一種凍存液及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凍存液及其用途，本發(fā)明的凍存液含有體積百分含量為5％?25％的甘油，2％?10％的二甲基亞砜，45％?65％的S Buffer，余量為去離子水。本發(fā)明的凍存液在甘油和S Buffer體系中首次加入一定濃度配比的二甲基亞砜，在保存秀麗隱桿線蟲時，線蟲的存活率和反復(fù)凍融后的復(fù)蘇率顯著提高，極高的復(fù)蘇率有效地保證了后續(xù)實驗研究的進行，同時能夠反復(fù)凍存使用的線蟲在一定程度上降低了線蟲培養(yǎng)保存的成本，極大地提高了凍存線蟲的利用率；本發(fā)明的凍存液保存秀麗隱桿線蟲，方法簡單，效果顯著，無需液氮，節(jié)約了成本。
【專利說明】
一種凍存液及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于保存秀麗隱桿線蟲的凍存液。
【背景技術(shù)】
[0002] 秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)作為生命科學(xué)研究的經(jīng)典模式生物，近 年來一直活躍于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，其屬于線形動物門、小桿亞綱、小桿目、小桿總 科。雌雄同體蟲可產(chǎn)卵約300個，卵孵出幼蟲，經(jīng)4次蛻皮發(fā)育為成蟲，該成蟲只有959個體細(xì) 胞，而雄蟲有1031個體細(xì)胞。秀麗隱桿線蟲基因組測序也于2002年10月完成，準(zhǔn)確率達(dá) 99%，剩下1%的缺口。由于秀麗隱桿線蟲基因組序列高達(dá)40%與人類同源，為科學(xué)家研究 基因組的功能提供了一個強有力的工具。
[0003] 秀麗隱桿線蟲在生命科學(xué)領(lǐng)域扮演著重要的角色，但是目前有關(guān)秀麗隱桿線蟲的 培養(yǎng)和保存方面的報道并不多。國內(nèi)外文獻報道的凍存方法效果普遍不佳或比較繁瑣，或 需要液氮保存，費用昂貴;實際生產(chǎn)中常用的凍存液為濃度10%_30%的甘油，配方單一且 不確定，線蟲復(fù)蘇效率較低，不可反復(fù)凍存使用等缺陷，給生產(chǎn)和實驗研究帶來諸多影響和 不確定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的是提供一種凍存液。
[0005] 本發(fā)明米用的技術(shù)方案:一種凍存液，其特征在于，含有體積百分含量為5 %-25 % 的甘油，2%-10%的二甲基亞砜，45%-65%的S Buffer，余量為去離子水。
[0006] 優(yōu)選的是，所述的凍存液含有體積百分含量為15%的甘油，8%的二甲基亞砜， 55%的S Buffer。
[0007] -種凍存液的用途，其特征在于，所述凍存液用于保存秀麗隱桿線蟲，所述凍存液 含有體積百分含量為5 %-25 %的甘油，2 % -10 %的二甲基亞砜，45 %-65 %的S Buffer，余 量為去尚子水。
[0008] 優(yōu)選的是，所述凍存液含有體積百分含量為15 %的甘油，8%的二甲基亞砜，55% 的S Buffer。
[0009] 其中，所述凍存液保存秀麗隱桿線蟲的溫度為-80°C。
[0010] -種秀麗隱桿線蟲的凍存方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0011] S1，在培養(yǎng)有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基上，切取多個等份，分別接種于相同等份的 NGM培養(yǎng)基上，蟲體面朝下；
[0012] S2,將S1獲得的蟲體置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0013 ] S3，用M9Buffer冼下S2培養(yǎng)后的蟲體，靜置；
