技術(shù)背景

本發(fā)明的主題涉及附著于基質(zhì)的貼壁細(xì)胞的凍存及后續(xù)解凍的方法。還揭示了鑒定一種或多種胞外基質(zhì)(ecm)組分和/或基質(zhì)細(xì)胞蛋白的方法，所述胞外基質(zhì)組分和/或基質(zhì)細(xì)胞蛋白提高細(xì)胞在從凍存狀態(tài)解凍期間及之后的活力和滯留。

減少在研究中使用動(dòng)物數(shù)量的持續(xù)需求驅(qū)動(dòng)著基于細(xì)胞和基于組織的體外分析的發(fā)展，并提供關(guān)于各種化學(xué)制品、化合物和制劑的準(zhǔn)確毒性數(shù)據(jù)。在2009年，歐盟禁止了使用動(dòng)物來測(cè)試化妝品成分。這之后可能會(huì)禁止使用動(dòng)物來測(cè)試其他類型化合物(包括藥物和家用化學(xué)制品)的毒性。

對(duì)于該需求，已采用通過將細(xì)胞和組織的溫度降至水的冰點(diǎn)以下進(jìn)行的細(xì)胞和組織的凍存來保護(hù)和保存生物系統(tǒng)。細(xì)胞的凍存通常在懸浮形式中進(jìn)行，并且對(duì)于細(xì)胞在固定基質(zhì)上的凍存的研究極少。因此，開發(fā)用于細(xì)胞懸液的常用的凍存方案也通常應(yīng)用于固定基質(zhì)上的貼壁細(xì)胞，這常常導(dǎo)致凍存后細(xì)胞脫離和膜的破壞。只能通過使用合適的冷凍保護(hù)劑來使細(xì)胞在凍存處理中的凍融的嚴(yán)苛條件下存活。因此，冷凍生物學(xué)中的大多數(shù)研究著眼于尋找并測(cè)試新型冷凍保護(hù)劑。

然而，在凍融的嚴(yán)苛條件之后，對(duì)于ecm(天然或合成)的細(xì)胞貼附的滯留對(duì)于保存天然和工程改造的組織以及其它應(yīng)用的如體外毒理學(xué)測(cè)試而言是至關(guān)重要的。貼壁機(jī)制的破壞不可避免地具有嚴(yán)重的后果；甚至對(duì)于貼壁機(jī)制的可逆作用也可能是災(zāi)難性的，因?yàn)榕c基礎(chǔ)性的ecm的空間分離足以阻止再附著。

因此，需要用于貼壁細(xì)胞的改善的凍存方案。具體地說，希望在將附著于基質(zhì)的細(xì)胞從凍存狀態(tài)升溫后，獲得改善的細(xì)胞貼附和活力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文公開了一種用于附著于基質(zhì)的貼壁細(xì)胞的凍存方法，所述方法提高凍存細(xì)胞的細(xì)胞活力和滯留(retention)。所述方法包括：用至少一種ecm組分處理基質(zhì)和/或向所述基質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基添加至少一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白，將細(xì)胞鋪板于經(jīng)處理的基質(zhì)上；和通過使細(xì)胞降溫至凍存溫度來在經(jīng)處理的基質(zhì)上凍存所述細(xì)胞。

還公開了鑒定一種或多種ecm組分和/或基質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法，所述ecm組分和/或基質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)提高基質(zhì)上的細(xì)胞在從凍存狀態(tài)解凍后的活力和滯留。所述方法包括：選擇特定細(xì)胞類型的細(xì)胞；用一種或多種不同的ecm組分處理基質(zhì)和/或向所述基質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基添加一種或多種基質(zhì)細(xì)胞蛋白；將所述特定細(xì)胞類型的細(xì)胞鋪板于經(jīng)處理的基質(zhì)上；通過使細(xì)胞降溫至凍存溫度，在經(jīng)各種處理的基質(zhì)上凍存所述細(xì)胞；通過如下方式解凍所述細(xì)胞：將含有所述細(xì)胞的經(jīng)處理的基質(zhì)暴露于第一環(huán)境，所述第一環(huán)境具有高于所述凍存溫度的第一升溫溫度，使細(xì)胞從凍存溫度經(jīng)歷第一次升溫，然后，通過使所述細(xì)胞暴露于第二環(huán)境，所述第二環(huán)境具有高于第一升溫溫度的第二升溫溫度，使所述細(xì)胞從第一升溫溫度進(jìn)一步升溫；評(píng)估解凍的細(xì)胞以確定細(xì)胞活力和滯留；和，鑒定一種或多種ecm組分和/或至少一種基質(zhì)細(xì)胞組分，所述ecm組分和/或基質(zhì)細(xì)胞組分能提高特定細(xì)胞類型的細(xì)胞在從凍存狀態(tài)解凍后的活力和滯留。

附圖說明

附圖1a和1b的柱狀圖說明在以各種降溫速率進(jìn)行凍存后，ecm或組織培養(yǎng)物處理的塑料(tcp)上的貼壁牛角膜內(nèi)皮(bce)細(xì)胞的(a)細(xì)胞活力和(b)dna含量(％)(即細(xì)胞滯留)。

附圖2a-2d的柱狀圖說明在采用(a)單一和成對(duì)的ecm組分、(b)三種ecm組分的組、(c)四種ecm組分的組、和(d)五種ecm組分的組進(jìn)行凍存后，貼壁bce細(xì)胞的細(xì)胞活力。

附圖3a-3d的柱狀圖說明在采用(a)單一和成對(duì)的ecm組分、(b)三種ecm組分的組、(c)四種ecm組分的組，和(d)五種ecm組分的組進(jìn)行凍存后，貼壁bce細(xì)胞的dna含量(％)(即細(xì)胞滯留)。

附圖4a-4d的柱狀圖說明在采用(a)單一和成對(duì)的ecm組分、(b)三種ecm組分的組、(c)四種ecm組分的組、和(d)五種ecm組分的組進(jìn)行凍存后，貼壁人間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)的細(xì)胞活力。

附圖5a和5b的柱狀圖說明在通過單一快速解凍步驟或兩步法解凍方案進(jìn)行凍存和解凍后，各種基質(zhì)上的貼壁hmsc的(a)細(xì)胞活力和(b)dna含量(％)(即細(xì)胞滯留)。

附圖6的柱狀圖說明在明膠上或ecm與層粘連蛋白、膠原i、膠原iii和膠原v的組合上，采用或不采用基質(zhì)細(xì)胞蛋白生腱蛋白x，進(jìn)行凍存之后，貼壁hmsc的細(xì)胞活力。

具體實(shí)施方式

本文所使用的與數(shù)量相關(guān)使用的修飾語“約”包括所述的值，并且具有上下文描述的含意。例如，它至少包括與該具體數(shù)值的測(cè)量相關(guān)聯(lián)的誤差度。在使用范圍的情況下，修飾語“約”也應(yīng)該被認(rèn)為是公開了由兩個(gè)端點(diǎn)的絕對(duì)值定義的范圍。例如，“約2-約4”的范圍也公開了“2-4”的范圍。

除非在本文中另有明確說明，述及溫度(℃)時(shí)，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-4％。

除非在本文另有明確說明，述及細(xì)胞活力和細(xì)胞滯留或附著力(％)時(shí)，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-3％。

除非在本文另有明確說明，述及濃度(μg/ml)時(shí)，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-4％。

除非在本文另有明確說明，述及摩爾濃度(m)時(shí)，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-2％。

除非在本文另有明確說明，述及降溫速率(℃/分鐘)時(shí)，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-3％。

