一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，公開了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方法。本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液包括10v/v％DMSO、50v/v％骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基、40v/v％胎牛血清。與常規(guī)細(xì)胞凍存液相比，采用本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞回收率明顯高于其他常規(guī)凍存液，可以用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)期保存及應(yīng)用。本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化離心后，去上清，F(xiàn)BS重懸細(xì)胞沉淀，加入所述凍存保護(hù)液后凍存細(xì)胞。與常規(guī)的凍存方法相比，本發(fā)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞回收率明顯高于其他常規(guī)方法。
【專利說明】
_種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞(stem cell)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewal)的多潛能細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層ISC具有自我復(fù)制、自我更新、多方向分化潛能、造血支持以及免疫調(diào)控等特性。在特定的機(jī)體外分化環(huán)境下，能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、心臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細(xì)胞，被認(rèn)為是細(xì)胞治療技術(shù)的最有希望的來源細(xì)胞之一。除此以外，間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vEGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等在內(nèi)的各種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子可參與多種細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而收集條件培養(yǎng)基是獲得這些活性成分的有效方法。
[0003]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新我增殖能力以及向分化潛能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強(qiáng)的分化潛能和可自體移植等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到學(xué)者們的青睞，被認(rèn)為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞。
[0004]間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。因此，研究一種有效的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，使具有臨床應(yīng)用價(jià)值的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期保存并維持原有的多向分化能力，顯得尤為重要。
[0005]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存需要將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集起來，加入含有特定成分的細(xì)胞凍存保護(hù)液制成單細(xì)胞懸液，分裝于凍存管中置于超低溫冰箱或者液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。
[0006]目前現(xiàn)有技術(shù)中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存除了用二甲基亞砜DMS0，還會(huì)采用普通商品化的培養(yǎng)基或血清進(jìn)行細(xì)胞凍存。但上述配方凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均效果不理想，復(fù)蘇后細(xì)胞回收率及細(xì)胞活率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009]—種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，包括
[0010]DMSO10v/v%
[0011]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基50v/v%
[0012]胎牛血清40v/v%。
[0013]其中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法為:取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種含F(xiàn)BS的DMEM/F12的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)上清，離心后取上清。
[0014]在一些實(shí)施方案中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選為匯合度80-90%骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0015]在一些實(shí)施方案中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述接種具體為向按照(5-10) X 103/cm2細(xì)胞密度接種。
[0016]在一些實(shí)施方案中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述含F(xiàn)BS的DMEM/F12的培養(yǎng)基中FBS的含量為10v/v%。
[0017]在一些實(shí)施方案中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述培養(yǎng)具體為培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%。
[0018]本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)后收集培養(yǎng)上清，離心后取上清獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。其中，所述離心優(yōu)選為1000rpm-2000rpm 離心 5min_10min。
[0019]進(jìn)一步的，本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法還包括過濾除菌的步驟。優(yōu)選為用0.22μηι濾膜過濾除菌。
[0020]本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可以放置在-20°C培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80°C保存I年以上。需要使用時(shí)，恢復(fù)到常溫使用。
[0021]本發(fā)明還提供了所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液的制備方法，按比例將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基與胎牛血清混合，然后加入DMS0。
[0022]本發(fā)明還提供了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化離心后，去上清，F(xiàn)BS重懸細(xì)胞沉淀，加入權(quán)利要求1所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，混勻后，分裝至凍存管中，-80 V中凍存過夜后，轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)久保存。
[0023]其中，所述的凍存方法中，所述消化為向細(xì)胞中加入0.2%的胰酶消化1111；[11-31]1；[11，用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止酶解；
[0024]進(jìn)一步，所述的凍存方法中，所述離心為1000rpm-1500rpm離心5-10min。
