本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)car(嵌合抗原受體)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的方法，該轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的水平?jīng)Q定工程化免疫細(xì)胞(如，免疫治療中使用的嵌合抗原受體t細(xì)胞)的活化水平。特別地，發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種分子開關(guān)系統(tǒng)和新的car結(jié)構(gòu)體，使得在給予可溶性化合物(其誘導(dǎo)抑制性結(jié)構(gòu)域和激活信號(hào)結(jié)構(gòu)域的共定位)時(shí)，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行可調(diào)節(jié)的激活，尤其是通過化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化(cid)。因此，由嵌合抗原受體(car)觸發(fā)的工程化免疫細(xì)胞的活化可以隨時(shí)通過抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行監(jiān)測(cè)或分流。本發(fā)明為可調(diào)節(jié)的和更安全的過繼性免疫治療的前景開辟了道路。

背景技術(shù)：

涉及體外產(chǎn)生的自體抗原特異性t細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的過繼性免疫治療是一種有前景的治療癌癥的策略?？梢酝ㄟ^擴(kuò)增抗原特異性t細(xì)胞或通過基因工程化t細(xì)胞的重定向來產(chǎn)生用于過繼性免疫治療的t細(xì)胞(park，rosenbergetal.2011)。病毒抗原特異性t細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是用于治療移植相關(guān)性病毒感染和罕見病毒相關(guān)性惡性腫瘤的成熟的方法。類似地，已經(jīng)顯示，腫瘤特異性t細(xì)胞的分離和轉(zhuǎn)移在治療黑素瘤方面是成功的。通過轉(zhuǎn)基因t細(xì)胞受體或嵌合抗原受體(car)的遺傳轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成功產(chǎn)生了t細(xì)胞的新特異性。car是合成受體，由單個(gè)融合分子中與一個(gè)或多個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)的靶向部分組成。car已經(jīng)成功地使得t細(xì)胞針對(duì)來自各種惡性腫瘤(包括淋巴瘤和實(shí)體瘤)的腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原(jena，dottietal.2010)進(jìn)行重定向。

第一代car修飾的t細(xì)胞在臨床前試驗(yàn)中取得了成功，并進(jìn)入了i期臨床試驗(yàn)。對(duì)卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和各種類型的白血病和淋巴瘤的臨床試驗(yàn)已經(jīng)開始(https：//clinicaltrials.gov/)。臨床試驗(yàn)顯示，幾乎沒有抗腫瘤活性的證據(jù)，其中活化、持續(xù)性和歸巢回癌組織均不足。不同研究已報(bào)道，部分第一代car在沒有共刺激作用的情況下導(dǎo)致無反應(yīng)性和體內(nèi)擴(kuò)增失敗。

為了克服這些局限性，設(shè)計(jì)了第二代和第三代car修飾的t細(xì)胞，以增強(qiáng)臨床前試驗(yàn)中car修飾的t細(xì)胞的激活信號(hào)、增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和效應(yīng)子功能(effectorfunction)。開發(fā)了第二代car，以在胞內(nèi)域(endodomain)結(jié)合一種或多種共刺激分子(如，cd28、ox40和4-1bb)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，并且這些改善了抗原特異性t細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。第三代car包括共刺激胞內(nèi)域的組合?，F(xiàn)在，第二代和第三代car修飾的t細(xì)胞都已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。第一臨床試驗(yàn)涉及表達(dá)car的t細(xì)胞，其將抗cd19結(jié)合結(jié)構(gòu)域與4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域和cd3zeta組合作為激活信號(hào)結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致了一些患者癥狀完全緩解，這種緩解一直持續(xù)到治療后的10個(gè)月。發(fā)現(xiàn)car修飾的t細(xì)胞在這些患者中擴(kuò)增了3倍數(shù)(3log)，滲入并溶解癌組織。有趣的是，這些細(xì)胞的一部分顯示出用于預(yù)防性腫瘤復(fù)發(fā)的t細(xì)胞記憶表型。雖然這些car修飾的t細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的治療效果，但是在第一次輸注car-修飾的t細(xì)胞后3周，它們的活性引起了危及生命的腫瘤溶解。

最近報(bào)道的不良事件強(qiáng)調(diào)，在使用第二代和第三代car修飾的t細(xì)胞時(shí)，需要特殊的預(yù)防措施。一名患者在環(huán)磷酰胺化療并隨后輸注識(shí)別抗原erbb2(her-2/neu)的car-修飾的t細(xì)胞5天后死亡(morganetal.2010)。毒性導(dǎo)致了促炎細(xì)胞因子的在臨床上的顯著釋放、肺部毒性、多器官衰竭和患者的最終死亡。這種和其他不良事件強(qiáng)調(diào)使用car-修飾的t細(xì)胞時(shí)謹(jǐn)慎的必要性，因?yàn)榕c針對(duì)腫瘤相關(guān)性抗原的抗體不同，這些細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)從體內(nèi)清除。

存在多項(xiàng)正在進(jìn)行的研究，以開發(fā)更安全的基于car的免疫治療。多項(xiàng)研究報(bào)告了旨在提高t免疫治療的功效和安全性的多種系統(tǒng)。在健康人中的t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力包括由共刺激信號(hào)和抑制性信號(hào)之間的平衡調(diào)節(jié)的多個(gè)順序步驟，這兩種信號(hào)微調(diào)免疫反應(yīng)。稱為免疫檢查點(diǎn)的抑制性信號(hào)(如，ctla-4-或pd-1)對(duì)于維持自身耐受性至關(guān)重要，并且還限制免疫介導(dǎo)的側(cè)支組織損傷(dolanetal，2014)。

最近，設(shè)計(jì)了抑制性嵌合抗原受體(icar)，其具有的目標(biāo)是在遇到脫靶細(xì)胞時(shí)將抑制t細(xì)胞功能上。icar由融合至t細(xì)胞抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的抗原特異性單鏈可變片段(scfv)構(gòu)成。表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原而不是正常組織抗原的細(xì)胞將誘導(dǎo)t細(xì)胞活化、細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子信號(hào)以殺死在靶細(xì)胞(ontargetcell)。在研究中(federovetal.2013)，基于ctla-4-或pd-1-的icar表現(xiàn)出選擇性限制通過內(nèi)源t細(xì)胞受體或活化嵌合受體誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞毒性和增殖。因此，為了發(fā)揮功能，icar技術(shù)依賴于2種抗原的初步選擇：一種腫瘤相關(guān)抗原和一種正常組織抗原。此外，pd-1或ctla-4的抑制效果僅在脫靶細(xì)胞(off-targetcell)上運(yùn)行。

在buddeetal.(2013)中描述了另一系統(tǒng)，其中cd20嵌合抗原受體與誘導(dǎo)型胱天蛋白酶9(ic9)自殺開關(guān)(suicideswitch)相結(jié)合。在申請(qǐng)us2014/0286987中，在前藥ap1903(他克莫司)的存在下，通過結(jié)合到突變的fk506結(jié)合蛋白(fkbp1)使得后一種基因具有功能性。由bellicum公司發(fā)起的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，其中上述半胱天冬酶技術(shù)(caspacid^tm)被工程化到第三代cart細(xì)胞靶向的gd2中。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將dna從載體轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞中，并且該載體衍生的dna引導(dǎo)表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化(cid)和輔助蛋白。在ap1903藥物存在下，將產(chǎn)生cid蛋白的二聚化，從而開啟信號(hào)級(jí)聯(lián)。在由給予的t細(xì)胞引起嚴(yán)重危及生命的毒性的情況下，ap1903將被注入以觸發(fā)caspacid^tm啟動(dòng)的細(xì)胞的快速破壞和消除。一個(gè)重要的特征是，該表達(dá)限于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。此外，根據(jù)bellicum系統(tǒng)，不存在調(diào)節(jié)t細(xì)胞的活性的可能，因?yàn)榕c藥物接觸的caspacid^tm的表達(dá)導(dǎo)致t細(xì)胞死亡。申請(qǐng)wo2014/152177中描述了一種類似的基于多聚化劑的凋亡誘導(dǎo)系統(tǒng)。

需要一種基于car的免疫治療技術(shù)，其通過添加可溶性化合物能夠抑制或調(diào)節(jié)嵌合抗原受體(car)免疫細(xì)胞的活性而不會(huì)殺死所述細(xì)胞；這是靈活的，因?yàn)榭扇苄曰衔锏淖饔每梢允羌?xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的，并且與在靶/脫靶細(xì)胞選擇無關(guān)。

本發(fā)明在此提供了此類免疫治療，在細(xì)胞毒性的情況下(即需要時(shí))，該免疫治療通過給予特定的可溶性化合物可以特異性地抑制/調(diào)節(jié)活化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一方面，本發(fā)明提供了通過給予可溶性化合物以調(diào)節(jié)嵌合抗原受體-工程化免疫細(xì)胞，如car-t細(xì)胞的活化水平的方法。

在優(yōu)選的方面，可溶性化合物可以是小分子(如，雷帕霉素類似物(rapalog))或雙特異性抗體，其觸發(fā)至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的共定位，并因此通過抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的作用增強(qiáng)car-工程化免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，包含結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域的抑制性膜蛋白(imp)與car在免疫細(xì)胞中共表達(dá)。car和imp，尤其通過包含在car內(nèi)的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使得相對(duì)于可溶性化合物具有反應(yīng)性，由此通過imp具有的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的二聚化或配體識(shí)別，以及car具有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的二聚化或配體識(shí)別而允許共定位，從而具有降低car活化的效果。抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為程序性死亡-1(pd-1)，其減弱t細(xì)胞受體(tcr)介導(dǎo)的il-2生產(chǎn)和t細(xì)胞增殖的活化。在sheppardetal.(2004)中，證明t細(xì)胞功能的pd-1調(diào)節(jié)涉及通過zap70的tcr介導(dǎo)的磷酸化的抑制以及cd3ζ結(jié)合。

本發(fā)明提供了落入本發(fā)明范圍內(nèi)的多種構(gòu)象，例如取決于所使用的可溶性化合物的類型，結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域可以是細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的(圖1和圖2)。另一方面，免疫細(xì)胞中表達(dá)的嵌合抗原受體(car)可以是多鏈car或單鏈car。本發(fā)明還提供了獨(dú)立于所選擇的car結(jié)構(gòu)體的開關(guān)系統(tǒng)，其并非一定要求在car中包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域或二聚化結(jié)構(gòu)域。根據(jù)該在后的方面，第一和第二結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域是表達(dá)在免疫細(xì)胞表面上的至少兩種異源抑制膜蛋白(imp)的一部分，使得抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域(充當(dāng)抑制car誘導(dǎo)激活的(間接)分子開關(guān))二聚化并活化。這類開關(guān)的實(shí)例涉及圖3所示的il-10路徑。二聚化誘導(dǎo)劑，如雷帕霉素使得兩個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域的共定位。一旦二聚化，il-10r抑制促炎細(xì)胞因子，如ifn-γ、il-2、il-3、tnfα和gm-csf的合成。這種抑制似乎是由涉及多種中間體(如，受體相關(guān)的janus激酶1(jak1)和酪氨酸激酶2(tyk2)激酶)的反應(yīng)級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的，導(dǎo)致如finbloometal.(1995)中所述的stat蛋白的酪氨酸磷酸化。

另外，本發(fā)明涵蓋了可通過本發(fā)明的方法獲得的分離的細(xì)胞或細(xì)胞系，更特別地，包括或表達(dá)本文所述的任何蛋白質(zhì)、多肽、等位變體、改變的或缺失的基因或載體的分離的免疫細(xì)胞。根據(jù)申請(qǐng)人實(shí)施的并在wo2013176915中描述的先前的發(fā)展，本發(fā)明的免疫細(xì)胞或細(xì)胞系可以被進(jìn)一步工程化用于患者中的同種植入，例如通過破壞t細(xì)胞受體。

從上述方面，本發(fā)明的另一方面涉及用于治療或預(yù)防，如癌癥等病癥的方法，其中car誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞可用于靶向患者中的病理細(xì)胞，并且其中需要使用可溶性化合物以保持免疫細(xì)胞增殖可控。

附圖說明

附圖和表格的簡(jiǎn)要說明

圖1：當(dāng)抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物和多鏈嵌合抗原受體(car)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域均定位在細(xì)胞外時(shí)，使用pd-1作為抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的基于細(xì)胞外化學(xué)誘導(dǎo)二聚化(cid)策略的示意圖。

該系統(tǒng)由2部分組成：第一部分包含稱為抑制性膜蛋白(imp)的多肽并且第二部分對(duì)應(yīng)于嵌合抗原受體(car)。imp是具有細(xì)胞外部分和具有細(xì)胞內(nèi)部分的跨膜蛋白，細(xì)胞外部分是能夠結(jié)合至化學(xué)誘導(dǎo)二聚化(cid)劑的二聚化結(jié)構(gòu)域，并且細(xì)胞內(nèi)部分含有抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域(此處為pd1)。

圖中表示的car是具有3條鏈(α、β和γ)的多鏈car(此處為mccar)，(如wo2014039523中所描述的)衍生自fc受體。α鏈攜帶識(shí)別表面標(biāo)志物配體的scfv結(jié)合結(jié)構(gòu)域，β鏈攜帶共刺激結(jié)構(gòu)域(此處為41-bb)以及γ鏈攜帶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)結(jié)構(gòu)域(此處為cd3ζ)。圖1a顯示了在γ鏈的細(xì)胞外部分上具有的二聚化結(jié)構(gòu)域；圖1b顯示了α鏈的細(xì)胞外部分的二聚化結(jié)構(gòu)域。

當(dāng)表達(dá)imp分子和mccar的免疫細(xì)胞不與cid試劑接觸時(shí)，mccar可以以正常的方式起作用，即最后破壞由scfv特異性部分識(shí)別的靶細(xì)胞。在mccar的不適當(dāng)或過度作用的情況下，可以向患者給予cid試劑(此處為雷帕霉素)，以便觸發(fā)可調(diào)節(jié)的的抑制開關(guān)，如本文后續(xù)所闡述的。

在兩種配置(圖1a和圖1b)中，雷帕霉素的存在允許2個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域(一個(gè)在imp分子上，另一個(gè)在mccar的α-或γ-鏈上)共定位，即這2個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域彼此更接近。通過這種作用，抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域pd1與mccar的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)結(jié)構(gòu)域cd3ζ共定位。后者的去磷酸化增強(qiáng)了從cd3ζ開始的反應(yīng)級(jí)聯(lián)，并最終導(dǎo)致對(duì)mccar的抑制。

圖2：當(dāng)抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物和多鏈嵌合抗原受體(car)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域均位于在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，使用pd-1作為抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的基于細(xì)胞內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化(cid)策略的示意圖。

該系統(tǒng)由諸如圖1所示的2個(gè)部分組成，圖2a和圖2b分別相應(yīng)于當(dāng)二聚化結(jié)構(gòu)域分別存在于mccar的α鏈和γ鏈上的情形。與圖1的不同在于，imp蛋白的二聚化結(jié)構(gòu)域和mccar的二聚化結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞內(nèi)。其作用過程與圖1的相同，不同之處在于雷帕霉素需要穿過免疫細(xì)胞的膜才能結(jié)合到結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