如本文所用，術(shù)語“室溫”是指標(biāo)準(zhǔn)壓強(qiáng)下約為18℃到25℃的溫度。在不同的實(shí)施例中，室溫可能約為18℃、約為19℃、約為20℃、約為21℃、約為22℃、約為23℃、約為24℃，或約為25℃。

本方法涉及固定在基質(zhì)上的貼壁細(xì)胞的凍存(即通過冷凍保存)以及所述細(xì)胞的后續(xù)解凍，即從凍存溫度升溫，以用于各種應(yīng)用，如體外毒理學(xué)測(cè)試。例如，術(shù)語“冷凍”是指低于水的冰點(diǎn)的溫度，即低于0℃。凍存通常包括將細(xì)胞冷凍至遠(yuǎn)低于冰點(diǎn)的溫度，例如至-80℃或更低，更通常是至-130℃或更低?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域從業(yè)人員已知的任何凍存方法，沒有限制。凍存溫度可低于-20℃，例如-80℃或更低，或者-130℃或更低。凍存溫度可約為-20℃至-200℃，約為-30℃至-175℃，約為-50℃至-160℃，約為-65℃至-150℃，約為-75℃至-135℃，約為-80℃至-130℃，約為-90℃至-125℃，或約為-100℃至-115℃。參見例如，armitage等，“降溫速率對(duì)冷凍細(xì)胞存活的影響在單層與懸液中不同”("theinfluenceofcoolingrateonsurvivaloffrozencellsdiffersinmonolayersandsuspensions")，cryo-letters17:213-218(1996)。

本方法經(jīng)設(shè)計(jì)以使細(xì)胞能在再升溫后立即使用，這消除了對(duì)細(xì)胞鋪板、擴(kuò)增及再鋪板的需要。為此，已經(jīng)開發(fā)了用于將凍存的貼壁細(xì)胞從凍存溫度升溫的兩階段升溫方案。參見例如，campbell等，美國(guó)專利號(hào)6,596,531("campbell'531")，其通過引用全文納入本文，并顯示了貼壁細(xì)胞可在多孔板中以貼壁分化細(xì)胞單層的形式凍存。

本方法針對(duì)附著于基質(zhì)的貼壁細(xì)胞(例如bce細(xì)胞和hmsc)的凍存。參見例如，ji等，“貼壁人胚胎干細(xì)胞的凍存”("cryopreservationofadherenthumanembryonicstemcells")，biotechnologyandbioengineering88(3):299-312(2004)；katkov等，“完全解離的貼壁人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的無dmso編程的的凍存”("dmso-freeprogrammedcryopreservationoffullydissociatedandadherenthumaninducedpluripotentstemcells")，stemcellsinternational2011,2011:981606.doi:10.4061/2011/981606，于2011年1月1日電子公開；以及xu等，“在凍存期間，滲透和冷激擊對(duì)貼壁人間充質(zhì)干細(xì)胞的影響”("effectsofosmoticandcoldshockonadherenthumanmesenchymalstemcellsduringcryopreservation")，j.biotech.162(2-3):224-231(2012)。

可使用任何合適的基質(zhì)，沒有限制。例如，可使細(xì)胞附著于組成具有多個(gè)孔的微滴定板(即多孔板)的表面的組織培養(yǎng)塑料(tcp)、膠原凝膠、天然基質(zhì)，或合成材料。對(duì)于基質(zhì)的細(xì)胞附著是本領(lǐng)域已知的。參見例如，campbell等，“用于凍存細(xì)胞的無血清溶液”("serumfreesolutionsforthecryopreservationofcells")，invitrocelldev.biol.,43:269-275(2007)；campbell等，“豬主動(dòng)脈瓣膜小葉衍生肌成纖維細(xì)胞的凍存”("cryopreservationofporcineaorticheartvalveleaflet-derivedmyofibroblasts")，biopreservationandbiobanking，8(4):211-217(2010)；campbell等，“凍存后用海藻糖培養(yǎng)產(chǎn)生活性內(nèi)皮細(xì)胞”("culturingwithtrehaloseproducesviableendothelialcellsaftercryopreservation")，cryobiology，64(3):240-244(2012)；hornung等，“固定于結(jié)構(gòu)化玻璃和硅基質(zhì)上的錨定依賴性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凍存”("cryopreservationofanchorage-dependentmammaliancellsfixedtostructuredglassandsiliconsubstrates")，cryobiology，33:260-70(1996)；mcgann等，“凍存期間細(xì)胞與細(xì)胞間和細(xì)胞與表面間的相互作用反應(yīng)”("cell-to-cellandcell-to-surfaceinteractionsaffectresponsesduringcryopreservation")，transfusion，33(7):611(1993)；ohno，“一種原位冷凍錨定依賴性細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法”("asimplemethodforinsitufreezingofanchorage-dependentcells")，刊于:adoyle，jbgriffiths，dgnewell(編)，《細(xì)胞和組織培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)步驟》(cellandtissueculture:laboratoryprocedures)，奇切斯特：約翰威力父子公司(johnwileyandsons)(1994)；pasch等，“懸液和單層角質(zhì)形成細(xì)胞的凍存中hes濃度的變化”("variationofthehesconcentrationforthecryopreservationofkeratinocytesinsuspensionsandinmonolayers")，cryobiology，41(2):89-96(2000)；以及pasch等，“單層角質(zhì)形成細(xì)胞的凍存”("cryopreservationofkeratinocytesinamonolayer")，cryobiology，39(2):158-168(1999)，上述每篇文獻(xiàn)均通過引用全文納入本文，并顯示貼壁細(xì)胞的成功活力和對(duì)于tcp的細(xì)胞附著。

本發(fā)明的方法涉及通過采用ecm或一種或多種ecm組分處理基質(zhì)來促進(jìn)和提高細(xì)胞在凍存期間的活力和附著力。ecm是為組織提供結(jié)構(gòu)框架的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的小生境，也密切涉及細(xì)胞加工，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化、增殖、附著、極性及存活。參見例如，frantz等，“胞外基質(zhì)概況”("theextracellularmatrixataglance")，j.cellsci.，123:4196-4200(2010)，該文獻(xiàn)揭示了ecm在細(xì)胞的最終細(xì)胞健康中起到重要作用。

例如，短語“改善的細(xì)胞活力”或“改善的活力”是指細(xì)胞活力(％)至少為60％，例如80％或更高。改善的細(xì)胞活力(％)可以是65％或更高、67％或更高、70％或更高、73％或更高、75％或更高、77％或更高、80％或更高、83％或更高、85％或更高、87％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高，或99％或更高。同樣地，術(shù)語“細(xì)胞滯留”，“滯留”，“細(xì)胞附著”或“附著”是指，例如，dna含量的測(cè)量，其可用作細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)。短語“改善的細(xì)胞滯留”、“改善的滯留”、“改善的細(xì)胞附著”或“改善的附著”是指，例如，至少為80％、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、87％或更多、89％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多，或99％或更多的dna的含量(％)。參見例如，malpique等，“貼壁細(xì)胞的凍存：提高解凍后細(xì)胞活力和功能的策略”("cryopreservationofadherentcells:strategiestoimprovecellviabilityandfunctionafterthawing")，tissueengineeringpartcmethods，15(3):373-386(2009)。

如附圖1說明，對(duì)于ecm而不是tcp的細(xì)胞的附著，提高了凍存期間和之后的細(xì)胞活力和滯留。完全形成和組織的ecm的存在提供了更近似于細(xì)胞的天然環(huán)境的表面。因此，細(xì)胞附著可能較少地受凍存過程影響。此外，ecm組合物可能影響細(xì)胞在凍存期間維持附著的能力。而且，通過采用ecm來凍存細(xì)胞，細(xì)胞所處的構(gòu)造可能更有利于其整體健康并且可能改善其應(yīng)對(duì)冷凍溫度的耐受力和恢復(fù)力。

