本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。尤其，本發(fā)明屬于基因治療的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及免疫學(xué)和治療癌癥的細胞療法。本發(fā)明進一步涉及富集工程化t細胞的方法，以及工程化t細胞在醫(yī)學(xué)治療中的用途。

背景技術(shù)：

正在開發(fā)具有工程化抗腫瘤特異性或抗病原體特異性的t細胞的過繼轉(zhuǎn)移。在這樣的策略中，具有特定的抗腫瘤特異性，或特定的抗病原體特異性的外源性免疫受體，比如αβt細胞受體，或γδt細胞受體或嵌合抗原受體被從患者轉(zhuǎn)移到自體t細胞，或，例如在異源的干細胞移植進入患者的情況下，進入響應(yīng)的異源t細胞中。例如，正在經(jīng)歷血液干細胞移植的白血病患者在治療期間也將清除淋巴細胞。因此，這種患者也可將從例如注入已經(jīng)被工程化而表達特定抗白血病t細胞受體的供體t細胞獲益。

盡管臨床試驗已經(jīng)證實了過繼轉(zhuǎn)移tcr工程化細胞在癌癥患者中的價值，但是這種策略的臨床益處通常僅僅能在部分患者中觀察到。對于觀察到的tcr工程化t細胞有限效力的一種解釋是新引入的tcr和內(nèi)源性tcr之間競爭cd3組分造成的治療性tcr的次優(yōu)表面表達(provasi等natmed.2012年5月；18(5):807-15)。而且，這種策略在異源環(huán)境，例如異源的干細胞移植中的應(yīng)用受到嚴重的安全性考慮的阻礙，因為表達內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞可在異源干細胞移植環(huán)境中誘導(dǎo)有害的副作用，比如例如移植物抗宿主疾病。因此，已經(jīng)開發(fā)了選擇工程化t細胞的策略，其關(guān)注工程化t細胞的陽性選擇。迄今存在的策略的目的是包括替代基因標記，比如例如新霉素基因，或例如熒光蛋白質(zhì)或允許陽性選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的或轉(zhuǎn)染的細胞的一些其他的另外基因。但是，這種策略具有另外的安全性考慮，因為除了過繼轉(zhuǎn)移具有期望的特異性的外源性免疫受體，它們需要包括通常較大的可能是免疫原性的外源性基因。

另外，本領(lǐng)域也已經(jīng)認識到，因為基因工程化細胞被注入患者的實際情況，萬一發(fā)生副作用的情況下，從患者選擇性清除這些細胞可能是有益的。因此，工程化t細胞通常除了外源性免疫受體，也包括其他基因使得選擇性清除工程化t細胞。這種基因包括例如自殺基因，使得當施用試劑至患者時，選擇性殺死具有自殺基因的細胞，比如hsv-tk(見，bondanza等，blood107，1828-1836(2006))。

因此，在本領(lǐng)域，工程化t細胞和用于受試者，比如用于治療人的策略已經(jīng)聚焦于在工程化t細胞中包括另外基因，使得選擇用于受試者的工程化細胞和/或使得清除用所述工程化t細胞治療的受試者的工程化t細胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明現(xiàn)提供了進一步方法，其使得富集工程化t細胞而不需要添加任何另外的基因。而且，該方法使得選擇工程化t細胞，而沒有工程化t細胞的任何干擾。工程化t細胞可保持不受影響。

本發(fā)明人認識到通過使用陽性選擇方法，例如使用選擇標記選擇工程化t細胞，可仍存在工程化t細胞的亞群，使得除了表達期望的特異性的外源性免疫受體和分開的選擇標記之外，還表達功能水平的內(nèi)源性αβt細胞受體。將在任何陽性選擇策略中選擇這種亞群并且可限制工程化細胞產(chǎn)物的治療性效力和安全性?，F(xiàn)有技術(shù)還沒有提供允許清除這種亞群的方法。

此外，使用例如結(jié)合外源性免疫受體的抗體的選擇工程化t細胞的陽性選擇方法可誘導(dǎo)大量的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的細胞凋亡。另外，包括選擇標記的陽性選擇方法需要添加可誘導(dǎo)有害的免疫應(yīng)答的基因，如此選擇標記通常是非宿主的(例如非人的)并且所以可被識別為是外源的而使得宿主清除轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。

因此，本發(fā)明人開始開發(fā)新的策略，其除了選擇工程化t細胞之外，也可清除如上述有害的亞群，除了外源性免疫受體，不需要工程化t細胞包括任何另外基因，并且使得工程化t細胞不受影響。

本發(fā)明的富集工程化t細胞方法與涉及使用陰性選擇步驟的任何現(xiàn)有技術(shù)方法相反。從包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞的t細胞混合物，可從混合物分離非工程化的αβt細胞。這種方法也包括分離下述任何工程化t細胞，所述工程化t細胞包括在具有次優(yōu)表達外源性免疫受體并且可仍具有大量表達的內(nèi)源性αβt細胞受體的t細胞的混合物中。這種方法也使得包括在t細胞的混合物中的工程化t細胞不受影響，避免例如非期望的誘導(dǎo)可能在使用結(jié)合工程化t細胞的抗體的陽性選擇方法中出現(xiàn)的細胞凋亡。

所述方法包括使用特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的選擇性抗體。因此，它們的細胞表面上包括內(nèi)源性αβt細胞受體的t細胞的混合物中的任何t細胞將從混合物分開，從而獲得具有外源性免疫受體的工程化t細胞的富集制品。這種選擇性抗體使用內(nèi)源性αβt細胞受體和外源性免疫受體的序列差異。即使相同來源的工程化的t細胞的αβt細胞受體也可用作外源性免疫受體。所需要的是修飾對應(yīng)內(nèi)源性αt細胞受體的抗體的結(jié)合位點的外源性αβt細胞受體的氨基酸序列，使得抗體不再與其結(jié)合?？砂ㄟM一步修飾，例如維持或優(yōu)化t細胞受體功能、維持特異性和/或引入優(yōu)選的兩條鏈的配對。

選擇性抗體可用在分離技術(shù)，比如macs、facs和免疫親和性色譜中。如本發(fā)明獲得的富集工程化t細胞的制品尤其用于醫(yī)學(xué)治療。這種醫(yī)學(xué)治療可以是癌癥的治療。例如，在白血病的治療中，進行異源干細胞移植的患者也可從注入富集工程化t細胞，即同種異體工程化t細胞的制品獲益，所述工程化t細胞可通過本發(fā)明的任何方法獲得，并且其是提供例如對于患者的白血病細胞具有特異性的外源性免疫受體的工程化t細胞。如此，可進一步促進治療時白血病的清除，同時可基本上降低或甚至完全避免了由于存在表達內(nèi)源性αβt細胞受體的t細胞而誘導(dǎo)有害的副作用的風(fēng)險。

類似地，在本發(fā)明的不同方面中，工程化淋巴細胞，即工程化t細胞或工程化nk細胞也可提供外源性免疫受體，例如car或工程化αβt細胞受體或(工程化)γδt細胞受體，使得外源性免疫受體與響應(yīng)的內(nèi)源性αβt細胞受體，或內(nèi)源性γδt細胞受體不同，使得特異性針對外源性免疫受體的抗體將特異性清除工程化t細胞。本發(fā)明的這些方面描繪在富集方法的圖1和清除方法的圖2中。因此，與任何現(xiàn)有技術(shù)方法相反，不需要工程化t細胞中包括編碼外源性免疫受體的基因之外的任何另外的基因，而使得清除工程化t細胞。

因此，與在現(xiàn)有技術(shù)中使用的利用例如選擇標記的任何選擇方法，或現(xiàn)有技術(shù)中使用的利用例如自殺基因的任何選擇性殺死方法相反，本發(fā)明現(xiàn)提供了外源性免疫受體，其不需要任何另外的選擇標記基因和/或任何另外的自殺基因。本發(fā)明現(xiàn)使得產(chǎn)生可以以不受影響的方式富集工程化t細胞，即工程化t細胞不需要任何結(jié)合任何外部試劑比如例如抗體或與任何外部試劑比如例如抗體相互作用。另外，用選擇性抗體經(jīng)特異性靶向外源性免疫受體，可清除，即消除具有可與內(nèi)源性t細胞受體區(qū)分開的外源性免疫受體的工程化t細胞。富集過程中使用的相同修飾可用清除過程。在富集方法中，第一抗體選擇性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體，而不結(jié)合工程化αβt細胞受體的修飾序列。相反地，第二抗體現(xiàn)結(jié)合工程化αβt細胞受體的所述修飾序列，但是不結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體。如此，最低限度修飾的αβt細胞受體可提供為外源性免疫受體，其允許結(jié)合兩種不同的選擇性抗體而被富集和體內(nèi)清除。所需要的是外源性免疫受體和特異性針對內(nèi)源性αβt細胞受體的選擇性抗體，和/或特異性針對外源性免疫受體的抗體。

因此，本發(fā)明現(xiàn)提供了結(jié)合選擇性抗體的外源性免疫受體，不需要任何另外的外源性基因用于富集和/或清除工程化t細胞。

附圖說明

圖1.示意性顯示了富集工程化t細胞的基本原理。a)提供了結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體(由箭頭指示)。在該方案中，抗體結(jié)合恒定區(qū)。b)、c)、e)和f)提供了不結(jié)合提供的抗體的外源性免疫受體(由帶交叉線的箭頭指示)。b)顯示了其中可變區(qū)(v)是內(nèi)源性來源的而恒定區(qū)是另一物種的。恒定區(qū)的序列不同，使得抗體不與其結(jié)合。c)顯示了其中部分恒定β鏈被另一物種的相應(yīng)部分替換的內(nèi)源性來源的αβt細胞受體。e)顯示了γδt細胞受體和f)顯示了嵌合抗原受體。d)顯示了不適合作為外源性免疫受體的內(nèi)源性來源的工程化αβ鏈，因為提供的抗體可與其結(jié)合。

圖2.示意性顯示了(體內(nèi))清除工程化t細胞的基本原理。提供了選擇性結(jié)合(由箭頭指示)b)中顯示的外源性αβt細胞受體并且不結(jié)合(由帶交叉線的箭頭指示)如a)中所描繪的內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體。這種抗體可也結(jié)合如c)中顯示的外源性αβt細胞受體，其基本上對應(yīng)其中抗體的結(jié)合位點已經(jīng)通過替換僅僅較少區(qū)域的β鏈而被引入β鏈的內(nèi)源性αβt細胞受體。外源性αβt細胞受體的修飾，比如d)中描繪的不允許結(jié)合抗體的修飾，不適于用在清除策略中。類似地，提供的抗體選擇性結(jié)合f)中顯示的外源性γδt細胞受體而不結(jié)合如e)中所描繪內(nèi)源性αβt細胞受體?？贵w選擇性靶向具有外源性免疫受體的工程化t細胞，而不靶向具有如a)和f)中所描繪的內(nèi)源性t細胞受體的內(nèi)源性t細胞。