[0025]優(yōu)選的，所述的凍存方法中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液的加入量為每(1-2) X 16細(xì)胞加入ImL所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液。
[0026]采用本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，結(jié)合本發(fā)明所述的凍存方法進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存，將起到更好的凍存效果，有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在凍存及復(fù)蘇過程中細(xì)胞活力的提高。復(fù)蘇后的細(xì)胞回收率明顯高于其他常規(guī)凍存液。
[0027]本發(fā)明還提供了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存試劑盒，包含本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液。
[0028]本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液包括10 v/v % DMSO、50 v/v %骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基、4(^八％胎牛血清。與常規(guī)細(xì)胞凍存液相比，采用本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞回收率明顯高于其他常規(guī)凍存液，可以用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)期保存及應(yīng)用。本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化離心后，去上清，F(xiàn)BS重懸細(xì)胞沉淀，加入所述凍存保護(hù)液后凍存細(xì)胞。與常規(guī)的凍存方法相比，本發(fā)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞回收率明顯高于其他常規(guī)方法。
【附圖說明】
[0029]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0030]圖1示實(shí)施例3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)不同凍存液凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞活力檢測(cè)圖，其中實(shí)驗(yàn)組為本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存，對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)凍存液凍存；[0031 ]圖2示實(shí)施例4復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組的表面抗原圖；
[0032]圖3示實(shí)施例4復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的表面抗原圖；
[0033]圖4示實(shí)施例5復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未誘導(dǎo)組茜素紅染色圖；
[0034]圖5示實(shí)施例5復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色圖；
[0035]圖6示實(shí)施例6復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未誘導(dǎo)組油紅O染色圖；
[0036]圖7示實(shí)施例6復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后油紅O染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0038]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0039]實(shí)施例1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的收集
[0040]1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0041 ]取正常人的骨髓樣本，在無菌環(huán)境下，在骨髓中加入等體積的生理鹽水，輕輕混勻，用巴氏吸管吸取骨髓混合液緩慢加入到等體積淋巴細(xì)胞分離液中；以300g-400g離心10-15min，離心后用巴氏吸管吸取中間層的單核細(xì)胞層;轉(zhuǎn)移到含有5-10mL Hanks緩沖溶液的離心管中，輕輕混勻；以200-300g離心5-15min，去上清，重復(fù)清洗1-2次；用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+10ng/mL bFGF)重懸細(xì)胞沉淀，并接種于培養(yǎng)皿中；放置在37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);48小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清，重新?lián)Q上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基;每3天換液，4-8天即可見細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90 % ;
[0042]2、條件培養(yǎng)基收集:用于條件培養(yǎng)基的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，先按照(5-10) X 13/cm2細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿，DMEM/F12+10%FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管中，1000-2000rpm離心5-10min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22μπι濾膜過濾除菌，收集在無菌培養(yǎng)瓶中。放置在-20 °C培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80 °C保存I年以上。需要使用時(shí)，恢復(fù)到常溫使用。
[0043]實(shí)施例2:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液
[0044]每ImL細(xì)胞凍存液配方為:0.lmLDMS0、0.4mLFBS、0.5mL實(shí)施例1所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
[0045]實(shí)施例3:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
[0046]取匯合度達(dá)到80-90%的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用I3BS清洗2次，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞2min，細(xì)胞變圓后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，以1000-1500rpm離心5-10min，去上清，加入FBS重懸細(xì)胞沉淀，去20-50yL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每(1-2) X 16細(xì)胞用ImL實(shí)施例2所述凍存液進(jìn)行凍存。細(xì)胞置于凍存管加入凍存液，放于含異丙醇的程序降溫盒中，放入-80°C過夜后，即可轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。半年后取出復(fù)蘇，計(jì)算細(xì)胞活力。
[0047]對(duì)照組:取匯合度達(dá)到80-90 %的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用I3BS清洗2次，加入0.25 %胰酶消化細(xì)胞2min，細(xì)胞變圓后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，以1000-1500rpm離心5-1Omin，去上清，加入FBS重懸細(xì)胞沉淀，去20_50yL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每(1_2) X 16細(xì)胞用ImL標(biāo)準(zhǔn)凍存液進(jìn)行凍存。細(xì)胞置于凍存管加入標(biāo)準(zhǔn)凍存液，放于含異丙醇的程序降溫盒中，放入-80°C過夜后，即可轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。半年后取出復(fù)蘇，計(jì)算細(xì)胞活力。其中標(biāo)準(zhǔn)凍存液為:每ImL標(biāo)準(zhǔn)凍存液含0.1mL DMSO、0.9mL FBS。
