(zhǎng)錐可與基質(zhì)12、凹部22和小孔24接觸。微型模格模式化的生長(zhǎng)因子通向顯微制作小孔24的路徑可引導(dǎo)神經(jīng)突，如圖1A所示那樣。
圖1C和1D顯示了沿圖1A的1C-1C平面的剖視圖。小孔24開(kāi)口通入中間層18的壁38和底層20的壁40所確定的存貯室36?？稍谛】?4中形成膜42(如脂質(zhì)雙層膜)以將存貯室與凹部22分開(kāi)。
置于小孔24的膜42可基本上防止凹部22和存貯室36之間所有的物質(zhì)通過(guò)。然而膜42可以是半透膜，能有效調(diào)節(jié)物質(zhì)通過(guò)小孔24而不完全阻止所有物質(zhì)通過(guò)。例如膜42可形成半透膜，允許某些原子、分子和離子通過(guò)而限制其它原子、分子和離子通過(guò)。具有這種性能的脂質(zhì)雙層膜，特別是含有離子通道或運(yùn)載體等分子的脂質(zhì)雙層膜，能容易地通過(guò)特定離子同時(shí)限制或基本上阻止其它離子通過(guò)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的Lang muir-Blodgett技術(shù)制備脂質(zhì)雙層膜。例如參見(jiàn)Montal和MuellerProc.Natl.Acad.Sci.USA.693561-3566(1972)；Montal，Meth.Engymol.32545-556(1974)和Lindstrom等J.Biol，Chem.2558340-8350(1980)。
凹部22和存貯室36可各含有一種液體，凹部22中的液體可與存貯室36中的液體相同或不同。這些液體優(yōu)選生理溶液，如生理鹽水，其與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相容。此種液體的例子包括磷酸緩沖鹽水、碳酸緩沖鹽水、HEPES緩沖鹽水、Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)液(DMEM，Sigma Chemical Co.St.Louis.Mo，Cat.#D6546)和本領(lǐng)域已知的其它溶液。
這些溶液還可含有生物活性物質(zhì)44，因此凹部22和/或存貯室36含有生物活性物質(zhì)，凹部22和或存貯室中的生物活性物質(zhì)就可通向小孔24和膜42。例如，存貯室36可含有激素、包在脂質(zhì)體中的神經(jīng)遞質(zhì)，實(shí)際的細(xì)胞或能保存電勢(shì)能刺激神經(jīng)元的離子溶液。小孔24可以是刺激位點(diǎn)，通過(guò)化學(xué)、激素、細(xì)胞的、電子的或其它相互作用有效刺激細(xì)胞。在所有情況下，此刺激點(diǎn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞26(如神經(jīng)元)是非常特異的，其模擬了體內(nèi)化學(xué)性突觸或空隙接合處的長(zhǎng)度范圍。
生物活性物質(zhì)44可調(diào)節(jié)膜42的通透性，或能夠接觸膜42并與其融合，從而有效地將該物質(zhì)從存貯室輸送到凹部22或從凹部22輸送到存貯室36。生物活性物質(zhì)44可只存在于凹部22和存貯室36之一中，優(yōu)選存在于存貯室36中。生物活性物質(zhì)可包括通道形成分子如α-溶血素、短桿菌肽、丙甲甘肽(alamethicin)或其它通道成型劑，藥物、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化吸引劑、激素、生長(zhǎng)因子、粘附分子、氨基酸、糖、抗體等物質(zhì)；細(xì)胞能源；或其它化合物。生物活性劑44可以是含有離子通道、受體或可與膜42融合和插入分子到膜42中的其它生物活性分子的微膠團(tuán)，脂質(zhì)體或其它生物膜制品。這類(lèi)生物活性物質(zhì)可有效刺激細(xì)胞26或調(diào)節(jié)其活性。
圖1D顯示了具有電極46的本發(fā)明實(shí)施例。電極46可用本領(lǐng)域已知的各種材料包括銀、氯化銀、鉻、錫、銦、氧化銦錫、氧化鋅、膠態(tài)印制碳、鉑、鈀、金、鋁和其它元素、氧化物和材料制備。電極46可用于從電源48運(yùn)載電信號(hào)以提供電流或在電極46之間施加電壓并刺激細(xì)胞26或調(diào)節(jié)其活性。
可用通過(guò)微射流輸送系統(tǒng)輸送到存貯室36和小孔24的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑刺激在本發(fā)明人造突觸芯片上生長(zhǎng)的一個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞的一部分或諸細(xì)胞。圖1E所示人造突觸芯片10是包括液體導(dǎo)管41的系統(tǒng)的一部分，導(dǎo)管41供運(yùn)載液體39(液體流動(dòng)任選地由泵43所產(chǎn)生)至微射流通道45，以輸送給存貯室36和小孔24。液體39優(yōu)選為生物相容性液體，如生理鹽水，優(yōu)選包括pH緩沖劑，以維持其pH值與維持細(xì)胞健康相容的水平，可包括生物活性物質(zhì)44，例如神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑、含有神經(jīng)遞質(zhì)的脂質(zhì)體或可能影響細(xì)胞的其它物質(zhì)。供給的液體39可貯存在經(jīng)液體導(dǎo)管41或其它裝置可操作地連接于泵43和微射流通道45的庫(kù)47中。液體出口49可用來(lái)排去或去除多余的或廢棄的液體。能有效導(dǎo)致液體39按所需方向流動(dòng)的泵可以是適合于引起液體流動(dòng)的任何機(jī)械設(shè)備。引起液體流動(dòng)的機(jī)械設(shè)備因壓力差、滲透壓差可迫使液體流動(dòng)，可通過(guò)電學(xué)方法包括電滲法或其它方法引起流動(dòng)。
例如泵43可包括機(jī)械泵，如壓電泵、壓縮空氣泵、蠕動(dòng)泵、靜電泵或電磁泵?；蛘?，泵43還可包括非機(jī)械泵，例如其中流動(dòng)力通過(guò)熱、化學(xué)(包括滲透)、聲波、磁、電或電滲方法或機(jī)制產(chǎn)生。適合顯微制作裝置使用的泵，特別是電滲泵，在Andersson等Sensors and Actuators B72259-265(2001)；Morf等Sensors andActuators B72266-272(2001)；Morf等Sensors and Actuators B72273-282(2001)和Zeng等，Sensors and Actuators B72209-212(2002)中有描述。
例如，圖1F說(shuō)明了帶有泵43的系統(tǒng)的一部分。該系統(tǒng)包括具有生長(zhǎng)錐30的細(xì)胞生長(zhǎng)在氮化硅基質(zhì)16上的模板14上的人造突觸芯片10和包括緩沖液入口41A和遞質(zhì)入口41B兩部分組成的液體導(dǎo)管41。沒(méi)顯示的是含有緩沖液的庫(kù)47，其連接于緩沖液入口41A，及含有遞質(zhì)液的庫(kù)47，其連接于遞質(zhì)入口41B。圖1F描述的泵43是一種微電子機(jī)械(MEM)泵，類(lèi)似于噴墨打印機(jī)中所用的泵以噴射液滴。例如在授于Kamisuki等人的美國(guó)專(zhuān)利5,734,395中描述了MEM泵。如圖1F所描述的MEM泵包括硅隔片51、反電極53和構(gòu)建在隔片結(jié)構(gòu)上的微射流通道55。隔片51上的微射流通道55區(qū)域充滿了液體39并與庫(kù)47(未顯示)流體相連續(xù)。含有生物活性物質(zhì)44的液體可以是，例如神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)節(jié)劑、突觸體或含有任何類(lèi)型生物活性物質(zhì)的脂質(zhì)體。起初，隔片51是水平(非偏轉(zhuǎn))構(gòu)型。施加在隔片51和反電極53之間的微小偏壓，有效地使隔片51向下彎曲(如圖1F所示)，因此增加了隔片51上的微射流通道55區(qū)域的容積并沿遞質(zhì)入口41B從庫(kù)47排出液體39。去除此偏壓使隔片51放松回到其原先位置，迫使液體流出微射流通道55，流向存貯室36和小孔24。這樣液體39中的神經(jīng)遞質(zhì)44被轉(zhuǎn)運(yùn)到存貯室36附近，并可擴(kuò)散入存貯室36和小孔24中，接觸生長(zhǎng)錐30并影響該細(xì)胞，以這種方式，例如，可將神經(jīng)遞質(zhì)簡(jiǎn)單脈沖輸送給生長(zhǎng)于穿過(guò)小孔24的細(xì)胞部分。在人造突觸芯片的實(shí)施例中，導(dǎo)管41簡(jiǎn)單地包括遞質(zhì)入口41B；在其它實(shí)施方式中，如圖1F所描述的，導(dǎo)管41還包括緩沖液入口41A。通過(guò)緩沖液入口的緩沖液流作用是用緩沖液沖洗微射流導(dǎo)管45，將神經(jīng)遞質(zhì)44運(yùn)走，減少或結(jié)束這些物質(zhì)的作用。這種沖洗使該系統(tǒng)作好接受下一次神經(jīng)遞質(zhì)44脈沖的準(zhǔn)備以及結(jié)束先前脈沖的作用。
神經(jīng)遞質(zhì)擴(kuò)散通過(guò)小孔24，由于該小孔厚度可能僅約500納米，因而非?？?。MEM泵43的隔片51在高頻率時(shí)可彎曲因而可高頻率噴射液體39?？梢愿哳l率，包括每秒僅幾周或赫茲(Hz)到約數(shù)百kHz之間的頻率，輸送生物活性物質(zhì)44(如神經(jīng)調(diào)節(jié)劑或神經(jīng)遞質(zhì)44)。這種快速信號(hào)傳遞比得上體內(nèi)大腦和視網(wǎng)膜中所見(jiàn)的快速信號(hào)傳遞速度。