圖3：當(dāng)抑制性膜蛋白(imp)p復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞外時(shí)，使用il-10r作為抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的基于細(xì)胞外的化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化(cid)策略的示意圖。在二聚化結(jié)構(gòu)域分別存在于imp復(fù)合物而非mccar上的意義上，此處呈現(xiàn)的系統(tǒng)是一種與圖1和圖2所示的系統(tǒng)不同的系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于imp復(fù)合物和嵌合抗原受體(此處為mccar)。imp復(fù)合物由2個(gè)獨(dú)立的蛋白組成，每個(gè)均是跨膜的，在細(xì)胞外具有二聚化結(jié)構(gòu)域并且在細(xì)胞內(nèi)具有il-10r抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域(單體il-10rα和單體il-10rβ)的一個(gè)單體。mccar與圖1和圖2所示的相比。

圖4：當(dāng)imp分子和sccar中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域均位于細(xì)胞外時(shí)，使用pd-1(作為imp分子中的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域)和單鏈car的基于細(xì)胞外的化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化(cid)策略的示意圖。在不存在小分子時(shí)，sccar在遇到腫瘤細(xì)胞表面抗原時(shí)可以發(fā)揮作用。在小分子的存在下，存在cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二聚化，允許2個(gè)多肽鏈的“共定位”，并因此pd-1可以對(duì)sccar發(fā)揮其抑制作用。sccar停止發(fā)揮作用。

圖5：當(dāng)imp分子和sccar中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域均位于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，使用pd-1(作為imp分子中的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域)和單鏈car的基于細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化(cid)策略示意圖。這與圖4中描繪的細(xì)胞外的原理相同，不同之處在于小分子必須跨越膜以便能夠二聚化2個(gè)細(xì)胞內(nèi)cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

當(dāng)需要時(shí)，即在car不適當(dāng)或過度的作用的情況下，向患者給予雷帕霉素。雷帕霉素使得imp復(fù)合物上具有的2個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域的二聚化。這增強(qiáng)了il-10r的2種單體的共定位，并因此通過涉及干擾素ifn-γ和jak-stat信號(hào)路徑的反應(yīng)級(jí)聯(lián)增強(qiáng)對(duì)car的抑制活性。因此，功能性il-10r二聚體可通過嵌合抗原受體(car)間接監(jiān)測(cè)或分流免疫細(xì)胞的活化。

下列表格顯示了在所述imp復(fù)合物及嵌合抗原受體(car)的構(gòu)建中涵蓋的所有組分的序列。

具體實(shí)施方式

在過繼性t細(xì)胞治療中控制功能性反應(yīng)的能力是關(guān)鍵的事項(xiàng)。在這樣的治療策略中，通過表達(dá)表面暴露的嵌合抗原受體(car)將t細(xì)胞工程化，其實(shí)現(xiàn)了高的腫瘤特異性靶細(xì)胞識(shí)別。然而，為了控制和最小化潛在的毒性作用，非常需要可調(diào)節(jié)的開關(guān)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。

發(fā)明人開發(fā)了基于嵌合多蛋白復(fù)合物的設(shè)計(jì)來工程化這種免疫細(xì)胞的方法，該方法能夠通過添加可溶性化合物，如雷帕霉素類似物使嵌合抗原受體(car)失活。

特別地，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)工程化免疫細(xì)胞的活化水平的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)使用編碼嵌合抗原受體(car)的至少第一多核苷酸轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞，該嵌合抗原受體(car)可以通過外部配體在體內(nèi)和/或體外活化；所述car包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和

(b)進(jìn)一步使用編碼工程化抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物的至少第二多核苷酸轉(zhuǎn)染所述免疫細(xì)胞，所述imp復(fù)合物包含至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

使得所述免疫細(xì)胞共表達(dá)所述car和所述抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物；以及

(c)使所述工程化的免疫細(xì)胞接觸所述外部配體，以便由所述car轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)；然后

(d)通過添加可溶性化合物以降低所述car的所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，所述可溶性化合物結(jié)合所述imp的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述car分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以共定位所述imp和所述car，

由此調(diào)節(jié)工程化免疫細(xì)胞的活化水平。

通過“調(diào)節(jié)”活化水平，旨在通過給予可溶性化合物在car-工程化學(xué)免疫細(xì)胞上獲得抑制反應(yīng)，并且優(yōu)選不是與現(xiàn)有技術(shù)的其它系統(tǒng)相反的破壞性反應(yīng)。當(dāng)患者發(fā)生不良事件的嚴(yán)重情況時(shí)，這特別有助于將car誘導(dǎo)的活化調(diào)整到患者的需求且更嚴(yán)格。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，car轉(zhuǎn)導(dǎo)的所述信號(hào)是免疫細(xì)胞的激活且免疫細(xì)胞被激活。

根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方式，imp和car分子的共定位具有關(guān)閉car信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。

本發(fā)明系統(tǒng)的一個(gè)有趣的特征是其基于蛋白質(zhì)的共定位(即非共價(jià)結(jié)合)的靈活性。因此，在停止給予可溶性化合物(例如，雷帕霉素類似物)之后的短時(shí)間內(nèi)，可以預(yù)期到可溶性化合物不再與結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，“關(guān)閉”將不再進(jìn)行且car工程化的免疫細(xì)胞將能夠重新得到其潛力。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域是cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明中，還可以考慮進(jìn)行car轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)“微調(diào)”的可能性：取決于給予給患者的car工程化免疫細(xì)胞的活性不足/過度后不良事件的嚴(yán)重程度，可以調(diào)節(jié)整可溶性化合物的劑量。

取決于信號(hào)的性質(zhì)，在工程化免疫細(xì)胞中通過car轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)可以是對(duì)工程化免疫細(xì)胞的活化信號(hào)或失活信號(hào)。這取決于由免疫細(xì)胞表達(dá)的car中包括的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)結(jié)構(gòu)域(活化或抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域)。當(dāng)免疫細(xì)胞表達(dá)“正car”時(shí)(正car通常包含含有itam組分的活化結(jié)構(gòu)域，具有在識(shí)別腫瘤表面特異性抗原時(shí)激活細(xì)胞(即其免疫功能)的效果)，imp將作用為針對(duì)細(xì)胞活化的制動(dòng)器(剎車，brake)并且進(jìn)一步充當(dāng)“關(guān)閉”系統(tǒng)。相反，在轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)由包含，例如抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域(如，基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim))的“負(fù)car”產(chǎn)生時(shí)，這種抑制將部分或全部解除，充當(dāng)“接通”系統(tǒng)。

抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物

根據(jù)另一方面，本發(fā)明公開了抑制性雙重car/imp復(fù)合物，其包含至少兩種跨膜嵌合多肽：

-第一跨膜嵌合多肽，編碼包含一個(gè)二聚化結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體；

-第二跨膜嵌合多肽，編碼工程化抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物，imp復(fù)合物包含至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)二聚化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，抑制性雙重car/imp復(fù)合物包含位于細(xì)胞外的二聚化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)實(shí)施方式，作為所述抑制性雙重car/imp復(fù)合物的一部分的car為多鏈car。

根據(jù)實(shí)施方式，作為所述抑制性雙重car/imp復(fù)合物的一部分的car為單鏈car。

在一種實(shí)施方式中，作為工程化的抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物的一部分的內(nèi)抑制性結(jié)構(gòu)域是pd-1蛋白(也稱為“程序性細(xì)胞死亡蛋白1”或cd279)。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，二聚化結(jié)合結(jié)構(gòu)域是fkbp或frb。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有與seqidno14和seqidno15至少80％的同一性。

根據(jù)本發(fā)明，抑制性膜(imp)復(fù)合物對(duì)應(yīng)于至少一種跨膜嵌合蛋白；該跨膜嵌合蛋白含有至少一個(gè)胞內(nèi)抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在一種實(shí)施方式中，imp復(fù)合物包含一種跨膜嵌合蛋白，該跨膜嵌合蛋白包含至少一個(gè)抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域和第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過存在的可溶性化合物，能夠結(jié)合到存在于嵌合抗原受體(car)上的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖1和圖2)。

這些抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域可能屬于“免疫檢查點(diǎn)”分子，其有效地作用為“制動(dòng)器”以下調(diào)或抑制免疫反應(yīng)。

在這些抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域中，有些可以是“功能性”抑制劑，因?yàn)樗鼈兡軌蛲ㄟ^(可逆的)翻譯后修飾(如，通過去磷酸化機(jī)制(即對(duì)于pd-1))相互作用，有些可以是“結(jié)構(gòu)性”抑制劑，如能夠物理阻斷蛋白質(zhì)的抗體(優(yōu)選人源化體內(nèi)抗體)。

根據(jù)本發(fā)明，這些抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域可以來自，但不限于以下各項(xiàng)：程序性死亡1(pd-1，也稱為pdcd1或cd279，登錄號(hào)：nm_005018)、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla-4，也稱為cd152，genbank登錄號(hào)af414120.1)、lag3(也稱為cd223，登錄號(hào)：nm_002286.5)、tim3(也稱為havcr2，genbank登錄號(hào)：jx049979.1)、btla(也稱為cd272，登錄號(hào)：nm_181780.3)、by55(也稱為cd160，genbank登錄號(hào)：cr541888.1)、tigit(也稱為vstm3，登錄號(hào)：nm_173799)、lair1(也稱為cd305，genbank登錄號(hào)：cr542051.1，(meyaard，ademaetal.1997))、siglec10(genebank登錄號(hào)：ay358337.1)、2b4(也稱為cd244，登錄號(hào)：nm_001166664.1)、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、cd96、crtam、siglec7(nicoll，nietal.1999)、siglec9(zhang，nicolletal.2000；ikehara，ikeharaeta1.2004)、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、fas、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit1、foxp3、prdm1、batf(quigley，pereyraetal.2010)、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2、gucy1b3，這些蛋白已被描述為具有抑制免疫細(xì)胞活化的能力。

特別優(yōu)選的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域來自pd-1并且優(yōu)選地包含與seqidno.23具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

除了這些免疫檢查點(diǎn)(如pd-1)之外，針對(duì)免疫反應(yīng)的其它抑制劑也包括在本發(fā)明內(nèi)，例如某些細(xì)胞因子。

根據(jù)可替代的實(shí)施方式，本發(fā)明的imp復(fù)合物包括兩種跨膜嵌合蛋白，各自包含可以通過可溶性化合物結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖3)。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域是白細(xì)胞介素il-10rα和il-10rβ單體，并且優(yōu)選地包含分別與seqidno.59和seqidno.60具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

通常，il-10r由兩個(gè)待激活的亞基組成：il-10rα(參考uniprot：q13651；參考序列：np_001549)；和il-10rβ(參考uniprot：q08334，參考序列：nm_000628，對(duì)于人類物種)。根據(jù)satoshietal.(1999)，il-10對(duì)免疫細(xì)胞(如本發(fā)明的car-淋巴細(xì)胞t)的抑制作用是通過抑制干擾素α-和干擾素γ-誘導(dǎo)的基因的表達(dá)來獲得的。

典型地，本發(fā)明的il10ra/il10b多肽分別包含分別與seqidno：59和seqidno：60具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在il10ra/il10b多肽的二聚化之后發(fā)生il-10r的抑制作用，并且導(dǎo)致涉及jak-stat信號(hào)路徑的細(xì)胞因子，如干擾素ifn-γ、il-2、il-3或tnf-α的抑制(finbloometal.1995)。因此，功能性il-10r二聚體可以通過嵌合抗原受體(car)間接地監(jiān)測(cè)或分流免疫細(xì)胞的活化。

除了il-10r白細(xì)胞介素之外，可以根據(jù)圖3中示出的系統(tǒng)使用開關(guān)的其它實(shí)例，只要它們對(duì)于免疫分子是負(fù)調(diào)節(jié)因子并且它們是多聚的。它們之中，人們可以發(fā)現(xiàn)tgf-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)、vegf(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)或凋亡誘導(dǎo)多聚體受體，如tnfr(腫瘤壞死因子受體)或dr3(死亡受體-3)。

鑒于上述情況，包含抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域，如il-10r的根據(jù)本發(fā)明的imp的特征之一在于，這種抑制性系統(tǒng)不需要來自car的任何組分來啟動(dòng)其作用。因此，該抑制性系統(tǒng)可以與任何car組合，而不用考慮其特異性和架構(gòu)，從而下調(diào)激活的cart細(xì)胞，同時(shí)充當(dāng)“通用”開關(guān)。隨后，本發(fā)明考慮了如先前描述的car和分子開關(guān)的組合使用，而無論由car靶向的抗原是什么。

imp復(fù)合物的跨膜部分不僅選自如在以下部分“嵌合抗原受體”中呈現(xiàn)的用于嵌合抗原受體(car)的那些，而且選自對(duì)此種多個(gè)部分的多肽的構(gòu)建領(lǐng)域的技術(shù)人員而言看起來適合的多個(gè)其它跨膜部分。

根據(jù)本發(fā)明的imp復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能夠結(jié)合到可溶性化合物的蛋白，可溶性化合物經(jīng)由信號(hào)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)對(duì)car活化的調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，本發(fā)明的系統(tǒng)由兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，該兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過可溶性化合物的干涉而共定位或二聚化。

本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為二聚化結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)一種或其它上述實(shí)施方式，這兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在于兩個(gè)不同的imp上，或者一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一個(gè)imp的一部分而另一個(gè)存在于car上，這取決于所使用的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的類型和作用。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與相同的可溶性化合物相互作用。

兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的“共定位”或“二聚化”(也稱為“化學(xué)誘導(dǎo)的二聚化”或cid)是指在某種小分子、酶或其他二聚體的存在下，兩種蛋白質(zhì)靠近在一起制成是一種非共價(jià)結(jié)合的大分子復(fù)合物。在本發(fā)明的情況下，這種cid系統(tǒng)使得操縱信號(hào)路徑。

根據(jù)一種實(shí)施方式，結(jié)合或二聚化結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞外的。當(dāng)作為二聚劑的小分子不具有免疫原性和/或不能容易穿過免疫細(xì)胞的膜時(shí)，該配置是有利的/更有利的。取決于所使用的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域(例如，il10r與pd-1)，第一和第二結(jié)合或二聚化結(jié)構(gòu)域可以分別存在于imp蛋白和car結(jié)構(gòu)上(圖1)，或者兩者均存在于來自imp復(fù)合物的2個(gè)獨(dú)立的多肽上(圖3)。在第一種情況下，當(dāng)一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在于car結(jié)構(gòu)上時(shí)，抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域?qū)⒅苯訉?duì)car起作用，這與第二種情形相反，在第二種情形中，imp復(fù)合物對(duì)免疫細(xì)胞活化具有抑制作用，這被視為獨(dú)立于car的活化。

根據(jù)可替代的實(shí)施方式，結(jié)合結(jié)構(gòu)域或二聚化結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞內(nèi)的。當(dāng)一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或二聚化結(jié)構(gòu)域是一個(gè)imp的一部分(具有抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域)以及第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域或二聚化結(jié)構(gòu)域是car的一部分時(shí)，這種構(gòu)象適用(圖2)。例如，當(dāng)使用潛在的免疫原性小分子時(shí)，這種化學(xué)誘導(dǎo)二聚化(cid)策略將是優(yōu)選的。

結(jié)合結(jié)構(gòu)域/二聚化結(jié)構(gòu)域在α鏈上的定位對(duì)于結(jié)構(gòu)或構(gòu)象原因可能是有利的。

仍處于本發(fā)明范圍內(nèi)，二聚化結(jié)構(gòu)域是優(yōu)選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此當(dāng)在二聚化劑存在下時(shí)，一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到另一結(jié)構(gòu)域。