圖3.示意性顯示了如在實施例部分所使用的外源性免疫受體和t細胞受體組分。a)提供了內(nèi)源性來源的外源性αβt細胞受體。隨后通過用來自另一物種的區(qū)段交換其區(qū)段來修飾該外源性αβt細胞受體。全部恒定區(qū)被替換，如b)中所顯示。或β鏈的部分恒定區(qū)被替換，如c)中所顯示。使用替換策略，以替換每條鏈的恒定區(qū)的不同的部分、不同的結(jié)構(gòu)域(d1、d2、d3、d4)，用于鑒定與靶向內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體結(jié)合的序列。每條修飾的鏈與比如c)中所描繪的未修飾的鏈配對。在另一策略中，使用的外源性免疫受體是選擇的γδt細胞受體。

圖4.富集具有外源性γδt細胞受體的工程化t細胞制品的改善的抗腫瘤功能。通過從t細胞的混合物gmp級清除αβtcr陽性t細胞，富集γδtcr工程化t細胞。a)pmp71:γ-t2a-δ轉(zhuǎn)導(dǎo)的αβt細胞在γδtcrt細胞分離(αβtcr清除)之前和就在其之后的流式細胞術(shù)表示。跟蹤富集t細胞在t細胞擴增期間的γδtcr表達。t細胞用pan-γδtcr和pan-αβtcr抗體染色并且指出了每個象限中細胞的百分數(shù)。b)γδtcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細胞(總體，9％γδtcr+)和清除了αβtcr(41％γδtcr+)的t細胞與負載⁵¹cr的daudi細胞以指示的e:t比例溫育4-5小時。pb:αmdm2/βp53轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞用作對照t細胞。特異性裂解的百分數(shù)顯示為三個+/-sd的平均值。通過雙因素anova計算統(tǒng)計學(xué)顯著性；**p<0.01；***p<0.001。c)γδtcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的總體(6％γδtcr+)和αβtcr消除的(51％γδtcr+)t細胞與所指示的不同腫瘤靶細胞溫育并且通過ifnγelispot測量ifnγ分泌。pmp71:δngfr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細胞用作對照t細胞。每15000個t細胞的ifnγ斑點顯示為三個+sd的平均值。僅僅t細胞不產(chǎn)生任何顯著水平的ifnγ。通過雙因素anova計算統(tǒng)計學(xué)顯著性；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖5.富集具有外源性γδt細胞受體的工程化t細胞制品消除的同種異體反應(yīng)性和保留的抗腫瘤反應(yīng)性。用pmp71:δngfr或pmp71:γ-t2a-δ逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)健康供體衍生的pbmc，富集γδtcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細胞(αβtcr消除和65％γδtcr+)或不富集(總體和9％γδtcr+)并且如所描述擴增。超過20天不刺激t細胞并且最后6天中斷il-2并且視為是靜息t細胞。a)靜息t細胞與opm2腫瘤細胞和一組錯配的ebv-lcl共培養(yǎng)24小時。通過ifnγelispot測量抗腫瘤活性和同種異體反應(yīng)性。每15.000個t細胞的ifnγ斑點顯示為三個+sd的平均值。

圖6.消除αβtcr-mabbw242抗體與αβtcr恒定結(jié)構(gòu)域中鼠氨基酸序列的結(jié)合。a)在使用pan-αβtcrmabbw242的macs陰性選擇之后，有效富集用全鼠無義(αmdm2/βp53)αβtcr(αmu/βmu)轉(zhuǎn)導(dǎo)的pbmc。左圖表示包括轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的t細胞的混合物，如通過存在αβtcr⁺t細胞所闡釋。右圖表示富集對于小鼠αβtcr表達是陽性的細胞群體。群體中消除了表達內(nèi)源性αβtcr的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。

b)用全鼠無義(αmdm2/βp53)αβtcr(αmu/βmu)、全人ny-eso-1αβtcr(αhu/βhu)或包括鼠恒定結(jié)構(gòu)域的ny-eso-1嵌合αβtcr(αhumu/βhumu)轉(zhuǎn)導(dǎo)jurma細胞。vβ4-染色和β小鼠-染色表示表達水平并且通過百分數(shù)指示。用αβtcr-pe染色表示臨床級pan-αβtcr-mabbw242的結(jié)合并且由平均熒光強度(mfi)指示。對于所有的facs圖：數(shù)據(jù)是7個單獨實驗的代表。

圖7.人和小鼠α和β鏈的比對和結(jié)構(gòu)域交換。

a)人和小鼠tcrα和tcrβ恒定區(qū)中氨基酸序列的比對。方框表示覆蓋人和小鼠之間所有氨基酸差異的結(jié)構(gòu)域；tcrcα具有三個不同的結(jié)構(gòu)域，而tcrcβ具有四個結(jié)構(gòu)域。星號表示人和鼠序列中相同的氨基酸。b)克隆至pmp71-載體的三個不同tcrα和四個不同tcrβ基因的示意性概述，深灰色方框表示人氨基酸序列側(cè)翼的鼠源化結(jié)構(gòu)域，如通過淺灰色方框所闡釋。tcrcβ開始于edlkn，氨基酸編號1-5，直至kdsrg，氨基酸編號176-180。比對的小鼠tcrcβ的結(jié)構(gòu)域3對應(yīng)于具有突變q88h、y101h、n106e、e108k、t110p、q111e、d112g、r113s、a114p、i120n、v121i的人結(jié)構(gòu)域3。也見，seqidnos.5和6的氨基酸217-250。v：可變區(qū)和c：恒定結(jié)構(gòu)域。v：可變區(qū)和c：恒定結(jié)構(gòu)域。圖a和b改編自sommermeyer&uckert，2010，journalofimmunology。

圖8.人tcrβ鏈中的結(jié)構(gòu)域3是αβtcr-mabbw242結(jié)合抗原決定部位的一部分。分別用全人ny-eso-1αβtcr(αhu/βhu)、嵌合ny-eso-1αβtcr(αhumu/βhumu)或部分鼠源化tcrβ-鏈與相應(yīng)的人tcrα-鏈的不同組合，或部分鼠源化tcrα-鏈與人tcrβ-鏈的組合轉(zhuǎn)導(dǎo)jurma細胞。通過vβ4-染色測量tcr的表達并且測試所有的tcr-組合它們被αβtcr-mabbw242的識別，如通過流式細胞術(shù)所確定。數(shù)值表示vβ4陽性細胞部分的百分數(shù)和總體細胞群體的平均熒光強度(mfi)。

圖9.有效的富集用部分鼠源化人αβtcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的工程化t細胞。

測試表達人αβtcr(αhu/βhu)、嵌合αβtcr(αhumu/βhumu)、β-鏈中具有鼠源化結(jié)構(gòu)域3的αβtcr(αhu/βm3)或具有組合的鼠源化αm2和βm3-結(jié)構(gòu)域的αβtcr(αm2/βm3)的jurma細胞通過macs陰性選擇使用αβtcr-包被磁珠的富集(右圖)。因為所有的tcr-鏈突變體是ny-eso-1/hla-a2特異性的，在分選之前，將它們與表達全人wt1特異性αβtcr的jurma細胞以1:1的比例混合，模擬細胞的異種群體(左圖和中間圖)。在清除之后，收集陰性細胞部分并且通過流式細胞術(shù)測量。vβ4-陽性部分表示ny-eso-1特異性tcr，和vβ21-部分表示wt1特異性tcr。數(shù)值表示對vβ4染色或vβ21染色是陽性的細胞的百分數(shù)。

圖10.來自人trc-domain和小鼠tra、trb、trg和trdc-domain的c-domain序列的例子的比對。序列和相應(yīng)的seqidno列在表1中。

定義

在下述說明書和實施例中，使用了許多術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書，包括這些術(shù)語給定范圍的清晰和一致的理解，提供了下述定義。除非本文另外定義，否則使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻的公開以它們的整體通過引用并入本文。

進行本發(fā)明方法中使用的常規(guī)技術(shù)的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。分子生物學(xué)、生物化學(xué)、計算化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組dna、生物信息學(xué)、基因組學(xué)，測序和相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并且在例如下述參考文獻中進行了討論：sambrook等，molecuarcloning.alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1989；ausubel等，currentprotocolosinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987和定期更新；以及enzymology，academicpress，sandiego中的系列方法。

在該文檔和其權(quán)利要求書中，動詞“包括”和其詞形變化以其非限制性含義使用，意思是包括詞后面的項目，但是不排除未具體提到的項目。其包括動詞“基本上由……組成”以及“由……組成”。

如本文所使用，單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文清楚地另外指出。例如，如上所使用，用于分離“一個”dna分子的方法，包括分離多個分子(例如10個、100個、1000個、1萬個、10萬個、100萬個或更多個分子)。

比對(alignin)和比對(alignment)：術(shù)語“比對(aligning)”和“比對(alignment)”意思是基于存在相同或類似核苷的較短或較長的片段，比較兩條或更多條核苷酸序列。用于比對核苷酸序列的數(shù)個方法是本領(lǐng)域已知的，如下面將進一步闡釋。術(shù)語“比對(alignin)”和“比對(alignment)”也意味著基于存在相同或類似氨基酸的較短或較長的片段，比較兩條或更多條氨基酸序列。用于比對氨基酸序列的數(shù)個方法是本領(lǐng)域已知的，如下面進一步闡釋。

“基因的表達”指其中可操作地與適當?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)域，尤其啟動子連接的dna區(qū)域轉(zhuǎn)錄成rna的過程，所述rna是有生物活性的，即其能夠翻譯成有生物活性的蛋白質(zhì)或肽(或活性肽片段)或其本身是有活性的(例如在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或rnai中)。活性蛋白質(zhì)在某些實施方式中指有組成型活性的蛋白質(zhì)。編碼序列優(yōu)選地為有義定向并且編碼期望的生物活性蛋白質(zhì)或肽或活性肽片段。

如本文所使用，術(shù)語“可操作地連接”指多核苷酸元件以功能關(guān)系連接。當核酸與另一核酸序列以功能關(guān)系放置時，核酸被“可操作地連接”。例如，如果啟動子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列被可操作地連接至編碼序列。可操作地連接意思是被連接的dna序列通常是連續(xù)的，并且其中必要地連接連續(xù)的和閱讀框中的兩個或更多個蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。