生物活性物質(zhì)44的濃度取決于幾種因素，包括MEM噴射器的脈沖頻率，液體流過(guò)微射流導(dǎo)管45的流速。在微射流導(dǎo)管45也可誘導(dǎo)電滲流，此時(shí)在任選的緩沖液室電極上施加電壓。小孔24中的生物活性物質(zhì)44的濃度部分取決于擴(kuò)散速度，此速度受濃度的影響。泵43的尺寸，例如噴射器直徑，取決于遞質(zhì)入口41B的出口57的直徑，可能范圍在幾微米至數(shù)百微米(μm)之間。該尺寸可能取決于微射流通道的所要求容量。
如圖1F所述的泵43和系統(tǒng)的性能取決于設(shè)計(jì)和所用的材料，以及其使用過(guò)程中所用的液體。例如，該系統(tǒng)經(jīng)歷的阻尼(衰減)與幾種因素有關(guān)，包括液體的粘度和微射流導(dǎo)管45的幾何形狀、微射流通道55的幾何形狀和其它構(gòu)件的幾何形狀。為了獲得理想的性能，優(yōu)選的系統(tǒng)配置有由聚硅組成的隔片51、狹窄的微射流通道55、以及隔片51和反電極53之間一個(gè)小的初始分隔。由于沒(méi)有激活聚硅隔片運(yùn)動(dòng)的閾電壓，MEM噴射泵可輸送微微微升至微微微微微升的小體積(液體)，負(fù)載隔片51大小的電容器至零點(diǎn)幾伏特所需的功率是大約一皮瓦特。一個(gè)光電二極管，如一個(gè)離子雪崩光電二極管，能產(chǎn)生一納瓦特功率，因此能負(fù)載數(shù)百個(gè)或者甚至數(shù)千個(gè)這種MEM泵來(lái)輸送生物活性物質(zhì)給細(xì)胞。
驅(qū)動(dòng)泵43的動(dòng)力來(lái)自圖1F所示光電二極管陣列59中的一個(gè)光電二極管。接觸此陣列59的光線有效地驅(qū)動(dòng)了配置的泵43，將含生物活性物質(zhì)44的液體39泵入微射流導(dǎo)管45，生物活性物質(zhì)44可流過(guò)該導(dǎo)管并擴(kuò)散入小孔24，與例如長(zhǎng)入小孔24的生長(zhǎng)錐30接觸。例如，以此種方式，人造突觸芯片10可用于將光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為生物信號(hào)。人造突觸芯片10的陣列，或包含此種芯片的陣列系統(tǒng)，或人造突觸芯片或具有小孔陣列的芯片，也可以類(lèi)似方式用于將光信號(hào)轉(zhuǎn)為生物信號(hào)。或者，還可采用電信號(hào)刺激細(xì)胞或刺激在人造突觸芯片上生長(zhǎng)的細(xì)胞以引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，例如，引導(dǎo)細(xì)胞朝向電極生長(zhǎng)。
構(gòu)建人造突觸芯片10之類(lèi)裝置所需的組件和器件可采用通常稱(chēng)為“顯微制作”或“納米制作”的技術(shù)來(lái)制備。可在以下文獻(xiàn)中找到實(shí)施本發(fā)明所用的顯微制作方法。美國(guó)專(zhuān)利5,776,748(授予Singhvi等)；5,900,160(授予Whitesides等)，6,060,121(授予Hidber等)，6,180,239(授予Whitesides等)；“Patterning of a Polysiloxanerecursor to Silicate Glasses by Microcontact Printing”，Marzolin等，ThinSolid Films，1998，3159-12；“Microfabrication，Microstructures andMicrosystems”，Qin等；in Microsystem Technology in Chemistry and LifeSciences第194卷，Manz A和Becker H主編，Spring-Verlag，Berlin，1998.1-20；“Unconventional Methods for Fabricating and Patterning Nanostructures”，Xie等，Chem Rev，991823-1848(1999)中找到實(shí)施本發(fā)明所用的顯微制作方法。上述和下述所有專(zhuān)利和出版物的內(nèi)容均納入本文作為參考。采用這些顯微制作方法構(gòu)建的高級(jí)顯微結(jié)構(gòu)可用于制備諸如人造突觸芯片10等裝置和修飾基質(zhì)。下圖中所示結(jié)構(gòu)采用Stanford Nanofabrication facility(Leland Stanford Junior University，StanfordCA94305)制備。
圖2A顯示本發(fā)明ASC的氮化硅支持層16中形成的小孔24。圖2A的方位與圖1B相同，顯示小孔24面向ASC的細(xì)胞接觸表面。此孔直徑約10μm(標(biāo)尺桿代表1μm)。小孔24以凹部22暴露的底部32的邊緣34為邊界。以圖2A所示小比例尺，小孔24就其形狀和表面而言相當(dāng)光滑。為了改進(jìn)分辨率，先用金包覆該裝置。注意此工序所用的等離子體蝕刻在小孔中沒(méi)有產(chǎn)生垂直側(cè)壁。側(cè)壁的縱橫比約2.5∶1。雖然圖2A中顯示的小孔24的例子形成穿通氮化硅支持層16的通道，但也可采用其它材料如聚合物和玻璃。
可將微射流存貯室36與凹部22的另一側(cè)連接?？蓪⒋尜A室36的大小構(gòu)制成能容納神經(jīng)調(diào)節(jié)劑水溶液或水性懸液。小孔24提供了從存貯室36輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑至細(xì)胞26至少一部分的導(dǎo)管。此外，可采用其它導(dǎo)管和射流輸送系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)液體和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑到所需部位、在小孔24或毗鄰小孔24、存貯室36或其它部位。例如含有貯備液體和/或神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的庫(kù)位于遠(yuǎn)離小孔的部位，可操作性地通過(guò)一導(dǎo)管將該倉(cāng)庫(kù)與存貯室36和小孔24相連。
圖2B是在底部具有微小孔的顯微制作壁的掃描電子顯微照片(SEM)，顯示本發(fā)明人造突觸芯片的存貯室36，系從ASC的細(xì)胞接觸基質(zhì)表面12的對(duì)面看。該顯微照片比例尺較圖2A為大，從人造突觸芯片10另一邊看存貯室36，顯示圍繞小孔24的是光滑的氮化硅表面。顯示中間層18的壁38和底層20的壁40，顯示一小部分底層20構(gòu)成了壁38和壁40的框架，黑點(diǎn)表示供細(xì)胞附著和刺激的小孔24(在此級(jí)放大中不能清楚看見(jiàn))。設(shè)計(jì)存貯室36來(lái)存放細(xì)胞培養(yǎng)液，壁底尺寸為1mm直徑。
如圖1A和1B所示，ASC10的基質(zhì)12具有微型模格14，能有效引導(dǎo)和指導(dǎo)細(xì)胞突起，如神經(jīng)突28和生長(zhǎng)錐30的生長(zhǎng)。圖2C是掃描電子顯微照片，顯示這種定向細(xì)胞生長(zhǎng)，顯示大鼠P7視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)在用薄層模格模式化的塑料基質(zhì)上生長(zhǎng)。圖2C左邊底部的插入物說(shuō)明在加入RGC前顯微制作在基質(zhì)上的鋸齒狀模格，如電子顯微照片所示，細(xì)胞體和細(xì)胞突起沿模格相當(dāng)靠近。標(biāo)尺桿代表長(zhǎng)度100μm。
細(xì)胞也能在穿通ASCi0的支持層16的顯微制作小孔24上生長(zhǎng)。圖2D顯示PC12細(xì)胞圍繞和在氮化硅表面5μm直徑小孔上的生長(zhǎng)。在圖2D邊緣可見(jiàn)小孔24下的存貯室36的邊界。
制備微型模格14的優(yōu)選方法是使基質(zhì)12與顯微接觸印刷印模接觸，此器件具有沉積到基質(zhì)12上的按順序安裝的分子，可以是不連續(xù)的安裝，顯微制作方法適合制備顯微接觸印模。圖3是在表面上制備微型模格14的本發(fā)明印模的SEM平面圖，表面拓?fù)鋱D以正方形陣列的形式表示。材料沉積在印模表面，接觸圖1所示人造突觸芯片10裝置的基質(zhì)12。此印模能在基質(zhì)12上有效形成微型模格。此法形成微型模格是顯微接觸印刷的一種方法。這種顯微接觸印刷方法形成的微型模格能有效校準(zhǔn)基質(zhì)上細(xì)胞的位置和生長(zhǎng)。圖3顯示硅晶片顯微機(jī)械加工模板制成的聚二甲基硅氧烷(PDMS)印模的掃描電子顯微照片(SEM)。圖3所示顯微接觸印模具有正方形陣列的表面拓?fù)錁?gòu)造。其它模格包括圓形、橢圓形、條形和其它形狀，可在顯微接觸印模表面制作。
如圖3所示的顯微印?？捎霉饪碳夹g(shù)制作。例如，圖3所示印模可在模格化以產(chǎn)生顯微接觸印刷模板的硅晶片上的光刻薄層(1-7μm)上形成。掩膜和印模模板由Stanford Nanofabrication Facility制造。該模板模格由供細(xì)胞附著和神經(jīng)元生長(zhǎng)的線狀陣列所組成。此模板的制備是將掩膜用紫外線光蝕刻在硅片上的感光樹(shù)脂正面。用Sylgard 184硅氧烷高彈體在該模板上原位產(chǎn)生PDMS印模，再加熱固化。也可將高彈體和熟化劑在一起澆注，在硅模板上形成PDMS，脫氣和室溫放置，來(lái)制作印模，然后切下PDMS的一部分用等離子體處理制作印模以增加疏水性(提高蛋白質(zhì)吸附)和用SFM成象。