[0014] S4，將S3洗下的蟲體置于凍存液中保存，所述凍存液含有體積百分含量為5 % -25%的甘油，2%-10%的二甲基亞砜，45%-65%的S Buffer，余量為去離子水。
[0015] 其中，所述S1中切取的份數(shù)為四等份，分別接種于4份NGM培養(yǎng)基上。
[0016]其中，所述S2中的培養(yǎng)溫度為20°C，培養(yǎng)時間為96h。
[0017]其中，所述S4中的保存溫度為_80°C。
[0018]其中，所述S4中的凍存液含有體積百分含量為15 %的甘油，8 %的二甲基亞砜， 55%的S Buffer。
[0019]本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果是，本發(fā)明的凍存液在甘油和S Buffer體系中加入二甲基 亞砜，在保存秀麗隱桿線蟲時，線蟲的存活率和反復(fù)凍融后的復(fù)蘇率顯著提高，尤其在甘油 體積百分含量為15%，二甲基亞砜的體積百分含量為8%，S Buffer的體積百分含量為55% 時，其存活率達(dá)到94.86%，復(fù)蘇率達(dá)到43.85%，極高的復(fù)蘇率有效地保證了后續(xù)實驗研究 的進行，同時能夠反復(fù)凍存使用的線蟲在一定程度上降低了線蟲培養(yǎng)保存的成本，極大地 提高了凍存線蟲的利用率;本發(fā)明的凍存液保存秀麗隱桿線蟲，方法簡單，無需液氮，節(jié)約 了成本。
【附圖說明】
[0020] 以下結(jié)合附圖和【具體實施方式】來進一步詳細(xì)說明本發(fā)明：
[0021] 圖1為秀麗隱桿線蟲在A4B4C3與A3B4C3兩種不同配比保存下的復(fù)蘇結(jié)果比較圖；
[0022] 圖2為秀麗隱桿線蟲在A3B4C3凍存液與現(xiàn)有凍存液保存下的存活結(jié)果比較圖；
[0023] 圖3為秀麗隱桿線蟲在A3B4C3凍存液與現(xiàn)有凍存液保存下的復(fù)蘇結(jié)果比較圖。
【具體實施方式】
[0024] 1.蟲種和菌株
[0025] N2野生型秀麗隱桿線蟲(C.eleganS，N2)和0P50尿嘧啶突變型大腸桿菌，均由陜西 師范大學(xué)孫燕副教授惠贈。
[0026] 2.試劑
[0027] NGM培養(yǎng)基:每份培養(yǎng)基含有NaCl 0.3g，蛋白胨0.25g，lmol/L KH2P〇4_K2HP〇4緩沖 液（pH = 6 ? 0) 2 ? 5mL，膽固醇乙醇溶液（5mg/mL)0 ? lmL，lmo 1/L MgS040 ? lmL，lmol/L CaCl2〇.lmL〇
[0028] NGM培養(yǎng)基的制備方法：取NaCl 0.3g，蛋白胨0.25g，lmol/L KH2P〇4_K2HP〇4緩沖液 (pH=6 ? 0) 2 ? 5mL，加水定容至lOOmL，高壓滅菌后，待培養(yǎng)液降溫至60 °C時，加入膽固醇乙醇 溶液(5mg/mL)0. lmL，lmol/L MgS040. lmL，lmol/L CaCl2〇. lmL，快速混勾，于4°C下保存。
[0029] LB培養(yǎng)液:2單位質(zhì)量的胰蛋白胨，1單位質(zhì)量的酵母提取物和2單位質(zhì)量的NaCl構(gòu) 成的溶液，溶液pH為7.4。
[0030] S Buffer:6? 45X 10-3mol/L的K2HP〇4,4? 355X 10-2mol/L的KH2P〇4,0? lmol/L的NaCl 構(gòu)成的溶液。
[0031 ] M9Buffer: 0 ? 042mol/L的Na2HP〇4，0 ? 022mol/L的KH2P〇4,0 ? 085mol/L的NaCl， 0.0 lmo 1/L的MgSCk構(gòu)成的溶液。
[0032] 本文獻中所提到的NGM培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)液，S Buffer和M9Buffer皆為上述的NGM培 養(yǎng)基，LB培養(yǎng)液，S Buffer和M9Buffer。
[0033] 3.實施例