一些實(shí)施方式涉及貼壁細(xì)胞在完全形成的ecm上的凍存。其他實(shí)施方式涉及采用某些ecm組分的貼壁細(xì)胞的凍存，以促進(jìn)凍存期間細(xì)胞的附著，并且在細(xì)胞從凍存狀態(tài)重新升溫后在使用前為其提供更天然的環(huán)境。用ecm組分處理基質(zhì)可涉及將ecm組分被覆于細(xì)胞基質(zhì)上。

所述ecm組分可包括本領(lǐng)域已知的任何ecm組分。例如，本領(lǐng)域已知，細(xì)胞對(duì)ecm基質(zhì)的附著是通過接合復(fù)合物(粘著斑)介導(dǎo)的。這些接合復(fù)合物包括特異性粘附受體，其中許多屬于稱為整聯(lián)蛋白的同源基質(zhì)受體的大型超家族，其大部分識(shí)別它們結(jié)合的胞外蛋白中的arg-gly-asp(rgd)三肽序列。一些細(xì)胞在與膠原的結(jié)合中利用其他明顯無關(guān)的跨膜糖蛋白，并且許多細(xì)胞具有將細(xì)胞直接連接到ecm的完整的膜蛋白聚糖。參見例如，rixen等，“在體外i型和iv型膠原上，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的附著與擴(kuò)散：研究?jī)?nèi)皮修復(fù)機(jī)制的模型”("adhesionandspreadingofcornealendothelialcellsoncollagentypeiandivinvitro:amodeltostudymechanismsofendothelialrepair")，res.exp.med.，190:203-211(1990)。

在培養(yǎng)條件下，各種細(xì)胞類型，例如牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)于組織培養(yǎng)聚苯乙烯的最初附著，可能取決于細(xì)胞-粘附糖蛋白，例如纖連蛋白和/或玻連蛋白，對(duì)培養(yǎng)表面的吸附。參見例如，underwood等，“細(xì)胞-粘附蛋白玻連蛋白和纖連蛋白的生物活性的比較”("acomparisonofthebiologicalactivitiesofthecell-adhesiveproteinsvitronectinandfibronectin")，j.cell.sci.，93(pt.4):641-649(1989)。在細(xì)胞接種之前，所述細(xì)胞-粘附蛋白可以純化形式預(yù)被覆在聚合物上；它們也可以從用于補(bǔ)充培養(yǎng)基的血清吸附到培養(yǎng)表面上；或者，它們可由細(xì)胞合成并沉積到塑料表面上。

已經(jīng)報(bào)道內(nèi)源性蛋白質(zhì)至少部分地有助于在沒有血清來源的蛋白質(zhì)(例如纖連蛋白和玻連蛋白)的情況下將細(xì)胞附著于合成的基質(zhì)上?？梢允褂萌魏涡妈b定的或眾所周知的內(nèi)源性蛋白質(zhì)和細(xì)胞粘附蛋白。參見例如，gordon等，“損傷期間細(xì)胞骨架的作用-誘導(dǎo)的角膜內(nèi)皮的細(xì)胞遷移”("roleofthecytoskeletonduringinjury-inducedcellmigrationincornealendothelium")，cellmotil.&cytoskeleton，6:47-57(1990)。蛋白聚糖介導(dǎo)的相互作用可促進(jìn)附著細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白絲的組織。肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)作用涉及肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的作用，其調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度和締合，并且取決于球狀和絲狀肌動(dòng)蛋白之間的平衡。這受到溫度、ph、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑的存在的影響，所有這些都是凍存中的因素。因此，在本方法中，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)可用作ecm蛋白。

bce細(xì)胞生產(chǎn)許多ecm蛋白，以建立成熟的基質(zhì)，包括纖連蛋白、層粘連蛋白和i型、iii型、iv型和v型膠原。纖連蛋白和層粘連蛋白由分離的細(xì)胞和單層中的細(xì)胞差異表達(dá)。類似地，不同的膠原類型也不以與優(yōu)勢(shì)膠原iii等同的方式表達(dá)。參見例如，gospodarowicz等，“在培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定和定位纖連蛋白：細(xì)胞表面極性和生理意義”("theidentificationandlocalizationoffibronectininculturedcornealendothelialcells:cellsurfacepolarityandphysiologicalimplications")，exp.eyeres.，29:485-509(1979)；gospodarowicz等，“在培養(yǎng)的血管和角膜內(nèi)皮細(xì)胞中生產(chǎn)和定位層粘連蛋白”("theproductionandlocalizationoflaminininculturedvascularandcornealendothelialcells"，j.cellphysiol.，107:171-183(1981)；及scheffer等，“由培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞合成的膠原的特征”("characterizationofcollagenssynthesizedbyculturedbovinecornealendothelialcells")，j.biol.chem.，256(7):3361-3365(1981)。例如，層粘連蛋白，在單層形成前大量產(chǎn)生，隨后蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降，并且可能不利于凍存期間的粘附，如纖連蛋白，其生成不隨細(xì)胞密度而變化。此外，可證明多種組分的組合是維持附著和活力的更好的基質(zhì)。例如，已顯示纖連蛋白有利于牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞附著于基質(zhì)中的膠原。參見例如，scott等，“牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)膠原和其他亞內(nèi)皮組分的附著的研究”("investigationoftheattachmentofbovinecornealendothelialcellstocollagensandothercomponentsofthesubendothelium")，exp.cellres.，144:472-478(1983)。

hmsc也生產(chǎn)ecm蛋白，包括纖連蛋白、層粘連蛋白以及i型、iii型、iv型和v型膠原，并且可受到它們所在的ecm小生境的大幅影響。ecm組合物影響間充質(zhì)干細(xì)胞如何并且向什么譜系分化，當(dāng)開發(fā)用于將在板上凍存的干細(xì)胞的ecm覆層時(shí)，需要考慮該方面。參見例如，singh等，“纖連蛋白和干細(xì)胞分化——來自軟骨形成的研究結(jié)果”("fibronectinandstemcelldifferentiation-lessonsfromchondrogenesis")，j.cellsci.，125:3703-3712(2012)。

基質(zhì)可用ecm組分處理，所述ecm組分包括：纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v中一種或多種?；|(zhì)可用濃度約為0.5－25μg/ml，例如約1－15μg/ml，或約1－10μg/ml的ecm組分處理?；|(zhì)可用ecm組分處理，所述ecm組分的濃度為約0.75－20μg/ml、約2－20μg/ml、約2－15μg/ml、約5－10μg/ml、約5－12μg/ml、約5－15μg/ml、約5－18μg/ml、約5－20μg/ml、約5－22μg/ml、約7－20μg/ml、約7－15μg/ml、約7－10μg/ml、約10－25μg/ml、約10－20μg/ml、約10－15μg/ml、約15－25μg/ml，或約15－20μg/ml。

當(dāng)凍存的細(xì)胞是牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，基質(zhì)可用ecm組分處理，所述ecm組分可包括：纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v中的一種、兩種、三種、四種、五種或六種。ecm組分的示例性組合包括：纖連蛋白、膠原i和膠原v；纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i和膠原iv；纖連蛋白、膠原iii、膠原iv和膠原v；或者膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v。