用這些方法可制備各種不同的印模模格，它們適合于神經(jīng)突生長(zhǎng)的最佳線條寬度或厚度、長(zhǎng)度和間距。例如，線寬度范圍可采用幾納米(nm)寬至幾百微米(μm)寬，優(yōu)選線寬度10納米至20微米。線可短至幾納米，可長(zhǎng)至幾厘米，優(yōu)選線長(zhǎng)范圍為10納米至約100微米長(zhǎng)。模格中線條之間的間距范圍可為約1微米至幾百微米，優(yōu)選線條間距約2微米至約100微米。
顯微制成印模后，用需要沉積在基質(zhì)12上的分子包覆此印模以提供微型模格14。微型模格可包含生物活性分子和物質(zhì)，例如神經(jīng)遞質(zhì)；激素；神經(jīng)生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子；協(xié)同刺激分子；抗體和本領(lǐng)域已知的其它生物分子。例如印?？捎媚艽龠M(jìn)細(xì)胞粘附的粘附劑包覆。粘附劑包括聚-L-賴(lài)氨酸、細(xì)胞TaKTM(Becton Dickinson.Franklin Lakes.NJ)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)等細(xì)胞粘附分子、凝集素和本領(lǐng)域已知的其它粘附劑。粘附劑也可用熒光標(biāo)記以便觀察。模格可以印制在玻璃、硅、氮化硅、聚酰亞胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙交酯、特氟隆、其它聚合物或適合用作細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)的任何基質(zhì)上。例如，可讓包覆的印模與氮化硅支持層上的聚酰亞胺基質(zhì)接觸以提供促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的基質(zhì)?？捎脽晒怙@微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。可用汞弧燈激發(fā)偶聯(lián)于聚-L-賴(lài)氨酸或其它微型模格分子的熒光染料以提供熒光信號(hào)顯示粘附劑。
圖4顯示植入動(dòng)物體內(nèi)的系統(tǒng)50。在實(shí)施方案中，將該系統(tǒng)植入動(dòng)物的視網(wǎng)膜中。系統(tǒng)50包括有ASC52、光敏裝置54、ASC和光敏裝置之間的通訊連線56和動(dòng)力源58。光敏裝置54可與ASC52分開(kāi)，或可與ASC52相接觸，或可包括ASC52部分。光敏裝置52可是光電倍增器，半導(dǎo)體光電傳感器，化學(xué)光電傳感器，金屬光電傳感器，如硒或其它光電池，或本領(lǐng)域已知的其它光電傳感器。通訊線路56可是任何一種導(dǎo)電體如電線、線路圖尋跡或其它電線路。在實(shí)施方案中通訊線路56是一種化學(xué)通訊線路，光電傳感器靠它改變化學(xué)環(huán)境致使化學(xué)信號(hào)輸送至ASC52的至少一部分。動(dòng)力源58可以是任何動(dòng)力源，如電池，能靠溫度梯度產(chǎn)生動(dòng)力的熱動(dòng)力源，或能從光產(chǎn)生能量的光電池。
圖5A表示植入了ASC62的動(dòng)物眼睛60。顯示ASC62植入在動(dòng)物視網(wǎng)膜下腔64中，占據(jù)視網(wǎng)膜光感受器66和視網(wǎng)膜色素上皮68之間的位置。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可將ASC62植入到內(nèi)界膜72上的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層70附近，靠近玻璃體液74的邊界。圖5B顯示視網(wǎng)膜下腔64和植入的ASC的詳圖。
ASC可用于植入動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中。例如，可將本發(fā)明的ASC植入動(dòng)物的視網(wǎng)膜中，為患有創(chuàng)傷、疾病或退變的視網(wǎng)膜提供神經(jīng)修復(fù)。模格中可含有一種分子或分子組合，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)因子，包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦衍生的生長(zhǎng)因子(BDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、NT-3、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等生長(zhǎng)因子，環(huán)腺苷酸、環(huán)島苷酸等環(huán)狀核苷酸；層粘連蛋白，肌腱蛋白，膠原，纖連蛋白，整聯(lián)蛋白，免疫球蛋白等胞外基質(zhì)分子(包括細(xì)胞粘附分子N-CAM和L-CAM、axonin、鈣粘著蛋白等)proteglycans，anosmin-1，血小板反應(yīng)蛋白等；髓磷脂和髓磷脂相關(guān)抑制劑如髓磷脂相關(guān)糖蛋白和nogo；酪氨酸激酶受體如ephrins；netrins；炎癥細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和白血病抑制因子(LIF)，腫瘤壞死因子(TNF)，白介素等；神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿等；刺激分子如氯化鉀，胰島素等；協(xié)同刺激分子，抗體和本領(lǐng)域已知的其它生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子。
關(guān)鍵是優(yōu)化從印模轉(zhuǎn)移到細(xì)胞系統(tǒng)的模格保留，用于基質(zhì)植入，如視網(wǎng)膜植入?？衫镁€寬度和生物分子濃度控制每根顯微印制線的神經(jīng)突數(shù)目，模格轉(zhuǎn)移程度可用顯微鏡測(cè)定。
如圖1所示，本發(fā)明裝置的凹部22和存貯室36適合于貯存神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑至細(xì)胞的至少一部分。本發(fā)明通過(guò)引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)至納米小孔和經(jīng)此納米小孔輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑給細(xì)胞突起，提供了引導(dǎo)神經(jīng)調(diào)節(jié)劑輸送給單個(gè)細(xì)胞、特別是輸送至該細(xì)胞一定部位的能力。適合的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑包括能有效刺激細(xì)胞或調(diào)節(jié)其它物質(zhì)刺激細(xì)胞的效果的任何一種物質(zhì)。例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)劑可以是神經(jīng)遞質(zhì)、激素、離子、信使分子、核酸、核酸載體、藥物、細(xì)胞、細(xì)胞碎片，細(xì)胞器、脂質(zhì)體或其它生物活性材料。神經(jīng)調(diào)節(jié)劑如神經(jīng)遞質(zhì)包括氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，以及相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和刺激劑，如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、丙酸α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁酮(isoxalone)(AMPA)，quisqualate和紅藻氨酸鹽及其同類(lèi)物，本領(lǐng)域已知的其它谷氨酰胺物質(zhì)和擬甘氨酸物質(zhì)；擬膽堿物質(zhì)如乙酰膽堿、環(huán)庚基二膽堿、其同類(lèi)物和本領(lǐng)域已知的其它擬膽堿物質(zhì)；擬腎上腺物質(zhì)如多巴胺、腎上腺素，去甲腎上腺素，其同類(lèi)物和本領(lǐng)域已知的其它擬腎上腺物質(zhì)。5-羥色胺和該領(lǐng)域已知的擬5-羥色胺物質(zhì)；γ-氨基丁酸(GABA)和該領(lǐng)域已知的其它擬GABA物質(zhì)；?；撬?、章魚(yú)胺；磷酸核苷酸如三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸島苷(GDP)和三磷酸島苷(GTP)，環(huán)狀核苷酸如環(huán)腺苷酸(cAMP)和環(huán)島苷酸(cGMP)以及該領(lǐng)域已知的其它神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。此外，神經(jīng)遞質(zhì)包括對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)受體如谷氨酸受體、NMDA受體、AMPA受體、甘氨酸受體、多巴胺受體、乙酰膽堿受體及該領(lǐng)域已知的其它受體有活性的所有物質(zhì)。神經(jīng)調(diào)節(jié)劑還包括信使物質(zhì)，包括肽激素和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑如腦啡肽、內(nèi)啡肽，腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，血管活性腸肽(VIP)和該領(lǐng)域已知的其它肽，類(lèi)固醇激素，第二信使如磷酸肌醇和離子如鈣、鉀、鋅及其鹽。這些物質(zhì)可游離在水溶液或水懸液中，可存在于微膠團(tuán)中或由脂質(zhì)體攜帶。