[0034] 甘油體積百分含量分別為5 %、10%、15%、20%，25 %;二甲基亞砜體積百分含量 分別為2%、4%、6%、8%，10%;3 8此€6^本積百分含量分別為45%，50%，55%，60%， 65%，設(shè)計試驗方案如表1、表2所示。
[0035] 表1:因素位級
[0037]表2L25(53)正交試驗方案
[0039] 凍存實驗:在培養(yǎng)至第96h的含秀麗隱桿線蟲的NGM培養(yǎng)基上，用手術(shù)刀切取四等 份膠塊，分別接種于4份NGM培養(yǎng)基上，蟲體面朝下，置于20°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，用 lmL M9Buf f er從NGM培養(yǎng)基洗下蟲體，靜置;用表2所示不同配比的凍存液分別保存蟲體，每 種凍存液各保存3份，于_80°C條件下保存；統(tǒng)一保存3個月后，38°C水浴快速解凍，靜置 20min，吸取全部沉淀部分，接種到涂有大腸桿菌0P50的NGM培養(yǎng)基中，分別計算蟲體存活 率，結(jié)果如表3。
[0040] 表3不同配比下的凍存液保存蟲體的存活率比較


[0044] 由表3可知，A3B4C3凍存液為最優(yōu)組合。即甘油15 %、二甲基亞砜8%、S Buffer 55 %。由R值可以看出，Ra>Rb>Rc，甘油和二甲基亞砜濃度對秀麗隱桿線蟲存活率影響較大。
[0045] 由于試驗設(shè)計的組合并沒有出現(xiàn)理論得出的A3B4C3的凍存液配方組合，因此將其 與試驗中線蟲存活率最高的8號組合進行三重復(fù)比較試驗，結(jié)果如圖1，從圖1中可知A3B4C3 組合的線蟲存活率較高，并具有統(tǒng)計差異（"***"代表P〈〇. 001);最終確定最優(yōu)的凍存液組 合:甘油15%、二甲基亞砜8%、S Buffer 55%。
[0046] 在確定最優(yōu)凍存液組合的前提下，在培養(yǎng)至第96h的含秀麗隱桿線蟲的NGM培養(yǎng)基 上，用手術(shù)刀切取四等份膠塊，分別接種于4份NGM培養(yǎng)基上，蟲體面朝下，置于20°C生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，用lmL M9Buffer從NGM培養(yǎng)基洗下蟲體，分別使用最優(yōu)配比凍存液、Worm Book經(jīng)典凍存液（15 % 甘油+85 % S Buf f er)、30 % 甘油+70 % S Buf f er、50mL/L甘油+LB培養(yǎng) 液于_80°C條件下保存蟲體，每種凍存液各保存3份。統(tǒng)一保存3個月后，38°C水浴快速解凍， 靜置20min后，吸取全部沉淀部分，接種到涂有大腸桿菌0P50的NGM培養(yǎng)基中，分別計算蟲體 存活率并進行比較。
[0047] 如圖2,甘油15%+二甲基亞砜8%+55%S Buffer(A)保存的秀麗隱桿線蟲凍存后 復(fù)蘇率達(dá)到94.86% ;30%甘油+70%S Buffer(B)保存的秀麗隱桿線蟲凍存后復(fù)蘇率為 64.66%，15%甘油+85%S Buffer(C)保存的秀麗隱桿線蟲凍存后復(fù)蘇率達(dá)到55.63% ; 50mL/L甘油+LB培養(yǎng)液(D)保存的秀麗隱桿線蟲凍存后復(fù)蘇率達(dá)到70.16%，研究中發(fā)現(xiàn)A保 存的線蟲存活率最高，較其他三組具有極顯著差異。
[0048]在確定最優(yōu)凍存液配方的前提下，在培養(yǎng)至第96h的含秀麗隱桿線蟲的NGM平板 上，用手術(shù)刀切取四等份膠塊，分別接種于4份NGM培養(yǎng)基上，蟲體面朝下，置于20°C生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，用lmL M9Buffer從NGM培養(yǎng)基洗下蟲體，分別使用最優(yōu)配比凍存液、Worm Book經(jīng)典凍存液（15 % 甘油+85 % S Buf f er)、30 % 甘油+70 % S Buf f er、50mL/L甘油+LB培養(yǎng) 液于_80°C條件下保存蟲體，每種凍存液各保存3份。統(tǒng)一保存3個月后，38°C水浴快速解凍， 再次放入_80°C冰箱，一周后取出，38°C水浴快速解凍，吸取全部沉淀部分，接種到涂有大腸 桿菌0P50的NGM培養(yǎng)基中，分別計算蟲體存活率并進行比較。