當(dāng)凍存的細(xì)胞是人間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，ecm組分可以是包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v的一種或多種蛋白質(zhì)。ecm組分的示例性組合可包括：纖連蛋白、膠原iv和/或膠原v；纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i和膠原v；膠原iv和膠原v；纖連蛋白、層粘連蛋白和膠原v；層粘連蛋白、膠原iv和膠原v；膠原iii、膠原iv和膠原v；以及層粘連蛋白、膠原iii和膠原v。

除了ecm組分外，可將基質(zhì)細(xì)胞蛋白添加至基質(zhì)，或可將它們添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。近年來，已揭示基質(zhì)細(xì)胞蛋白的功能和重要性。雖然這些蛋白質(zhì)存在于ecm中，它們?cè)诰S持基質(zhì)的結(jié)構(gòu)方面不起重要作用。相反，它們參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)?；|(zhì)細(xì)胞蛋白通過與細(xì)胞表面受體、激素和其它效應(yīng)分子(包括ecm)相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。它們分泌并存在于胞外環(huán)境中，但不像常規(guī)的ecm蛋白一樣起到結(jié)構(gòu)性作用。雖然在發(fā)育過程中更為顯著，但它們?nèi)匀淮嬖谟诔扇酥?，特別是在受傷部位。它們發(fā)揮各種各樣的功能，這由它們所在的環(huán)境決定。在本方法中，可以使用任何已知的基質(zhì)細(xì)胞蛋白或未來發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)細(xì)胞蛋白。參見例如，bornstein等，“基質(zhì)細(xì)胞蛋白：細(xì)胞功能的胞外調(diào)節(jié)劑”("matricellularproteins:extracellularmodulatorsofcellfunction")，curr.opin.cellbiol.，14:608-616(2002)；bornstein等，“基質(zhì)細(xì)胞蛋白：概述”("matricellularproteins:anoverview")，j.cellcommun.signal.，3:163-165(2009)；frangogiannis，“心臟適應(yīng)和疾病中的基質(zhì)細(xì)胞蛋白”("matricellularproteinsincardiacadaptationanddisease")，physiol.rev.，92:635-688(2012)；morris等，“基質(zhì)細(xì)胞蛋白和生物材料”("matricellularproteinsandbiomaterials")，matrixbiol.mar.，pii:s0945-053x(14)00051-1.doi:10.1016/j.matbio.2014.03.002(2014)；roberts，“基質(zhì)細(xì)胞蛋白的新興功能”("emergingfunctionsofmatricellularproteins")，cellmol.lifesci.，68(19):3133-3136(2011)；wong等，“基質(zhì)細(xì)胞蛋白：?jiǎn)?dòng)癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境”("matricellularproteins:primingthetumourmicroenvironmentforcancerdevelopmentandmetastasis")，brit.j.cancer，108:755-761(2013)。迄今為止的大多數(shù)研究已經(jīng)用敲除小鼠研究了基質(zhì)細(xì)胞蛋白的各種功能，而幾乎沒有體外評(píng)估這些蛋白的研究。

基質(zhì)細(xì)胞蛋白影響細(xì)胞行為的能力可被利用以促進(jìn)細(xì)胞在體外系統(tǒng)的活力和附著力。同樣，基質(zhì)可用一種或多種基質(zhì)細(xì)胞蛋白，單獨(dú)或與ecm組分組合，來處理。也即，所述方法也可包括向細(xì)胞基質(zhì)或培養(yǎng)基添加基質(zhì)細(xì)胞蛋白。合適的基質(zhì)細(xì)胞蛋白包括血小板反應(yīng)蛋白-1、生腱蛋白-c，生腱蛋白-x，sparc(分泌型蛋白，酸性且富含半胱氨酸)、骨膜素(periostin)、ccn-1，以及骨橋蛋白。

可使用濃度約為0－5μg/ml的基質(zhì)細(xì)胞蛋白?；|(zhì)細(xì)胞蛋白可以如下濃度使用：約0.25－5μg/ml、約0.5－5μg/ml、約0.75－5μg/ml、約1－5μg/ml、約2－5μg/ml、約3－5μg/ml、約4－5μg/ml、約0－4μg/ml、約0－3μg/ml、約0－2μg/ml、約0－1μg/ml、約0.5－4μg/ml、約0.5－3μg/ml、約1－4μg/ml、約1－3μg/ml，或約1－2μg/ml。

通過將細(xì)胞與二糖，如海藻糖，孵育，可在凍存前進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞(campbell等，在保存前用糖處理細(xì)胞材料的方法(methodfortreatmentofcellularmaterialswithsugarspriortopreservation)，見于2007年9月18日出版的美國(guó)專利7,270,946)

通過在將細(xì)胞在冷凍至凍存溫度前使其與凍存組合物接觸，可在凍存期間進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞與凍存組合物接觸是指使細(xì)胞以某種方式與凍存組合物接觸，從而在降溫至凍存溫度期間，細(xì)胞被凍存組合物保護(hù)。例如，可通過填充待保護(hù)的細(xì)胞的附著的板中合適的孔來使細(xì)胞與凍存組合物接觸。

也可使待凍存的細(xì)胞與冷凍相容的ph緩沖液接觸，所述ph緩沖液通常至少主要包含：堿性鹽溶液、能量源(例如葡萄糖)，以及能夠在降溫溫度下保持中性ph的緩沖劑。眾所周知的這樣的材料包括，例如杜爾貝科改良的伊格培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)(dmem)。該材料也可作為凍存組合物的一部分。參見例如，campbell等，“貼壁平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞與二糖一起凍存”("cryopreservationofadherentsmoothmuscleandendothelialcellswithdisaccharides")，刊于:katkovi.(編)，《凍存前沿》(currentfrontiersincryopreservation)，克羅地亞:科技公司(intech)(2012)；以及campbell等，“胰腺儲(chǔ)存解決方案的發(fā)展：供于低溫儲(chǔ)存后β細(xì)胞存活和代謝狀態(tài)的細(xì)胞保護(hù)補(bǔ)充劑的初步篩選”("developmentofpancreasstoragesolutions:initialscreeningofcytoprotectivesupplementsforβ-cellsurvivalandmetabolicstatusafterhypothermicstorage")，biopreservationandbiobanking，11(1):12-18(2013)。

凍存組合物可能包含本領(lǐng)域已知的任何冷凍保護(hù)性物質(zhì)。已知的冷凍保護(hù)劑化合物包括乙酰胺、瓊脂糖、藻酸鹽、l-苯胺、白蛋白、醋酸銨、丁二醇、硫酸軟骨素、氯仿、膽堿、右旋糖、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜(dmso)、赤藻糖醇、乙醇、乙二醇、甲酰胺、葡萄糖、甘油、α-甘油磷酸酯、甘油單乙酸酯、甘氨酸、羥乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化鎂、硫酸鎂、麥芽糖、甘露糖醇、甘露糖、甲醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、苯酚、普朗尼克(pluronic)多元醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇、吡啶n-氧化物、核糖、絲氨酸、溴化鈉、氯化鈉、碘化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉、山梨醇、蔗糖、海藻糖、三甘醇、三甲胺醋酸鹽、尿素、纈氨酸、木糖等。

冷凍保護(hù)劑化合物可存在于凍存組合物中，例如其含量是約0.05m－6m、約0.1－3m、約0.25－6m、約1－6m、約2－6m、約3－6m、約4－6m、約5－6m、約0.25－1m、約0.25－2m、約0.25－3m、約0.25－4m、約0.25－5m、約1－4m、約1－3m、約1－2m、約3－5m、約2－4m、約0.5－6m、約0.5－5m、約0.5－4m、約0.5－3m、約0.5－2m，或約0.5－1m。