在可以預(yù)期的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，人們可以找到多個(gè)配對(duì)，如fkbp/fkbp與二聚化劑fk1012(spenceretal，1993)；fkbp/can與二聚化劑fk506(hoetal，1996)；fkbp/cyp-fas與二聚化劑fkcsa(belshawetal，1996)；fkbp/frb與二聚化劑雷帕霉素(riveraetal，1996)；gyrb/gyrb與二聚化劑香豆霉素(farraretal，1996)；gai/gid1與二聚化劑赤霉素(miyamotoetal，2012)。在最后一篇公開出版物中，該系統(tǒng)已被證明不僅在高等植物中起作用而且還在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是fkbp/frb，并且二聚化劑是雷帕霉素類似物，并且根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，雷帕霉素類似物是雷帕霉素。

根據(jù)特定的實(shí)施方式，結(jié)合結(jié)構(gòu)域fkbp/frb是多肽，該多肽包含與seqidno：14和seqidno：15分別具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

根據(jù)一種實(shí)施方式，本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其包含前述的多核苷酸。

可溶性化合物

“可溶性化合物”是指可溶于患者血清的化合物，使其不會(huì)沉淀并作用于患者血液循環(huán)中存在的各種工程化免疫細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的可溶性化合物優(yōu)選為小分子，但也可以是雙特異性抗體。如本文所使用的“小分子”是低分子量(＜2000道爾頓)的有機(jī)化合物?？蓱?yīng)用于本發(fā)明中的小分子的非限制性實(shí)例包括大環(huán)內(nèi)酯雷帕霉素及其類似物(也稱為“雷帕霉素類似物”)，如ap21967、德福莫林(ap23573)、依維莫司(rad001)和替西羅莫司(cci-779)?？梢詰?yīng)用于本發(fā)明的小分子的其它非限制性實(shí)例包括，他克莫司(fk506)、fk506衍生物，如fk1012、fk506類似物，如ap1903?？梢詰?yīng)用于本發(fā)明中的小分子的其它非限制性實(shí)例，包括香豆霉素、赤霉素、haxs、ap1510、ap20187和ap21967。這些“小分子”可以快速擴(kuò)散通過細(xì)胞膜，使得它們可以到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)并結(jié)合特定的蛋白質(zhì)；它們作用為效應(yīng)物，同時(shí)改變蛋白質(zhì)的功能活性。例如，可以在http：//www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/mb_cgi？mode＝&term＝small+molecule+libraries中找到這些化合物的文庫。

在優(yōu)選的小分子中，特別適合于本發(fā)明的那些是能夠二聚結(jié)合結(jié)構(gòu)域的試劑，也稱為二聚化劑，如雷帕霉素類似物。

對(duì)應(yīng)于雷帕霉素的類似物的雷帕霉素類似物包括雷帕霉素(西羅莫司)、cci779(替西羅莫司)和rad001(依維莫司)。雷帕霉素是由復(fù)活節(jié)島的土壤中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)產(chǎn)生的大環(huán)抗生素。雷帕霉素被發(fā)現(xiàn)是一種有效的抗真菌藥物，但也顯示出最初被認(rèn)為是不良的免疫抑制作用，這隨后導(dǎo)致其發(fā)展為臨床有用藥物。在本發(fā)明設(shè)想的“可溶性化合物”中，還可以考慮使用抗體，更特別的是雙特異性抗體和單克隆抗體。像小分子和二聚化劑一樣，雙特異性單克隆抗體的設(shè)計(jì)使得它們的表位可以同時(shí)結(jié)合imp復(fù)合物和/或car結(jié)構(gòu)上存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它們的結(jié)合通常使imp復(fù)合物和/或car的抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域共定位，并且因此導(dǎo)致對(duì)car的調(diào)節(jié)作用。

作為少數(shù)實(shí)施例，優(yōu)選的雙特異性單克隆抗體可以涉及frb蛋白的表位和fkbp蛋白的表位；或涉及fkbp蛋白的兩種不同的表位；或涉及kbp蛋白上的表位和can蛋白上的一個(gè)表面；或涉及fkbp蛋白上的表位和cyp-fas蛋白上的一個(gè)表位；或涉及gyrb蛋白的兩個(gè)不同表位；或涉及gai上的一個(gè)表位和gid1蛋白的一個(gè)表位。用于獲得雙特異性單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(springert.a，1985)。

嵌合抗原受體

本發(fā)明旨在生產(chǎn)工程化免疫細(xì)胞，其中活化水平可以通過imp/car系統(tǒng)調(diào)節(jié)。為了進(jìn)行這種調(diào)節(jié)，本發(fā)明提供了生產(chǎn)嵌合抗原受體(car)的具體設(shè)計(jì)，其更迅速地與imp復(fù)合物直接(圖1-2)或間接(圖3)地相互作用。

通常，car由融合至t細(xì)胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈(scfv：ζ)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外單鏈抗體(scfv)組成，并且當(dāng)在t細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，能夠基于其他地方(wo2010025177a、wo2012079000a、wo2013126712a、ep2126054a)的單克隆抗體特異性，重定向抗原識(shí)別?？梢栽诒景l(fā)明中使用的car的多個(gè)實(shí)例是針對(duì)cd123(來自cellectis的克隆#43和#32716)、cs1和tpbg(5t4)的car，并且可以包含非限制性實(shí)施例的氨基酸序列：seqidno：2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5。

aml細(xì)胞的免疫表型的最新進(jìn)展已經(jīng)揭示出多種aml相關(guān)的細(xì)胞表面抗原，其可以作為未來療法靶標(biāo)。白細(xì)胞介素3受體α鏈(il-3rα；cd123-ncbi參考號(hào)：np_001254642)已經(jīng)鑒定為一種潛在的免疫治療靶，因?yàn)榕c正常造血干細(xì)胞相比，其在aml腫瘤細(xì)胞上過度表達(dá)。此外，cd123特異性治療的兩個(gè)i期試驗(yàn)已經(jīng)完成，兩種藥物均表現(xiàn)出良好的安全性(臨床試驗(yàn)政府編號(hào)id：nct00401739和nct00397579)。

用于包括結(jié)腸直腸癌、卵巢癌和胃癌等的實(shí)體瘤以及用于，如兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病(all)等的非實(shí)體腫瘤的免疫治療的一種候選抗原是滋養(yǎng)層糖蛋白，也稱為tpbg或5t4(uniprot：q13641)。由于在胎兒滋養(yǎng)層(其中首次發(fā)現(xiàn))或滋養(yǎng)層糖蛋白(tpbg)中的表達(dá)，5t4通常被稱為癌胚抗原。5t4蛋白是含有七個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)的n-糖基化跨膜72kda糖蛋白(holeetal，1988)。發(fā)現(xiàn)5t4抗原在包括胃癌(starzynskaetal.1995)、卵巢癌和惡性上皮腫瘤(wrigleyetal.1995)在內(nèi)的多個(gè)癌癥中表達(dá)。另外，在具有高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)的兒童早期b型急性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)5t4癌胚抗原(castroetal.2012)。其在正常組織中的表達(dá)非常有限，但是在惡性腫瘤的整個(gè)發(fā)展中廣泛存在(carsbergetal.1995)。

cs1(gene參考號(hào)：cs1unq576/pro1138，uniprot參考號(hào)：q9nq25)是屬于免疫球蛋白超家族(igsf)的cd2子集的細(xì)胞表面糖蛋白，并且被多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞高度表達(dá)，但很少由正常細(xì)胞表達(dá)(chuetal.2013)。根據(jù)本發(fā)明的新的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)體包括另外的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域不同于針對(duì)存在于靶細(xì)胞上的組分的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域，并且其會(huì)與作用于imp蛋白的相同可溶性組分反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的單鏈car基本是常規(guī)的單鏈一代car，其補(bǔ)充地含有針對(duì)可溶性分子的結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域。

取決于所使用的cid策略，結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域可以位于細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)還同時(shí)預(yù)期了第2代car(未組合共刺激分子)和第3代car(組合共刺激分子)。

在本發(fā)明的配置中，其中結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞外的，根據(jù)本發(fā)明的car可以含有一種或多種下列組分：

(a)信號(hào)序列，以及2個(gè)抗原特異性靶向區(qū)中的一個(gè)(scfv的重鏈或輕鏈)；

(b)任選的連接子；

(c)結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域；

(d)剩余的抗原特異性靶向區(qū)(scfv的重鏈或輕鏈)；

(e)任選的鉸鏈(或間隔區(qū))；

(f)跨膜結(jié)構(gòu)域；

(g)含有至少一種共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

從上述結(jié)構(gòu)可以看出，相對(duì)于其它細(xì)胞外組分的位置，結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域的位置可以改變。

本發(fā)明還包括如申請(qǐng)人先前在wo2014039523a或pct/ep2014/059662中所描述的多鏈car。

多鏈嵌合抗原受體(mccar)和單鏈嵌合抗原受體(sccar)構(gòu)象均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的多鏈car結(jié)構(gòu)可以通過引入對(duì)可溶性化合物敏感的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或二聚化結(jié)構(gòu)域)，由先前的多鏈car進(jìn)行調(diào)整。

如圖1-2所示，取決于所使用的cid策略，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以位于細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)。

在其中多鏈car衍生自，如wo2014039523a中的fc受體的情況下，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或二聚化結(jié)構(gòu)域)可以位于α鏈(fcεrα)、β鏈fcεrβ)或γ鏈(fcεrγ)上。

根據(jù)特定的實(shí)施方式，通過多鏈基嵌合抗原受體(car)轉(zhuǎn)染工程化免疫細(xì)胞，在該多鏈基嵌合抗原受體(car)中，二聚化結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)是α鏈的一部分。

此種mccar可以包含下列組分中的一個(gè)或其子集：

-α鏈(fcεrα)，含有：

(a)信號(hào)序列和抗原特異性靶向區(qū)；

(b)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或二聚化結(jié)構(gòu)域)；

(c)細(xì)胞外間隔域(spacerdomain)(鉸鏈)；

(d)跨膜結(jié)構(gòu)域；

-β鏈(fcεrβ)，其含有：

(a)信號(hào)序列；

(b)細(xì)胞外間隔域(鉸鏈)；

(c)跨膜結(jié)構(gòu)域；

(d)共刺激配體；

-γ鏈(fcεεrγ)，其含有：

(a)信號(hào)序列；

(b)細(xì)胞外間隔域(鉸鏈)；

(c)跨膜結(jié)構(gòu)域；

(d)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)另一特定實(shí)施方式，通過多鏈基嵌合抗原受體(mccar)轉(zhuǎn)染工程化免疫細(xì)胞，在該多鏈基嵌合抗原受體(mccar)中，二聚化結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)是γ鏈的一部分；這類mccar可以包含下列組分中的一個(gè)或子集：

-α鏈(fcεrα)，含有：

(a)信號(hào)序列和抗原特異性靶向區(qū)；

(b)細(xì)胞外間隔域(鉸鏈)；

(c)跨膜結(jié)構(gòu)域；

(d)任選的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；

-β鏈(fcεrβ)，其含有：

(a)信號(hào)序列；

(b)細(xì)胞外間隔域(鉸鏈)；

(c)跨膜結(jié)構(gòu)域；

(d)共刺激配體；

-γ鏈(fcεrγ)，其至少含有：

(a)信號(hào)序列；

(b)結(jié)合(或二聚化)結(jié)構(gòu)域；

(c)細(xì)胞外間隔域(鉸鏈)；

(d)跨膜結(jié)構(gòu)域；

(e)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

如本文中使用的“細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域”被定義的寡肽或多肽，其能夠結(jié)合配體。優(yōu)選的，結(jié)構(gòu)域?qū)⒛軌蚺c細(xì)胞表面分子相互作用。

細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單鏈抗體片段(scfv)，其包含靶抗原特異性單克隆抗體(由柔性連接子連接、對(duì)特定靶抗原特異)的輕鏈(vl)和重鏈(vh)可變片段。除了scfv之外，特異于特異性抗原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以用于預(yù)定的靶向淋巴細(xì)胞，如作為非限制性實(shí)例的駱駝或鯊魚(vnar)單結(jié)構(gòu)域抗體片段或受體配體樣血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子多肽、整合素(integrin)結(jié)合肽、調(diào)蛋白(heregulin)或il-13突變蛋白、抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體高變環(huán)或cdr。

所述第一跨膜多肽可以進(jìn)一步包含細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的莖區(qū)。在本文中使用的術(shù)語“莖區(qū)”通常是指任何寡肽或多肽，其作用為將跨膜結(jié)構(gòu)域連接到細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。特別地，莖區(qū)被用來為細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供更多的柔性和可達(dá)性。莖區(qū)可以包含多達(dá)300個(gè)氨基酸、優(yōu)選10至100個(gè)氨基酸、并且最優(yōu)選25至50個(gè)氨基酸。莖區(qū)可以衍生自天然產(chǎn)生的分子的全部或部分，如衍生自cd8、cd4或cd28的細(xì)胞外區(qū)域的全部或部分，或衍生自抗體恒定區(qū)的全部或部分。可替代地，莖區(qū)可以是相應(yīng)于天然產(chǎn)生的莖序列的合成序列，或者可以是完全合成的莖序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述莖區(qū)是人類cd8α鏈(例如，np_001139345.1)的一部分。

因此，多鏈car在免疫細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生修飾的細(xì)胞，該修飾的細(xì)胞選擇性地消除確定的靶標(biāo)，包括，但不限于攜帶相應(yīng)腫瘤相關(guān)性表面抗原的惡性細(xì)胞、或攜帶病毒特異性表面抗原的病毒感染細(xì)胞、或攜帶譜系特異性或組織特異性表面抗原的靶細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的多鏈car可以包含多個(gè)細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以同時(shí)結(jié)合靶中不同的元素，由此增強(qiáng)免疫細(xì)胞活化和功能。細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以串聯(lián)在相同的跨膜多肽上，并且任選地可以通過連接子分離。在另一實(shí)施方式中，不同的細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以位于構(gòu)成多鏈car的不同跨膜多肽上。本發(fā)明可以涉及多鏈car群體，它們各自包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

另外，本發(fā)明可以包括工程化免疫細(xì)胞，其在所述細(xì)胞表面表達(dá)多鏈car群體，car的每個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及工程化免疫細(xì)胞，其中導(dǎo)入了編碼多肽(其組成多鏈car群體)的多核苷酸，多鏈car的每一個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。多鏈car群體是指至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)多鏈car，它們中的每一個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明的不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以同時(shí)結(jié)合靶中不同的元素，由此增強(qiáng)免疫細(xì)胞活化和功能。