術(shù)語“基因構(gòu)建體”意思是包括可操作地與適當?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)域(例如啟動子)連接、在細胞中轉(zhuǎn)錄成rna分子(例如mrna)的區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū)域)的dna序列。基因構(gòu)建體可因此包括數(shù)個可操作地連接的序列，比如啟動子、5’前導(dǎo)序列包括例如參與翻譯啟動的序列、(蛋白質(zhì))編碼區(qū)域、剪接供體和受體位點、內(nèi)含子和外顯子序列，和包括例如轉(zhuǎn)錄終止序列位點的3’非翻譯的序列(也稱為3’非翻譯序列或3’utr)。

“同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列的一致性的度量。一般而言，比對序列從而獲得最高級別的匹配?！巴恍浴北旧砭哂斜绢I(lǐng)域認可的含義并且可使用公開的技術(shù)計算。見，例如：(computationalmolecularbiology，lesk，a.m.，ed.，oxforduniversitypress，newyork，1988；biocomputing：informaticsandgenomeprojects，smith，d.w.，ed.，academicpress，newyork，1993；computeranalysisofsequencedata，parti，griffin，a.m.和griffin，h.g.，eds.，humanapress，newjersey，1994；sequenceanalysisinmolecularbiology，vonheinje，g.，academicpress，1987；和sequenceanalysisprimer；gribskov，m.和devereux，j.，eds.，mstocktonpress，newyork，1991)。盡管存在許多方法測量兩條多核苷酸或多肽序列之間的同一性，但是術(shù)語“同一性”是技術(shù)人員熟知的(carillo，h.和lipton，d.，siamj.appliedmath(1988)48:1073)。通常用于確定兩條序列之間同一性或相似性的方法包括但不限于下面公開的那些：guidetohugecomputers，martinj.bishop，ed.，academicpress，sandiego，1994和carillo，h.和lipton，d.，siamj.appliedmath(1988)48:1073。確定同一性和相似性的方法編寫在計算機程序中。確定兩條序列之間同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于gcs程序包(devereux，j.等，nucleicacidsresearch(1984)12(1):387)，blastp，blastn，fasta(atschul，s.f.等，j.molec.biol.(1990)215:403)。

如本文所使用，術(shù)語“啟動子”指核酸序列，其用于控制一個或多個基因的轉(zhuǎn)錄、位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的轉(zhuǎn)錄方向的上游，并且結(jié)構(gòu)上通過存在用于dna依賴性rna聚合酶的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點和任何其他dna序列，包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、阻遏和激活蛋白質(zhì)結(jié)合位點，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的核苷的直接或間接用于調(diào)節(jié)從啟動子轉(zhuǎn)錄量的任何其他序列來鑒定。任選地，術(shù)語“啟動子”在本文也包括5’utr區(qū)域(5’非翻譯區(qū))(例如本文啟動子可包括基因的翻譯啟動密碼子上游(5’)的一個或多個部分，因為該區(qū)域可用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。

術(shù)語“氨基酸序列”或“蛋白質(zhì)”或“肽”指由氨基酸鏈組成的分子，而不指特定的作用模式、尺寸、3維結(jié)構(gòu)或來源。其“片段”或“部分”可因此仍稱為“氨基酸序列”或“蛋白質(zhì)”或“肽”。

“工程化細胞”，在本文指已經(jīng)通過例如引入外源性核酸序列或特定改變內(nèi)源性基因序列而被工程化的細胞。引入的外源性核酸序列可包括可被修飾的任何物種的野生型序列。工程化細胞可包括遺傳修飾，比如內(nèi)源性基因的一個或多個突變、插入和/或缺失和/或基因組中外源性核酸(例如基因構(gòu)建體)的插入。工程化細胞可指分離的或培養(yǎng)的細胞。工程化細胞可以是“轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞”，其中細胞已經(jīng)被例如工程化病毒感染。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，比如實施例中所描述，但是也可考慮其他適當?shù)牟《据d體，比如慢病毒。也可使用非病毒方法，比如dna載體的轉(zhuǎn)染或電穿孔?？墒褂玫膁na載體是轉(zhuǎn)座子載體。因此，工程化細胞可也以是“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞”或“瞬時轉(zhuǎn)染的細胞”。轉(zhuǎn)染指非病毒方法，將dna(或rna)轉(zhuǎn)移至細胞使得基因表達。轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域廣泛已知的，比如核酸的磷酸鈣轉(zhuǎn)染、peg轉(zhuǎn)染，和脂質(zhì)體或脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染。這種轉(zhuǎn)染可以是瞬時的，但是也可以是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，其中細胞可被選擇，因為其具有整合在它們基因組中的基因構(gòu)建體。

術(shù)語“選擇標記”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的術(shù)語并且本文用于描述當表達時可用于選擇包含選擇標記的細胞的任何基因?qū)嶓w。選擇標記基因產(chǎn)物賦予例如抗生素抗性，或另一可選擇的特性或營養(yǎng)要求。選擇標記，比如本領(lǐng)域熟知的包括綠色熒光蛋白(gfp)、egfp、熒光素酶、gus等。

“αβt細胞”或“alphabetat細胞”可從功能角度定義，因為表達αβtcr的t淋巴細胞，其識別與在各種細胞的表面上表達的mhc分子(主要組織相容性復(fù)合物)結(jié)合的肽。mhc呈遞源自細胞的蛋白質(zhì)的肽。當，例如細胞被病毒感染時，mhc將呈遞病毒肽，并且αβtcr和mhc-復(fù)合物之間的相互作用激活特定類型的t-細胞，其啟動并且免疫應(yīng)答，以清除感染的細胞。因此，αβt細胞可在功能上定義為能夠識別與mhc分子結(jié)合的肽的細胞?？墒褂脤τ讦力聇細胞受體特異性的抗體，比如下面描述的(例如對于人αβtcr特異性的bw242抗體)來鑒定αβt細胞。αβt細胞可選自外周血液，例如經(jīng)cd3抗原，因為大部分t細胞具有αβtcr。這種選擇也將包括γδt-細胞。從這些選擇的細胞，可確定對應(yīng)αt細胞受體鏈和βt細胞受體鏈的核酸(或氨基酸)序列。因此，αβt細胞也可定義為包括對應(yīng)αt細胞受體鏈和/或βt細胞受體鏈的核酸(或氨基酸)序列的細胞。

“γδt細胞”或“gammadeltat細胞”表示觸發(fā)它們激活的抗原分子還是大部分未知的t細胞的少數(shù)子集。γδt細胞可視為是獲得性免疫性的組分，因為它們使tcr基因重排，以生產(chǎn)連接多樣性并且將發(fā)展記憶表型。但是，各種子集也可視為是先天性免疫性的一部分，其中受限的tcr用作模式識別受體。例如，vγ9/vδ2t細胞被一組共同稱為磷酸化抗原的非肽類磷酸化的類異戊二烯前體特異性和快速激活。可使用特異性針對γδt細胞受體的抗體來鑒定γδt細胞。適于facs的抗體是廣泛可用的。選擇條件，比如抗體制造商提供的，使得選擇陰性和/或陽性細胞。可能適當?shù)目贵w可獲得自bdpharmingen(bd，1bectondrive，franklinlakes，njusa)，γδtcr-apc(克隆b1，#555718)或可獲得自beckmancoulter，pan-γδtcr-pe(克隆immu510，#im1418u)。而且，從這些選擇的細胞，可確定對應(yīng)γt細胞受體鏈和/或δt細胞受體鏈的核酸(或氨基酸序列)序列。因此，γδt細胞也可定義為包括對應(yīng)γt細胞受體鏈和/或δ2t細胞受體鏈的核酸(或氨基酸)序列的細胞。

t細胞或t淋巴細胞，屬于稱為淋巴細胞的白細胞家族，其在細胞介導(dǎo)的免疫性中發(fā)揮作用。t細胞源自于骨髓中的造血干細胞，在胸腺(t發(fā)源的地方)中成熟，并且在外周淋巴組織中獲得它們?nèi)康墓δ堋Ｔ趖細胞發(fā)育期間，由于初始β或δtcr基因重排，cd4^-cd8^-t-細胞(cd4和cd8共受體都是陰性)發(fā)展為αβ(αβ)或γδ(γδ)。經(jīng)歷早期β鏈重排的細胞在細胞表面上表達由全部的β鏈組成的前tcr結(jié)構(gòu)和前tcrα鏈。這種細胞轉(zhuǎn)變至cd4⁺cd8⁺狀態(tài)，使tcrα鏈基因座重排，并且在表面上表達αβtcr。成功完成γ基因重排的cd4^-cd8^-t細胞在β基因重排之前表達γδtcr并且仍是cd4^-cd8^-。(claudiotripodo等gammdeltatcelllymphomasnaturereviewsclinicaloncology6，707-717(2009年12月)。t細胞受體與cd3蛋白關(guān)聯(lián)，以形成t細胞受體復(fù)合物。t細胞，即表達αβtcr或γδtcr，在細胞表面上表達t細胞受體復(fù)合物。γδt細胞占t細胞總?cè)后w的約1-5％。t細胞受體鏈的細胞外區(qū)域包括可變區(qū)。t細胞受體鏈的可變區(qū)具有三個互補決定區(qū)(cdr1、cdr2、cdr3)。這些區(qū)域一般而言是非常易變的并且有助于tcr之間的多樣性。在t細胞的發(fā)育期間組成cdr區(qū)，其中所謂的可變-(v)基因區(qū)段、多樣-(d)基因區(qū)段，和連接-(j)基因區(qū)段被隨機組合而產(chǎn)生多種多樣的tcr。t細胞受體鏈的恒定區(qū)，即作為α、β、γ或δ鏈基本上不變。類似地，t細胞受體鏈的框架區(qū)，即作為α、β、γ或δ鏈也基本上不變。

天然殺傷細胞(nk細胞)定義為大顆粒淋巴細胞(lgl)并且組成由常見的產(chǎn)生b和t淋巴細胞的淋巴祖先分化的第三類細胞。已知nk細胞在骨髓、淋巴結(jié)、脾、扁桃體和胸腺中分化和成熟，其中它們進入循環(huán)。nk細胞不表達t細胞抗原受體(tcr)或pant標記cd3或表面免疫球蛋白(ig)b細胞受體，但是它們通常在人中表達表面標記cd16(fcγriii)和cd56，在c57bl/6小鼠中表達nk1.1或nk1.2。高達80％的人nk細胞也表達cd8。