脂質(zhì)體如本領(lǐng)域所知是一種膜性小泡囊，適合輸送親水和疏水化合物，基于脂質(zhì)體的給藥系統(tǒng)見(jiàn)例如Gregoriadis G主編的“脂質(zhì)體技術(shù)”第二卷Incorporation ofDrugs，Proteins and Genetic Material.CRC Press 1984和Knight C G主編“脂質(zhì)體物理結(jié)構(gòu)到治療應(yīng)用”，Eisevier 1981。適合實(shí)施本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑還包括含離子通道、受體或其它生物活性分子的生物膜制品，描述見(jiàn)Coronado等J.Gen.Phys.76424-446，1980。
這類(lèi)生物膜制品可將與分子融合并將其插入小孔24的膜42中，或插入細(xì)胞26、神經(jīng)突28或生長(zhǎng)錐30的膜42中。例如短桿菌肽、丙甲甘肽和該領(lǐng)域已知的其它分子是適合實(shí)施本發(fā)明該實(shí)施方案的成孔分子。適合實(shí)施本發(fā)明的離子通道分子包括多個(gè)亞單位巨分子裝配體，如配體門(mén)控離子通道，包括環(huán)狀核苷酸門(mén)控通道、鈣活化通道、ACHR離子通道、谷氨酸受體離子通道，包括所有的NMDA、AMPA、quisqualate、紅藻氨酸鹽亞型、甘氨酸受體離子通道，和電壓門(mén)控離子通道分子，以及多個(gè)亞單位巨分子裝配體如鈉通道、鉀通道、鈣通道、氯通道，和其它通道，包括間隙接頭通道、動(dòng)力敏感通道、非門(mén)控和非選擇性通道。運(yùn)載分子如兩性霉素也適合。另外，可用蛋白質(zhì)如已摻入的作為成膜材料一部分的成孔蛋白和運(yùn)載體來(lái)形成此膜。見(jiàn)Schindler，Methods Enzymol.1989；171225-253。
實(shí)施例1顯微制作小孔采用斯坦佛納米制作設(shè)施(Stanford Nanofabriction Facility)在硅芯片表面制備了顯微制作小孔。圖2顯示帶有顯微制作小孔的顯微制作坑。斯坦佛硅加工技術(shù)適合在氮化硅上產(chǎn)生微米和納米級(jí)小孔。采用低壓化學(xué)蒸汽沉積(LPCVD)在<100>定向硅晶片表面上生成氮化硅。將能在光敏聚合物中明確結(jié)構(gòu)的平板印刷術(shù)，與用等離子蝕刻使氮化硅結(jié)構(gòu)模格化相結(jié)合，在晶片一側(cè)產(chǎn)生小孔，另一側(cè)產(chǎn)生蝕刻劑掩膜層。采用各向異性蝕刻劑如氫氧化四甲銨(TMAH)去除沿{111}晶面上的硅，但留下氮化硅不受影響。這在小孔下方產(chǎn)生了一種通道洞(連接通路)，使氮化硅膜暴露并完成加工。
圖2A顯示顯微制作容器的SEM。注意箭頭所指的黑點(diǎn)是供細(xì)胞附著和刺激的顯微蝕刻小孔，設(shè)計(jì)此井坑來(lái)保持細(xì)胞培養(yǎng)液。井坑底尺寸為1毫米寬。
圖2B顯示圖2A的容器底部的顯微小孔。該小孔直徑約10微米。雖然沒(méi)有顯示，但小孔的另一側(cè)與顯微通道存貯室相連接，作此存貯室的制作是將帶顯微通道的PDMS印模密封于基質(zhì)的底面。
此導(dǎo)管或通路，開(kāi)口于作為向粘附于基質(zhì)的細(xì)胞所加神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的存貯室的微射流通道中。如上所述，用標(biāo)準(zhǔn)PDMS印模制作微射流通道并將其密封于晶片上。這種微射流通道用極好的密封劑不難密封于晶片。例如含通道的PDMS印模在酸清洗(如HCl)和等離子處理后形成不可逆結(jié)合，邊界止于氮化硅表面。所述微射流通道具有寬范圍的分支，用途包括(1)作為通用緩沖液存貯室不斷從細(xì)胞另一側(cè)補(bǔ)充/交換廢棄產(chǎn)物；(2)輸送遞質(zhì)、脂質(zhì)體、細(xì)胞的電壓/電流鉗位(clamping)，或(3)細(xì)胞釋放產(chǎn)物取樣。
形成的小孔大小幾納米至幾十微米，細(xì)胞可在其上生長(zhǎng)。例如細(xì)胞可直接生長(zhǎng)在50納米小孔上。采用長(zhǎng)度小于神經(jīng)元的小孔能確保只刺激一個(gè)細(xì)胞。
實(shí)施例2裝置制作和優(yōu)化此實(shí)施例說(shuō)明用于形成顯微制作小孔中雙層膜的本發(fā)明裝置的制造和優(yōu)化。制作的芯片表面積約1平方厘米，最終厚度約0.5毫米。在500納米厚氮化硅中等離子蝕刻出25-250微米(直徑)圓形小孔。芯片覆蓋一厚層聚酰亞胺，除一側(cè)暴露的氮化硅500微米方形區(qū)域外。
在斯坦佛納米制作設(shè)施(SNF)中用4英寸<100>定向摻硼雙拋光硅晶片(各面厚度500微米)進(jìn)行制作。采用低壓化學(xué)蒸氣沉積(LPCVD)在晶片表面生成氮化硅薄層(500納米)。采用標(biāo)準(zhǔn)的接觸照相平板印刷術(shù)和氮化硅等離子體蝕刻確定小部件(如小孔)。晶片背面的較大部件類(lèi)似地用背面校直、接觸照相平板印刷術(shù)和等離子體蝕刻確定。
沿{111}平面與晶片表面成54.7°角各向異性蝕刻硅晶片。選擇晶片背面的方形洞產(chǎn)生比位于中心的小孔更大的180微米正方形，這樣留下了氮化硅薄膜自由橫跨于該區(qū)域而無(wú)任何硅支撐。由于氮化硅的高抗張強(qiáng)度，這種氮化硅膜相當(dāng)牢固和穩(wěn)定，易于忍耐受加工過(guò)程中產(chǎn)生的力。
將含有氮化硅中確定部件的晶片置于20％氫氧化四甲銨(TMAH)中100℃約6小時(shí)，氮化硅起著掩膜作用使TMAH沿{111}晶體平面各向異性蝕刻該晶片。
由于暴露的硅是導(dǎo)體，必須氧化其表面以降低電容和噪聲。于1100℃蒸氣氧化4小時(shí)，提供了約1.1微米氧化硅。最后為了進(jìn)一步降低電容，將光敏性聚酰亞胺(Durimide 7520，Arch Chemicals，Zwijudrecht.Belgium)紡成30-70微米厚，暴露在接觸校直器下、曝光，熟化，產(chǎn)生15-35微米厚的覆蓋層。
為了產(chǎn)生疏水性表面，將芯片浸泡在十六烷(Sigma.St.Louis MO)、氯仿和辛基三氯硅烷(Aldrich.Milwaukee.WI)的80∶19∶1體積比混合液中，每側(cè)15分鐘，在氯仿中淋洗二次，每次5分鐘，完成處理。加約5微升水滴并驗(yàn)證觸角大于90°，測(cè)試包覆情況。
硅的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠控制雙層支持部分(BSP)的厚度。選擇氮化硅BSP的厚度等級(jí)小于用于形成雙層結(jié)構(gòu)(6-25微米)小孔特氟隆部分，希望該較薄部分能提供較小的溶劑環(huán)面和較大的雙層面積。此部分仍然是大于2-4納米等級(jí)的雙層，因此，脂質(zhì)從此部分的邊緣彎向該雙層仍是必然的。然而，這種彎曲距離較小，產(chǎn)生比小孔尺寸大的雙層面積。這對(duì)穩(wěn)定性的沖擊尚不知道，但它使得有更大面積供蛋白質(zhì)插入并能在較小的小孔中產(chǎn)生雙層。
ASC能提供神經(jīng)元的精確刺激，產(chǎn)生靈敏的電學(xué)測(cè)定結(jié)果。如同任何電子回路，過(guò)度的電容可能產(chǎn)生一個(gè)問(wèn)題；提高了電噪聲。過(guò)度電容是一個(gè)問(wèn)題有二個(gè)理由(1)因入口電阻與該電容串聯(lián)產(chǎn)生的電噪聲，和(2)當(dāng)制作跨越ASC小孔的脂質(zhì)雙層時(shí)不能觀察到超過(guò)背景的膜電容。由于硅在室溫下是導(dǎo)體，水浴與硅的接觸就有效地將芯片的整個(gè)區(qū)域與該系統(tǒng)相連。1cm2芯片含500nm氮化硅(ε≈7.5)，電容為13nF，比25微米直徑雙層的電容高三個(gè)數(shù)量級(jí)。
然而，薄的BSP在含有電荷運(yùn)載體的溶液中具有大電容，可能存在的問(wèn)題是需要精確的電測(cè)量結(jié)果或細(xì)胞的精確電刺激。發(fā)現(xiàn)此問(wèn)題的解決方法有兩個(gè)首先去除硅和水浴之間的電連接，使晶片暴露于1100℃蒸氣，在所有暴露的硅表面產(chǎn)生1微米的氧化硅。兩個(gè)因素中的這一個(gè)降低了電容，因?yàn)樵撓到y(tǒng)有效地變成兩個(gè)氮化物電容器，經(jīng)一個(gè)硅導(dǎo)體串聯(lián)連接。然而，通過(guò)除去水浴與硅接觸時(shí)發(fā)生的(連接)間斷，簡(jiǎn)化了該系統(tǒng)的電容模式。