在細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到靶上導(dǎo)致免疫細(xì)胞的活化和免疫反應(yīng)后，本發(fā)明的多鏈car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。換言之，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)激活免疫細(xì)胞(其中表達(dá)多鏈car)的至少一種正常效應(yīng)子功能。例如，t細(xì)胞的效應(yīng)子功能可以是細(xì)胞溶解活性或輔助活性，包括細(xì)胞因子的分泌。因此，術(shù)語“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”是指轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)信號(hào)功能信號(hào)并引導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行專門功能的蛋白質(zhì)部分?？稍诙噫渃ar中使用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例，可以是fc受體或t細(xì)胞受體的細(xì)胞質(zhì)序列，以及協(xié)同作用以在抗原受體接合后啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同受體的細(xì)胞質(zhì)序列，以及這些序列的任何衍生物或變體，和具有相同功能的能力的任何合成序列。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含兩種不同類型的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)序列，即啟動(dòng)抗原依賴性初級(jí)激活的序列，以及以抗原非依賴性方式起作用以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)的序列。初級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)序列可以包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序的信號(hào)基序(稱為itam)。itam是在多種受體的胞質(zhì)內(nèi)的尾部中發(fā)現(xiàn)的充分限定的信號(hào)基序，其作為syk/zap70類酪氨酸激酶的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明中使用的itam的實(shí)例可以包括衍生自以下各項(xiàng)的作為非限制性實(shí)例的那些：tcrζ、fcrγ、fcrβ、fcrε、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多鏈car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含cd3ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域，或fcεriβ或γ鏈的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明的多鏈car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含共刺激信號(hào)分子。共刺激分子是除抗原受體以外的細(xì)胞表面分子，或有效免疫反應(yīng)所需的其配體。

“共刺激配體”是指抗原呈遞細(xì)胞上的分子，其特異性地結(jié)合t細(xì)胞上的同源共刺激分子，由此提供這樣的信號(hào)，該信號(hào)(除了，例如由tcr/cd3復(fù)合物與mhc分子(加載有肽)的結(jié)合所提供的初級(jí)信號(hào)之外)介導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配體可以包括，但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、誘導(dǎo)型共刺激配體(icos-l)、細(xì)胞間粘附分子(icam、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、m1cb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、結(jié)合toll配體受體的激動(dòng)劑或抗體以及與b7-h3特異性結(jié)合的配體)。共刺激配體還尤其包括，與存在于t細(xì)胞上的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體，諸如，但不限于cd27、cd28、4-ibb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、ltght、nkg2c、b7-h3、特異性結(jié)合cd83的配體。

“共刺激分子”是指t細(xì)胞上特異性結(jié)合共刺激配體由此介導(dǎo)細(xì)胞的共刺激反應(yīng)(諸如但不限于增殖)的同源結(jié)合配偶體。共刺激分子包括，但不限于mhci類分子、btla和toll配體受體。共刺激分子的實(shí)例包括cd27、cd28、cd8、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特異性結(jié)合cd83的配體等。

所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是tnfr-相關(guān)因子2(traf2)結(jié)合基序、共刺激tnfr成員家族的胞質(zhì)內(nèi)尾部(intracytoplasmictail)。共刺激tnfr家族成員的胞質(zhì)內(nèi)尾部含有由主要的保守基序(p/s/a)x(q/e)e)或次要基序(pxqxxd)組成的traf2結(jié)合基序，其中x是氨基酸。響應(yīng)于受體三聚化，traf蛋白被招募到多個(gè)tnfr的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾部中。

本發(fā)明的多鏈car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含共刺激信號(hào)分子4-1bb(genbank：aaa53133.)的一部分。

適當(dāng)?shù)目缒ざ嚯牡膮^(qū)別特征，包括在免疫細(xì)胞(特別是淋巴細(xì)胞或天然殺傷(nk)細(xì)胞)的表面上表達(dá)的能力，以及一起相互作用以引導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)預(yù)定靶細(xì)胞的細(xì)胞反應(yīng)的能力。包含細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的多鏈car的不同的跨膜多肽一起相互作用，以在與靶配體結(jié)合后參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)?？缒そY(jié)構(gòu)域可以衍生自天然或合成的來源?？缒そY(jié)構(gòu)域可以衍生自從任何膜結(jié)合或跨膜蛋白。作為非限制性實(shí)例，跨膜多肽可以是t細(xì)胞受體的亞基(如α、β、γ或ζ)、構(gòu)成cd3復(fù)合物的多肽、il2受體p55(α鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、fc受體的亞基(特別是fcγ受體iii的亞基)或cd蛋白?？商娲?，跨膜結(jié)構(gòu)域可以是合成的并且可以主要包含疏水性殘基，例如亮氨酸和纈氨酸。

多鏈car可以包含來源于fcεri鏈的跨膜多肽，如fcεriα鏈，其中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域被細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換。

所述多鏈car可以包含fcεriα鏈的一部分和fcεriβ鏈的一部分，或者它們的變體，以便fcεri鏈自發(fā)地二聚化在一起以形成二聚化嵌合抗原受體。多鏈嵌合抗原可以包含fcεriα鏈的一部分和fcεriγ鏈的一部分，或者它們的變體，以便fcεri鏈自發(fā)三聚化在一起以形成三聚化嵌合抗原受體。另一個(gè)替代是多鏈嵌合抗原受體，其可以包含fcεriα鏈的一部分、fcεriβ鏈的一部分和fcεriγ鏈的一部分，或者它們的變體，以便fcεri鏈自發(fā)四聚化在一起以形成四聚化嵌合抗原受體。

多核苷酸，載體：

本發(fā)明還涉及編碼上述的可調(diào)節(jié)的/可調(diào)的imp復(fù)合物和根據(jù)本發(fā)明的car多肽結(jié)構(gòu)的多核苷酸、載體。本發(fā)明提供多核苷酸，包括dna和rna分子，其編碼本文公開的跨膜多肽(包括在多鏈或多鏈car中)。特別地，本發(fā)明涉及這樣的多核苷酸，其包含編碼組成上述多鏈/單鏈car的至少一種跨膜多肽的核酸序列。更特別地，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，其包含編碼組成上述多鏈/單鏈car的跨膜多肽的兩種或多種核酸序列。

多核苷酸可以可以存在于表達(dá)盒或表達(dá)載體中(例如，用于引入到細(xì)菌宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒，或用于轉(zhuǎn)染昆蟲宿主細(xì)胞的病毒載體，例如桿狀病毒載體，或用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的質(zhì)?；虿《据d體，如慢病毒)。

根據(jù)一種實(shí)施方式，在用于產(chǎn)生工程化免疫細(xì)胞的本發(fā)明方法期間實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)染，是使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行的，以便將car和/或imp穩(wěn)定整合到免疫細(xì)胞基因組中。

根據(jù)另一實(shí)施方式，通過使用car/imp編碼多順反子mrna進(jìn)行轉(zhuǎn)染以便于暫時(shí)表達(dá)。

可以將不同的核酸序列包括在核酸序列(包含編碼核糖體跳過序列)(如編碼2a肽的序列)的一個(gè)多核苷酸或載體中。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒群亞型中鑒定出的2a肽，導(dǎo)致核糖體從一個(gè)密碼子到下一個(gè)密碼子“跳過”，而不在由密碼子編碼的兩個(gè)氨基酸之間形成肽鍵(參見donnellyetal.，j.ofgeneralvirology82：1013-1025(2001)；donnellyetal.，j.ofgen.virology78：13-21(1997)；doroninaetal.，mol.and.cell.biology28(13)：4227-4239(2008)；atkinsetal.，rna13：803-810(2007))?！懊艽a子”是指由核糖體翻譯成一個(gè)氨基酸殘基的mrna上(或dna分子的有義鏈上)的三個(gè)核苷酸。因此，當(dāng)多肽被框中的2a寡肽序列分隔開時(shí)，可以由mrna內(nèi)的單個(gè)連續(xù)的開放閱讀框合成兩個(gè)多肽。這種核糖體跳過機(jī)制是本領(lǐng)域公知的，并且已知被多種載體使用以表達(dá)由單個(gè)信使rna編碼的多種蛋白質(zhì)。

為了將跨膜多肽(如fcεr)引導(dǎo)至宿主細(xì)胞的分泌路徑中，在多核苷酸序列或載體序列中提供了分泌信號(hào)序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。分泌信號(hào)序列可以是fcεr的分泌信號(hào)序列，或者可以來源于另一個(gè)分泌的蛋白(例如，t-pa)或者是從頭合成的。分泌信號(hào)序列可操作地連接至跨膜核酸序列，即兩個(gè)序列在正確的閱讀框架中接合并定位以將新合成的多肽引導(dǎo)到宿主細(xì)胞的分泌路徑中。分泌信號(hào)序列通常定位在編碼目標(biāo)多肽的核酸序列的5’端，但是某些分泌信號(hào)序列可以定位在目標(biāo)核酸序列的其它位置(參見，例如welchetal.，美國專利no.5,037,743；hollandetal.，美國專利no.5,143,830)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，信號(hào)肽包含fcεriα鏈(np_001992.1)的1至25號(hào)殘基。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，鑒于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，這些多核苷酸分子之間存在相當(dāng)大的序列變異是可能的。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列被密碼子優(yōu)化以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)選用于在人細(xì)胞中表達(dá)。密碼子優(yōu)化是指目標(biāo)序列中，通常在給定物種的高度表達(dá)基因中罕見的密碼子，與通常在這些物種的高度表達(dá)基因中常見的密碼子的互換，編碼氨基酸的此種密碼子作為被互換的密碼子。

工程化免疫細(xì)胞

本發(fā)明還涉及分離的免疫細(xì)胞，其是具有至少一種工程化(imp)抑制性膜蛋白的嵌合抗原受體(car)。

欲根據(jù)本發(fā)明使用的免疫細(xì)胞可以是例如t細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞或nk細(xì)胞。

根據(jù)特定的實(shí)施方式，免疫細(xì)胞是t細(xì)胞。

在imp復(fù)合物轉(zhuǎn)染步驟后，并且在與外部配體溫育步驟之前(諸如表面抗原)，工程化免疫細(xì)胞可以被輸注到患者體內(nèi)。

根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種可調(diào)節(jié)的/可調(diào)的免疫細(xì)胞，其也被工程化為同種異體的。這種非自體特征對(duì)于開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化療法特別有用，其中同種異體治療細(xì)胞可以預(yù)先制造并可用于立即向患者給予。

此種方法包含失活編碼t細(xì)胞受體(tcr)組分的至少一種基因(特別是tcrα、tcrβ基因)的步驟。

在制備本發(fā)明的可調(diào)節(jié)的/可調(diào)的car-工程化免疫細(xì)胞期間的任何時(shí)間，可以進(jìn)行，例如tcr組分的失活步驟。然而，優(yōu)選在轉(zhuǎn)染步驟之前進(jìn)行，以便不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)/擴(kuò)增產(chǎn)生過多相互作用。

還涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)的是進(jìn)一步工程化免疫細(xì)胞(即t細(xì)胞)的可能性，從而使得它們耐化療藥物，如嘌呤核苷酸類似物(氯法拉濱、氟達(dá)拉濱...)。

根據(jù)本發(fā)明，實(shí)現(xiàn)這些基因失活的特別合適的方法是使用外切核酸酶如tale核酸酶。這可以，如其他地方的描述來進(jìn)行(wo2012138927和下一章節(jié)“定義”中所引用的現(xiàn)有技術(shù))。

工程化免疫細(xì)胞的方法

本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)可調(diào)節(jié)的/可調(diào)的car-工程化免疫細(xì)胞的方法，其包括兩個(gè)轉(zhuǎn)染步驟(第一步是編碼嵌合抗原受體(car)的至少第一多核苷酸的轉(zhuǎn)染，且第二步是具有抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物的第二多核苷酸的轉(zhuǎn)染)以及，最后的選擇具有共表達(dá)多核苷酸的免疫細(xì)胞的步驟。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)用于免疫治療的工程化免疫細(xì)胞的方法，包括向細(xì)胞中導(dǎo)入不同多肽(其組成car/imp)，以及擴(kuò)增所述細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，考慮到在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，多核苷酸被包括在慢病毒載體中。這樣的慢病毒載體可以包含標(biāo)記基因(如gfp)和/或螢火蟲熒光素酶。

在又一實(shí)施方式中，在生產(chǎn)工程化免疫細(xì)胞方法中的所述轉(zhuǎn)染步驟a)，通過經(jīng)由重組方法(優(yōu)選同源重組)插入car和imp多核苷酸來進(jìn)行。該實(shí)施方法具有更特異的整合和更少的異位插入的優(yōu)點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過表達(dá)外源特異性內(nèi)切核酸酶以及添加編碼car/imp肽的至少一種多核苷酸模板來進(jìn)行這種位點(diǎn)特異性插入。作為實(shí)施例，位點(diǎn)特異性插入可以在tcr基因中完成，這使得減少或消除tcr(t細(xì)胞受體)功能，具有使免疫細(xì)胞(特別是t細(xì)胞)具有更少的同種異體反應(yīng)的效果。在免疫細(xì)胞是同種異體的免疫治療的背景下，該在后的方面特別地尋求降低gvhd的風(fēng)險(xiǎn)。

特異性核酸酶通常在基因組的所需位置產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)，并利用細(xì)胞的內(nèi)源機(jī)制通過同源重組(hr)和非同源末端連接(nhej)的自然過程修復(fù)所誘導(dǎo)的斷裂。工程化的核酸酶，如鋅指核酸酶(zfn)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)、工程化的歸巢內(nèi)切核酸酶和rna或dna引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶(如crispr/cas、cpf1或argonaute系統(tǒng))特別適合于進(jìn)行本發(fā)明的基因插入或失活。

在其它參考文獻(xiàn)中，wo2013/176915和wo2014/191128分別描述了talen和cas9。鋅指核酸酶(zfn)已初步描述于kim，yg；cha，j.；chandrasegaran，s.(1996).″hybridrestrictionenzymes：zincfingerfusionstofokicleavagedomain″.procnatlacadsciusa93(3)：1156-60中。