如本文使用的和本領(lǐng)域已知的，術(shù)語“抗體”指包括具有互補決定區(qū)(cdr)的抗原結(jié)合位點的任何多肽。術(shù)語包括但不限于抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、單鏈抗體、僅僅重鏈的抗體、llama抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體和納米抗體(例如vhh)。術(shù)語“抗體”也可包括免疫球蛋白片段，比如fab、f(ab’)2、fv、scfv、fd、dab，和其他抗體片段或保留抗原結(jié)合功能的包括cdr的其他構(gòu)造。典型地，這種片段包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體或其片段可包括任何已知的抗體同種型和它們的構(gòu)象，例如，iga，比如iga1或iga2、igd、ige、igg，比如igg1、igg2a、igg2b、igg3、igg4或igm類別。

發(fā)明詳述

工程化t細胞的富集

在第一方面中，本發(fā)明涉及從t細胞混合物富集具有外源性免疫受體的工程化t細胞的方法，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞，所述方法包括下述步驟：

a)提供t細胞混合物，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞；

b)使t細胞混合物接觸特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體，以使得形成抗體-非工程化t細胞復(fù)合物；

c)從t細胞混合物分離抗體-非工程化t細胞復(fù)合物，從而獲得富集工程化t細胞的制品。

根據(jù)本發(fā)明的具有外源性免疫受體的工程化t細胞是已經(jīng)被工程化使得它們表達外源性免疫受體的t細胞。就抗原識別和t細胞作用而言，外源性免疫受體與內(nèi)源性t細胞受體具有相同的功能。非工程化t細胞是表達內(nèi)源性t細胞受體的細胞。內(nèi)源性t細胞受體是γδt細胞受體類型或αβt細胞受體類型。

根據(jù)本發(fā)明的外源性免疫受體定義為不是內(nèi)源性t細胞受體。例如，外源性免疫受體可以是特定選擇的γδt細胞受體，其用于癌癥的治療。所述序列可與內(nèi)源性γδt細胞受體類似。差異在于外源性免疫受體已經(jīng)被有意地為特定的靶標所選擇。外源性免疫受體由例如轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體表達并且不被內(nèi)源性基因座表達。與被工程化，以提供具有外源性免疫受體的工程化t細胞的t細胞的來源相比，根據(jù)本發(fā)明的外源性免疫受體可以是不同來源的，即來自另一物種。與被工程化，以提供具有外源性免疫受體的工程化t細胞的t細胞的來源相比，外源性免疫受體可以是相同來源的，即來自相同的物種。外源性免疫受體也可以是工程化γδt細胞受體或工程化αβt細胞受體。

工程化t細胞受體是這樣的t細胞受體，其氨基酸序列已經(jīng)被修飾使得其與內(nèi)源性t細胞受體的相應(yīng)氨基酸序列相比，具有不同的氨基酸序列，即至少不考慮其cdr。因此，如在工程化t細胞受體中呈現(xiàn)的修飾不應(yīng)干擾初始的抗原特異性。在實施例部分，這通過負載對于初始t細胞受體特異性的肽抗原的熒光標記的mhc-多聚體，由工程化的和非工程化t細胞受體之間相當?shù)娜旧剿砻?。這種工程化涉及修飾例如一條或兩條t細胞受體鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列。

外源性免疫受體也可以是嵌合抗原受體(car)。嵌合抗原受體(car)是重組受體，其結(jié)合了抗原特異性抗體的特異性與t細胞的激活功能(如最近綜述shi等，molcancer.2014sep21；13:219)。car可以是抗體和允許在免疫細胞的細胞表面上表達抗體以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞跨膜結(jié)構(gòu)域之間的融合分子。

在本發(fā)明的一個方面中，外源性免疫受體選自工程化γδt細胞受體、工程化αβt細胞受體、γδt細胞受體或嵌合抗原受體(car)。在本發(fā)明的一個方面中，外源性免疫受體選自工程化γδt細胞受體、工程化αβt細胞受體或γδt細胞受體。在另一方面中，外源性免疫受體選自工程化αβ或γδt細胞受體。

在方法的第一步驟中，提供t細胞混合物，其包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和表達內(nèi)源性αβt細胞受體的t細胞?？扇缦旅孢M一步描述來制備這種t細胞混合物。該t細胞混合物接觸特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體，以使得形成抗體-非工程化t細胞復(fù)合物。特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的所述抗體不特異性結(jié)合外源性免疫受體。因此，所述抗體對于內(nèi)源性αβt細胞受體是選擇性的。

特異性結(jié)合αβt細胞受體的抗體結(jié)合例如t細胞受體的α鏈、t細胞受體的β鏈，或t細胞受體的α和β鏈。人來源的α和β鏈的細胞外結(jié)構(gòu)域的例子分別列舉在seqidno.1-2中。如所描述的，αβt細胞受體具有可變區(qū)，最可變的區(qū)域由α和β鏈的cdr組成。因為非工程化t細胞的所述內(nèi)源性αβt細胞受體就特異性而言是異種的，所以特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體結(jié)合異種群體的αβt細胞受體。因此，抗體特異性結(jié)合在異種群體的αβt細胞受體中出現(xiàn)的αβt細胞受體的區(qū)域。優(yōu)選地，抗體特異性結(jié)合αβt細胞受體的恒定區(qū)。優(yōu)選地，抗體特異性結(jié)合人α鏈的恒定區(qū)，和/或人β鏈的恒定區(qū)。優(yōu)選地，抗體優(yōu)選地結(jié)合人α鏈的恒定區(qū)，如seqidno.1所列舉和如圖7a中所描繪，和/或結(jié)合人β鏈的恒定區(qū)，如seqidno.2所列舉和如圖7a中所描繪。

特異性結(jié)合αβt細胞受體的抗體的結(jié)合可通過例如facs分析來檢測。例如，非工程化t細胞接觸對照抗體或特異性結(jié)合αβt細胞受體的抗體。根據(jù)本發(fā)明，特異性結(jié)合αβt細胞受體的抗體可定義為導(dǎo)致相對于對照抗體平均熒光強度(mfi)增加的抗體，如果流式細胞術(shù)所測定。mfi是選擇的熒光通道中熒光強度的平均值(fitc、pe、percp等)。作為陰性對照抗體，可使用不結(jié)合免疫球蛋白(或非常不同免疫球蛋白)的抗體。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員非常能夠選擇適當?shù)臈l件，以確定抗體與αβt細胞受體的特異性結(jié)合?？贵w結(jié)合可由特異性和親和性來表示。特異性決定了抗體結(jié)合哪種抗原或其抗原決定部位。親和性是抗體和抗原之間結(jié)合強度的度量(ka)。

因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟練選擇特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體。例如，特異性結(jié)合人內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體可商業(yè)上獲得自miltenyi(miltenyibiotecgmbh，friedrich-ebert-straβe68，51429bergischgladbach，德國)。該抗體來自細胞克隆bw242/412，其是小鼠同種型igg2b。fitc標記的bw242/412抗體可獲得自miltenyi，貨號130-098-688。bw242/412細胞克隆和bw242/412表達的抗體詳細描述在例如ep0403156b1中，其通過引用并入本文。尤其，這種抗體是由bma031重鏈和輕鏈序列，如ep0403156b1中為克隆bma031列舉重鏈和輕鏈序列編碼的抗體。其他適當?shù)目贵w例如抗αβtcr抗體可獲得自beckmancoulter，marseillecedex，法國，例如pan-αβtcr-pe(#a39499)或pan-αβtcr-pc5(#a39500)。進一步適于小鼠αβ鏈的可以是鼠tcrβ-pe(克隆h57-597)，可獲得自bdpharmingen(bd，1bectondrive，franklinlakes，njusa)。

在形成抗體-非工程化t細胞復(fù)合物之后，接下來將抗體-非工程化t細胞復(fù)合物從t細胞混合物分離，從而獲得富集工程化t細胞的制品。如此，從t細胞混合物中去除了具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞。使用特異性抗體的適當?shù)姆蛛x步驟是本領(lǐng)域熟知的。例如，磁激活細胞分選(macs)、熒光激活細胞分選(facs)或免疫親和性色譜是可以使用的方法。特異性結(jié)合αβt細胞受體的抗體可連接用于macs的磁珠，或為facs熒光標記，或連接適當?shù)纳V樹脂。利用macs或免疫親和性色譜，獲得了不結(jié)合樹脂的細胞，從而獲得了富集工程化t細胞的制品。在facs中，獲得了未標記的細胞，從而獲得富集工程化t細胞的制品。作為僅僅使用特異性結(jié)合αβt細胞受體的抗體的可選方案，可使用對于所述抗體特異性的第二抗體。例如，當所述抗體是小鼠抗體時，可使用與樹脂或磁珠連接的山羊-抗小鼠抗體?？贵w-非工程化t細胞復(fù)合物將經(jīng)山羊-抗小鼠抗體結(jié)合樹脂或磁珠?；蛘撸禺愋越Y(jié)合αβt細胞受體的抗體可攜帶生物素標簽，比如在實施例中描述的標簽，和可使用與樹脂或磁珠連接的抗生物素抗體。因此，許多分離方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的和熟知的，可適于從t細胞混合物分離抗體-非工程化t細胞復(fù)合物，從而獲得富集工程化t細胞的制品。

如所述的，t細胞混合物也可包括具有次優(yōu)表達外源性免疫受體并且可仍具有表達的大量內(nèi)源性αβt細胞受體的工程化t細胞。因此，提供的t細胞混合物可包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞、具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞，以及具有外源性免疫受體和內(nèi)源性αβt細胞受體的工程化t細胞。因此，在分離步驟中，具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞，和具有外源性免疫受體和內(nèi)源性αβt細胞受體的工程化t細胞也可被從混合物分離。因此，分離步驟不限于僅僅從混合物分離內(nèi)源性αβt細胞。因此，當在方法的步驟a)中，提供t細胞混合物時，該混合物也可包括具有外源性免疫受體和內(nèi)源性αβt細胞受體的這種工程化t細胞。在步驟b)中，可接著經(jīng)內(nèi)源性αβt細胞受體形成抗體-工程化t細胞復(fù)合物，以使得在步驟c)中分離這些細胞，以及非工程化t細胞細胞。例如，如圖4a左圖所顯示，t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞(γδtcr，右下象限)、具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞(αβtcr，左上象限)，和具有外源性免疫受體和內(nèi)源性αβt細胞受體的工程化t細胞(γδtcr和αβtcr二者，右上象限)。當清除時，去除了αβtcr陽性細胞，包括為γδtcr和αβtcr標記的大部分細胞。這種細胞通常在目前可用的任何標準陽性選擇方法中也將被保留。