其次，加入聚酰亞胺層降低電容。選擇帶負(fù)電的光敏聚酰亞胺(ε≈3.5)，可用標(biāo)準(zhǔn)平板印刷術(shù)加工。熟化時(shí)，所用的30-100微米聚酰亞胺變成15-50微米。此外，熟化的聚酰亞胺對(duì)溶劑降解高度耐受。設(shè)計(jì)留下500微米×500微米的氮化硅不覆蓋在小孔上。操縱溶液水平使只有5毫米×5毫米的芯片暴露于溶液，將35微米聚酰亞胺的電容降低到僅22pF。
實(shí)施例3跨越氮化硅小孔的雙層結(jié)構(gòu)用Montal和Mueller的方法(1972)形成脂質(zhì)雙層。在實(shí)施Langmuir-Blodgett技術(shù)時(shí)，在小孔中產(chǎn)生了兩個(gè)脂質(zhì)單層，小孔中的脂質(zhì)得以校準(zhǔn)它們的疏水性尾部形成脂質(zhì)雙層。因?yàn)橹|(zhì)尾的疏水性，為了形成穩(wěn)定的雙層，BSP的表面也必須是疏水性的。如果基質(zhì)是疏水的，脂質(zhì)可平滑地從覆蓋基質(zhì)轉(zhuǎn)為跨越小孔。為了逆轉(zhuǎn)天然親水氮化硅的潤(rùn)濕性，用烷基硅烷(辛基三氯硅烷)覆蓋氮化硅。采用此覆蓋相當(dāng)簡(jiǎn)單和非常有效。無(wú)人發(fā)現(xiàn)可用來(lái)處理的裝置形成雙層。采用較長(zhǎng)碳鏈的硅烷或替代材料使表面更具疏水性將進(jìn)一步提高雙層的穩(wěn)定性。
表1顯示該裝置的特征。改變聚酰亞胺層厚度來(lái)驗(yàn)證我們的芯片背景電容模式。該模式以我們的接觸5mm×5mm芯片的水浴小室為基礎(chǔ)。測(cè)定了水浴和放大器的固有電容為7.2pF，包括在此數(shù)字中。對(duì)于50微米小孔裝置，其中聚酰亞胺厚32微米，該模式產(chǎn)生的背景電容為45pF。與之相比，6微米厚特氟隆為77pF。
表1，本研究中用的裝置特征，測(cè)定了聚酰亞胺厚度和總電容，同時(shí)計(jì)算其它性能。

簡(jiǎn)單地將測(cè)定的總電容和計(jì)算的基礎(chǔ)電容之差除以小孔的面積，測(cè)得雙層的比電容，其數(shù)值范圍為0.64-0.70μF/cm2，相當(dāng)于其它人造雙層實(shí)驗(yàn)中所見(jiàn)。在雙層形成后幾分鐘內(nèi)測(cè)定總電容避免了因雙層變薄產(chǎn)生的變化。注意到由于小孔面積減少，雙層電容變得比基礎(chǔ)電容小，會(huì)在比電容上產(chǎn)生大的誤差。
芯片上雙層形成的經(jīng)驗(yàn)式證據(jù)是三倍，對(duì)于最大尺寸的小孔，由于雙層產(chǎn)生的電容變化不難觀察到。對(duì)于典型的比電容值0.65μF/cm2，100μm小孔上的雙層電容為51pF，在65pF背景上不難觀察到。此外，通過(guò)小孔的電阻大于1GΩ，表明存在雙層，對(duì)于所有尺寸的小孔，觀察到“gigaseal”至少為2.5GΩ，表明形成了雙層。
對(duì)于較小的小孔，較難的是觀察背景上的電容變化，此時(shí)影響雙層電性能的膜結(jié)合蛋白質(zhì)如運(yùn)載體和離子通道賦予了膜形成的最好證據(jù)。選擇離子通道肽短桿菌肽D(gD)是因其易于使用和導(dǎo)電性變化大。對(duì)于短桿菌肽D要求脂質(zhì)雙層膜增加電流，各水浴中加入溶于乙醇的2mg/ml gD(Sigma.St.Louis Mo)5-20微升后，雙層的導(dǎo)電性在幾分鐘內(nèi)顯著增加，而電容維持恒定。加入的乙醇本身無(wú)作用。因此，在對(duì)施加的電勢(shì)(通過(guò)導(dǎo)電性的增加測(cè)得)的反應(yīng)上電流增加，表明脂質(zhì)雙層確已形成。
觀察各離子通道或微孔要求電噪聲盡可能小。除環(huán)境來(lái)源和電容的噪聲外，電噪聲主要來(lái)源有二硅的光運(yùn)載體和入口電阻。第一個(gè)噪聲來(lái)源是光，當(dāng)光入射到芯片上時(shí)激發(fā)運(yùn)載體通過(guò)帶隙，產(chǎn)生氮化硅兩層之間的波動(dòng)。取決于光的來(lái)源和強(qiáng)度，可測(cè)出產(chǎn)生的噪聲為幾十至幾百皮安培峰-峰值。簡(jiǎn)單地關(guān)掉室內(nèi)燈光或用遮光盒包裹此裝置，足以降低噪聲源產(chǎn)生的電噪聲。
電噪聲的另一來(lái)源是由于與雙層電容相串聯(lián)的水浴的入口電阻?？?cè)肟陔娮?Ra)包含三個(gè)部分整體水浴電阻率(32A-cm)，小孔中的水浴電阻率和小孔入口電阻。對(duì)于小的入口電阻，小孔預(yù)計(jì)噪聲r(shí)ms為 其中f是測(cè)量的帶寬。
表1顯示對(duì)每張測(cè)試芯片計(jì)算的結(jié)果。對(duì)于50μm小孔，計(jì)算的預(yù)期值為1.4pArms，而實(shí)際測(cè)定值在1.8~2.4pA之間，差異是由于局部環(huán)境噪聲。
實(shí)施例4雙層的穩(wěn)定性和壽命用Montal和Mueller(1972)的技術(shù)形成雙層。先用約5微升的1∶9(V∶V)十六烷∶已烷(Burdick&Jackson.Muskegon MI)預(yù)處理小孔。用硅烷高真空潤(rùn)滑脂(DowCorning，Midland MI)將芯片裝在兩個(gè)Teflon浴槽之間。各浴槽充滿1M KCl恰至小孔以下。將溶于氯仿的10mg/ml 1.2-二植烷酰-sn-甘油磷酸膽堿(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)溶液5微升加入各浴槽并使之蒸發(fā)。當(dāng)各浴槽水平上升時(shí)，小孔中形成脂質(zhì)雙層，如該裝置電容和導(dǎo)電性證明的那樣。
對(duì)任何支持基質(zhì)而言，支持形成的雙層穩(wěn)定一段長(zhǎng)時(shí)間的能力是一種重要的性能。發(fā)現(xiàn)ASC上形成的脂質(zhì)雙層膜很穩(wěn)定。就穩(wěn)定性而言，發(fā)現(xiàn)ASC比Teflin隔層有二個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一，ASC上形成的脂質(zhì)雙層膜比Teflon隔層形成的膜薄但堅(jiān)硬。Teflon隔層在壓力變化下會(huì)彎曲而氮化硅相當(dāng)剛硬。第二，氮化硅表面和小孔邊緣在納米水平上是光滑的(見(jiàn)圖2)，不象在Teflon隔層機(jī)械加工形成的小孔沿小孔邊緣有納米級(jí)的缺陷。
通過(guò)觀察脂質(zhì)雙層膜的壽命證明了膜的穩(wěn)定性。在前幾分鐘內(nèi)雙層大約有一半破裂，但某些雙層很長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定。觀察到的雙層最長(zhǎng)壽命為8小時(shí)。沒(méi)有試圖系統(tǒng)性測(cè)定較此時(shí)間更長(zhǎng)的膜情況。發(fā)現(xiàn)形成穩(wěn)定性雙層的數(shù)目極大地取決于芯片的清潔度，采用剛完成加工的新鮮ASC裝置，相當(dāng)容易形成穩(wěn)定的雙層膜。然而，清潔后再使用的ASC上較難形成穩(wěn)定的雙層膜，發(fā)現(xiàn)清潔后小孔中留有殘余物時(shí)不可能形成脂質(zhì)雙層膜。
實(shí)施例5采用α-溶血素的單通道記錄在跨ASC小孔形成的脂質(zhì)雙層膜上研究了葡萄球菌α-溶血素(αHL)通道的離子通道活性。此293個(gè)氨基酸的七聚物微孔形成了穿通脂雙層的2納米通道。用接插鉗位放大器(patch clamp amplifier)(Heka EPC-8，Heka Elektronik，Lambrecht，Germany)和模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器(Instrutech 1TC-18，Port Washington，NY)在10KHz取樣進(jìn)行單通道自動(dòng)記錄。用內(nèi)裝的7極低通過(guò)貝塞耳(Bessel)濾光片于5kHz進(jìn)行過(guò)濾。用Pulse 8.4(Heka)將數(shù)據(jù)收集到計(jì)算機(jī)并用Igor Pro 4.0(Wave Metrics，LakeOswego，OR)進(jìn)行分析。將αHL微孔加到順式小室(1-10微升，321ng/ml)并保持-40mV(反側(cè)接地)，將αHL加到反側(cè)也能產(chǎn)生通道，但由于內(nèi)腔狹長(zhǎng)擴(kuò)散時(shí)間較長(zhǎng)。
圖6A和6C說(shuō)明從顯微制作裝置100微米小孔中人造雙層膜接觸反式浴槽中β-環(huán)糊精(βCD)時(shí)記錄的α-溶血素(αHL)單通道電流。保持的電勢(shì)為+40mV(順式浴槽為接地電勢(shì))。圖6A顯示αHL通道的代表性單通道數(shù)據(jù)，在類(lèi)似實(shí)驗(yàn)中，施加-40mV電壓脈沖750ms，記錄電流，測(cè)出的電流每個(gè)通道為31.0±3.2pA。計(jì)算的αHL通道典型微孔導(dǎo)電性為811±55pS。加入β-環(huán)糊精(βCD)到該通道反側(cè)導(dǎo)致該通道中電流波動(dòng)，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子的運(yùn)入和運(yùn)出。在微摩爾濃度(如40μM-300μMβCD)時(shí)見(jiàn)到這種作用。當(dāng)通道阻塞時(shí)，如圖6A所示清楚地看到電流降低。βCD部分阻塞呈現(xiàn)朝下的峰。以較高取樣速度(100kHz)和延長(zhǎng)時(shí)間插入更清楚地顯示了βCD的作用。這些結(jié)果與先前用Teflon隔層形成的雙層所獲得的通道記錄結(jié)果相符。圖6B顯示在1MKC1，10mM Kpi和pH7.4時(shí)αHL單通道的電流電壓座標(biāo)圖。此擬合線(實(shí)線)通過(guò)-40mV和+40mV諸點(diǎn)。圖6C顯示在±200mV和±300mV時(shí)顯微制作裝置100微米小孔中人造雙層膜兩個(gè)αHL通道的電流是時(shí)間的函數(shù)。