冷凍保護(hù)劑組合物可能包含至少一種環(huán)己烷二醇(chd)化合物，例如順式或反式的1,3-環(huán)己烷二醇(1,3chd)或1,4－環(huán)己烷二醇(1,4chd)，或其外消旋混合物，作為冷凍保護(hù)劑化合物。

chd化合物可在凍存組合物中存在，例如其含量是約0.05－2m、約0.1－1m、約0.1－2m、約0.1－1m、約0.1－1.5m、約0.1－0.5m、約0.1－0.25m、約1－2m、約1.5－2m、約0.75－2m、約0.75－1.5m、約0.75－1m、約0.05－1m、約0.05－0.75m、約0.05－0.5m，或約0.05－0.1m。凍存組合物也可包含良好適用于細(xì)胞、組織和器官的儲(chǔ)存的溶液。溶液可包括上文討論過的緩沖液。例如，溶液可以是eurocollins溶液，所述溶液由右旋糖、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉以及氯化鉀組成。參見例如，taylor等，“作為冷凍保護(hù)劑的運(yùn)載體溶液的unisol和euro-collins溶液的比較”("comparisonofunisolwitheuro-collinssolutionasavehiclesolutionforcryoprotectants")，transplantationproceedings，33:677-679(2001)。

凍存組合物可同時(shí)包含至少一種chd化合物和至少一種額外的冷凍保護(hù)劑化合物。

另外，凍存組合物也可包含抗冷凍蛋白質(zhì)/多肽(afp)或抗冷凍糖脂(afgl)。afp也包括抗冷凍糖蛋白(afgp)和昆蟲抗冷凍或“熱滯(thermalhysteresis)”蛋白(thp)。最近發(fā)現(xiàn)的afgl已在昆蟲和植物中觀察到。據(jù)信，天然產(chǎn)生的afp能夠結(jié)合于正在發(fā)展的冰晶體的棱柱面，從而改變它的形成。由于魚和昆蟲產(chǎn)生這些蛋白，這意味著它們冰點(diǎn)的下降，所以它們能夠在一般應(yīng)會(huì)導(dǎo)致它們的體液被凍住的條件下存活。就此而言，本方法可使用任何新發(fā)現(xiàn)的或眾所周知的afp。參見例如，sicheri和yang，nature，375:427-431,(1995)，描述八種這樣的蛋白；devries，“抗冷凍糖肽和多肽：與冰和水的相互作用”("antifreezeandicenucleatorproteinsinterrestrialarthropods")，meth.enzymol.，127:293-303(1986)；duman，“陸地節(jié)肢動(dòng)物的抗冰凍和冰核蛋白”("antifreezeandicenucleatorproteinsinterrestrialarthropods")，annualrev.physiol.，63:327-3257(2001)；holmstrup等，“在北極跳蟲onychiurusarcticus中的脫水和抗旱”("dehydrationandcoldhardinessinthearcticcollembolanonychiurusarcticus")，j.comp.physiol.b，168:197-203(1998)；kuiper等，“通過吸附冰來純化抗冷凍蛋白”("purificationofantifreezeproteinsbyadsorptiontoice")，biochem.biophys.res.commun.，300(3):64-68(2003)；miller等，“一些成年的和未成熟的昆蟲在內(nèi)陸阿拉斯加越冬的抗寒策略”("cold-hardinessstrategiesofsomeadultandimmatureinsectsoverwinteringininterioralaska")，comp.biochem.physiol.，73a:595-604(1982)；neven等，“昆蟲血淋巴脂蛋白冰核劑的純化和特征：磷脂酰肌醇和載脂蛋白在冰核活動(dòng)中的重要性的證據(jù)”("purificationandcharacterizationofaninsecthemolymphlipoproteinicenucleator:evidencefortheimportanceofphosphatidylinositolandapolipoproteinintheicenucleatoractivity")，j.comp.physiol.b，159:71-82(1989)；sformo等，“阿拉斯加樹皮甲蟲的幼蟲中的深度過冷，玻璃化和-100℃的極限生存”("deepsupercooling,vitrificationandlimitedsurvivalto-100℃inthealaskanbeetlecucujusclavipespuniceuslarvae")，j.exp.biol.，213(3):502-509(2010)；storey等，“動(dòng)物的耐寒性”("freezetoleranceinanimals")，physiol.rev.，68:27-84(1988)；storey等，“昆蟲中抗寒的生化適應(yīng)”("biochemicaladaptationforcoldhardinessininsects")，phil.trans.r.soc.lond.，b326:635-54(1990)；walters等，“北極阿拉斯加石蠅(nemouraarctica)的耐寒性”("freezetoleranceinthearcticalaskastonefly,nemouraarctica")，j.exp.biol.，212:305-12(2009a)；walters等，“在耐寒的阿拉斯加甲蟲(upisceramboides)中冷凍保護(hù)劑的生物合成以及蘇糖醇的選擇性積累”("cryoprotectantbiosynthesisandtheselectiveaccumulationofthreitolinthefreezetolerantalaskanbeetle,upisceramboides")，j.biol.chem.，284:16822-16831(2009b)；walters等，“在耐寒的阿拉斯加甲蟲(upisceramboides)中的非蛋白的產(chǎn)生熱滯后的木甘聚糖防凍劑”("anon-proteinthermalhysteresis-producingxylomannanantifreezeinthefreeze-tolerantalaskanbeetle,upisceramboides")，proc.natl.acad.sci.，106,20210-20215(2009c)；walters等，“在不同的分類中發(fā)現(xiàn)與耐寒相關(guān)的產(chǎn)生熱滯后的木甘聚糖糖脂抗凍劑”("athermalhysteresis-producingxylomannanglycolipidantifreezeassociatedwithcoldtoleranceisfoundindiversetaxa")，j.comp.physiol.b.，181(5):631-40(2011)；wang等，“加拿大擬步甲蟲的抗凍蛋白增強(qiáng)彼此的活性”("antifreezeproteinsofthebeetledendroidescanadensisenhanceoneanother'sactivities")，biochemistry，44:10305-10312(2005)；worland等，“極地陸生節(jié)肢動(dòng)物在零度溫度下的脫水應(yīng)激”("desiccationstressatsubzerotemperaturesinpolarterrestrialarthropods")，j.insect.physiol.，49:193-203(2003)；zachariassen等，“昆蟲抗血清中的成核劑耐寒”("nucleatingagentsinthehaemolymphofinsectstoleranttofreezing")，nature，262:285-87(1976)；以及zachariassen，“昆蟲中耐寒性生理學(xué)”("physiologyofcoldtoleranceininsects")，physiol.rev.，65:799-832(1985)。

示例性afp包括afpi(i型afp)、afpiii(iii型afp)以及/或afgp。凍存組合物中存在的afp含量，例如，對(duì)每一種存在的afp而言，約為組合物的0.001－1mg/ml、約0.05－0.5mg/ml，或約0.1－0.75mg/ml。

一旦細(xì)胞已經(jīng)接觸了凍存組合物，細(xì)胞即可隨后被冷凍用于凍存。用于凍存的降溫可用任何方式進(jìn)行，并且可以使用任何上述以外的物質(zhì)。