如所述的，在本發(fā)明的方法中，提供的t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供所述混合物包括下述步驟：

i.提供t細胞；

ii.提供編碼外源性免疫受體的核酸；

iii.將核酸引入t細胞，從而提供t細胞混合物，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞。

提供t細胞的步驟可包括提供αβt細胞，例如經(jīng)使用macs選擇來選擇細胞，使用例如αβt細胞受體抗體，比如bw242。提供t細胞的步驟也可包括提供包括t細胞的pbmc，所述t細胞包括γ和δt細胞和αβt細胞。提供t細胞的步驟也可包括經(jīng)用cd3抗體的macs選擇，提供細胞混合物，所述細胞包括αβt細胞和γδt細胞，例如t淋巴細胞。t-細胞可以是原代細胞，例如來自受試者，比如人受試者。只要細胞群體，或其大部分包括表達αβt-細胞受體的細胞，即在例如facs分選中對于αβt-細胞受體是陽性的，任何細胞類型，原代細胞或任何其他細胞系都將是合適的。

外源性免疫受體可以是例如γδt細胞受體，其包括第一條鏈，γ鏈和第二條鏈，δ鏈。這些可提供在單個核酸或兩個分開的核酸上。第一核酸編碼第一條鏈，和第二核酸編碼第二條鏈，或單個核酸編碼第一條鏈和第二條鏈二者。所述核酸可以是dna或rna。只要當其引入細胞和表達使得外源性免疫受體的氨基酸序列，其編碼在細胞的表面上表達。

優(yōu)選地，在一種實施方式中，編碼外源性免疫受體的核酸編碼外源性免疫受體，比如實施例部分中所描述的，其中不同的鏈，即α和β鏈或γ和δ鏈，作為單個翻譯蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達，其在兩條鏈的編碼序列之間包括f2a或t2a肽接頭序列，比如實施例中所描述，使得翻譯的蛋白質(zhì)自切割而形成分開的鏈。

編碼外源性免疫受體的核酸可以是mrna，當例如經(jīng)轉(zhuǎn)染引入至t細胞的細胞質(zhì)時，其可直接在外源性免疫受體中翻譯。優(yōu)選地，編碼例如t-細胞受體鏈的核酸包括在基因構(gòu)建體中?；驑?gòu)建體使得編碼外源性免疫受體的mrna表達，使得其在工程化t細胞的表面上表達?；驑?gòu)建體可包括在dna載體或病毒載體中。核酸的引入可經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，這取決于使用哪種類型的核酸。應(yīng)理解，取決于使用的基因構(gòu)建體的類型，基因構(gòu)建體可由dna或rna組成。例如，當基因構(gòu)建體并入逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體基因時，構(gòu)建體包括在rna載體基因組(即編碼基因構(gòu)建體的序列)中。逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體是本領(lǐng)域熟知的，其具有rna基因組，當進入細胞時，逆轉(zhuǎn)錄成dna，隨后整合進入宿主基因組。因此，逆轉(zhuǎn)錄使得遺傳信息，即基因構(gòu)建體從rna轉(zhuǎn)移至雙鏈dna，從而允許從其表達。整合是有利的，因為其使得轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞增殖，同時保留了包括基因構(gòu)建體的病毒載體基因組?；驑?gòu)建體也可包括在dna載體，例如質(zhì)粒dna中。適當?shù)膁na載體可以是轉(zhuǎn)座子。適當?shù)霓D(zhuǎn)座子系統(tǒng)(例如基于i類或ii類)是本領(lǐng)域熟知的。如所述的，當外源性免疫受體包括兩個鏈，例如γ和δt細胞受體鏈時，可提供兩個分開的基因構(gòu)建體，例如在單個或兩個分開的逆轉(zhuǎn)錄病毒或dna載體上?？蛇x地，單個基因構(gòu)建體也可表達編碼兩條鏈的單個mrna，比如實施例部分中描述。這種mrna可分別編碼兩條鏈，例如經(jīng)ires，或經(jīng)使用如本文所描述的自我可切割的肽序列。

使用的核酸提供了編碼的外源性免疫受體的表達。這例如經(jīng)通過使用例如強啟動子的高水平表達外源性免疫受體而實現(xiàn)。使用高表達水平使得抑制內(nèi)源性t細胞受體表達，如在實施例部分所例證。內(nèi)源性t細胞表達也可經(jīng)可選的和另外方法比如例如經(jīng)shrna表達的rnai、鋅指、crispr或talens所抑制。

無論如何，將核酸引入t細胞可能是有效的，但是可提供t細胞混合物，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞。具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞表示其中沒有引入核酸的t細胞。而且，因為所述工程化t細胞也可包括也存在于t細胞混合物中的工程化t細胞的亞群，其中引入不導(dǎo)致(足夠)抑制內(nèi)源性αβt細胞受體。沒有(足夠)抑制內(nèi)源性αβt細胞受體的t細胞這種亞群也可從t細胞混合物中有效去除，因為抗αβt細胞受體抗體可與其結(jié)合。工程化t細胞的這種群體在例如facs分析中對于外源性免疫受體和內(nèi)源性αβt細胞受體可被陽性染色。

包括外源性免疫受體的工程化t細胞也可包括選擇標記。除了外源性免疫受體，選擇標記可定義為允許選擇和其一起提供的細胞的任何核酸序列和/或氨基酸序列。例如，選擇標記可以是新霉素或嘌呤霉素抗性基因?？赏ㄟ^在存在新霉素或嘌呤霉素的情況下溫育，進行選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)移基因構(gòu)建體和/或載體的細胞。其他選擇標記可以是例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的任何一種?？扇缓笸ㄟ^使用例如facs進行選擇。如上所述，導(dǎo)致不充分抑制內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞可包括基因構(gòu)建體并且因此也包括選擇標記。這種細胞是非期望的并且去除這些也將導(dǎo)致工程化t細胞的富集。因此，該富集方法也受益于現(xiàn)有技術(shù)的工程化t細胞，其已經(jīng)用陽性選擇方法選擇，例如通過包括另外的選擇標記和/或通過用針對外源性免疫受體的抗體選擇細胞。

但是，具有選擇標記不是必須的，因為本發(fā)明的方法使得去除非工程化細胞，而不用使用任何選擇標記。應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明，選擇標記不是外源性免疫受體。因此，在本發(fā)明的一個方面中，工程化t細胞不分別表達選擇標記。因此，根據(jù)本發(fā)明的所述核酸除了編碼外源性免疫受體，不必編碼分別表達的選擇標記。因此，在一種實施方式中，編碼外源性免疫受體的所述核酸或dna載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、轉(zhuǎn)座子等不包括選擇標記。應(yīng)理解，選擇標記在工程化t細胞中是有功能的。

在本發(fā)明的另一方面中，包括非工程化t細胞和工程化t細胞的t細胞混合物是人細胞。因此，這意味著編碼外源性免疫受體的核酸被引入人t細胞，以提供這種t細胞混合物。這意味著在該方法中使用的抗體特異性結(jié)合人αβt細胞受體。在本發(fā)明的進一步方面中，特異性結(jié)合人αβt細胞受體的抗體是bw242/412抗體。如所述的，所述抗體商業(yè)上可獲得自miltenyi(miltenyibiotecgmbh,friedrich-ebert-straβe68,51429bergischgladbach，德國)并且詳細描述在，例如ep0403156b1中，其通過引用并入本文。

如上所述，特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體不特異性結(jié)合外源性免疫受體。因此，這些選擇標準適用于可由該方法選擇的任何抗體。所以，雖然作為轉(zhuǎn)基因提供，但是外源性免疫受體可能不對應(yīng)對于使用的t細胞是內(nèi)源性的αβt細胞受體。這是因為，在本發(fā)明的步驟b)和c)中，不僅僅去除了非工程化t細胞而且也去除了工程化t細胞。假如期望使用αβt細胞受體作為外源性免疫受體，因此需要修飾序列，使得抗體不再特異性結(jié)合外源性免疫受體。因此，在本發(fā)明的一個方面中，外源性免疫受體是工程化αβt細胞受體。

在本發(fā)明的一個方面中，外源性免疫受體是γδt細胞受體或工程化γδt細胞受體或工程化αβt細胞受體。在本發(fā)明的一個方面中，外源性免疫受體是γδt細胞受體或工程化γδt細胞受體或工程化αβt細胞受體，其中外源性免疫受體是具有相同來源的t細胞混合物。在另一方面中，外源性免疫受體是人γδt細胞受體或人工程化γδt細胞受體或人工程化αβt細胞受體。與αβt細胞受體相對照，γδt細胞受體的序列不同于αβt細胞受體。因此，特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體通常不特異性結(jié)合任何內(nèi)源性γδt細胞受體。因此，不需要修飾用作外源性免疫受體的γδt細胞受體。然而，出于其他原因，也可能考慮修飾γδt細胞受體，例如當工程化t細胞在體內(nèi)使用并且與內(nèi)源性γδt細胞區(qū)分時，如下面進一步闡釋。

在一種實施方式中，外源性免疫受體是γδt細胞受體，其包括如seqidno.3和seqidno.4中列舉的γ和δ鏈序列。這些序列對應(yīng)g115和δ5。具有該外源性免疫受體的工程化t細胞可通過使用例如bw242抗體來富集。

在本發(fā)明的另一方面中，工程化αβt細胞受體或工程化γδt細胞受體包括修飾恒定區(qū)。修飾恒定區(qū)可能是有利的，因為可避免影響可變區(qū)和因此影響抗原特異性和/或親和性的任何風(fēng)險。

在一種實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，特異性結(jié)合人αβt細胞受體的抗體是bw242/412抗體和外源性免疫受體是工程化人αβt細胞受體。優(yōu)選地，工程化包括修飾人αβt細胞受體的恒定區(qū)。更優(yōu)選地，修飾恒定區(qū)包括修飾t細胞受體β鏈的結(jié)構(gòu)域3，其中優(yōu)選地修飾包括結(jié)構(gòu)域3的鼠源化。如在實施例部分例證的，bw242/412抗體的結(jié)合位點定位在t細胞受體β鏈的結(jié)構(gòu)域3。因此，僅僅修飾該區(qū)域?qū)⑹沟胋w242/412抗體對于人內(nèi)源性αβt細胞受體是選擇性的，而基本上結(jié)合外源性免疫受體，即所述修飾的人αβt細胞受體鏈。優(yōu)選地，αβt細胞受體鏈包括鼠結(jié)構(gòu)域3相應(yīng)的鼠氨基酸序列，代替人βt細胞受體的人結(jié)構(gòu)域3結(jié)構(gòu)域3，如圖7a中所描繪(見人序列的氨基酸88-121，如與相應(yīng)的小鼠序列對比)。