實(shí)施例6運(yùn)用人造突觸進(jìn)行單細(xì)胞刺激興奮通過(guò)納米小孔刺激細(xì)胞并利用Ca2+敏感染料產(chǎn)生的熒光測(cè)定細(xì)胞活動(dòng)的方法包括以下一些方法(1)電壓鉗制細(xì)胞到小孔(施加吸力通過(guò)微通道)并改變微射流通道中緩沖液的電壓；(2)脈沖加入神經(jīng)遞質(zhì)到細(xì)胞底面，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)刺激；(3)將含遞質(zhì)的脂質(zhì)體微射流輸送到小孔開(kāi)口；(4)微射流存貯室的工程化細(xì)胞，通過(guò)釋放遞質(zhì)刺激神經(jīng)突。
在制作的微孔陣列上培養(yǎng)PC12細(xì)胞至接近鋪滿。用加有Ca2+敏感染料(如吲哚-1、呋喃-2、熒光-3、鈣綠、水母蛋白)的細(xì)胞以熒光顯微鏡觀察測(cè)定細(xì)胞活動(dòng)。熒光的作用是監(jiān)測(cè)小孔上的細(xì)胞活性和觀察其對(duì)鄰近細(xì)胞的作用。可以修飾小孔周?chē)谋砻嬉詫?shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的良好“密封”(良好密封是機(jī)械作用穩(wěn)定并具有接近或超過(guò)lgigaΩ的電阻)。表面修飾劑可包括不同的胞外基質(zhì)蛋白和“細(xì)胞Tak”(Becton Dickinson)。適合本發(fā)明裝置和方法使用的不同刺激技術(shù)包括時(shí)間和空間分辨法以及慢刺激。小孔的尺寸也可以不同。此外，可用預(yù)先裝載了離子通道或人造成孔分子(包括可形成孔的蛋白質(zhì))的脂質(zhì)雙層包覆小孔?？扇缜懊娴膶?shí)施例所述，形成這些脂質(zhì)雙層膜。離子通道或成孔分子可能已經(jīng)是膜的組成部分，如果它們是用于成膜的材料的一部分或摻入雙層中的。
采用顯微印模(如PDMS印模)制作微型模格覆蓋到顯微制作小孔陣列上，此微型模格能有效地引導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞在ASC基質(zhì)上的生長(zhǎng)，使細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)至毗鄰或覆蓋ASC小孔，可采用適合的校直系統(tǒng)在芯片上校準(zhǔn)帶小孔的顯微印模模格?？扇缟纤觯谶B接于各種微射流存貯室的顯微小孔陣列上刺激生長(zhǎng)在基質(zhì)上的PC12細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或其它細(xì)胞。
用從接觸凹部或存貯室中液體的電極發(fā)出的電壓脈沖刺激生長(zhǎng)在ASC基質(zhì)上的細(xì)胞，此電壓脈沖有效地使毗鄰或穿過(guò)小孔的細(xì)胞突起去極化。去極化電壓范圍約1-100mV。發(fā)現(xiàn)約10mV至約50mV之間的去極化最有效。
將含有神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和腺苷-tris-磷酸的脂質(zhì)體置于存貯室中。脂質(zhì)雙層膜橫跨小孔上。脂質(zhì)體與脂質(zhì)雙層膜融合釋放出神經(jīng)遞質(zhì)，與具有生長(zhǎng)穿過(guò)或毗鄰小孔的細(xì)胞突起的細(xì)胞接觸，使細(xì)胞受到刺激。透過(guò)脂質(zhì)體膜和脂質(zhì)雙層膜的透滲壓梯度促進(jìn)融合。電梯度、光學(xué)方法、在脂質(zhì)體和/或膜中包含促融合分子及其它方法也促進(jìn)融合。
用Ca2+敏感染料的熒光、電記錄和生化分析測(cè)定神經(jīng)元的興奮，來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞釋放入毗鄰小孔的凹部或存貯室中的神經(jīng)遞質(zhì)。
實(shí)施例7刺激人造突觸芯片上的細(xì)胞定位輸送液體裝置84由兩部分組成，一部分負(fù)責(zé)定位，一部分負(fù)責(zé)液體操縱。如圖1A~1D所述，這些裝置具有或沒(méi)有基質(zhì)12或底層20，與圖7A裝置相連接，如圖7B所示供定位輸送液體。圖7A說(shuō)明了本發(fā)明射流通道76配置器件，提供流向ASC10的存貯室36和小孔24或從其流出的液流。定位輸送液體的裝置84見(jiàn)圖7B，圖7B說(shuō)明ASC10和液體操縱裝置76之間的連接操作提供了定位輸送液體裝置84。為了定位輸送，這些裝置采用了氮化硅薄膜16中的5或10微米小孔24(如圖7B)。通過(guò)提供足夠小的小孔24，可限制輸送液體的體積和定位。這些實(shí)驗(yàn)中用的裝置84是1cm2芯片，厚約0.5mm，用等離子體蝕刻模格化氮化硅層16在晶片背面產(chǎn)生小孔24和方形洞(存貯室36)。沿著與晶片表面呈54.7°角度的(111)平面各向異性蝕刻此硅片，采用氮化硅作為蝕刻掩膜，選擇在晶片背面的方形洞36中產(chǎn)生一個(gè)大于小孔24的100微米的區(qū)域。這留下了自由橫跨該區(qū)域無(wú)任何硅支持的一層氮化硅薄膜。對(duì)可見(jiàn)波長(zhǎng)的光，氮化硅是透明的，因此通過(guò)此膜易于給細(xì)胞成像。由于氮化硅的高抗拉強(qiáng)度，此氮化硅膜相當(dāng)牢固和穩(wěn)定，能容易地耐受加工過(guò)程產(chǎn)生的力。定位后，定位輸送液體裝置84的其它必須任務(wù)是輸送液體給小孔。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，在ASC10的小孔24下方(圖7B)將PDMS制成的通道78與入口80和出口82以液體連續(xù)性相連(圖7A)。用常規(guī)照相平板印刷術(shù)在硅晶片上從300微米厚的SU-8光刻膠制作模板模具，用辦公室打印機(jī)在透明層上制作掩膜。通道78寬900微米，深150微米，長(zhǎng)8毫米，而PDMS澆成大約5毫米深。圖7A顯示對(duì)描繪此設(shè)計(jì)的卡通畫(huà)。PDMS一旦熟化，如圖7B所示通道78即與ASC相連接。將PDMS切成1cm2小塊，每個(gè)裝置一條通道。用稀鹽酸(1∶4)溶液清洗硅和PDMS，然后用氣體等離子體100W處理60秒。校直ACS10和其硅小孔24，置于PDMS通道78頂部的中心，擠壓小片在一起(約0.2N)使之連接并在熱平板上80℃加熱(見(jiàn)圖7B)。一旦完成，這種連接即不可逆。在與氮化硅分開(kāi)前PDMS將撕下。由于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)不易粘附于大多數(shù)基質(zhì)，包括硅/氮化硅；因此在接種細(xì)胞前必須處理裝置84以修飾其表面。先將裝置84浸入50微克/毫升的聚(D-賴(lài)氨酸)中室溫30分鐘。聚(D-賴(lài)氨酸)為加入供PC12細(xì)胞粘附和擴(kuò)展的小鼠層粘連蛋白提供了粘著層。以磷酸緩沖鹽水(PBS)淋洗裝置84后，加入溶于PBS的層粘連蛋白5微克/毫升，在培養(yǎng)箱(37℃、6.5％CO2)中培養(yǎng)8小時(shí)。然后用PBS淋洗裝置84準(zhǔn)備使用。
用氟-4(Molecular Probes，Eugene，OR)觀察胞內(nèi)Ca2+水平變化來(lái)測(cè)定緩激肽刺激。將1mM二甲基亞砜以Ringer氏溶液(135mM NaCl，5mM KCl，10mM D-葡萄糖，2mMMgCl2，2mM CaCl2，10mM HEPES，pH7.2)混合后重建液氟-4，至氟-4最終濃度1μm，制成加載液k。
刺激液是緩激肽(Sigma，St.Louis，MO)、Ringer氏溶液和硫氰酸羅丹明(Sulforhodamine)101(Sigma)的混合液。以Ringer液重建緩激肽至1mg/ml(1mM)，然后稀釋至所需的測(cè)試濃度。硫氰酸羅丹明(Texas紅)以DMSO重建為8mM，加入刺激液中，最終濃度為4-8μM。此Texas紅染料為同時(shí)觀察液流和刺激提供了工具。
用倒置熒光顯微鏡或直立共聚焦顯微鏡觀察熒光水平的變化。用于觀察單個(gè)細(xì)胞刺激的倒置顯微鏡是Nikon TE300(10×，0.30數(shù)字快門(mén)(NA))與Hamamatsu Orca ER CCD照相機(jī)。用Metamorph(Universal lmaging Corporation，Downingtown PA)收集數(shù)據(jù)。用于觀察多個(gè)細(xì)胞和雙色實(shí)驗(yàn)的共聚焦顯微鏡是Nikon E800(10×，浸入式物鏡，0.30NA)與Nikon PCM 2000共聚焦元件。用兩激光同時(shí)激發(fā)氟-4(氬離子，488nm)和Texas紅(HeNe，543nm)。用兩個(gè)光電倍增管同時(shí)攝象(515/30帶能和605/32帶能濾光片)，并用Simple PCI(Compix Inc，Cranberry Township，PA)進(jìn)行分析。