[0048]由圖1結(jié)果可見，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液(實(shí)驗(yàn)組)凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇活力明顯高于標(biāo)準(zhǔn)凍存液(對(duì)照組)凍存后的細(xì)胞活力。
[0049]實(shí)施例4:流式細(xì)胞儀檢測(cè)復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志。
[0050]取實(shí)施例3的方法凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞，待復(fù)蘇后細(xì)胞匯合度達(dá)到80%_90%，用0.25%胰酶消化離心細(xì)胞，并計(jì)數(shù)后每管加入2 X 15細(xì)胞數(shù)，染色緩沖液(PBS)洗I次，1000印111離心51^11;棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細(xì)胞；加入0)73、0090、0)105、0034、⑶45、及HLA-DRA抗體各2yL，并設(shè)一管為空白對(duì)照；在4 °C下，避光反應(yīng)15_20min;染色緩沖液洗一次，100rpm離心5min ；直接標(biāo)記的細(xì)胞棄上清，避光加入500yL的上樣緩沖液，混勾，用200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞樣品，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。結(jié)果如圖2和3。
[0051 ] 結(jié)果顯示復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞陰性表面⑶34、⑶45、HLA-DR為均呈現(xiàn)陰性，同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD73、CD90，CD105均呈現(xiàn)陽性。說明采用本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征。
[0052]實(shí)施例5:凍存復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化鑒定
[0053]取實(shí)施例3的方法凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞，待復(fù)蘇后細(xì)胞匯合度達(dá)到80%_90%，用
0.25%胰酶消化離心細(xì)胞，按照5 X 13細(xì)胞/cm2接種于六孔板中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、10%胎牛血清、I %谷氨酰胺、150μπι抗壞血酸、ΙΟπιΜβ-磷酸甘油、10nM地塞米松。每隔2_3天換液，28天后進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果見圖4和圖5。
[0054]結(jié)果顯示復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過成骨誘導(dǎo)4周后，由茜素紅染色可見鈣化結(jié)節(jié)。說明采用本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后仍然保持向成骨分化的潛能。
[0055]實(shí)施例6:凍存復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化鑒定
[0056]取實(shí)施例3的方法凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞，待復(fù)蘇后細(xì)胞匯合度達(dá)到80%_90%，用
0.25%胰酶消化離心細(xì)胞，收集細(xì)胞后，并按照5 X 13細(xì)胞/cm2接種于六孔板中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、10%胎牛血清、0.5mM ΙΒΜΧ、ΙμΜ地塞米松、ΙΟΟμΜ吲哚美辛、5yg/mL胰島素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天換液。四周后進(jìn)行油紅O染色，鑒定脂滴形成情況，結(jié)果見圖6和7。
[0057]結(jié)果顯示，復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過成脂誘導(dǎo)4周后，由油紅O染色可見紅色油滴，說明采用本發(fā)明所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后仍然保持向脂肪分化的潛能。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，其特征在于，包括 DMSO10v/v% 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基50v/v% 胎牛血清40v/v%。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存保護(hù)液，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法為:取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種含F(xiàn)BS的DMEM/F12的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)上清，離心后取上清。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍存保護(hù)液，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述接種具體為向按照(5-10) X 103/cm2細(xì)胞密度接種。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍存保護(hù)液，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述含F(xiàn)BS的DMEM/F12的培養(yǎng)基中FBS的含量為1 v/v %。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍存保護(hù)液，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述培養(yǎng)具體為培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80 % -90 %。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍存保護(hù)液，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述離心為1000rpm-2000rpm離心5min_l Omin。7.權(quán)利要求1所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液的制備方法，其特征在于，按比例將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基與胎牛血清混合，然后加入DMSO。8.一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化離心后，去上清，F(xiàn)BS重懸細(xì)胞沉淀，加入權(quán)利要求1所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，混勻后，分裝至凍存管中，-80 °C中凍存過夜后，轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)久保存。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的凍存方法，其特征在于，所述消化為向細(xì)胞中加入0.2%的胰酶消化lmin-3min，用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止酶解；所述離心為100rpm-1500rpm離心5-10min;所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液的加入量為每α-2) X 16細(xì)胞加入ImL所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液。10.—種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK105850979SQ201610143829
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月14日
【發(fā)明人】葛嘯虎, 陳海佳, 王飛, 王一飛, 馮德龍, 張維敏
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司