例如，用于凍存的降溫(冷凍)方案可以是任何合適的類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知多種類型的降溫方案。降溫方案可包括以連續(xù)速率降溫的方式從冰成核點(diǎn)降至-80℃或任何上述的降溫溫度，降溫速率取決于冷凍的細(xì)胞/組織的特性。例如，降溫速率可以是每分鐘約-0.1℃至約-10℃，或每分鐘約-1℃至約-2℃。降溫速率可以是每分鐘約-0.1℃至-9℃、每分鐘約-0.1℃至-8℃、每分鐘約-0.1℃至-7℃、每分鐘約-0.1℃至-6℃、每分鐘約-0.1℃至-5℃、每分鐘約-0.1℃至-4℃、每分鐘約-0.1℃至-3℃、每分鐘約-0.1℃至-2℃、每分鐘約-0.1℃至-1℃、每分鐘約-0.1℃至-0.5℃、每分鐘約-1℃至-2℃、每分鐘約-1℃至-3℃、每分鐘約-1℃至-4℃、每分鐘約-1℃至-5℃、每分鐘約-1℃至-6℃、每分鐘約-1℃至-7℃、每分鐘約-1℃至-8℃、每分鐘約-1℃至-9℃、每分鐘約-1℃至-10℃、每分鐘約-2℃至-3℃、每分鐘約-2℃至-5℃、每分鐘約-2℃至-7℃、每分鐘約-2℃至-8℃、每分鐘約-2℃至-20℃、每分鐘約-4℃至-10℃、每分鐘約-4℃至-8℃、每分鐘約-4℃至-6℃、每分鐘約-6℃至-10℃、每分鐘約-6℃至-9℃、每分鐘約-6℃至-8℃、每分鐘約-6℃至-7℃、每分鐘約-7℃至-10℃、每分鐘約-7℃至-9℃、每分鐘約-7℃至-8℃、每分鐘約-8℃至-9℃，或每分鐘約-9℃至-10℃。一旦細(xì)胞以該連續(xù)降溫速率方式降溫至約-40℃至-80℃或更低，即可將它們轉(zhuǎn)移到液氮或液氮的汽相中以進(jìn)一步降溫至凍存溫度，凍存溫度通常低于冷凍溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。在進(jìn)一步降溫至凍存溫度前，可使細(xì)胞降溫至約-40℃至-75℃、約-45℃至-70℃、約-50℃至-60℃、約-55℃至-60℃、約-70℃至-80℃、約-75℃至-80℃、約-40℃至-45℃、約-40℃至-50℃、約-40℃至-60℃、約-50℃至-70℃，或約-50℃至-80℃。

升溫方案可包括兩步升溫法。在兩步升溫方案中，可將凍存的細(xì)胞(凍存在凍存溫度)從凍存冰箱中移出。兩步方案的第一步中，使凍存細(xì)胞在第一環(huán)境中經(jīng)歷第一次緩慢的升溫。該環(huán)境不需要經(jīng)受任何特殊的處理或具有任何具體的修飾，并且可以使用任何環(huán)境。該環(huán)境可以是氣體氣氛，例如空氣。為了實(shí)現(xiàn)第一階段的緩慢升溫，可使該環(huán)境處于高于凍存溫度的第一升溫溫度。第一升溫溫度可以接近室溫。例如，可以使用30℃或更低，例如約15℃至30℃、約20℃至25℃，或者約為20℃至30℃的溫度。

兩步升溫步驟中的第二個(gè)步驟包括在第二升溫溫度的第二環(huán)境中快速解凍細(xì)胞，第二升溫溫度高于第一升溫步驟中所使用的升溫溫度。第二升溫溫度可以是32℃或更高、約32℃至50℃、約35℃至45℃、約40℃至50℃、約45℃至50℃、約32℃至40℃、約35℃至40℃，或約37℃。同樣，任何合適的環(huán)境，例如氣體(空氣)、液體或流化床可用作第二環(huán)境。例如，可以使用升溫溫度的水浴來實(shí)現(xiàn)該快速解凍。

附圖5說明兩步升溫策略改善了細(xì)胞活力和附著。ecm蛋白的添加促進(jìn)了細(xì)胞活力和附著，并且有效的ecm組合可取決于細(xì)胞類型。兩步升溫策略可應(yīng)用于像貼壁細(xì)胞一樣在固體基質(zhì)上凍存的所有細(xì)胞類型。

某些ecm組分和/或ecm組分的某些組合可增強(qiáng)一種類型細(xì)胞的活力和滯留，但不能增強(qiáng)另一種類型的細(xì)胞。因此，本發(fā)明主題還涉及鑒定一種或多種ecm組分的方法，所述ecm組分能夠改善細(xì)胞在從凍存狀態(tài)解凍后在基質(zhì)上細(xì)胞活力和滯留。該方法涉及，首先選擇一種特定細(xì)胞類型的細(xì)胞，例如bce細(xì)胞或人間充質(zhì)干細(xì)胞。方法還包括鑒定已知與所選細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)或由所選細(xì)胞類型生成的ecm組分。或者，在缺乏與所選細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)的特定ecm組分的現(xiàn)有知識(shí)的情況下，可篩選已知的ecm組分。然后，可用ecm組分和ecm組分的各種組合處理基質(zhì)，并且將所選細(xì)胞類型的細(xì)胞鋪板于各種經(jīng)處理的基質(zhì)上，然后如上所述，將細(xì)胞在經(jīng)處理的基質(zhì)上凍存并隨后解凍。一旦細(xì)胞已經(jīng)解凍，即可評(píng)估細(xì)胞的活力和滯留，以鑒定何種ecm組分或ecm組分的組合導(dǎo)致為60％或更高，例如80％或更高的細(xì)胞活力(％)，以及所選細(xì)胞類型的至少80％的dna含量(％)?？梢愿鶕?jù)任何已知的方法來評(píng)估細(xì)胞活力和滯留。已知的用于測(cè)量細(xì)胞活力(％)的方法包括活力實(shí)驗(yàn)，例如基于熒光的實(shí)驗(yàn)。已知的測(cè)量dna含量(％)的方法包括用于提供細(xì)胞數(shù)量準(zhǔn)確測(cè)量結(jié)果的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

也可以鑒定與特定細(xì)胞類型的ecm組分協(xié)作最好的冷凍保護(hù)劑，因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑化合物的選擇可影響凍存后的細(xì)胞活力和滯留。例如，甘油和dmso促進(jìn)體外微管的組裝，然而其他冷凍保護(hù)劑，例如丙二醇，而不是dmso，在卵母細(xì)胞中解聚肌動(dòng)蛋白。參見例如，vincent等，“在兔胚胎單細(xì)胞凍存期間冷凍保護(hù)劑對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的影響”("effectsofcryoprotectantsonactinfilamentsduringthecryopreservationofone-cellrabbitembryos")，cryobiology，27:9-23(1990)。在一些細(xì)胞中，dmso導(dǎo)致應(yīng)力纖維的解體以及胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白束的形成。所以，凍存附著于基質(zhì)的細(xì)胞的重要方面是在冷凍和解凍的嚴(yán)苛條件后細(xì)胞保留在基質(zhì)上的能力。

實(shí)施例在下文中列出，并且說明可用于實(shí)施具體實(shí)施方式中的不同方法和條件。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說多種替代方式、改進(jìn)和變化方式是顯而易見的。因此，實(shí)施例僅僅是說明性的而不是限制性的。