微射流系統(tǒng)包括裝置84和相關(guān)的液體供應(yīng)和注射器，提供通過(guò)小孔的小量刺激劑。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是使緩激肽流經(jīng)通道78并使緩激肽流經(jīng)小孔24。有多種方法使液體在微通道中流動(dòng)，使液體流入輸液通道，包括用泵、重力、壓力(如針筒中針芯移動(dòng)產(chǎn)生的壓力)、電滲和其它方法引起流動(dòng)。我們選擇了用針筒壓力驅(qū)使的流動(dòng)。由于針筒產(chǎn)生的壓力梯度和化學(xué)擴(kuò)散共同使緩激肽流經(jīng)小孔24。
將24號(hào)特氟隆軟管插入各個(gè)入口孔80和82提供液體。用1毫升結(jié)核菌素注射器驅(qū)使液體流入膠管中，速度10-30μl/秒，注入體積范圍為250-1000μl，輸送時(shí)間15-60秒。平均流速16μl/秒，當(dāng)與通道的幾何形狀結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的雷諾數(shù)約3100，高于層流限度。高于層流限度是此系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。由于晶片厚度，在通道78和小孔24之間有一500微米的空隙，非層流方法通過(guò)非擴(kuò)散發(fā)生混合，使緩激肽加速抵達(dá)小孔。液體輸送系統(tǒng)安置到位，即可輸送適當(dāng)量的刺激物給生長(zhǎng)在支持層16上的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞刺激。選擇大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)，因?yàn)樗鼈兛捎米魃窠?jīng)生物學(xué)模型，并且容易照料、易于獲得。用緩激肽刺激時(shí)PC12細(xì)胞系改變了其胞內(nèi)Ca2+水平，緩激肽濃度1μM時(shí)獲得最大變化。測(cè)試前至少4小時(shí)，將該細(xì)胞接種在裝置84上使其粘附。控制刺激程度的兩個(gè)參數(shù)是濃度和體積。通過(guò)調(diào)節(jié)提供的緩激肽的濃度或體積來(lái)控制受刺激細(xì)胞所在小孔的距離。當(dāng)輸送到小孔24的緩激肽總量大時(shí)(濃度高或體積大)，很多PC12細(xì)胞受到刺激。見(jiàn)圖8A-8C，多細(xì)胞刺激的時(shí)間推移共聚焦顯微照片顯示緩激肽流經(jīng)粘附于裝置84表面的PC12細(xì)胞時(shí)受刺激細(xì)胞的波動(dòng)。小孔24直徑10微米(為PC12細(xì)胞體的一半)，顯示位于圖8A-8C點(diǎn)線圖的中心。
圖8A-8C顯示緩激肽(100μM)被驅(qū)使流經(jīng)通道78約21秒鐘，橫斷面強(qiáng)度(任選單位，恒定標(biāo)尺)表明PC12細(xì)胞受到刺激，圖8A表示緩激肽加入PC12細(xì)胞前的對(duì)照情況。圖8A的強(qiáng)度圖顯示0點(diǎn)時(shí)的兩個(gè)橫斷面，表明開(kāi)始時(shí)細(xì)胞未受刺激。在剛顯示圖8A畫(huà)面后將含100μM緩激肽的Ringer溶液加入通道78。當(dāng)小孔24向外幅射出液體時(shí)PC12細(xì)胞受到刺激。三秒鐘內(nèi)，離小孔25微米的一個(gè)PC12細(xì)胞受到刺激，如圖8B(箭頭)所示明亮細(xì)胞在小孔24的左下方。再過(guò)6秒鐘即緩激肽開(kāi)始流入9秒鐘后，進(jìn)一步遠(yuǎn)離小孔24(100微米)的細(xì)胞受刺激(圖8C雙箭頭)，該區(qū)域中的其它細(xì)胞也受到刺激，箭頭所指為展示亮度的代表性細(xì)胞。
此實(shí)施例證明采用化學(xué)刺激劑能夠局部地刺激細(xì)胞，為用生理性刺激刺激細(xì)胞和用于動(dòng)物器官或組織內(nèi)的所需部位提供一種神經(jīng)生物系統(tǒng)。可通過(guò)改變提供的流經(jīng)顯微小孔的神經(jīng)遞質(zhì)的量和濃度控制刺激的距離和時(shí)間，只要這種控制與動(dòng)物正常生理相容。
實(shí)施例8植入人造突觸芯片將人造突觸芯片植入家兔視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下腔。按照標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物外科技術(shù)麻醉新西蘭白兔。切口作在靠近眼球中線的鞏膜上，切開(kāi)一小的鞏膜瓣提供進(jìn)入下層脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的入口，在脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜血管層、脈絡(luò)膜基底層輕輕作一切口，并橫切視網(wǎng)膜色素內(nèi)皮層以提供進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔朝向光感受器的入口。將鹽水輕輕注入視網(wǎng)膜下腔使視網(wǎng)膜色素內(nèi)皮與視網(wǎng)膜光感受器分開(kāi)。將ASC放置入視網(wǎng)膜下腔，從此點(diǎn)向凹部緩慢推進(jìn)到眼球中線附近。ASC放在凹部附近所需部位后，將一針插入鞏膜開(kāi)口進(jìn)入玻璃體，在玻璃體中注入一小氣泡提供對(duì)視網(wǎng)膜的壓力以保持視網(wǎng)膜處于植入物之上，縫合切口，因氣體吸收氣泡在數(shù)天內(nèi)縮小并消失。
從以上所述將會(huì)明白，本文雖然已闡述了本發(fā)明的具體形式，并主要就人造突觸芯片(定位輸送液體的裝置)和類(lèi)似裝置及系統(tǒng)作了說(shuō)明，但可以不背離本發(fā)明的思路和范圍作出各種修改。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，一個(gè)實(shí)施例中顯示的特征可用于其它實(shí)施例。術(shù)語(yǔ)“裝置”、“部分”、“截面”、“步驟”和類(lèi)似意義的詞，當(dāng)用于本文時(shí)不應(yīng)解釋為援引了35U.S.C§112/6條款，除非后面的權(quán)利要求書(shū)表達(dá)上采用了術(shù)語(yǔ)“工具”或“步驟”跟著講具體功能而無(wú)具體結(jié)構(gòu)或活動(dòng)。
雖然闡明和描述了本發(fā)明的具體形式，應(yīng)明白可不背離本發(fā)明的思路和范圍作出各種修改，因此這不意味限制本發(fā)明，除非如所附的權(quán)利要求書(shū)所述。
權(quán)利要求
1.一種引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的裝置，其特征在于該裝置包含一種基質(zhì)，此基質(zhì)具有供接受細(xì)胞突起的表面，和能有效引導(dǎo)細(xì)胞突起按所需方向在所述表面上生長(zhǎng)的微型模格。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述表面還包含一需要部位，所述微型模格能有效引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)至所述表面上所述的需要部位。
3.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中，所述的需要部位選自納米小孔、電接觸點(diǎn)和微型模格功能部件(feature)。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述微型模格含有的功能部件選自趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述微型模格通過(guò)使基質(zhì)表面與顯微接觸印刷印模接觸而產(chǎn)生。
6.一種輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑至細(xì)胞的至少一部分的裝置，其特征在于該裝置含有一個(gè)表面和一個(gè)存貯室；所述存貯室能有效貯存所述神經(jīng)調(diào)節(jié)劑；所述表面有一內(nèi)面、一外面和一個(gè)納米小孔；所述納米小孔提供所述內(nèi)面和所述外面之間的連接通路；所述外面供接觸細(xì)胞；所述內(nèi)面與所述存貯室接觸；所述納米小孔有效地提供了輸送所述神經(jīng)調(diào)節(jié)劑從所述存貯室到所述細(xì)胞的至少一部分的導(dǎo)管。
7.如權(quán)利要求6所述的裝置，其中，所述外表面包含能有效引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的微型模格。
8.如權(quán)利要求6所述的裝置，其中，微型模格含有的功能部件選自趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。
9.如權(quán)利要求6所述的裝置，其中，神經(jīng)調(diào)節(jié)劑選自神經(jīng)遞質(zhì)、激素、離子、信使分子、核酸、核酸載體、藥物、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、脂質(zhì)體和其它生物活性材料。
10.一種能接觸和刺激細(xì)胞的至少一部分的裝置，其特征在于該裝置含有一個(gè)表面；所述表面有一外面和一回路；所述外面供接觸細(xì)胞；所述回路至少有一個(gè)接觸點(diǎn)；所述回路能有效刺激毗鄰所述接觸點(diǎn)的細(xì)胞的至少一部分。