遞送方法

上述的不同方法涉及在細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白，如imp復(fù)合物、嵌合抗原受體(car)。作為將編碼多肽的多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中的結(jié)果，可以在細(xì)胞中表達(dá)多肽?？商娲?，可以在細(xì)胞外產(chǎn)生多肽，然后將其導(dǎo)入到細(xì)胞中。用于將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且包括作為非限制性實(shí)例的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法(其中多核苷酸構(gòu)建體被整合到細(xì)胞的基因組中)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法(其中多核苷酸構(gòu)建體未整合到細(xì)胞的基因組中)和病毒介導(dǎo)的方法?？梢酝ㄟ^，例如重組病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒)、脂質(zhì)體等將多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中。例如，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括，例如顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。考慮到在細(xì)胞中表達(dá)，多核苷酸可以包括在載體中，更特別是質(zhì)粒或病毒中。質(zhì)粒載體可以包含選擇標(biāo)記，其提供對(duì)接收載體的細(xì)胞的鑒定和/或選擇。不同的轉(zhuǎn)基因可以被包含在一個(gè)載體中。所述載體可以包含編碼核糖體跳過序列的核酸序列，例如編碼2a肽的序列。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒群亞型中鑒定出的2a肽，導(dǎo)致核糖體從一個(gè)密碼子到下一個(gè)密碼子的“跳過”，而不在由密碼子編碼的兩個(gè)氨基酸之間形成肽鍵(參見donnellyetal.，j.ofgeneralvirology82：1013-1025(2001)；donnellyetal.，j.ofgen.virology78：13-21(1997)；doroninaetal.，m0l.and.cell.biology28(13)：4227-4239(2008)；atkinsetal.，rna13：803-810(2007))?！懊艽a子”是指由核糖體翻譯成一個(gè)氨基酸殘基的mrna上(或dna分子的有義鏈上)的三個(gè)核苷酸。因此，當(dāng)多肽被框中的2a寡肽序列分隔開時(shí)，可以由mrna內(nèi)的單個(gè)連續(xù)的開放閱讀框合成兩個(gè)多肽。這種核糖體跳過機(jī)制是本領(lǐng)域公知的，并且已知被多種載體使用以表達(dá)由單個(gè)信使rna編碼的多種蛋白質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的編碼多肽的多核苷酸可以是mrna，其例如，通過電穿孔而被直接導(dǎo)入到細(xì)胞中。發(fā)明人確定了用于在t細(xì)胞中的mrna電穿孔的最佳條件。發(fā)明人使用細(xì)胞波(cytopulse)技術(shù)(其使得通過使用脈沖電場(chǎng))以瞬時(shí)透化活細(xì)胞，以將材料遞送到細(xì)胞中?；谑褂胮ulseagile(btxhavardapparatus，84octoberhillroad，holliston，ma01746，usa)電穿孔波形的技術(shù)使得能夠準(zhǔn)確地控制脈沖持續(xù)時(shí)間、強(qiáng)度以及脈沖之間的間隔(美國專利6,010,613和國際pct申請(qǐng)wo2004083379)。所有這些參數(shù)均可以被改變，以便達(dá)到獲得最高轉(zhuǎn)染效率且最低死亡率的最佳條件。本質(zhì)上，第一高電場(chǎng)脈沖使得孔形成，而隨后的較低電場(chǎng)脈沖使得將多核苷酸移動(dòng)到細(xì)胞中。

t細(xì)胞的活化和擴(kuò)增

無論是在t細(xì)胞的基因改造之前或之后，通常均可以使用在以下各項(xiàng)中描述的方法來激活和擴(kuò)增t細(xì)胞，例如美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美國專利申請(qǐng)公開no.20060121005?？梢栽隗w外或體內(nèi)擴(kuò)增t細(xì)胞。通常，通過與試劑的接觸來擴(kuò)增本發(fā)明的t細(xì)胞，試劑刺激t細(xì)胞表面上的cd3tcr復(fù)合物和共刺激分子，以便為t細(xì)胞制造激活信號(hào)。例如，可以使用化學(xué)物質(zhì)，如鈣離子載體a23187、佛波醇12-肉豆蔻酰13-乙酸酯(pma)或促有絲分裂凝集素樣植物血凝素(pha)來為t細(xì)胞創(chuàng)造激活信號(hào)。作為非限制性實(shí)例，可以在體外刺激t細(xì)胞群體，例如通過與抗-cd3抗體或其抗原結(jié)合片段或者固定在表面上的抗-cd2抗體接觸，或通過與鈣離子載體聯(lián)合的蛋白激酶c激活劑(例如，苔蘚抑制素)接觸。為了共刺激t細(xì)胞表面上的輔助分子，使用了結(jié)合輔助分子的配體。例如，可以在適合于刺激t細(xì)胞增殖的條件下，使t細(xì)胞群與抗cd3抗體和抗cd28抗體接觸。為了刺激cd4+t細(xì)胞或cd8+t細(xì)胞的增殖，可以使用抗cd3抗體和抗cd28抗體。例如，提供各種信號(hào)的試劑可以在溶液中或偶合到表面上。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地理解的，顆粒與細(xì)胞的比率可取決于相對(duì)于靶細(xì)胞的顆粒尺寸。

適于t細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括適合的培養(yǎng)基(例如最低必需培養(yǎng)基或rpmi培養(yǎng)基1640或x-vivo5，(lonza))，該培養(yǎng)基可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白細(xì)胞介素-2(il-2)、胰島素、ifn-g、1l-4、1l-7、gm-csf-10、gm-csf-2、1l-15、tgfp、il-21和tnf-或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于細(xì)胞生長(zhǎng)的任何其它添加劑。用于細(xì)胞生長(zhǎng)的其它添加劑包括，但不限于表面活性劑、人血漿蛋白液和還原劑，如n-乙酰半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可以包括rpmi1640、a1m-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo1和x-vivo20、優(yōu)化劑(optimizer)、添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素，不含血清，或補(bǔ)充有適量是的血清(或血漿)或定義的激素組、和/或量足以使t細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞因子?？股?例如，青霉素和鏈霉素)僅包括在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中，但不包括在要輸注到受試者體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物中。靶細(xì)胞被維持在支持生長(zhǎng)所需的條件下；例如適合的溫度(例如37℃)和氣氛(例如空氣加5％co2)。已經(jīng)暴露于不同刺激時(shí)間下的t細(xì)胞可能表現(xiàn)出不同的特征。

治療性應(yīng)用

在另一實(shí)施方式中，如前所獲得的分離的免疫細(xì)胞可用于過繼性細(xì)胞免疫治療。

根據(jù)可替代的實(shí)施方式，所述免疫細(xì)胞來自患者本身。根據(jù)一種實(shí)施方式，從供體獲得所述免疫細(xì)胞。

根據(jù)另一實(shí)施方式，所述免疫細(xì)胞是同種異體的，以便可以制備一批細(xì)胞給予一組患者而不僅是供體本身。在經(jīng)濟(jì)術(shù)語中代表真正優(yōu)勢(shì)的這個(gè)特征是強(qiáng)制性的，以降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)。

為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，免疫細(xì)胞，如t細(xì)胞在t細(xì)胞受體(tcr)基因中經(jīng)歷敲除(ko)，t細(xì)胞受體(tcr)基因負(fù)責(zé)識(shí)別結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合物(mhc)分子的抗原。通過失活tcr基因，后者不能與抗原肽和mhc(肽/mhc)接合，因此不存在t淋巴細(xì)胞的活化。

根據(jù)一種實(shí)施方式，通過敲除(ko)對(duì)tcr基因的失活是通過核酸內(nèi)切酶來實(shí)施的，優(yōu)選通過tale-核酸酶實(shí)施。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的所述t細(xì)胞可以用來在有需求的患者中治療癌癥、感染或自身免疫疾病。

在另一方面，本發(fā)明依賴于治療有需求的患者的方法，方法包括下列步驟中的至少一個(gè)：

(a)提供可通過前述方法的任一種獲得的分離的t細(xì)胞；

(b)將細(xì)胞給予給患者。

本發(fā)明的所述t細(xì)胞可以經(jīng)受堅(jiān)強(qiáng)的體內(nèi)擴(kuò)增并且可以持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間。

所述治療可以是改善、治愈或預(yù)防性的。這可以在標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議下完成，并根據(jù)需要可以重復(fù)多次。所得到的經(jīng)修飾的t細(xì)胞可以給予患者或根據(jù)其作為“現(xiàn)成”治療產(chǎn)品的可用性給予一個(gè)或多個(gè)患者。

可以與所公開的方法一起使用的細(xì)胞描述于前面部分中。所述治療可用于治療診斷患有癌癥、病毒感染和自身免疫疾病的患者?？梢灾委煹陌┌Y包括沒有血管化的或基本尚未血管化的腫瘤以及血管化的腫瘤。癌癥可以包括非實(shí)體瘤(例如，血液腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括實(shí)體瘤。將用本發(fā)明的耐藥的同種異體t細(xì)胞治療的癌癥的類型包括，但不限于惡性上皮腫瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和和某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性惡性腫瘤以及惡性腫瘤，例如肉瘤、惡性上皮瘤和黑素瘤。還包括的是成人腫瘤/癌癥和兒科腫瘤/癌癥。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，通常通過根據(jù)本發(fā)明的同種異體耐藥性t細(xì)胞來治療兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病(all)和肌萎縮性骨髓瘤白血病(aml)疾病。這可以分別通過使用耐藥性kotraccd19⁺cart細(xì)胞和耐藥性kotraccd123⁺t細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)?！皌rac”是指“t細(xì)胞受體α恒定基因”并且對(duì)應(yīng)于tcrα亞基恒定基因。

這可以是與以下療法相結(jié)合的治療：從由抗體治療、化療、細(xì)胞因子治療、樹突細(xì)胞治療、基因治療、激素治療、激光治療和放射治療組成的組中選擇的一種或多種針對(duì)癌癥的療法。

所述治療可以給予進(jìn)行免疫抑制治療的患者，例如由于藥物抗性基因的表達(dá)或藥物致敏基因的失活而使得對(duì)至少一種藥劑具有抗性的細(xì)胞或細(xì)胞群。在這一方面，藥物治療應(yīng)有助于根據(jù)本發(fā)明的t細(xì)胞在患者體內(nèi)的選擇和擴(kuò)增。

根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞群的給予可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括氣霧劑吸入、注射、攝入、輸血、植入或移植。本文的組合物可以通過皮下、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腸內(nèi)、髓內(nèi)，肌內(nèi)，顱內(nèi)、靜脈內(nèi)或淋巴內(nèi)射、或腹膜內(nèi)注射。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物優(yōu)選通過靜脈注射來給予。

細(xì)胞或細(xì)胞群的給予可以由每kg體重給予10³-10¹⁰個(gè)細(xì)胞組成，優(yōu)選10⁵至10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重，包括處于前述范圍內(nèi)的所有整數(shù)細(xì)胞數(shù)?？梢砸砸淮位蚨啻蝿┝縼斫o予細(xì)胞或細(xì)胞群。在另一實(shí)施方式中，所述有效量的細(xì)胞以單劑量給予。在另一實(shí)施方式中，有效量的細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)以多于一次劑量給予。給予時(shí)間處于管理醫(yī)師的判斷范圍內(nèi)，并取決于患者的臨床狀況。細(xì)胞或細(xì)胞群可以從任何來源獲得，例如血庫或供者。雖然個(gè)體需要變化，但用于特定疾病或病癥的給定細(xì)胞類型的有效量的最佳范圍的確定，處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。有效量是指提供治療或預(yù)防益處的量。給予的劑量將取決于接受者的年齡、健康和體重、共同治療的種類(如果有的話)、治療頻率和期望效果的性質(zhì)。

有效量的細(xì)胞或藥物組合物可以優(yōu)選腸胃外給予。給予可以是靜脈內(nèi)給予。給予可以通過在腫瘤內(nèi)注射直接進(jìn)行。

可以結(jié)合(例如，之前、同時(shí)或之后)任何數(shù)量的相關(guān)治療方式向患者給予細(xì)胞，相關(guān)治療方式包括，但不限于使用，如抗病毒療法、西多福韋和白細(xì)胞介素-2等藥劑的治療，用于ms患者的阿糖胞苷(也稱為ara-c)或那他珠單抗治療，或用于牛皮癬患者的依法利珠單抗治療，或用于pml患者的其它治療。本發(fā)明的t細(xì)胞可以與化療、放療、免疫抑制劑(如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506)、抗體、或其他免疫消融劑(如campath、抗-cd3抗體或其它抗體療法)、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、類固醇、fr901228、細(xì)胞因子和放射組合使用。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和fk506)或抑制對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的信號(hào)重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liuetal.，cell66：807-815，11；hendersonetal.，immun.73：316-321，1991；biereretal.，citrr.opin.mmn.5：763-773，93)。本發(fā)明的細(xì)胞組合物可以結(jié)合以下各項(xiàng)向患者聯(lián)合給予：(例如，之前、同時(shí)或之后的)骨髓移植、使用化療藥劑(如氟達(dá)拉濱、外束放射治療(xrt)、環(huán)磷酰胺)或抗體(如okt3或campath)的t細(xì)胞消融療法?？梢栽赽細(xì)胞消融療法(如與cd20反應(yīng)的藥劑，例如rituxan)之后，給予本發(fā)明的細(xì)胞組合物。例如，受試者可以經(jīng)歷如下標(biāo)準(zhǔn)治療：用高劑量化療，然后進(jìn)行外周血干細(xì)胞移植。移植后，受試者可接受本發(fā)明的擴(kuò)增的免疫細(xì)胞的輸注。擴(kuò)增的細(xì)胞可以在手術(shù)之前或之后給予。

藥物組合物

本發(fā)明的分離的t細(xì)胞可以單獨(dú)給予，或者作為與稀釋劑和/或其他組分組合的藥物組合物來給予。簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明的組合物可以包含本文描述的t細(xì)胞以及一種或多種藥學(xué)上或生理上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。此種組合物可以包含緩沖劑，如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制為用于靜脈給予。本發(fā)明的藥物組合物可以以適合于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式給予。盡管可以通過臨床試驗(yàn)來確定適當(dāng)劑量，但給予的數(shù)量和頻率將由患者的狀況以及患者疾病的類型和嚴(yán)重性等因素確定。

試劑盒和載體

本發(fā)明包括用于具有可調(diào)節(jié)的活化水平的工程化免疫細(xì)胞的試劑盒或載體，其包含：

-編碼嵌合抗原受體(car)的第一多核苷酸；和

-編碼如上描述的“抑制性膜復(fù)合物”段落中所描述的工程化抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物的第二多核苷酸。

定義

在上述描述中，廣泛地使用了多個(gè)術(shù)語。提供以下定義以便于理解本發(fā)明的實(shí)施方式。

-多肽序列中的氨基酸殘基在本文中根據(jù)單字母代碼來指定，其中例如q表示gln或谷氨酰胺殘基，r表示arg或精氨酸殘基，d表示asp或天冬氨酸殘基。

-核苷酸指定如下：使用單字母代碼指定核苷的堿基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鳥嘌呤。對(duì)于簡(jiǎn)并核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，n表示g、a、t或c。

-如本文所使用的，“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，寡核苷酸，由聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)生成的片段，和通過連接、斷裂、內(nèi)切核酸酶作用和外切核酸酶作用產(chǎn)生的片段。核酸分子可以由如下單體組成：天然存在的核苷酸(如dna和rna)、或天然存在核苷酸的類似物(例如天然核苷酸的對(duì)映體形式)或兩者的組合。核酸可以是單鏈或雙鏈的。

-“基因”是指遺傳的基本單位，由沿著染色體線性排列的dna片段組成，其編碼特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段、小rna等?；蛲ǔ０▎?dòng)子、5′非翻譯區(qū)、一個(gè)或多個(gè)編碼序列(外顯子)、任選的內(nèi)含子、3′非翻譯區(qū)?；蜻€可以包含終止子、增強(qiáng)子和/或沉默子。

-“基因組”是指細(xì)胞中包含的全部遺傳物質(zhì)，如核基因組、葉綠體基因組、線粒體基因組。

-“突變”是指多核苷酸(cdna、基因)或多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸/氨基酸的替換、缺失、插入。突變可影響基因或其調(diào)節(jié)序列的編碼序列。其也可能影響基因組序列的結(jié)構(gòu)或編碼的mrna的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性。

-“tale-核酸酶”是指由典型地來源于轉(zhuǎn)錄活化子樣效應(yīng)子蛋白(tale)的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域與內(nèi)切核酸酶催化結(jié)構(gòu)域的融合產(chǎn)生的工程化蛋白。此種催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為核酸酶結(jié)構(gòu)域且更優(yōu)選為具有核酸內(nèi)切酶活性的結(jié)構(gòu)域，例如i-tevi、cole7、nuca和fok-i。在特定的實(shí)施方式中，所述核酸酶是單體tale-核酸酶。單體核酸酶是不需要為特異性識(shí)別和切割而二聚化的核酸酶，如wo2012138927中描述的工程化dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域與i-tevi的催化結(jié)構(gòu)域的融合。在另一特定的實(shí)施方式中，所述罕見切割核酸內(nèi)切酶是二聚化tale核酸酶，優(yōu)選包含融合到foki的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。tale-核酸酶已經(jīng)被描述和用于刺激基因靶向和基因修飾(boch，scholzeetal.2009；moscouandbogdanove2009；christian，cermaketal.2010)?？梢陨唐访鹴alen^tm(cellectis，8ruedelacroixjarry，75013paris，france)商購這種工程化的tale-核酸酶。