實(shí)施例

實(shí)施例1-在ecm對(duì)比tcp上的細(xì)胞凍存的細(xì)胞活力與滯留

分化的細(xì)胞系，bce細(xì)胞(bce細(xì)胞系，atcc#crl-2048)維持在37℃、5％二氧化碳下的杜爾貝科改良的伊格培養(yǎng)基(dmem)中，dmem具有10％胎牛血清(fcs)、1.0mm丙酮酸鈉，以及4mm谷氨酰胺，以及青霉素(100u)/鏈霉素(100μg/ml)。bce細(xì)胞鋪板于組織培養(yǎng)塑料上或天然bce細(xì)胞衍生的ecm上。為了制得ecm，將bce細(xì)胞以接近融合密度(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)鋪板于96孔板中，并在具有10％fcs和82μg/ml抗壞血酸磷酸鎂(購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社(wakochemical))的dmem中置留6天。細(xì)胞培養(yǎng)基中的抗壞血酸促進(jìn)ecm的沉積和形成。6天以后，通過加入水中的25mmnh4oh溶液，之后水洗3次，移出細(xì)胞。參見例如，roemer等，“炎性細(xì)胞介導(dǎo)的間質(zhì)胞外基質(zhì)的損傷的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)”("invitroassaysystemsforinflammatorycell-mediateddamagetointerstitialextracellularmatrix")，invitrotoxicol.，7(2):75-81(1994)。

隨后使鋪板的bce細(xì)胞隨后暴露于2mdmso，并通過如下方式凍存：將板置于冰上并用0.5m甘露醇預(yù)處理細(xì)胞以使細(xì)胞準(zhǔn)備好暴露至預(yù)期在添加冷凍保護(hù)劑(例如2mdmso)時(shí)使用的高滲環(huán)境。在添加終濃度的冷凍保護(hù)劑后，以可控速率使板降溫至-80℃，然后置于-130℃。使用以下可控降溫速率：-0.2℃/分鐘，-1.0℃/分鐘，-10.0℃/分鐘，和修改的-1.0℃/分鐘，該概況(mp)包括在成核步驟中。在至少儲(chǔ)存24小時(shí)之后，根據(jù)campbell'531(同上)中的兩步升溫方案，將板升溫。首先，將板置于-20℃，30分鐘，然后將板置于37℃以快速解凍。一旦板解凍(無可見冰)，就將其置于冰上，并用加有10％fcs的dmem中的0.5m甘露醇反復(fù)洗滌孔。在用加有10％fcs的dmem另外洗滌后，細(xì)胞在37℃于dmem(10％fcs)中放置1小時(shí)，回收，然后評(píng)估細(xì)胞活力和滯留。解凍后，分別使用alamar指示劑和實(shí)驗(yàn)來評(píng)估細(xì)胞的活力和細(xì)胞滯留。

用alamar非侵入性代謝指示劑(購(gòu)自德雷克診斷公司(trekdiagnostics))檢測(cè)細(xì)胞活力。alamar指示劑是測(cè)量細(xì)胞內(nèi)氧化/還原反應(yīng)的熒光染料，因此指示細(xì)胞在暴露于冷凍保護(hù)劑后的整體活力。alamar指示劑可用熒光或吸光度讀取。凍存后，向留在200μl的dmem(10％fcs)中的細(xì)胞添加體積為20μl的alamar指示劑，并將板在37℃孵育3小時(shí)。在熒光酶標(biāo)儀(購(gòu)自分子儀器公司(moleculardevices))上以544nm的激發(fā)波長(zhǎng)和590nm的發(fā)射波長(zhǎng)讀取alamar指示劑的熒光值。數(shù)據(jù)相對(duì)于未處理的對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這些值表示為9-12個(gè)重復(fù)的平均值(+/-sem)。

通過實(shí)驗(yàn)(購(gòu)自分子探針公司(molecularprobes))測(cè)量每個(gè)孔中細(xì)胞的dna含量，來評(píng)估在凍存(即細(xì)胞保留)后，微量滴定板的孔中剩下的細(xì)胞的比例。dna含量用作細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)使用熒光染料來標(biāo)記核酸，然后使用熒光酶標(biāo)儀以485nm的激發(fā)波長(zhǎng)和538nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。rna酶a(購(gòu)自西格瑪公司(sigma))也用于消除個(gè)體細(xì)胞內(nèi)rna的可變量，從而提供對(duì)于dna含量的直接測(cè)量。數(shù)據(jù)相對(duì)于未處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且表示9-12個(gè)重復(fù)的平均值(+/-sem)。

如附圖1中說明的，無關(guān)于所用的降溫速率，將細(xì)胞鋪板于其本身天然的ecm上而不是tcp上時(shí)，細(xì)胞活力顯著提高(p<0.001)。除了-10.0℃/分鐘，對(duì)于所有降溫速率的細(xì)胞滯留，鋪板于ecm上均等同或優(yōu)于鋪板于tcp上的細(xì)胞。然而，在-10.0℃/分鐘的降溫速率下，鋪板于其ecm上的細(xì)胞比鋪板于tcp上的細(xì)胞就細(xì)胞滯留而言有顯著改善(p<0.0001)。附圖1說明相較于較高的降溫速率，較低的降溫速率普遍提供更好的活力和附著(p<0.001)。盡管在所有降溫速率進(jìn)行凍存的過程中，ecm的存在均改善細(xì)胞活力，但是在以較高降溫速率進(jìn)行凍存的過程中，ecm的存在增強(qiáng)了細(xì)胞滯留。在較低的降溫速率下，鋪板于ecm和tcp上細(xì)胞的細(xì)胞滯留是等同的。一種可能的解釋是存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的血清中的ecm蛋白(例如玻連蛋白)，產(chǎn)生基礎(chǔ)的基質(zhì)，由此提供在凍存期間供于細(xì)胞錨著的框架。由于這種可能性，后續(xù)的實(shí)施例(2－4)是在無血清的條件下實(shí)施的。

完全形成和組織的ecm的存在提供更近似于細(xì)胞的天然環(huán)境的表面。因此，細(xì)胞附著可能較少地受凍存步驟影響。此外，ecm組合物可能影響細(xì)胞在凍存期間維持附著的能力。而且，通過ecm來凍存細(xì)胞，細(xì)胞所處的構(gòu)造可能更有利于其整體健康并且可能改善其應(yīng)對(duì)冷凍溫度的耐受力和恢復(fù)力。

實(shí)施例2-用ecm組分的不同組合凍存的bce細(xì)胞的活力和滯留

bce細(xì)胞(bce細(xì)胞系，atcc#crl-2048)保存在37℃、5％二氧化碳下的杜爾貝科改良的伊格培養(yǎng)基(dmem)中，dmem具有10％胎牛血清(fcs)、1.0mm丙酮酸鈉，以及4mm谷氨酰胺，和青霉素(100u)/鏈霉素(100μg/ml)。

確定ecm組分——纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v——的最佳濃度，然后以單一組分或與一種或多種其它組分的組合形式進(jìn)行評(píng)估。ecm蛋白從商業(yè)來源獲得，并且在鋪板細(xì)胞之前，使用濃度約為1－10μg/ml的ecm蛋白處理微量滴定板。在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中，用各種濃度的ecm蛋白處理各孔，并在37℃放置2小時(shí)，然后根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，在37℃用1％牛血清白蛋白(bsa)孵育1小時(shí)，以封閉未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)。參見例如，underwood，“胞外基質(zhì)分子對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞體外性能的影響”("theeffectofextracellularmatrixmoleculesontheinvitrobehaviorofbovineendothelialcells")，exp.cell.res.，205:311-319(1993)?？子脽o血清培養(yǎng)基漂洗，然后置于培養(yǎng)基中，直到接種細(xì)胞。