[0049] 如圖3,甘油15%+二甲基亞砜8%+55%S Buffer(A)保存的秀麗隱桿線蟲反復(fù)凍 存后復(fù)蘇率達(dá)到43.85% ;30%甘油+70%S Buffer(B)保存的秀麗隱桿線蟲反復(fù)凍存后復(fù) 蘇率為6.32%;15%甘油+85%3 811打打(〇保存的秀麗隱桿線蟲反復(fù)凍存后復(fù)蘇率達(dá)到 6.96%;5〇111171甘油+1^培養(yǎng)液(0)保存的秀麗隱桿線蟲反復(fù)凍存后復(fù)蘇率達(dá)到4.16%，研 究中發(fā)現(xiàn)A保存的線蟲復(fù)蘇率最高，較其他三組具有極顯著差異，B，C和D保存的線蟲在反復(fù) 凍融后復(fù)蘇率過低，已難以進行后續(xù)實驗研究。
[0050]本發(fā)明還進行了主體間效應(yīng)檢測分析，分析結(jié)果如表4。從表4中可知，凍存液中加 入的二甲基亞砜對線蟲復(fù)蘇率的影響具有顯著差異，也從統(tǒng)計學(xué)角度更加精準(zhǔn)地解釋了凍 存體系中增加一定濃度的二甲基亞砜后提高秀麗隱桿線蟲存活率的原因。 [0051 ] 表4主體間效應(yīng)的檢驗
【主權(quán)項】
1. 一種凍存液，其特征在于，含有體積百分含量為5%-25%的甘油，2%-10%的二甲基 亞砜，45%_65%的S Buffer，余量為去離子水。2. 如權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述的凍存液含有體積百分含量為15%的 甘油，8%的二甲基亞砜，55%的S Buffer。3. -種凍存液的用途，其特征在于，所述凍存液用于保存秀麗隱桿線蟲，所述凍存液含 有體積百分含量為5%_25%的甘油，2%-10%的二甲基亞砜，45%-65%的S Buffer，余量 為去離子水。4. 如權(quán)利要求3所述的凍存液的用途，其特征在于，所述凍存液含有體積百分含量為 15%的甘油，8%的二甲基亞砜，55%的S Buffer。5. 如權(quán)利要求3所述的凍存液的用途，其特征在于，所述凍存液保存秀麗隱桿線蟲的溫 度為_80°C。6. -種秀麗隱桿線蟲的凍存方法，其特征在于，包括如下步驟： S1，在培養(yǎng)有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基上，切取多個等份，分別接種于相同等份的NGM培 養(yǎng)基上，蟲體面朝下； S2,將S1獲得的蟲體置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； S3，洗下S2培養(yǎng)后的蟲體，靜置； S4，將S3洗下的蟲體置于凍存液中保存，所述凍存液含有體積百分含量為5 % -25 %的 甘油，2%-10%的二甲基亞砜，45%-65%的S Buffer，余量為去離子水。7. 如權(quán)利要求6所述的秀麗隱桿線蟲的凍存方法，其特征在于，所述S1中切取的份數(shù)為 四等份，分別接種于4份NGM培養(yǎng)基上。8. 如權(quán)利要求6所述的秀麗隱桿線蟲的凍存方法，其特征在于，所述S2中的培養(yǎng)溫度為 20°C，培養(yǎng)時間為96h。9. 如權(quán)利要求6所述的秀麗隱桿線蟲的凍存方法，其特征在于，所述S4中的保存溫度 為-80。。。10. 如權(quán)利要求6所述的秀麗隱桿線蟲的凍存方法，其特征在于，所述S4中的凍存液含 有體積百分含量為15%的甘油，8%的二甲基亞砜，55%的S Buffer。
【文檔編號】A01N1/02GK105850983SQ201610305756
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】謝暉, 梁繼民, 曾琦, 陳丹, 王福, 鮑翠平
【申請人】西安電子科技大學(xué)