因此，如在對于bw242抗體(或bma031抗體)的實施例部分所顯示，結(jié)合通過定位結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體的結(jié)合位點對相應(yīng)的人αβt細胞受體的特定修飾，可使相應(yīng)的人αβt細胞受體的修飾最小化。例如，bw242/412抗體的結(jié)合位點現(xiàn)被定位于結(jié)構(gòu)域3，進一步選擇性修飾結(jié)構(gòu)域3的氨基酸將鑒定與bw242/412抗體相互作用的結(jié)構(gòu)域3的氨基酸。如此，可提供最小化修飾的工程化人αβt細胞受體，差別僅僅幾個氨基酸。同樣地，當在內(nèi)源性αβt細胞受體和相應(yīng)的工程化αβt細胞受體之間選擇bw242之外的抗體時可使用相同的方法。

富集工程化t細胞和它們的用途

在另一實施方式中，根據(jù)本發(fā)明如上述的方法提供了可通過任何一種所述的方法獲得的富集工程化t細胞的制品。與沒有經(jīng)歷這種方法的制品相比，這種制品將包括較高百分數(shù)的工程化t細胞?？赏ㄟ^任何所述方法獲得的這種富集工程化t細胞的制品也可定義為已經(jīng)使用特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體從中分離了非工程t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的差的工程化t細胞的富集工程化t細胞的制品。這種制品也可定義為其中富集工程化t細胞基本上不包括內(nèi)源性αβt細胞受體的富集工程化t細胞的制品。這種制品也可定義為其中富集工程化t細胞基本上不包括內(nèi)源性αβt細胞受體并且也不包括選擇標記的富集工程化t細胞的制品。這種制品也可定義為其中富集工程化t細胞基本上不包括內(nèi)源性αβt細胞受體并且也不包括選擇標記以及還未用結(jié)合外源性免疫受體的抗體選擇的富集工程化t細胞的制品。

當與使用陽性選擇方法富集的現(xiàn)有技術(shù)的制品比較時，所述富集工程化t細胞的制品顯示出增強的癌癥細胞殺傷，如在實施例中所顯示。也如在實施例部分中所顯示，當為t細胞提供對于特定的癌癥具有特異性的外源性免疫受體時，當為受試者提供富集所述工程化t細胞的所述制品時，這種細胞將被選擇性殺死。因此，根據(jù)本發(fā)明的富集工程化t細胞的這種制品尤其用于醫(yī)學(xué)治療?？煽紤]的醫(yī)學(xué)治療是例如治療癌癥。因為工程化t細胞不再需要表達選擇標記，可避免與表達選擇標記相關(guān)的任何副作用。此外，富集工程化t細胞已經(jīng)去除了幾乎所有表達內(nèi)源性αβt細胞受體的t細胞并且所以可避免造成有害靶向的內(nèi)源性αβt細胞受體的任何風(fēng)險。富集工程化t細胞也將不會遭受與比如在現(xiàn)有技術(shù)選擇和富集方法中使用的，也可能降低施用的富集工程化t細胞產(chǎn)物質(zhì)量的抗體結(jié)合外源性免疫受體相關(guān)的任何細胞死亡。

體內(nèi)(富集)工程化t細胞的清除

在另一實施方式中，提供如上定義的特異性結(jié)合外源性免疫受體的抗體用于治療當用可通過上述任何一種方法獲得的富集具有所述外源性免疫受體的工程化t細胞的制品治療時遭受副作用的受試者。如上所闡釋，可通過本發(fā)明的任何一種方法獲得的富集工程化t細胞用于醫(yī)學(xué)治療。但是，由于施用的富集工程化t細胞，這種治療在一些情況下可導(dǎo)致不利的副作用。副作用可能是不受控的增殖或激活，或針對健康的細胞例如受試者的細胞上不可預(yù)知的抗原的激活。因此，在這種情形下，期望選擇性清除(消除)施用至受試者的工程化t細胞。這可通過施用特異性靶向工程化t細胞，即包括外源性免疫受體的t細胞的抗體來實現(xiàn)。所述抗體不靶向內(nèi)源性t細胞，比如內(nèi)源性αβt細胞或內(nèi)源性γδt細胞。如此，除了外源性免疫受體，工程化t細胞不再需要包括編碼例如使得選擇性殺傷工程化t細胞的自殺基因或其他基因的進一步基因構(gòu)建體。

因為所述抗體不靶向內(nèi)源性t細胞，如果使用具有對應(yīng)內(nèi)源性t細胞受體來源的工程化αβt細胞受體或工程化γδt細胞受體，則所述外源性免疫受體必須被修飾，即工程化，使得抗體僅僅靶向外源性免疫受體。例如，當使用小鼠結(jié)構(gòu)域3區(qū)域替換人結(jié)構(gòu)域3區(qū)域的外源性免疫受體時，所述抗體例如源自h57-597源自hb-218(atcc)靶向小鼠結(jié)構(gòu)域3區(qū)域。如此，在人受試者中，抗體將選擇性靶向工程化外源性免疫受體并且不靶向內(nèi)源性t細胞受體。因此，定位例如結(jié)合小鼠αβt細胞受體或小鼠γδt細胞受體抗體的結(jié)合位點是有用的，因為其將提供可被轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的人t細胞受體的各自t細胞受體的特定區(qū)域(或甚至特異性抗體)。優(yōu)選地，如用提到的抗體bw242/412(用于富集)和h57-597(用于清除)例證的，用于富集的修飾區(qū)域的序列與用于清除比如源自小鼠結(jié)構(gòu)域3區(qū)域的區(qū)域的序列相同。由于其在t細胞受體中突出的位置以及免疫原性的可能性，該區(qū)域可能尤其令人感興趣。同樣地，當使用可由可能與宿主蛋白(例如源自宿主抗體和/或源自宿主cd3)相同的組分構(gòu)建的嵌合抗原受體時，選擇不靶向相應(yīng)的宿主蛋白而是僅僅靶向嵌合抗原受體的抗體。在與為αβtcr描述的相同的方法中，這種宿主序列也可被修飾，即工程化，施用的使得抗體不靶向所述宿主蛋白。因此，在使用嵌合抗原受體的情況下，在部分宿主序列可被修飾使得使用的抗體可區(qū)分工程化car和相應(yīng)的宿主蛋白序列的角度，其可以是工程化的嵌合抗原受體。因此，通過比對例如小鼠序列和人序列，以及通過比較小鼠免疫受體和人免疫受體對于抗體的結(jié)合，比如實施例中所描述，人免疫受體可以是鼠源化的，即部分人免疫受體可被替換為鼠受體的相應(yīng)部分。可通過比對人序列和小鼠序列，比如例如圖10中所顯示，容易獲得相應(yīng)部分。因此，鼠源化可涉及用鼠源的相應(yīng)部分替換免疫受體的部分序列，這種部分可以是例如10-50個氨基酸長度，但是該部分也可包括是對應(yīng)兩條序列并且在兩條序列之間不同的部分區(qū)域的一個或多個氨基酸。

優(yōu)選地，治療受試者涉及治療人，其中優(yōu)選地抗體是人抗體或例如源自非人抗體比如h57-597抗體的可變區(qū)經(jīng)人源化而被工程化為人抗體骨架。優(yōu)選地，使用人抗體，因為非人序列可引發(fā)有害的應(yīng)答，例如在小鼠抗體的情況下，可激發(fā)人-抗小鼠應(yīng)答，這不是所期望的。應(yīng)理解，術(shù)語人抗體也包括人源化抗體。

如所述的，施用靶向外源性免疫受體和因此靶向工程化t細胞的抗體可誘導(dǎo)選擇性殺傷工程化t細胞。這種選擇性殺傷可在抗體結(jié)合外源性免疫受體之后誘導(dǎo)死亡。這種選擇性殺傷可被直接或間接誘導(dǎo)。抗體骨架的人衍生序列優(yōu)選治療人，因為選擇性殺傷可包括抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(adcc)、補體依賴性細胞毒性(cdc)或直接細胞凋亡。這種選擇性殺傷的例子描述在實施例部分中。

就如上述醫(yī)學(xué)用途而言，對于靶向工程化t細胞的抗體的用途，這種醫(yī)學(xué)用途不限于如可通過本發(fā)明如上述的方法獲得的富集工程化t細胞的制品。這種醫(yī)學(xué)用途也可適用于任何工程化t細胞，前提是所述抗體特異性用于結(jié)合外源性免疫受體而不結(jié)合宿主的免疫受體或car中包括的宿主蛋白序列。這種工程化t細胞也可通過使用例如使用選擇標記的現(xiàn)有技術(shù)方法來富集。此外，因為選擇修飾t細胞的方法不是必需的，所述用途也適用于具有外源性免疫受體的工程化nk細胞。

因此，在另一實施方式中，提供特異性結(jié)合外源性免疫受體的抗體，用于治療當用具有外源性免疫受體的工程化淋巴細胞治療時遭受副作用的受試者。優(yōu)選地，所述外源性免疫受體是工程化免疫受體。

優(yōu)選地，所述受試者是人。優(yōu)選地，所述工程化淋巴細胞是人工程化淋巴細胞。優(yōu)選地，所述工程化淋巴細胞是工程化nk細胞或工程化t細胞。所述抗體最優(yōu)選地是人抗體或人源化抗體，其如上所述優(yōu)選地誘導(dǎo)具有外源性免疫受體的工程化淋巴細胞的細胞死亡。

實施方式

1.用于從t細胞混合物富集具有外源性免疫受體的工程化t細胞的方法，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞，所述方法包括下述步驟：

a)提供t細胞混合物，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞；

b)使t細胞混合物接觸特異性結(jié)合內(nèi)源性αβt細胞受體的抗體，以使得形成抗體-非工程化t細胞復(fù)合物；

c)從t細胞混合物分離抗體-非工程化t細胞復(fù)合物，從而獲得富集工程化t細胞的制品。

2.根據(jù)實施方式1的方法，其中步驟a)包括下述步驟：

i.提供t細胞；

ii.提供編碼外源性免疫受體的一種或多種核酸；

iii.將所述一種或多種核酸引入t細胞，從而提供t細胞混合物，所述t細胞混合物包括具有外源性免疫受體的工程化t細胞和具有內(nèi)源性αβt細胞受體的非工程化t細胞。