如實(shí)施例1中所述，凍存細(xì)胞，隨后解凍。如實(shí)施例1中，使用alamar指示劑和實(shí)驗(yàn)來評(píng)估細(xì)胞活力和滯留。用兩種冷凍保護(hù)劑，dmso和1,2-丙二醇(pd)進(jìn)行凍存后細(xì)胞活力和持續(xù)細(xì)胞附著的評(píng)估。以80,000細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞鋪板于用不同ecm組合處理的孔中。附圖2和3中所示結(jié)果獲自以單層形式采用載劑溶液hepes緩沖鹽水(hbsi)(275mmnacl，25mmhepes)中的2.0mdmso凍存的細(xì)胞。使用pd作為冷凍保護(hù)劑，使用不同ecm組合觀察到相似結(jié)果。

如附圖2和3所示，ecm組分的幾種組合表現(xiàn)出極好的活力和附著。細(xì)胞活力和百分比指示細(xì)胞數(shù)量的dna含量是基于與處理的細(xì)胞同時(shí)鋪板的分開的未處理的對(duì)照細(xì)胞計(jì)算的。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析沒有鑒定出任何一種ecm組分組合是最顯著的。相反，認(rèn)為幾組ecm組合顯著優(yōu)于其余組，并且取決于所使用的冷凍保護(hù)劑(p<0.01)。注意到的趨勢(shì)包括，更好的活力和附著隨著更復(fù)雜的ecm組分混合物(4種或更多)出現(xiàn)。附圖2說明了在凍存和后續(xù)的解凍后，ecm蛋白對(duì)顯著提高細(xì)胞活力。對(duì)于活力而言，最佳組合包括纖連蛋白和膠原i，或?qū)τ诟街裕ɡw連蛋白和膠原v，其中層粘連蛋白至少有助于改善bce細(xì)胞的活力和附著。4種ecm組分的幾種組合(f+l+ci+civ、f+ciii+civ+cv，以及ci+ciii+civ+cv)導(dǎo)致近乎100％細(xì)胞在凍存后存活并附著。

附圖3說明，甚至是單一ecm蛋白的存在都能改善細(xì)胞在單獨(dú)的tcp上的附著。對(duì)于所有測(cè)試的ecm組合，包括由bce細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)，細(xì)胞附著>80％。通過用至少一種ecm組分凍存細(xì)胞，觀察到細(xì)胞附著的總體改善。

實(shí)施例3-用ecm組分的不同組合凍存的hmsc的細(xì)胞活力和滯留

將源于人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞維持在37℃、5％二氧化碳下的dmem/f12培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基具有10％fcs、非必需氨基酸，2mmglutamax，以及青霉素(50u)/鏈霉素(50μg/ml)。

初始實(shí)驗(yàn)評(píng)估ecm組分——纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v——以分別確定最佳濃度。然后，使用就個(gè)體蛋白質(zhì)建立的濃度研究蛋白質(zhì)對(duì)?；谟蓚€(gè)體蛋白質(zhì)和不同的蛋白質(zhì)對(duì)獲得的結(jié)果來選擇并研究三種或四種蛋白質(zhì)的進(jìn)一步組合。ecm蛋白從商業(yè)來源獲得，并且在鋪板細(xì)胞之前，使用濃度約為1－10μg/ml的ecm蛋白處理微量滴定板。在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中，用不同濃度的ecm蛋白處理單個(gè)孔，并在37℃放置2小時(shí)，然后在37℃用1％牛血清白蛋白(bsa)孵育1小時(shí)，以封閉未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)?？子脽o血清培養(yǎng)基漂洗，然后留置于培養(yǎng)基中，直到鋪板細(xì)胞。

如實(shí)施例1中所述，凍存細(xì)胞，隨后解凍。解凍后，檢測(cè)并比較附著于tcp或明膠(其常規(guī)用于hmsc的常規(guī)生長(zhǎng)和維持)上的細(xì)胞的活力，以確定哪些ecm組分在凍存期間為細(xì)胞的持續(xù)活力和附著提供最多支持。在這些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞活力百分比是基于凍存前每個(gè)孔中的細(xì)胞的活力來計(jì)算的。如實(shí)施例1中所述，使用alamar指示劑和實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)細(xì)胞活力和滯留。

雖然顯現(xiàn)的是多于一種的ecm蛋白的組合能改善bce細(xì)胞的細(xì)胞活力，但對(duì)于hmsc而言并不一定是這種情況。單個(gè)ecm組分將hmsc的活力改善至與2種或更多ecm組分的組合相似的程度。4種或更多種ecm蛋白的組合對(duì)bce細(xì)胞而言效果最好，但hmsc對(duì)于產(chǎn)生最佳活力的組合有明確的偏好。ecm組分的兩種組合產(chǎn)生大于70％的活力，兩種組合為f+l+ci+cv和civ+cv。另一組組合產(chǎn)生大于60％的活力，并且包括：f+l+cv、l+civ+cv、ciii+civ+cv、f+l+civ+cv、f+ci+civ+cv、f+ciii+civ+cv和l+ci+ciii+cv。有趣的是，通常用于hmsc細(xì)胞培養(yǎng)的明膠沒有促進(jìn)凍存和解凍后的細(xì)胞活力。這說明為特定細(xì)胞類型建立的基質(zhì)處理方法不一定適用于凍存。這也在包括基質(zhì)細(xì)胞蛋白時(shí)觀察到(參見實(shí)施例4)。一般來說，至少一種ecm蛋白的存在能改善凍存后hmsc的活力。那些表現(xiàn)出最佳活力的組合趨于在其混合物中包括纖連蛋白、膠原iv和/或膠原v。

實(shí)施例4-用基質(zhì)細(xì)胞蛋白，生腱蛋白x凍存后hmsc的活力

源于人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞鋪板于明膠或?qū)诱尺B蛋白、膠原i、膠原iii和膠原v的ecm組合上。附圖6所示樣品，在細(xì)胞鋪板時(shí)，包含濃度為500ng/ml的細(xì)胞間質(zhì)蛋白，生腱蛋白x。細(xì)胞凍存在含有2.5％硫酸軟骨素的1mdmso中，隨后解凍，如實(shí)施例1所述。解凍后，測(cè)量細(xì)胞活力，并相對(duì)于未處理的對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。相較于ecm單獨(dú)存在的情況(57％)，生腱蛋白x的添加促進(jìn)細(xì)胞活力的改善(100％)，并且在ecm±生腱蛋白x上的hmsc的整體活力優(yōu)于細(xì)胞在明膠上鋪板時(shí)的情況(p<0.05，附圖1)。有趣的是，與ecm組合相比，生腱蛋白x與明膠一起使用時(shí)沒有顯示出任何改善，可能是因?yàn)槊髂z是膠原的加工形式，而組合中使用的ecm組分都作為天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，為特定細(xì)胞類型培養(yǎng)建立的基質(zhì)處理方法不一定在貼壁細(xì)胞凍存期間起作用。

本文所示分化細(xì)胞系和間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)果說明，ecm組分的添加能改善活力，并維持凍存后細(xì)胞貼附于多孔板的附著。觀察到兩種類型細(xì)胞間的差異，這強(qiáng)調(diào)了ecm可在體外和體內(nèi)細(xì)胞的健康和維持中起關(guān)鍵作用。這對(duì)干細(xì)胞尤為重要，因?yàn)閑cm可影響其分化能力以及它們將分化為何種細(xì)胞譜系。這些結(jié)果也說明ecm的組合物影響所述細(xì)胞及其作為貼壁群體在凍存中存活的能力。

應(yīng)理解以上內(nèi)容的各種變形以及其他特征和功能或其變形，可與許多其他不同的系統(tǒng)或應(yīng)用結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可進(jìn)行各種目前未預(yù)見或未預(yù)料到的替代方案、變形、變化或改進(jìn)，它們也包括在所附權(quán)利要求書中。