11.如權(quán)利要求10所述的裝置，其中，所述刺激細(xì)胞的至少一部分包括刺激神經(jīng)突、通過(guò)神經(jīng)突刺激細(xì)胞和直接刺激細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求10所述的裝置，其中，所述表面含有微型模格。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，微型模格所含有的功能部件選自趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。
14.一種再生電極組裝體，其特征在于該組裝體包含引導(dǎo)神經(jīng)突的裝置和能有效接觸和刺激一個(gè)細(xì)胞的至少一部分的回路。
15.如權(quán)利要求14所述的再生電極組裝體，其中，引導(dǎo)神經(jīng)突的裝置包括權(quán)利要求1所述的裝置。
16.如權(quán)利要求14所述的再生電極組裝體，其中，引導(dǎo)神經(jīng)突的裝置包括權(quán)利要求6所述的裝置。
17.如權(quán)利要求14所述的再生電極組裝體，其中，所述回路包括權(quán)利要求10所述的裝置。
18.一種引導(dǎo)能生長(zhǎng)細(xì)胞突起的細(xì)胞按所需方式生長(zhǎng)細(xì)胞突起的方法，其特征在于包括提供一個(gè)含有微型模格的表面和接觸能生長(zhǎng)細(xì)胞突起的細(xì)胞以有效引導(dǎo)所述細(xì)胞按所需方式生長(zhǎng)細(xì)胞突起。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述微型模格含有的功能部件選自趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，該方法還包括使一表面與顯微接觸印刷印模接觸。
21.一種引導(dǎo)能生長(zhǎng)細(xì)胞突起的細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞突起至毗鄰回路接觸點(diǎn)部位的方法，其特征在于，包括提供含有回路和微型模格的一種表面，及使能生長(zhǎng)細(xì)胞突起的細(xì)胞與所述表面接觸以有效引導(dǎo)所述細(xì)胞生出細(xì)胞突起至毗鄰所述接觸點(diǎn)的部位。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述微型模格含有的功能部件選自趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，該方法還包括使一表面與顯微接觸印刷印模接觸。
24.一種刺激能生長(zhǎng)細(xì)胞突起的細(xì)胞的至少一部分的方法，其特征在于，包括使細(xì)胞與含有微型模格和所需部位的表面接觸；引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞突起至毗鄰所需部位的位置；從所述所需部位提供對(duì)所述細(xì)胞突起的刺激以有效刺激該細(xì)胞的至少一部分。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述所需部位包含納米小孔。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述所需部位包含一回路的接觸點(diǎn)，所述回路能有效刺激毗鄰所述接觸點(diǎn)的細(xì)胞的至少一部分。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，提供的刺激還包括輸送神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)劑選自神經(jīng)遞質(zhì)、激素、離子、信使分子、核酸、核酸載體、藥物、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、脂質(zhì)體和其它生物活性材料。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中刺激細(xì)胞包括刺激細(xì)胞突起、通過(guò)細(xì)胞突起刺激細(xì)胞和直接刺激細(xì)胞。
30.一種顯微制作的人造突觸，其特征在于包含顯微制作的裝置，此裝置具有帶微型模格和納米小孔的表面；所述微型模格能有效地引導(dǎo)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)；以及具有細(xì)胞突起的細(xì)胞；所述的細(xì)胞突起受所述微型模格的引導(dǎo)而接觸所述納米小孔。
31.如權(quán)利要求29所述的顯微制作人造突觸，其中，所述微型模格含有的功能部件選自趨化吸引因子、粘附分子、排斥分子、表面輪廓和至少一個(gè)富含特定原子的區(qū)域。
32.如權(quán)利要求29所述的顯微制作人造突觸，其還包含與所述納米小孔相連的存貯室、所述存貯室供貯存神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。
33.如權(quán)利要求31所述的顯微制作人造突觸，其中，神經(jīng)調(diào)節(jié)劑選自神經(jīng)遞質(zhì)、激素、離子、信使分子、核酸、核酸載體、藥物、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、脂質(zhì)體和其它生物活性材料。
34.一種制作眼內(nèi)裝置的方法，其特征在于，包括提供如權(quán)利要求10所述的供植入眼球內(nèi)的裝置。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述該裝置供植入眼內(nèi)一區(qū)域。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，植入?yún)^(qū)域選自視網(wǎng)膜、毗鄰內(nèi)界膜的區(qū)域和視網(wǎng)膜下腔。
37.一種制作眼內(nèi)裝置的方法，其特征在于，包括提供如權(quán)利要求14所述的再生電極組裝體供植入眼內(nèi)。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，再生電極組裝體被成形供植入眼內(nèi)一區(qū)域。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中植入?yún)^(qū)域選自視網(wǎng)膜、毗鄰內(nèi)界膜的區(qū)域和視網(wǎng)膜下腔。
40.一種可植入動(dòng)物體內(nèi)的系統(tǒng)，其特征在于，包含人造突觸芯片(ASC)、感光裝置、ASC和感光裝置之間的通訊連線和動(dòng)力源。
41.如權(quán)利要求40所述的系統(tǒng)，其中感光裝置與ASC操作性地接觸。
42.如權(quán)利要求40所述的系統(tǒng)，其中感光裝置是ASC的一部分
43.一種使細(xì)胞的一部分與液體接觸的裝置，其特征在于，包括一種基質(zhì)，該基質(zhì)具有供接受細(xì)胞突起的表面和能有效引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)到所述表面上所需部位的微型模格，以及含有供引流液體至所述所需部位的輸送液體通道的微射流系統(tǒng)。
44.如權(quán)利要求43所述的裝置，其中，所述所需部位包括小孔。
45.如權(quán)利要求44所述的裝置，該裝置還包括在所述液體輸送通道中引起液體流動(dòng)的工具。
46.如權(quán)利要求45所述的裝置，其中，在所述液體輸送通道中引起液體流動(dòng)的工具包括針筒中推動(dòng)的活塞。
47.如權(quán)利要求40所述的系統(tǒng)，其中，ASC包括含有輸送液體通道的微射流系統(tǒng)。
48.如權(quán)利要求47所述的裝置，其特征在于，該系統(tǒng)還包括在所述液體輸送通道中引起液體流動(dòng)的工具。
49.如權(quán)利要求48所述的裝置，其中，在所述液體輸送通道中引起液體流動(dòng)的工具包括針筒中推動(dòng)的活塞。
全文摘要
本發(fā)明提供了能引導(dǎo)細(xì)胞突起生長(zhǎng)形人造突觸的顯微制作裝置和方法。這種裝置稱(chēng)為人造突觸芯片。此種人造突觸包含有納米級(jí)制作小孔(約50－100納米大小)，其將細(xì)胞突起與神經(jīng)元興奮的化學(xué)或電學(xué)手段相連接，所述小孔寬度模擬了天然突觸的長(zhǎng)度，從而強(qiáng)調(diào)了神經(jīng)元和刺激源之間的空間定位關(guān)系。本發(fā)明還提供使神經(jīng)纖維再生長(zhǎng)入電極的裝置和方法，因此本發(fā)明提供了一種再生電極，其采用一種新穎的神經(jīng)界面應(yīng)對(duì)刺激，并采用一種新穎表面方法引導(dǎo)神經(jīng)元生長(zhǎng)，使得該裝置能夠在體內(nèi)連接于視網(wǎng)膜和其它解剖部位內(nèi)的神經(jīng)回路。
文檔編號(hào)G01N33/487GK1729285SQ02812796
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2002年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者哈維·A·菲什曼, 馬克·布魯曼克拉恩, 斯戴茜·福朗絲·本特, 戴維·M·布魯姆, 馬克·C·彼特曼, 喬納森·M·芭斯, 克里絲廷·李, 西爾多·冷 申請(qǐng)人:里蘭·斯坦福初級(jí)大學(xué)董事會(huì)