振動(dòng)刺激在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨、成脂分化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物技術(shù)及骨組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高頻振動(dòng)刺激在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化、成脂分化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨缺損修復(fù)一直以來(lái)是骨科難題。疾病、自然災(zāi)害、事故以及戰(zhàn)爭(zhēng)等各種原因造成的需接受植骨修復(fù)的人數(shù)逐年呈上升趨勢(shì)。傳統(tǒng)的骨修復(fù)方法往往需要犧牲自體骨進(jìn)行移植修復(fù)，容易造成供區(qū)的創(chuàng)傷和功能受限；而異體、異種骨因存在免疫排異反應(yīng)、交叉感染病毒等安全問(wèn)題而受到極大的限制。近年來(lái)，骨組織工程的迅速發(fā)展為骨缺損的修復(fù)提供了一種新途徑。利用骨組織工程需要的供體組織少、損傷??；細(xì)胞可在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，無(wú)抗原性或抗原性甚微；還可以根據(jù)修復(fù)缺損需要，利用仿生技術(shù)，將植入物制成精確的三維形狀，為復(fù)雜骨缺損的修復(fù)提供新的途徑。骨組織工程主要包括3個(gè)方面內(nèi)容，即骨引導(dǎo)生物材料支架、種子細(xì)胞和組織工程化骨組織的構(gòu)建。其中一個(gè)研宄重點(diǎn)就是種子細(xì)胞的來(lái)源。成骨細(xì)胞是經(jīng)典的種子細(xì)胞來(lái)源，但存在增殖、分化能力弱，大量取材不便等缺點(diǎn)，不能滿足作為骨組織工程種子細(xì)胞的需要。
[0003]近年來(lái)，干細(xì)胞成為骨組織工程研宄的熱點(diǎn)。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和多能誘導(dǎo)干細(xì)胞，可以進(jìn)一步分化為各種不同的組織，已被廣泛地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，BM_MSCs)因其來(lái)源廣泛、具有多向分化潛能和很強(qiáng)的自我修復(fù)能力、在體外適當(dāng)?shù)臈l件下可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等特點(diǎn)，成為目前骨組織工程中最常用的種子細(xì)胞之一，在骨組織損傷修復(fù)中發(fā)揮極其重要的作用。但是仍存在一些問(wèn)題，其中重要的一點(diǎn)便是其定向成骨誘導(dǎo)分化的效率較低。研宄表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化和成脂分化不是兩個(gè)孤立的過(guò)程，而是存在著相互制約的平衡關(guān)系。因此，如何促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化、抑制成脂分化成為研宄重點(diǎn)。
[0004]已有研宄揭示，BM-MSCs成骨、成脂分化受到多個(gè)胞內(nèi)或胞外信號(hào)分子和特異性轉(zhuǎn)錄因子共同參與調(diào)控。其中Runx-2和PPARy分別是成骨、成脂定向分化和控制兩者平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Runx-2能夠促進(jìn)BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化；PPARy抑制BM-MSCs成骨分化而促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖。隨著年齡增長(zhǎng)，Runx2表達(dá)降低，PPARy表達(dá)增高。衰老動(dòng)物骨髓能產(chǎn)生未知的PPARy活化劑促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成，抑制成骨細(xì)胞分化。
[0005]由于BM-MSCs為力學(xué)敏感細(xì)胞，在體外適當(dāng)機(jī)械刺激作用下，其生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生功能性改變，以達(dá)到力學(xué)刺激的最佳要求，并表現(xiàn)為成骨分化。其中，振動(dòng)等被動(dòng)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的應(yīng)力刺激可以作為一種被動(dòng)的、非侵入性的形式積極影響骨組織，為骨組織工程研宄中促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生更多功能性的成骨細(xì)胞提供了安全、高效的種子細(xì)胞來(lái)源。體內(nèi)研宄結(jié)果顯示，低頻振動(dòng)(〈100Hz)刺激可以促進(jìn)骨重建。體外試驗(yàn)研宄也表明，低頻振動(dòng)刺激可促進(jìn)小鼠成骨前體細(xì)胞2T3分化成熟，Runx-2, ALP基因表達(dá)上調(diào)(參見(jiàn)文獻(xiàn):M.J.Patel, Κ.H.Chang, Μ.C.Sykes, R.Talish, C.Rubin, H.Jo, Low magnitudeand high frequency mechanical loading prevents decreased bone format1nresponses of 2T3 preosteoblasts.Journal of cellular b1chemistry 106 (2009)306-316.1)，也可促進(jìn)MSCs的增殖及成骨分化(參見(jiàn)文獻(xiàn):D.Pre, G.Ceccarelli,L.Visai, L.Benedetti, M.1mbriani, M.G.Cusella De Angelis, G.Magenes,High-Frequency Vibrat1n Treatment of Human Bone Marrow Stromal Cells IncreasesDifferentiat1n toward Bone Tissue.Bone marrow research 2013 (2013) 803450.)