3.根據(jù)實施方式2的方法，其中所述一種或多種核酸除了編碼外源性免疫受體之外不編碼分開表達的選擇標記。

4.根據(jù)實施方式1-3任一項的方法，其中所述非工程化的和工程化t細胞是人。

5.根據(jù)實施方式4的方法，其中所述抗體是bw242/412。

6.根據(jù)實施方式1-5任一項的方法，其中所述外源性免疫受體是工程化αβt細胞受體，工程化γδt細胞受體。

7.根據(jù)實施方式6的方法，其中所述工程化αβt細胞受體或所述工程化γδt細胞受體是人工程化αβt細胞受體或人工程化γδt細胞受體。

8.根據(jù)實施方式6或?qū)嵤┓绞?的方法，其中所述工程化αβt細胞受體或所述工程化γδt細胞受體包括修飾恒定區(qū)。

9.根據(jù)實施方式5的方法，其中所述外源性免疫受體是工程化人αβt細胞受體，其中所述工程化包括t細胞受體β鏈的結(jié)構(gòu)域3的修飾，其中優(yōu)選地所述修飾包括結(jié)構(gòu)域3的鼠源化。

10.根據(jù)實施方式1-5任一項的方法，其中所述外源性免疫受體是γδt細胞受體，優(yōu)選地是人γδt細胞受體。

11.通過實施方式1-9任一項的方法獲得的富集工程化t細胞的制品。

12.根據(jù)實施方式11的富集工程化t細胞的制品在醫(yī)學(xué)治療中的用途。

13.根據(jù)實施方式12的富集工程化t細胞的制品在治療癌癥中的用途。

14.如實施方式1-9任一項定義的特異性結(jié)合外源性免疫受體的抗體在治療受試者中的用途，所述受試者當用通過實施方式1-9任一項的方法獲得的富集具有所述外源性免疫受體的工程化t細胞的制品治療時遭受副作用。

15.根據(jù)實施方式14的抗體，其中所述受試者是人。

16.根據(jù)實施方式15的抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。

17.根據(jù)實施方式14-16任一項的抗體，其中所述抗體誘導(dǎo)工程化t細胞的細胞死亡。

18.特異性結(jié)合外源性免疫受體的抗體在治療受試者中的用途，所述受試者當用具有外源性免疫受體的工程化淋巴細胞治療時遭受副作用。

19.根據(jù)實施方式18的抗體，其中所述受試者是人。

20.根據(jù)實施方式18或?qū)嵤┓绞?9的抗體，其中所述工程化淋巴細胞是人工程化淋巴細胞。

21.根據(jù)實施方式18-20任一項的抗體，其中所述工程化淋巴細胞是工程化nk細胞或工程化t細胞。

22.根據(jù)實施方式18-21任一項的抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。

23.根據(jù)實施方式18-22任一項的抗體，其中所述抗體誘導(dǎo)具有外源性免疫受體的工程化淋巴細胞的細胞死亡。

實施例

實施例1

富集具有外源性免疫受體，即aγδt細胞受體的工程化人t細胞

細胞和細胞系

daudi、k562、mda-mb231、bv173、opm2和phoenix-ampho細胞獲得自美國菌種保藏中心。opm2-熒光素酶(opm2-luc)和rpmi8226/s-luc(rpmi-luc)由antonmartens，scc9通過nielsbovenschen(bothuniversitymedicalcenterutrecht，荷蘭)友情提供并且daudi-熒光素酶(daudi-luc)由genmab(utrecht，荷蘭)友情提供。ebv-轉(zhuǎn)化的類淋巴母細胞細胞系(ebv-lcl)(warren等，tissueantigens59,293-303(2002)由tunamutis(universitymedicalcenter，荷蘭)友情提供。pbmc分離自可獲得自sanquin血庫(荷蘭阿姆斯特丹)或德國法蘭克福輸血醫(yī)學(xué)和免疫血液學(xué)協(xié)會的血沉棕黃層。來自aml患者的pbmc樣品由matthiastheobald(德國美因茨)和universitymedicalcenterutrechtbiobank提供并且根據(jù)gcp和赫爾辛基條約收集。

γ9δ2tcr逆轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計

經(jīng)密碼子優(yōu)化的組合tcr鏈交換獲得高腫瘤活性γ9δ2tcr鏈基因，γ克隆g115和δ克隆5(geneartlifetechnologies，regensburg，德國)并且作為包含γ-鏈-ires-新霉素或δ-鏈-ires-嘌呤霉素的單個tcr鏈載體克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pbullet。g115和δ克隆5包括seqidno.3和4中列舉的序列。另外，通過交換兩個不同的2a肽接頭序列f2a和t2a，和tcr鏈的順序設(shè)計包含兩個tcr鏈的四個不同的轉(zhuǎn)基因盒(γ9-f2a-δ2；δ2-f2a-γ9；γ9-t2a-δ2；γ9-t2a-δ2)(圖1a)(szymczak等，naturebiotechnology22,589-594(2004)。這些tcr盒被克隆至優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pmp71(engels等humgenether14,1155-1168(2003)，以同時表達兩條tcr鏈。由源自mdm2/hla-a2tcr的α鏈(stanislawski等，natimmunol2，962-970(2001)和源自p53/hla-a2tcr的β鏈(kuball等，immunity22，117-129(2005)組成的無義的鼠tcr在pbullet和pmp71逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)中都用作對照tcr。而且，pmp71中截短的神經(jīng)生長因子受體在逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗中用作對照(pmp71:dngfr)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使用標準方法經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)引入供體t細胞。發(fā)現(xiàn)使用標準試驗，f2a和t2a導(dǎo)致外源性γ9δ2t細胞受體的表達并且能夠誘導(dǎo)特異性裂解，以及在例如daudi或opm2癌癥細胞系中誘導(dǎo)ifn-γ生產(chǎn)。發(fā)現(xiàn)，肽接頭t2a產(chǎn)生較高的表達水平，如通過在轉(zhuǎn)導(dǎo)供體t細胞的facs分析中測量γ9δ2tcr的平均熒光強度所測定的。此外，γ9-t2a-δ2產(chǎn)生ifn-γ生產(chǎn)的最高誘導(dǎo)。γ9-t2a-δ2載體用在進一步的實驗中。

富集工程化t細胞

用pmp71:γ-t2a-δ轉(zhuǎn)導(dǎo)αβt-細胞并且用生物素標記的抗αβtcr抗體(克隆bw242/412，miltenyibiotec，德國)溫育隨后用與磁珠連接的抗生物素抗體(anti-biotinmicrobeads，miltenyibiotec)溫育。接下來，將細胞懸液施加在ld柱上并且根據(jù)制造商的方案(miltenyibiotec)通過macs細胞分離消除αβtcr陽性t細胞。

消除具有外源性γ9δ2tcr的富集工程化t細胞的同種異體反應(yīng)性并且保留抗腫瘤活性

富集之后，利用先前描述的t-細胞擴增方案擴增γδtcrt細胞(riddell和greenberg，journalofimmunologicalmethods128,189-201(1990))。該方法使得幾乎完全消除單αβtcr陽性t細胞(從51％至0.4％)并且顯著增加γδtcr單陽性t細胞(從20％至77％)(圖4a)。重要地，保留的αβtcr/γδtcr雙陽性t細胞的特征在于內(nèi)源性αβtcr的相對低的表面表達。該表型是穩(wěn)定的，直到刺激之后的第5天，此時t-細胞是高度激活的和增生性的。但是，表型在第9天變?yōu)橹饕力聇cr/γδtcr雙陽性t-細胞群體(68％)和降低的γδtcr單陽性細胞百分數(shù)(25％)，此時t細胞保持在更靜息期(圖4a)。

選擇和擴增10天之后測試富集工程化t細胞的功能并且與沒有清除了αβtcr的工程化細胞和對照比較。響應(yīng)三種不同的腫瘤細胞系，αβtcrt細胞清除明顯增加了daudi細胞的特異性裂解(p<0.01)(圖4b)以及ifn-γ生產(chǎn)(p<0.001)(圖4c)。在第10天也針對來自急性髓系白血病(aml)患者的一組原代白血病細胞測試工程化t細胞。用氨羥二磷酸二鈉阻斷異戊烯基焦磷酸下游的甲羥戊酸途徑治療白血病細胞，使得響應(yīng)16個aml樣品中的9個t細胞分泌ifnγ。在8個測試樣品中的5個，與分離自健康供體的非工程化的多克隆g9d2t細胞相比，富集γδtcr工程化t細胞產(chǎn)生顯著增強水平的ifnγ。

為了在體內(nèi)用基本上再現(xiàn)表達內(nèi)源性αβtcr鏈轉(zhuǎn)移之后刺激靜息t細胞，使用超過20天缺少刺激并且6天缺少il-2的工程化t細胞。針對一組13個錯配的ebv-lcl細胞系或健康的供體衍生pbmc在ifnγelispot試驗中測試mock(dngfr轉(zhuǎn)導(dǎo))、γδtcr工程化和γδtcr工程化αβtcr消除t細胞。響應(yīng)13個ebv-lcl細胞系中的9個，mockt細胞產(chǎn)生ifnγ。γδtcr工程化總體t細胞的同種異體反應(yīng)性顯著降低(對于9個ebv-lcl細胞系中的8個)并且更重要地在γδtcr工程化的αβtcr消除t細胞群體中甚至完全消除(圖5a)。當針對一組20種不同的健康供體衍生的pbmc測試不同的t細胞群體時，γδtcr工程化t細胞降低的同種異體反應(yīng)性更加明顯。在γδtcr轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細胞群體中沒有檢測到同種異體反應(yīng)性，但是響應(yīng)10個pbmc供體組合中的9個，mockt細胞產(chǎn)生ifnγ。

通過優(yōu)化的工程化t細胞產(chǎn)物改善體內(nèi)腫瘤控制

評估富集γδtcr工程化t細胞產(chǎn)物的臨床效力并且與用pbullet逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和抗生素選擇系統(tǒng)產(chǎn)生的稱為pb:γδtcrt細胞的γδtcr工程化t細胞相比較(voss等，methodsinmolecularmedicine109，229-256(2005)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血液αβt細胞、用抗生素(pbullet)選擇或用αβtcr磁珠(pmp71)富集并且隨后t細胞擴增，接著評估兩種制品。γδtcr陽性t細胞的百分數(shù)高于富集γδtcrt細胞產(chǎn)物，而且如通過mfi測量，每個細胞的γδtcr復(fù)合物與pb:γδtcrt細胞相比，增加大于2倍。另外，與pb:γδtcrt細胞相比，用pmp71:γ-t2a-δ載體盒轉(zhuǎn)導(dǎo)的富集γδtcr工程化t細胞制品增強了三種測試的腫瘤細胞系的裂解。為了測試，在過繼轉(zhuǎn)移γδtcr工程化t細胞的人源化小鼠腫瘤模型中體內(nèi)測試這些制品的抗腫瘤活性。