-術(shù)語“切割”是指多核苷酸的共價(jià)主鏈的斷裂。切割可以通過多種方法引發(fā)，包括，但不限于磷酸二酯鍵的酶促或化學(xué)水解。單鏈切割和雙鏈切割都是可能的，并且兩個(gè)不同的單鏈切割事件可導(dǎo)致發(fā)生雙鏈切割。雙鏈dna、rna或dna/rna雜交切割可導(dǎo)致產(chǎn)生鈍端或交錯(cuò)末端。

-“嵌合抗原受體(car)”是指包含細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合受體。

-如本文使用的術(shù)語“細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域”定義為寡肽或多肽，其能夠結(jié)合配體。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)域能夠與細(xì)胞表面分子相互作用。例如，細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)選擇以識(shí)別在靶細(xì)胞(與特定疾病狀態(tài)相關(guān))表面上充當(dāng)細(xì)胞表面標(biāo)記物的配體。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含單鏈抗體片段(scfv)，其包含由柔性連接子接合的靶抗原特異性單克隆抗體的輕鏈(vl)和重鏈(vh)可變片段。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，scfv來源于cd123、5t4或cs1抗體。

根據(jù)本發(fā)明的car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶結(jié)合后，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的活化和免疫反應(yīng)。在car中使用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選的實(shí)例可以是t細(xì)胞受體的細(xì)胞質(zhì)序列以及共同受體的細(xì)胞質(zhì)序列，該共同受體協(xié)同作用以在抗原受體接合后啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)不同類的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)序列，即啟動(dòng)抗原依賴性初級(jí)激活的序列，以及以抗原非依賴性方式起作用以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)的序列。初級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)序列可以包含被稱為itam的基于免疫受體酪氨酸的激活基序的信號(hào)基序。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含共刺激信號(hào)分子。共刺激分子是一種除了抗原受體之外的細(xì)胞表面分子或有效免疫反應(yīng)所需的它們的配體。共刺激分子包括，但不限于mhci類分子、btla和toll配體受體。共刺激分子的實(shí)例包括cd27、cd28、cd8、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特異性結(jié)合cd83的配體等。

根據(jù)本發(fā)明的car表達(dá)在細(xì)胞的表面膜上。因此，car可以包含跨膜結(jié)構(gòu)域。適當(dāng)?shù)目缒そY(jié)構(gòu)域的區(qū)別特征包括在細(xì)胞(在本發(fā)明中優(yōu)選免疫細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞或天然殺傷(nk)細(xì)胞)的表面上表達(dá)的能力，以及一起相互作用以引導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)預(yù)定靶細(xì)胞的細(xì)胞反應(yīng)的能力。跨膜結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步包含在細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間的莖區(qū)。在本文中使用的術(shù)語“莖區(qū)”通常是指發(fā)揮將跨膜結(jié)構(gòu)域連接到細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域作用的寡肽或多肽。特別地，莖區(qū)被用來為細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供更多的柔性和可達(dá)性。莖區(qū)可以包含多達(dá)300個(gè)氨基酸，優(yōu)選10至100個(gè)氨基酸并且最優(yōu)選25至50個(gè)氨基酸。莖區(qū)可以衍生白天然存在的分子的全部或部分，如衍生自cd8、cd4或cd28的細(xì)胞外區(qū)域的全部或部分，或衍生自抗體恒定區(qū)的全部或部分。可替代地，莖區(qū)可以是相應(yīng)于天然存在的莖序列的合成序列，或可以是完全合成的莖序列。

通常在癌細(xì)胞中觀察到靶抗原的下調(diào)或突變，從而產(chǎn)生抗原缺失逃逸變體。因此，為了抵消腫瘤的逃逸并使免疫細(xì)胞對(duì)靶更具特異性，cd19特異性car可以包含另一細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以同時(shí)結(jié)合靶中的不同元素，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活化和功能。cd19特異性car的實(shí)例是scfvfmc63(kochenderferjn，wilsonwh，janikje，etal.eradicationofb-lineagecellsandregressionoflymphomainapatienttreatedwithautologoustcellsgeneticallyengineeredtorecognizecd19.blood2010；116(20)：4099-410)或scfv4g7car(描述于以申請(qǐng)?zhí)杙ct/ep2014/059662提交的申請(qǐng))。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以串聯(lián)放置在相同的跨膜多肽上，并且任選地可以通過連接子分隔開。在另一種實(shí)施方式中，不同的細(xì)胞外配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被放置在組成car的不同的跨膜多肽上。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及car群體，car各自包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種工程化免疫細(xì)胞的方法，其包含提供免疫細(xì)胞并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)car群體，car群體中的每一個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種工程化免疫細(xì)胞的方法，包含提供免疫細(xì)胞并且向細(xì)胞中導(dǎo)入編碼構(gòu)成car群體的多肽的多核苷酸，car群體中的每一個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。“car群體”是指至少兩、三、四、五、六或更多個(gè)car，它們的每一個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明的不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地可以同時(shí)結(jié)合靶中的不同元素，由此增強(qiáng)免疫細(xì)胞活化和功能。本發(fā)明還涉及一種分離的免疫細(xì)胞，其包含car群體，該car群體中的每一個(gè)包含不同的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

-術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸的核酸分子。本發(fā)明的“載體”包括，但不限于病毒載體、質(zhì)粒、rna載體或可由染色體、非染色體、半合成的或合成的核酸組成的線性或環(huán)狀dna或rna分子。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制(附加型載體)和/或表達(dá)其連接的核酸(表達(dá)載體)的那些。大量合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可商購。

-“遞送載體”是指任何遞送載體，其可以用于本發(fā)明中以將本發(fā)明中需要的試劑/化學(xué)物質(zhì)和分子(蛋白質(zhì)或核酸)與細(xì)胞接觸(即“接觸”)或遞送到細(xì)胞或亞細(xì)胞室內(nèi)(即“導(dǎo)入”)。它包括，但不限于脂質(zhì)體遞送載體、病毒遞送載體、藥物遞送載體、化學(xué)載體、聚合物載體、脂溶復(fù)合物、復(fù)合物、樹枝狀大分子、微泡(超聲造影劑)、納米顆粒、乳劑或其它合適的轉(zhuǎn)移載體。

-病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(例如，腺相關(guān)病毒)、冠狀病毒、諸如原粘液病毒(例如流感病毒)等負(fù)鏈rna病毒、彈狀病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙臺(tái))、正鏈rna病毒諸如小rna病毒和甲病毒、和雙鏈dna病毒包括腺病毒、皰疹病毒(例如，1型和2型單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、巨細(xì)胞病毒)、和痘病毒(例如牛痘、禽痘和金絲雀痘)。其它病毒包括，例如諾瓦克病毒、披膜病毒、黃病毒、呼腸弧病毒、乳突病毒、嗜肝dna病毒和肝炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括：禽白血病肉瘤，哺乳動(dòng)物c型病毒、b型病毒、d型病毒、htlv-blv組、慢病毒、泡沫病毒(coffin，j.m.，retroviridae：thevirusesandtheirreplication，infundamentalvirology，thirdedition，b.n.fields，etal.，eds.，lippincott-ravenpublishers，philadelphia，1996)。

-“慢病毒載體”是指基于hiv的慢病毒載體，由于其相對(duì)于較大的包裝能力、降低的免疫原性和高效率穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)大范圍的不同細(xì)胞類型的能力而對(duì)基因遞送非常有前景。通常在將三種(包裝、包膜和轉(zhuǎn)移)或更多的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入生產(chǎn)細(xì)胞后產(chǎn)生慢病毒載體。像hiv一樣，慢病毒載體通過細(xì)胞表面上的病毒表面糖蛋白與受體的相互作用進(jìn)入靶細(xì)胞。進(jìn)入時(shí)，病毒rna經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄，其是由病毒逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物介導(dǎo)的。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是雙鏈線性病毒dna，其是用于將病毒整合至感染細(xì)胞dna中的底物。“整合性慢病毒載體(或lv)”是指作為非限制性實(shí)例，能夠整合靶細(xì)胞的基因組的載體。相反，“非整合性慢病毒載體(或nilv)”是指不通過病毒整合酶作用整合靶細(xì)胞的基因組的有效的基因遞送載體。

-一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞(cellorcells)是指任何真核生物細(xì)胞、原代細(xì)胞和來自這些生物體的用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞系。

-“一個(gè)或多個(gè)原代細(xì)胞(primaryorprimarycells)”是指直接從活組織(即活組織檢查材料)取出并建立用于在體外生長(zhǎng)的細(xì)胞，與連續(xù)致瘤或人工永生細(xì)胞系相比，其經(jīng)歷了很少的群體倍增并因此更能代表其來源的組織的主要功能組分和特征。作為非限制性的實(shí)例，細(xì)胞系可以選自由以下組成的組：cho-k1細(xì)胞、hek293細(xì)胞、caco2細(xì)胞、u2-os細(xì)胞、nih3t3細(xì)胞、nso細(xì)胞、sp2細(xì)胞、cho-s細(xì)胞、dg44細(xì)胞、k-562細(xì)胞、u-937細(xì)胞、mrc5細(xì)胞、imr90細(xì)胞、jurkat細(xì)胞、hepg2細(xì)胞、hela細(xì)胞、ht-1080細(xì)胞、hct-116細(xì)胞、hu-h7細(xì)胞、huvec細(xì)胞、molt4細(xì)胞。

-因?yàn)檠苌@些多肽的基因組數(shù)據(jù)可能產(chǎn)生一些變異性，并且還考慮到替換這些多肽中存在的某些氨基酸而不會(huì)顯著損失活性(功能性變體)的可能性，因此本發(fā)明包括上述多肽的與本專利申請(qǐng)?zhí)峁┑男蛄泄灿兄辽?0％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％且甚至更優(yōu)選至少95％同一性的多肽變體。

因此，本發(fā)明涉及多肽，其包含的多肽序列與選自由seqidno：1至seqidno：60組成的組中的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

-“同一性”是指兩個(gè)核酸分子或多肽之間的序列同一性。同一性可以通過比較用于對(duì)比目的而比對(duì)的每個(gè)序列中的位置來確定。當(dāng)比較序列中的位置被相同的堿基占據(jù)時(shí)，則分子在該位置處是同一的。核酸或氨基酸序列之間的相似性或同一性程度是由核酸序列在位置上共有同一或匹配的核苷酸數(shù)量的函數(shù)?？梢允褂酶鞣N比對(duì)算法和/或程序來計(jì)算兩個(gè)序列之間的同一性，包括作為gcg序列分析套裝(universityofwisconsin，madison，wis.)的一部分而獲得的fasta或blast，并且可以缺省設(shè)置使用。例如，預(yù)期了與本文描述的具體多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且優(yōu)選表現(xiàn)出基本上相同功能的多肽，以及編碼此種多肽的多核苷酸。

除了用于工程化對(duì)嘌呤核苷酸類似物(pna)藥物(特別是氯法拉濱和氟達(dá)拉濱)具有抗性的t細(xì)胞的一般方法之外，還可以通過內(nèi)切核酸酶失活dck基因。

一般方法

原代細(xì)胞

通過密度梯度離心從健康志愿者供體(etablissementdusang)的血沉棕黃層(白膜層，buffycoat)分離外周血單核細(xì)胞。然后，使用easysep人t細(xì)胞富集試劑盒(stemcelltechnologies)純化t淋巴細(xì)胞，并且在補(bǔ)充有20ng/mlil-2(miltenyi)和5％人類ab血清(seralab)的x-vivo15培養(yǎng)基(lonza)中，使用dynabeads人類t-激活劑cd3/cd28(lifetechnologies)進(jìn)行活化。

細(xì)胞系

從美國模式培養(yǎng)物保藏所獲得cd123-陽性細(xì)胞系，如kg1a或molm13和cd123-陰性細(xì)胞系，如rpmi-8226以用于多發(fā)性骨髓瘤(mm)。典型地，將細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有10-20％熱滅活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100單位/毫升青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi1640中。

編碼imp/car的mrna的合成

在mrna合成之前，通過pcr引入t7啟動(dòng)子和終止密碼子序列，以擴(kuò)增car結(jié)構(gòu)的所有個(gè)體鏈。在體外從pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄編碼目的蛋白的mrna并且使用mmessagemmachinet7ultra試劑盒(lifetechnologies)按照制造商的說明進(jìn)行聚腺苷酸化。使用rneasy柱(qiagen)在cytoporation培養(yǎng)基t中洗脫以純化rna，并且通過使用nanodropnd-1000分光光度計(jì)在260nm下測(cè)量吸光度進(jìn)行定量。在變性甲醛/mops瓊脂糖凝膠上驗(yàn)證rna的質(zhì)量。

t細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

在多順反子mrna的電穿孔后，在人類t細(xì)胞中表達(dá)由car和編碼工程化抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物的第二多核苷酸構(gòu)成的本發(fā)明的開關(guān)系統(tǒng)。使用以mmessagemmachine試劑盒生產(chǎn)的封端且多腺苷酸化的多順反子mrna和作為模板的線性化質(zhì)粒對(duì)t細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。用作模板的質(zhì)粒含有t7rna聚合酶啟動(dòng)子，隨后是編碼不同car/imp變體的多順反子dna序列。

使用cytolvt-s設(shè)備(cellectis)，根據(jù)以下協(xié)議進(jìn)行多順反子mrna進(jìn)入人類t細(xì)胞的電穿孔：將使用抗cd3/cd28涂珠和il2預(yù)活化數(shù)天(3-5)的5×10⁶t細(xì)胞再懸浮于cytoporation緩沖劑t中，并且使用45μgmrna進(jìn)行電穿孔。電穿孔二十四小時(shí)后，用可固定活力染料efluor-780和特異性pe-共軛的山羊抗鼠iggf(ab’)2片段標(biāo)記人類t細(xì)胞，該人類t細(xì)胞是經(jīng)使用編碼多鏈car的多順反子mrna工程化的，并且通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。

使用多順反子mrna工程化的活t細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)多鏈car。

t細(xì)胞中的慢病毒表達(dá)

car特異性imp/car的體外篩選

如先前報(bào)道的，使用慢病毒載體將編碼car的多順反子基因和編碼工程化抑制性膜蛋白(imp)復(fù)合物的第二多核苷酸裝載進(jìn)入人類t細(xì)胞中。首先，評(píng)估2個(gè)上述多核苷酸編碼的肽在轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞中隨時(shí)間推移的細(xì)胞表面表達(dá)譜。為此目的，可以使用抗-cd123scfv/fc融合蛋白。典型地，觀察到兩種肽在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的3天在細(xì)胞表面上高度表達(dá)，并且在2周期間保持了相對(duì)高的表達(dá)。然后，評(píng)估了兩種肽以介導(dǎo)抗原依賴性t細(xì)胞活化的能力。為了解決這個(gè)問題，使用cd123-陽性細(xì)胞系(如kg1或molm13)和cd123-陰性細(xì)胞系(rpmi-8226)進(jìn)行活性測(cè)定。如脫顆粒測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定和ifnγ分泌測(cè)定的結(jié)果所示，廣泛觀察到的是，兩種肽在cd123-陽性細(xì)胞系的存在下能夠激活t細(xì)胞，而在cd123-陰性細(xì)胞系的存在下不能激活t細(xì)胞。