。目前關(guān)于高頻振動(dòng)刺激的研宄，報(bào)道了 400 Hz刺激可促進(jìn)小鼠成骨前體MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)(參見(jiàn)文獻(xiàn):V.Dumas, B.Ducharne, A.Perrier, C.Fournier,A.Guignandon, M.Thomas, S.Peyroche, D.Guyomar, L.Vico, A.Rattner,Extracellular matrix produced by osteoblasts cultured under low—magnitude，high-frequency stimulat1n is favourable to osteogenic differentiat1n ofmesenchymal stem cells.Calcified tissue internat1nal 87 (2010) 351-364.)；IkHz振動(dòng)促進(jìn)MSCs成骨分化(參見(jiàn)文獻(xiàn):4 H.Nikukar, S.Reid, P.M.Tsimbouri, Μ.0.Riehle, A.S.Curtis, M.J.Dalby, Osteogenesis of mesenchymal stem cells bynanoscale mechanotransduct1n.ACS nano 7 (2013) 2758-2767.)。而高頻振動(dòng)刺激同時(shí)對(duì)BM-MSCs成骨、成脂分化的調(diào)控研宄未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是，解決現(xiàn)有調(diào)控成骨分化、成脂分化存在的不足的問(wèn)題，提供一種將高頻振動(dòng)刺激應(yīng)用于促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞體外向成骨分化、抑制成脂分化的技術(shù)方案。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:一種振動(dòng)刺激在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨、成脂分化中的應(yīng)用，所述的振動(dòng)刺激頻率為750Hz?800Hz。
[0008]本發(fā)明技術(shù)方案的具體內(nèi)容是:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化培養(yǎng)，并給予每天一次、每次20?45分鐘、頻率為750Hz?800Hz的高頻振動(dòng)刺激，連續(xù)14天，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化；還包括，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成脂分化培養(yǎng)，并給予每天一次、每次20?45分鐘、頻率為750Hz?800Hz的高頻振動(dòng)刺激，連續(xù)21天，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成脂分化。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:采用高振動(dòng)頻率750?800Hz區(qū)域，對(duì)BM-MSCs成骨及成脂分化的調(diào)控，有效促進(jìn)了 BM-MSCs成骨分化，抑制了成脂分化，可用于干細(xì)胞生物技術(shù)及骨組織工程，為促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生更多功能性的成骨細(xì)胞提供了安全、高效的種子細(xì)胞來(lái)源，以及在骨缺損、骨質(zhì)疏松等疾病的治療。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為本發(fā)明實(shí)施例及對(duì)比例提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)FDA活細(xì)胞染色后在倒置焚光顯微鏡下的焚光照片圖(標(biāo)尺:200 μ m)；
圖2高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成骨分化細(xì)胞外基質(zhì)鈣沉積茜素紅染色后在倒置熒光顯微鏡下的焚光照片圖(標(biāo)尺:200 μ m)；
圖3為高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成骨分化細(xì)胞外基質(zhì)鈣沉積定量分析的柱狀圖； 圖4為高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成骨分化RUNX2、C0L1A1表達(dá)影響的柱狀圖(7天振動(dòng)結(jié)果)；
圖5為高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成骨分化RUNX2、COLlAl表達(dá)影響的柱狀圖(14天振動(dòng)結(jié)果)；
圖6為高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成脂分化細(xì)胞外基質(zhì)脂質(zhì)沉積油紅O染色后在倒置熒光顯微鏡下的焚光照片圖(標(biāo)尺:200 μ m)；
圖7為高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成脂分化細(xì)胞外基質(zhì)脂質(zhì)沉積定量分析的柱狀圖；
圖8為高頻振動(dòng)刺激對(duì)BM-MSCs成脂分化PPARG2、CEBPA/CEBP- α表達(dá)影響的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的闡述。
[0012]本發(fā)明采用振動(dòng)頻率為750 Hz,800Hz對(duì)BM-MSCs的振動(dòng)刺激，對(duì)比例為振動(dòng)頻率30 Hz和不振動(dòng)。
[0013]各實(shí)施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。實(shí)施例中所用的人BM-MSCs購(gòu)于美國(guó)維吉利亞洲馬納薩斯菌種庫(kù)，先接種