照射的rag2^-/-γc^-/-雙敲除小鼠被注入熒光素酶-陽性daudi腫瘤細胞以及γδtcr或mocktcr工程化t細胞并且通過生物發(fā)光成像評估腫瘤生長。與mocktcrt細胞相比，兩種γδtcr工程化t細胞產(chǎn)物都顯著抑制腫瘤生長，但是與pb:γδtcrt細胞相比，富集γδtcrt細胞進一步延遲腫瘤生長并且顯著延長了生存。在注入照射的rag2^-/-γc^-/-雙敲除小鼠中，使用熒光素酶opm2細胞，在第二腫瘤模型中獲得了類似的結(jié)果。使用富集γδtcr工程化t細胞制品，在7只小鼠中的4只，完全抑制了腫瘤生長。在第一次腫瘤和t細胞注射之后120天，用第二次注射腫瘤細胞重新挑戰(zhàn)無腫瘤小鼠，而不用之前的照射并且非照射的幼稚小鼠用作腫瘤生長的對照。重新挑戰(zhàn)的小鼠仍無腫瘤而在幼稚小鼠中腫瘤生長，指示γδtcrt細胞治療在體內(nèi)提供了長期的腫瘤抑制。

結(jié)論

結(jié)果顯示富集工程化t細胞，即使用結(jié)合αβt細胞受體的抗體(bw242)提供γδt細胞受體的t細胞(γ克隆g115和δ克隆5)使得去除了未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。此外，表達的外源性免疫受體使得內(nèi)源性αβt細胞受體下調(diào)。這種富集工程化t細胞的制品提供了改善的抗腫瘤效力并且減少或消除了同種異體反應(yīng)性。此外，這種富集工程化t細胞制品提供了體內(nèi)高度改善的腫瘤控制。

實施例2

富集具有外源性免疫受體，即工程化αβt細胞受體的工程化人t細胞

富集具有外源性免疫受體，即小鼠αβt細胞受體的工程化的人t細胞

已經(jīng)顯示引入腫瘤特異性γδtcr使工程化t細胞中內(nèi)源性αβtcr的表達下調(diào)(見上面實施例1)。從而，當與非工程化αβt-細胞相比時，工程化t細胞顯示它們表面上相當更低的內(nèi)源性αβtcr密度。這是與使用的外源性免疫受體類型無關(guān)的效果。小鼠αβt細胞受體用作工程化人t細胞的外源性免疫受體。用macs使用單克隆抗體αβtcr-mab克隆bw242去除人αβt細胞。因此，在通過macs分離之后，重定向至表達鼠αβtcr的人αβt-細胞在它們表面上顯示降低水平的內(nèi)源性αβtcr(圖6a，比較macs之前和macs之后)。因此，通過使用對于人αβt細胞受體特異性的抗體，可富集具有小鼠αβt細胞受體的工程化t細胞。

bw242抗體不結(jié)合工程化人αβt細胞受體

因此，bw242抗體在鼠αβt細胞受體和人αβt細胞受體之間是選擇性的。所以，分析人αβtcr恒定結(jié)構(gòu)域的鼠源化對于αβtcr單克隆抗體的結(jié)合。鼠源化的最小化允許富集具有工程化抗原特異性的‘不受影響’的t細胞。當鼠源化被最小化時，外源性αβt細胞受體基本上與內(nèi)源性t細胞受體相同，同時允許選擇性去除表達大量αβt細胞受體的t細胞。

通過流式細胞術(shù)比較臨床級αβtcr單克隆抗體bw242(也稱為mabbw242或bw242)與全人αβtcr的結(jié)合以及與鼠源化突變體的結(jié)合。用包含工程化鼠無義αβtcr(α-鏈，獲得自mdm2特異性tcr(stanislawski等，natimmunol,2001.2(10):962-70頁)和β-鏈，獲得自p53特異性tcr(kuball等，immunity,2005.22(1):117-29頁)的臨床上批準的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pmp71逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)tcrβ^-/^-jurma細胞，或用ny-eso-1/hla-a2特異性全人αβtcr，或由人可變區(qū)和鼠恒定結(jié)構(gòu)域組成的ny-eso-1/hla-a2特異性嵌合αβtcr(也分別稱為αmu/βmu，αhu/βhu，和αhumu/βhumu)轉(zhuǎn)導(dǎo)tcrβ^-/^-jurma細胞。通過用針對ny-eso-1tcrβ-鏈的可變區(qū)的抗vβ4，或針對mdm2/p53鼠tcr的tcrβ-鏈的抗β小鼠染色，確認轉(zhuǎn)基因tcr表達。通過鼠等同物替換人tcrα和β恒定結(jié)構(gòu)域使mabbw242的下降至與結(jié)合全鼠tcr類似的水平(圖6b下圖，比較圖6和8)。這些數(shù)據(jù)指示人αβtcr的恒定區(qū)的鼠源化足夠消除mabbw242的結(jié)合。

具有覆蓋人和小鼠αβtcr的恒定區(qū)之間所有氨基酸差異的突變片段的混合tcrα和β-鏈是可獲得的(見圖7a和b)(sommermeyer等，jimmunol,2010.184(11):6223-31頁)。我們獲得了四個ny-eso-1tcrβ-鏈和三個ny-eso-1tcrα-鏈構(gòu)建體，每個構(gòu)建體包含在完全人氨基酸序列側(cè)翼的一個非同源的鼠結(jié)構(gòu)域。這些也示意性描繪在圖3中。將7個不同的tcr構(gòu)建體與其他全人tcr-鏈一起引入jurma細胞并且表達和測試被mabbw242的識別(圖8)。通過抗vβ4測量構(gòu)建體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并且平行進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。如對于抗αβtcr克隆bw242的識別，僅僅表達包括兩條鏈的全部鼠恒定結(jié)構(gòu)域的αβtcr的細胞(圖αhumu/βhumu)和表達αhumu/βm3的細胞顯示結(jié)合mabbw242的下降。這意味著表達包括鼠結(jié)構(gòu)域3的構(gòu)建體的細胞中mabbw242的抗體(βm3)的結(jié)合被顯著損害。因此，具有β鏈結(jié)構(gòu)域3修飾，比如通過用小鼠β鏈的β鏈結(jié)構(gòu)域3替換它或通過替換兩條α和β鏈的全部恒定區(qū)的工程化人αβt細胞受體在例如使用bw242的macs分離方法中不被選擇。

工程化αβt細胞受體保持特異性

表達人ny-eso-1αβtcr、嵌合ny-eso-1αβtcr或具有人tcrα-鏈的鼠源化βm3的jurma細胞用ny-eso-1特異性五聚體染色，并且通過流式細胞術(shù)測量對于五聚體結(jié)合陽性的細胞分數(shù)的平均熒光強度(mfi)。顯示ny-eso-1全人αβtcr、具有全小鼠恒定區(qū)的嵌合ny-eso-1αβtcr和具有人tcrα-鏈的鼠源化βm3都結(jié)合ny-eso-1特異性五聚體

bw242抗體允許富集具有工程化人αβt細胞受體的工程化t細胞

確定bw242macs分離技術(shù)是否可用于富集具有工程化人αβt細胞受體的工程化tcr細胞。使用混合細胞群體。t細胞群體包括不表達任何αβt細胞受體的t細胞、表達野生型αβt細胞受體的t細胞，和表達具有期望的特異性的αβt細胞受體的細胞，其中該受體任選地被修飾以消除與bw242的結(jié)合。所以，表達轉(zhuǎn)基因tcr、ny-eso-1/hla-a2特異性αβtcr的t細胞以1:1的比例與wt1特異性人αβtcr-轉(zhuǎn)基因細胞混合。隨后，通過使用αβtcrmab-涂布免疫磁珠評估這些細胞混合物的純化并且通過流式細胞術(shù)分析未結(jié)合的細胞分數(shù)(圖9)。從混合群體有效富集用人-小鼠嵌合αβtcr的細胞修飾，即αhumu/βhumu-tcr、αhu/βm3-tcr或αm2/βm3-tcr(見用vβ4染色的圖，百分數(shù)從13％增加至42％)，而在流過部分未檢測到表達全人ny-eso-1或wt1特異性αβtcr的細胞(見用vβ21染色的圖，百分數(shù)從45％下降至1％)。注意，所得群體中保留的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，作為tcr-陰性細胞也不受mabbw242的影響。這顯示tcrβ中至少結(jié)構(gòu)域3的鼠源化足夠富集腫瘤-反應(yīng)性的αβtcr。

選擇性裂解具有鼠源化人αβtcr的工程化t細胞

提供表達人αβtcr和鼠源化人嵌合αβtcr的jurma細胞(αhu/βm3)。提供特異性靶向tcrβ鏈的抗體，h57-597(購買自biolegendinc.,sandiegeo,ca92121例如貨號是109201。h57-597是armenianhamserigg1同種型。使用標準鉻釋放試驗評估裂解的百分數(shù)。具有鼠源化人αβtcr的jurma細胞顯示裂解增加四倍。這指示h57-597選擇性殺死攜帶鼠源化人αβtcr而不是全人αβtcr的jurma細胞。

序列表

seqidno.1-4列舉了tcr的氨基酸序列?？勺儏^(qū)沒有加下劃線?？勺儏^(qū)中的斜體序列對應(yīng)cdr3區(qū)域。鏈的恒定區(qū)加下劃線顯示。

seqidno.1：人tcrα鏈(克隆ra14)：

seqidno。2:人tcrβ鏈(克隆ra14)：

seqidno.3人tcrγ鏈(克隆g115)：

seqidno.4人tcrδ鏈(克隆g115)：

下面列舉了可獲得自ncbi的genbank數(shù)據(jù)庫的(部分)序列，編號為aat27465、aak49780、aat27464、x02883、m64239、m12887、m12888、x02384(ah002088)、m26057、m22148、m23381、m14996、m15002、m17323、m13340、m12834、m12837、af021335，其通過引用并入本文。

表1.人或小鼠來源的(部分)t細胞受體的氨基酸序列。

序列表

<110>umcutrechtholdingb.v.

<120>選擇修飾的工程化t細胞和清除工程化淋巴細胞

<130>p32146ep00

<160>23

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>272

<212>prt

<213>智人

<400>1

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<211>306

<212>prt

<213>小家鼠

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<213>小家鼠

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165