實(shí)施例

實(shí)施例1.imp(關(guān)閉受體)和工程化多鏈car(mccar)的組裝

根據(jù)公布的協(xié)議[如englerc，kandziar，marillonnets；(2008)″aonepot，onestep，precisioncloningmethodwithhighthroughputcapability″，plosone.3(11)]，使用金門組裝策略(goldengateassemblystrategies)進(jìn)行構(gòu)建體的組裝。因此，關(guān)閉開關(guān)受體(switch-offreceptor)和工程化的car被克隆在分離的穿梭克隆質(zhì)粒中。下表5給出了組裝的構(gòu)建體的非窮舉性實(shí)例；此處呈現(xiàn)的所有系統(tǒng)都被“關(guān)閉”。

用于組裝imp(關(guān)閉開關(guān)受體)的模塊序列獲自seqidno.61-64(細(xì)胞外cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或83-98(細(xì)胞內(nèi)cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)以及獲自具有seqidno.65-76(細(xì)胞外cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或99-106(細(xì)胞內(nèi)cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的工程化mccar。圖2a和圖2b示出了它們的構(gòu)象。

關(guān)閉開關(guān)受體和工程化的car(包括mccar的另外的適當(dāng)鏈(β和γ或α)被進(jìn)一步亞克隆在慢病毒生產(chǎn)質(zhì)粒中，可能在2a順式作用水解酶元件(gsg-p2a和gsg-t2a核糖體跳過肽)的上游，隨后是報(bào)道子標(biāo)記物(例如，熒光蛋白)或膜蛋白(如，rqr8)，它們被2a順式作用水解酶元件獨(dú)立地隔開或分隔在一起。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，如pcr、酶限制消化和連接來創(chuàng)建所有構(gòu)建。

實(shí)施例2.關(guān)閉開關(guān)受體和工程化mccar在原代t細(xì)胞中的慢病毒遞送

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案或由外部承包商生產(chǎn)病毒載體。使用關(guān)閉開關(guān)受體(switch-offreceptor)和工程化的mccar慢病毒顆粒同時(shí)或順序地轉(zhuǎn)導(dǎo)原代t細(xì)胞。使用大量facs分選或磁性分離，純化出工程化mccar和關(guān)閉開關(guān)受體的表達(dá)呈陽性的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞。在不存在小分子(雷帕霉素、雷帕霉素類似物或合成雷帕霉素類似物)的條件下，使用表達(dá)工程化car靶抗原的模型細(xì)胞系，評(píng)價(jià)全部批的工程化的mccar/關(guān)閉開關(guān)受體陽性群體的工程化mccar驅(qū)動(dòng)激活(脫顆粒/細(xì)胞毒性)、增殖和細(xì)胞因子釋放。然后，在存在小分子的條件下再現(xiàn)相同的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的抑制性能。

實(shí)施例3.關(guān)閉開關(guān)受體和工程化的sccar(單鏈car)的組裝

用于組裝imp(關(guān)閉開關(guān)受體)的模塊序列獲自seqidno.61-64(細(xì)胞外cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或83-98(細(xì)胞內(nèi)cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和獲得自如上表5中所描述的具有seqidno.77-82(細(xì)胞外cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或107-112(細(xì)胞內(nèi)cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的工程化sccar。它們的構(gòu)象示于圖4(細(xì)胞外cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和圖5(細(xì)胞內(nèi)cid結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。

根據(jù)公布的協(xié)議，使用金門組裝策略(goldenassemblystrategy)進(jìn)行構(gòu)建體的組裝。因此，關(guān)閉開關(guān)受體和工程化的car被克隆在分離的穿梭克隆質(zhì)粒中。關(guān)閉開關(guān)受體和工程化的sccar進(jìn)一步被亞克隆在慢病毒生產(chǎn)質(zhì)粒中，可能在2a順式作用水解酶元件的上游，隨后是報(bào)道子標(biāo)記物(例如熒光蛋白)，它們被2a順式作用水解酶元件獨(dú)立地隔開或分隔在一起。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，如pcr、酶限制消化和連接來創(chuàng)建所有構(gòu)建。

實(shí)施例4.關(guān)閉開關(guān)受體和工程化的sccars在原代t細(xì)胞中的慢病毒遞送

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議生產(chǎn)或由外部承包商生產(chǎn)病毒載體。使用關(guān)閉開關(guān)受體和工程化的sccar慢病毒顆粒同時(shí)或順次轉(zhuǎn)導(dǎo)原代t細(xì)胞。使用大量facs分選或磁性分離，純化出工程化sccar和關(guān)閉開關(guān)受體的表達(dá)呈陽性的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞。在不存在小分子(雷帕霉素、雷帕霉素類似物或合成雷帕霉素類似物)的條件下，使用表達(dá)工程化car靶抗原的模型細(xì)胞系，評(píng)價(jià)整體批量工程化的sccar/關(guān)閉開關(guān)受體陽性群體的工程化sccar驅(qū)動(dòng)激活(脫顆粒/細(xì)胞毒性)、增殖和細(xì)胞因子釋放。然后，在存在小分子的條件下重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的抑制性能。

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<120>用于調(diào)節(jié)car誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞活性的方法

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<220>

<223>序列信號(hào)γ

<400>13

metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalagly

20

<210>14

<211>114

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp

<400>14

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglysergly

100105110

alapro

<210>15

<211>102

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb

<400>15

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglyserglyalapro

100

<210>16

<211>156

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>γ-ti-a

<400>16

ileglygluproglnleucystyrileleuaspalaileleupheleu

151015

tyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulysileglnval

202530

arglysalaalailethrsertyrglulysserargvallyspheser

354045

argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr

505560

asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

65707580

argargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasn

859095

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

100105110

alatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysgly

115120125

hisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyr

130135140

aspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

145150155

<210>17

<211>156

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>γ-ti-b

<400>17

leuglygluproglnleucystyrileleuaspalaileleupheleu

151015

tyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulysileglnval

202530

arglysalaalailethrsertyrglulysserargvallyspheser

354045

argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr

505560

asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

65707580

argargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasn

859095

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

100105110

alatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysgly

115120125

hisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyr

130135140

aspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

145150155

<210>18

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vh-4g7-ss

<400>18

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargprogly

20

<210>19

<211>25

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd8atm

<400>19

iletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleu

151015

serleuvalilethrleutyrcysarg

2025

<210>20

<211>31

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>4-1bbtm

<400>20

ileileserphepheleualaleuthrserthralaleuleupheleu

151015

leuphepheleuthrleuargpheservalvallysargglyarg

202530

<210>21

<211>27

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>dap10tm

<400>21

ileleuleualaglyleuvalalaalaaspalavalalaserleuleu

151015

ilevalglyalavalpheleucysalaargarg

2025

<210>22

<211>33

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd28tm

<400>22

ilephetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrser

151015

leuleuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysarg

202530

arg

<210>23

<211>97

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1抑制性信號(hào)結(jié)構(gòu)域

<400>23

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glu

<210>24

<211>110

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos3_imp

<400>24

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105110

<210>25

<211>98

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos3_imp

<400>25

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglu

<210>26

<211>45

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd28連接子

<400>26

serargleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargpro

151015

glyprothrarglyshistyrglnprotyralaproproargaspphe

202530

alaalatyrargserglyserglyserglyserglyser

354045

<210>27

<211>48

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>4-1bb連接子

<400>27

glyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargpro

151015

valglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglu

202530

gluglugluglyglycysgluleuglyserglyserglyserglyser

354045

<210>28

<211>50

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ox40連接子

<400>28

alaleutyrleuleuargargaspglnargleuproproaspalahis

151015

lysproproglyglyglyserpheargthrproileglngluglugln

202530

alaaspalahisserthrleualalysileglyserglyserglyser

354045

glyser

50

<210>29

<211>28

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>dap10連接子

<400>29

proargargserproalaglngluaspglylysvaltyrileasnmet

151015

proglyargglyglyserglyserglyserglyser

2025

<210>30

<211>54

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd18連接子

<400>30

lysalaleuilehisleuseraspleuargglutyrargargpheglu

151015

lysglulysleulysserglntrpasnasnaspasnproleuphelys

202530

seralathrthrthrvalmetasnprolysphealagluserglyser

354045

glyserglyserglyser

50

<210>31

<211>49

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd28連接子

<400>31

argserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargserglyserglyserglysergly

354045

ser

<210>32

<211>33

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd275連接子

<400>32

argaspargcysleuglnhissertyralaglyalatrpalavalser

151015

progluthrgluleuthrglyhisvalglyserglyserglysergly

202530

ser

<210>33

<211>68

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>hvem連接子

<400>33

cysvallysargarglysproargglyaspvalvallysvalileval

151015

servalglnarglysargglnglualagluglyglualathrvalile

202530

glualaleuglnalaproproaspvalthrthrvalalavalgluglu

354045

thrileproserphethrglyargserproasnhisglyserglyser

505560

glyserglyser

65

<210>34

<211>45

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>light連接子

<400>34

metglugluservalvalargproservalphevalvalaspglygln

151015

thraspileprophethrargleuglyargserhisargargglnser

202530

cysservalalaargglyserglyserglyserglyser

354045

<210>35

<211>30

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd40l連接子

<400>35

metilegluthrtyrasnglnthrserproargseralaalathrgly

151015

leuproilesermetlysglyserglyserglyserglyser

202530

<210>36

<211>66

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>gitr連接子

<400>36

glnleuglyleuhisiletrpglnleuargserglncysmettrppro

151015

arggluthrglnleuleuleugluvalproproserthrgluaspala

202530

argsercysglnpheprogluglugluargglygluargseralaglu

354045

glulysglyargleuglyaspleutrpvalglyserglyserglyser

505560

glyser

65

<210>37

<211>56

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>tim1連接子

<400>37

lyslystyrphephelyslysgluvalglnglnleuservalserphe

151015

serserleuglnilelysalaleuglnasnalavalglulysgluval

202530

glnalagluaspasniletyrilegluasnserleutyralathrasp

354045

glyserglyserglyserglyser

5055

<210>38

<211>85

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>slam連接子

<400>38

glnleuargargargglylysthrasnhistyrglnthrthrvalglu

151015

lyslysserleuthriletyralaglnvalglnlysproglyproleu

202530

glnlyslysleuaspserpheproalaglnaspprocysthrthrile

354045

tyrvalalaalathrgluprovalprogluservalglngluthrasn

505560

serilethrvaltyralaservalthrleuprogluserglysergly

65707580

serglyserglyser

85

<210>39

<211>124

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd2連接子

<400>39

lysarglyslysglnargserargargasnaspglugluleugluthr

151015

argalahisargvalalathrglugluargglyarglysprohisgln

202530

ileproalaserthrproglnasnproalathrserglnhispropro

354045

proproproglyhisargserglnalaproserhisargpropropro

505560

proglyhisargvalglnhisglnproglnlysargproproalapro

65707580

serglythrglnvalhisglnglnlysglyproproleuproargpro

859095

argvalglnprolysproprohisglyalaalagluasnserleuser

100105110

proserserasnglyserglyserglyserglyser

115120

<210>40

<211>40

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>tlt-2連接子

<400>40

lyslysarghismetalasertyrsermetcysseraspproserthr

151015

argaspproproglyargprogluprotyrvalgluvaltyrleuile

202530

glyserglyserglyserglyser

3540

<210>41

<211>62

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>lag3連接子

<400>41

hisleutrpargargglntrpargproargargpheseralaleuglu

151015

glnglyilehisproproglnalaglnserlysileglugluleuglu

202530

glngluprogluprogluprogluprogluprogluprogluproglu

354045

progluprogluglnleuglyserglyserglyserglyser

505560

<210>42

<211>60

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>dap12連接子

<400>42

tyrpheleuglyargleuvalproargglyargglyalaalagluala

151015

alathrarglysglnargilethrgluthrgluserprotyrglnglu

202530

leuglnglyglnargseraspvaltyrseraspleuasnthrglnarg

354045

protyrtyrlysglyserglyserglyserglyser

505560

<210>43

<211>107

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd84連接子

<400>43

argleuphelysargargglnglyargilepheprogluglysercys

151015

leuasnthrphethrlysasnprotyralaalaserlyslysthrile

202530

tyrthrtyrilemetalaserargasnthrglnproalagluserarg

354045

iletyraspgluileleuglnserlysvalleuproserlysgluglu

505560

provalasnthrvaltyrsergluvalglnphealaasplysmetgly

65707580

lysalaserthrglnaspserlysproproglythrsersertyrglu

859095

ilevalileglyserglyserglyserglyser

100105

<210>44

<211>113

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd244連接子

<400>44

glupheleuthriletyrgluaspvallysaspleulysthrargarg

151015

asnhisgluglngluglnthrpheproglyglyglyserthriletyr

202530

sermetileglnserglnserseralaprothrserglngluproala

354045

tyrthrleutyrserleuileglnproserarglysserglyserarg

505560

lysargasnhisserproserpheasnserthriletyrgluvalile

65707580

glylysserglnprolysalaglnasnproalaargleuserarglys

859095

gluleugluasnpheaspvaltyrserglyserglyserglysergly

100105110

ser

<210>45

<211>157

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd229連接子

<400>45

leutyrservalleuserglnglytyrglulysleuaspthrproleu

151015

argproalaargglnglnprothrprothrseraspserserserasp

202530

serasnleuthrthrglugluaspgluaspargprogluvalhislys

354045

proileserglyargtyrgluvalpheaspglnvalthrglnglugly

505560

alaglyhisaspproalaprogluglyglnalaasptyraspproval

65707580

thrprotyrvalthrgluvalgluservalvalglygluasnthrmet

859095

tyralaglnvalpheasnleuglnglylysthrprovalserglnlys

100105110

glugluserseralathriletyrcysserilearglysproglnval

115120125

valproproproglnglnasnaspleugluileprogluserprothr

130135140

tyrgluasnphethrglyserglyserglyserglyser

145150155

<210>46

<211>151

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ltbr連接子

<400>46

lysalahisprotyrpheproaspleuvalglnproleuleuproile

151015

serglyaspvalserprovalserthrglyleuproalaalaproval

202530

leuglualaglyvalproglnglnglnserproleuaspleuthrarg

354045

gluproglnleugluproglygluglnserglnvalalahisglythr

505560

asnglyilehisvalthrglyglysermetthrilethrglyasnile

65707580

tyriletyrasnglyprovalleuglyglyproproglyproglyasp

859095

leuproalathrprogluproprotyrproileproglugluglyasp

100105110

proglyproproglyleuserthrprohisglngluaspglylysala

115120125

trphisleualagluthrgluhiscysglyalathrproserasngly

130135140

serglyserglyserglyser

145150

<210>47

<211>110

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos5-ter-α

<400>47

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105110

<210>48

<211>98

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos5-ter-α

<400>48

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglu

<210>49

<211>173

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>γ-cd3z鏈

<400>49

metileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalgluglnala

151015

alaalaleuglygluproglnleucystyrileleuaspalaileleu

202530

pheleutyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulysile

354045

glnvalarglysalaalailethrsertyrglulysserargvallys

505560

pheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasngln

65707580

leutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleu

859095

asplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarg

100105110

lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet

115120125

alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly

130135140

lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp

145150155160

thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

165170

<210>50

<211>101

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1_pos3

<400>50

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glyserglyserser

100

<210>51

<211>114

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos4-imp

<400>51

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglysergly

100105110

sergly

<210>52

<211>102

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos4-imp

<400>52

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglyserglysergly

100

<210>53

<211>97

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1_pos5-ter

<400>53

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glu

<210>54

<211>110

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos4-ter-imp

<400>54

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105110

<210>55

<211>98

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos4-ter-imp

<400>55

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglu

<210>56

<211>101

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1_pos4

<400>56

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glyserglysergly

100

<210>57

<211>108

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos5-ter-imp

<400>57

glyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrphepro

151015

lysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleugluasp

202530

glylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophelysphe

354045

metleuglylysglngluvalileargglytrpglugluglyvalala

505560

glnmetservalglyglnargalalysleuthrileserproasptyr

65707580

alatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohisalathr

859095

leuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105

<210>58

<211>96

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos5-ter-imp

<400>58

glyargvalalaileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileglu

859095

<210>59

<211>344

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ir-10ra抑制性結(jié)構(gòu)域

<400>59

ilevalileilephephealaphevalleuleuleuserglyalaleu

151015

alatyrcysleualaleuglnleutyrvalargargarglyslysleu

202530

proservalleuleuphelyslysproserpropheilepheileser

354045

glnargproserprogluthrglnaspthrilehisproleuaspglu

505560

glualapheleulysvalserprogluleulysasnleuaspleuhis

65707580

glyserthraspserglypheglyserthrlysproserleuglnthr

859095

glugluproglnpheleuleuproaspprohisproglnalaasparg

100105110

thrleuglyasnarggluproprovalleuglyaspsercysserser

115120125

glyserserasnserthraspserglyilecysleuglngluproser

130135140

leuserproserthrglyprothrtrpgluglnglnvalglyserasn

145150155160

serargglyglnaspaspserglyileaspleuvalglnasnserglu

165170175

glyargalaglyaspthrglnglyglyseralaleuglyhishisser

180185190

proprogluprogluvalproglyglugluaspproalaalavalala

195200205

pheglnglytyrleuargglnthrargcysalagluglulysalathr

210215220

lysthrglycysleugluglugluserproleuthraspglyleugly

225230235240

prolyspheglyargcysleuvalaspglualaglyleuhispropro

245250255

alaleualalysglytyrleulysglnaspproleuglumetthrleu

260265270

alaserserglyalaprothrglyglntrpasnglnprothrgluglu

275280285

trpserleuleualaleusersercysseraspleuglyileserasp

290295300

trpserphealahisaspleualaproleuglycysvalalaalapro

305310315320

glyglyleuleuglyserpheasnseraspleuvalthrleuproleu

325330335

ileserserleuglnserserglu

340

<210>60

<211>107

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ir-10b抑制性結(jié)構(gòu)域

<400>60

iletrpmetvalalavalileleumetalaservalphemetvalcys

151015

leualaleuleuglycysphealaleuleutrpcysvaltyrlyslys

202530

thrlystyralapheserproargasnserleuproglnhisleulys

354045

glupheleuglyhisprohishisasnthrleuleuphepheserphe

505560

proleuseraspgluasnaspvalpheasplysleuservalileala

65707580

gluaspsergluserglylysglnasnproglyaspsercysserleu

859095

glythrproproglyglnglyproglnserglu

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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151015

hisalaalaargproglyserglyglyvalglnvalgluthrileser

202530

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354045

histyrthrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserarg

505560

aspargasnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalile

65707580

argglytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargala

859095

lysleuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhispro

100105110

glyileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleu

115120125

lysleugluglyserglyalaprothrthrthrproalaproargpro

130135140

prothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargpro

145150155160

glualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleu

165170175

aspphealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcys

180185190

glyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysargserarg

195200205

alaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnproleulys

210215220

gluaspproseralavalprovalpheservalasptyrglygluleu

225230235240

asppheglntrpargglulysthrprogluproprovalprocysval

245250255

progluglnthrglutyralathrilevalpheproserglymetgly

260265270

thrserserproalaargargglyseralaaspglyproargserala

275280285

glnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleuglu

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<210>62

<211>485

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproglyserglyglyargvalalaileleutrphis

202530

glumettrphisgluglyleugluglualaserargleutyrphegly

354045

gluargasnvallysglymetphegluvalleugluproleuhisala

505560

metmetgluargglyproglnthrleulysgluthrserpheasngln

65707580

alatyrglyargaspleumetglualaglnglutrpcysarglystyr

859095

metlysserglyasnvallysaspleuthrglnalatrpaspleutyr

100105110

tyrhisvalpheargargileglyserglyalaprogluprolysser

115120125

proasplysthrhisthrcysproprocysproalaproprovalala

130135140

glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet

145150155160

ilealaargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis

165170175

gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval

180185190

hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr

195200205

argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly

210215220

lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile

225230235240

glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval

245250255

tyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser

260265270

leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu

275280285

trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro

290295300

valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval

305310315320

asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet

325330335

hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser

340345350

proglylyslysaspileileserphepheleualaleuthrserthr

355360365

alaleuleupheleuleuphepheleuthrleuargpheservalval

370375380

lysargglyargserargalaalaargglythrileglyalaargarg

385390395400

thrglyglnproleulysgluaspproseralavalprovalpheser

405410415

valasptyrglygluleuasppheglntrpargglulysthrproglu

420425430

proprovalprocysvalprogluglnthrglutyralathrileval

435440445

pheproserglymetglythrserserproalaargargglyserala

450455460

aspglyproargseralaglnproleuargprogluaspglyhiscys

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sertrpproleuglu

485

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<211>361

<212>prt

<213>人工序列

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

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hisalaalaargproglyserglyglyvalglnvalgluthrileser

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354045

histyrthrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserarg

505560

aspargasnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalile

65707580

argglytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargala

859095

lysleuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhispro

100105110

glyileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleu

115120125

lysleugluglyserglyalaproalaprovalglyleuvalalaarg

130135140

leualaaspgluserglyhisvalvalleuargtrpleupropropro

145150155160

gluthrprometthrserhisileargtyrgluvalaspvalserala

165170175

glyasnglyalaglyservalglnargvalgluileleugluglyarg

180185190

thrglucysvalleuserasnleuargglyargthrargtyrthrphe

195200205

alavalargalaargmetalagluproserpheglyglyphetrpser

210215220

alatrpsergluprovalserleuleuthrproseraspileleuleu

225230235240

alaglyleuvalalaalaaspalavalalaserleuleuilevalgly

245250255

alavalpheleucysalaargargserargalaalaargglythrile

260265270

glyalaargargthrglyglnproleulysgluaspproseralaval

275280285

provalpheservalasptyrglygluleuasppheglntrpargglu

290295300

lysthrprogluproprovalprocysvalprogluglnthrglutyr

305310315320

alathrilevalpheproserglymetglythrserserproalaarg

325330335

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproglyserglyglyargvalalaileleutrphis

202530

glumettrphisgluglyleugluglualaserargleutyrphegly

354045

gluargasnvallysglymetphegluvalleugluproleuhisala

505560

metmetgluargglyproglnthrleulysgluthrserpheasngln

65707580

alatyrglyargaspleumetglualaglnglutrpcysarglystyr

859095

metlysserglyasnvallysaspleuthrglnalatrpaspleutyr

100105110

tyrhisvalpheargargileglyserglyalaprothrthrthrpro

115120125

alaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleu

130135140

serleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhis

145150155160

thrargglyleuaspphealacysaspilephetrpvalleuvalval

165170175

valglyglyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalaphe

180185190

ileilephetrpvalargserlysargargserargalaalaarggly

195200205

thrileglyalaargargthrglyglnproleulysgluaspproser

210215220

alavalprovalpheservalasptyrglygluleuasppheglntrp

225230235240

argglulysthrprogluproprovalprocysvalprogluglnthr

245250255

glutyralathrilevalpheproserglymetglythrserserpro

260265270

alaargargglyseralaaspglyproargseralaglnproleuarg

275280285

progluaspglyhiscyssertrpproleuglu

290295

<210>65

<211>335

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>&#947;-mccar-excid-n?

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metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalaglyserglyglyvalglnvalgluthrileserprogly

202530

aspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyr

354045

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505560

asnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalilearggly

65707580

trpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleu

859095

thrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisproglyile

100105110

ileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleu

115120125

gluglyserglyalaprothrthrthrproalaproargproprothr

130135140

proalaprothrilealaserglnproleuserleuargprogluala

145150155160

cysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphe

165170175

alacysaspileglygluproglnleucystyrileleuaspalaile

180185190

leupheleutyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulys

195200205

ileglnvalarglysalaalailethrsertyrglulysserargval

210215220

lyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasn

225230235240

glnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspval

245250255

leuasplysargargglyargaspproglumetglyglylysproarg

260265270

arglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplys

275280285

metalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarg

290295300

glylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlys

305310315320

aspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

325330335

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<211>511

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>&#947;-mccar-excid-n?

<400>66

metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalaglyserglyglyargvalalaileleutrphisglumet

202530

trphisgluglyleugluglualaserargleutyrpheglygluarg

354045

asnvallysglymetphegluvalleugluproleuhisalametmet

505560

gluargglyproglnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyr

65707580

glyargaspleumetglualaglnglutrpcysarglystyrmetlys

859095

serglyasnvallysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhis

100105110

valpheargargileglyserglyalaprogluprolysserproasp

115120125

lysthrhisthrcysproprocysproalaproprovalalaglypro

130135140

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileala

145150155160

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

165170175

progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

180185190

alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval

195200205

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

210215220

tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys

225230235240

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

245250255

leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr

260265270

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

275280285

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

290295300

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

305310315320

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

325330335

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

340345350

lyslysaspileglygluproglnleucystyrileleuaspalaile

355360365

leupheleutyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulys

370375380

ileglnvalarglysalaalailethrsertyrglulysserargval

385390395400

lyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasn

405410415

glnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspval

420425430

leuasplysargargglyargaspproglumetglyglylysproarg

435440445

arglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplys

450455460

metalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarg

465470475480

glylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlys

485490495

aspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

500505510

<210>67

<211>391

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>67

metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalaglyserglyglyvalglnvalgluthrileserprogly

202530

aspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyr

354045

thrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserargasparg

505560

asnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalilearggly

65707580

trpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleu

859095

thrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisproglyile

100105110

ileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleu

115120125

gluglyserglyalaproalaprovalglyleuvalalaargleuala

130135140

aspgluserglyhisvalvalleuargtrpleuproproprogluthr

145150155160

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argvalgluileleugluglyargthrglucysvalleuserasnleu

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530535540

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asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

565570575

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glyglnproleulysgluaspproseralavalprovalpheserval

195200205

asptyrglygluleuasppheglntrpargglulysthrproglupro

210215220

provalprocysvalprogluglnthrglutyralathrilevalphe

225230235240

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aspargasnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalile

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lysleuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhispro

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glyileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleu

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lysleugluglu

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argserargalaalaargglythrileglyalaargargthrglygln

505560

proleulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyr

65707580

glygluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproproval

859095

procysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheproser

100105110

glymetglythrserserproalaargargglyseralaaspglypro

115120125

argseralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrppro

130135140

leuglyserglyserserserglyglyargvalalaileleutrphis

145150155160

glumettrphisgluglyleugluglualaserargleutyrphegly

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195200205

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tyrhisvalpheargargileglu

245

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<211>308

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>imp-intcid-n?1

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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100105110

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115120125

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130135140

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290295300

lysleugluglu

305

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<220>

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproglyseraspiletyriletrpalaproleuala

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

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hisalaalaargproglyseraspiletyriletrpalaproleuala

202530

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100105110

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275280285

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leuleulysleugluglu

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asptyrglygluleuasppheglntrpargglulysthrproglupro

130135140

provalprocysvalprogluglnthrglutyralathrilevalphe

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115120125

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130135140

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145150155160

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serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

180185190

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195200205

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210215220

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ileglu

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hisalaalaargproglyseraspiletyriletrpalaproleuala

202530

glythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcys

354045

argcysvallysargarglysproargglyaspvalvallysvalile

505560

valservalglnarglysargglnglualagluglyglualathrval

65707580

ileglualaleuglnalaproproaspvalthrthrvalalavalglu

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100105110

serglyserglyserserargalaalaargglythrileglyalaarg

115120125

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130135140

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165170175

valpheproserglymetglythrserserproalaargargglyser

180185190

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195200205

cyssertrpproleuglyserglyserglyglyargvalalaileleu

210215220

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245250255

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202530

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354045

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505560

alaproglylysserphelystrpmetglytrpileasnthrtyrthr

65707580

glygluserthrtyrseralaaspphelysglyargphealapheser

859095

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100105110

asngluaspthralathrtyrphecysalaargserglyglytyrasp

115120125

prometasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalsersergly

130135140

glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

145150155160

valleuthrglnserproalaserleualavalserleuglyglnarg

165170175

alathrilesercysargalasergluservalaspasntyrglyasn

180185190

thrphemethistrptyrglnglnlysproglyglnproprolysleu

195200205

leuiletyrargalaserasnleugluserglyileproalaargphe

210215220

serglyserglyserargthraspphethrleuthrileasnproval

225230235240

glualaaspaspvalalathrtyrtyrcysglnglnserasngluasp

245250255

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260265270

prothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

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290295300

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ileproleuleuvalvalileleuphealavalaspthrglyleuphe

325330335

ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

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370375380

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450455460

proprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleuglu

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glu

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354045

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505560

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65707580

glygluserthrtyrseralaaspphelysglyargphealapheser

859095

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glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

145150155160

valleuthrglnserproalaserleualavalserleuglyglnarg

165170175

alathrilesercysargalasergluservalaspasntyrglyasn

180185190

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prothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

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ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

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pheargargileglu

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glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

145150155160

valleuthrglnserproalaserleualavalserleuglyglnarg

165170175

alathrilesercysargalasergluservalaspasntyrglyasn

180185190

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195200205

leuiletyrargalaserasnleugluserglyileproalaargphe

210215220

serglyserglyserargthraspphethrleuthrileasnproval

225230235240

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prothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

275280285

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290295300

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305310315320

ileproleuleuvalvalileleuphealavalaspthrglyleuphe

325330335

ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

340345350

arglysglypheargleuleuasnprohisprolysproasnprolys

355360365

asnasnargalaleutyrleuleuargargaspglnargleupropro

370375380

aspalahislysproproglyglyglyserpheargthrproilegln

385390395400

glugluglnalaaspalahisserthrleualalysileglysergly

405410415

serglyserglyserserglyglyvalglnvalgluthrileserpro

420425430

glyaspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhis

435440445

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glytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalys

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leuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisprogly

500505510

ileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulys

515520525

leugluglu

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

asngluaspthralathrtyrphecysalaargserglyglytyrasp

115120125

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130135140

glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

145150155160

valleuthrglnserproalaserleualavalserleuglyglnarg

165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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prothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

275280285

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290295300

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305310315320

ileproleuleuvalvalileleuphealavalaspthrglyleuphe

325330335

ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

340345350

arglysglypheargleuleuasnprohisprolysproasnprolys

355360365

asnasnargproargargserproalaglngluaspglylysvaltyr

370375380

ileasnmetproglyargglyglyserglyserglyserglyserser

385390395400

glyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrphe

405410415

prolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleuglu

420425430

aspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophelys

435440445

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450455460

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