利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和/或多能干細(xì)胞的血中動(dòng)員的組織再生促進(jìn)劑的制作方法
【專利說明】利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和/或多能干細(xì)胞的血中動(dòng)員的組 織再生促進(jìn)劑
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年10月28日、發(fā)明名稱為"利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和/ 或多能干細(xì)胞的血中動(dòng)員的組織再生促進(jìn)劑"的中國申請(qǐng)?zhí)枮?01080059712. 0的分案申 請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及投予至與需要再生的組織不同的組織中的組織再生促進(jìn)劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 再生醫(yī)療是以損傷器官的功能性、器質(zhì)性再生為目的的醫(yī)療，其利用在體外進(jìn)行 了培養(yǎng)和加工的細(xì)胞或組織。例如，皮膚培養(yǎng)片等是將在體外對(duì)從本人或他人采集的皮膚 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并加工成片狀的制品移植到損傷皮膚上。再生醫(yī)療中，為了確保治療所使用 的細(xì)胞，需要在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)增殖。通過培養(yǎng)操作，有可能會(huì)發(fā)生細(xì)胞的劣化（老 化、腫瘤化、細(xì)菌和病毒等的污染），因此為了維持安全性需要在保證GMP標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)施內(nèi)進(jìn) 行制造，從而可預(yù)想到治療費(fèi)用的高額化將成為課題。
[0004] 另一方面，已知生物體在器官損傷時(shí)具備損傷部位的修復(fù)再生機(jī)制，但損傷部位 很大時(shí)，非功能性的疤痕組織會(huì)占據(jù)損傷部位。帶有這種疤痕組織的損傷治愈在腦梗塞或 脊髄損傷中成為神經(jīng)再生的抑制因子、在心肌梗塞中成為心臟破裂的要因、在大面積燒傷 或手術(shù)創(chuàng)傷中變?yōu)榘毯鄹泶竦?、在生命預(yù)后、美容方面成為明顯損害QOL的原因。如果能夠 活化生物體所具有的損傷組織的修復(fù)再生機(jī)制，則可以期待在不發(fā)生疤痕治愈的情況下誘 導(dǎo)利用功能性組織的損傷組織（器官）的再生。
[0005] 已知在骨髄內(nèi)除了分化成白細(xì)胞或紅細(xì)胞等的造血干細(xì)胞之外，還存在能夠分化 成骨、軟骨、脂肪等的間充質(zhì)干細(xì)胞，近年來還得知存在能夠分化成上皮系或神經(jīng)系細(xì)胞的 多能干細(xì)胞。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn) I :W02008/053892

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0010] 在現(xiàn)有的治療方法中，對(duì)于治愈困難的大面積皮膚潰瘍、難治性骨折、腦梗塞等難 治性疾病，開發(fā)通過生理性修復(fù)再生機(jī)制的活化來誘導(dǎo)損傷組織的治愈的新型治療方法成 為課題。
[0011] 用于解決技術(shù)問題的方法
[0012] 在使用小鼠確認(rèn)皮膚潰瘍部位治愈過程中HMGB-I及S100A8的將骨髓源性細(xì)胞 向皮膚潰瘍部的動(dòng)員效果時(shí)可知：通過向相對(duì)于皮膚潰瘍部遠(yuǎn)且不同位置的靜脈血內(nèi)投予 HMGB-I或S100A8,骨髓源性細(xì)胞被動(dòng)員到皮膚潰瘍部位。接著，在確認(rèn)HMGB-I及S100A8 的靜脈內(nèi)投予所產(chǎn)生的皮膚潰瘍治愈促進(jìn)效果時(shí)顯示：通過將它們投予至距離潰瘍部位遠(yuǎn) 且不同位置的血管內(nèi)，成功地促進(jìn)了皮膚潰瘍的治愈。進(jìn)而，在確認(rèn)皮膚潰瘍的非疤痕性治 愈促進(jìn)效果時(shí)顯示：通過將HMGB-I進(jìn)行靜脈內(nèi)投予，可以促進(jìn)已被動(dòng)員至血液中的骨髓源 性細(xì)胞向潰瘍部分的進(jìn)一步動(dòng)員，從而可以促進(jìn)皮膚潰瘍的早期閉合和非疤痕性治愈。
[0013] 另外，在確認(rèn)腦梗塞模型小鼠腦中的骨髓源性細(xì)胞的存在時(shí)顯示：對(duì)于制作腦梗 塞后靜脈投予了 HMGB-I的小鼠，在腦內(nèi)確認(rèn)到了表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的骨髓源性細(xì)胞。接 著，在確認(rèn)腦梗塞灶的縮小效果時(shí)顯示：與對(duì)照小鼠相比，HMGB-I靜脈投予小鼠中，對(duì)于腦 梗塞灶確認(rèn)到了顯著的改善效果。另外，在確認(rèn)腦梗塞后的存活率改善時(shí)顯示：在HMGB-I 靜脈投予例中小鼠的存活率提高。
[0014] 進(jìn)而，在使用小鼠確認(rèn)在骨折治愈過程中骨折部以外部位的骨髓多能干細(xì)胞的相 關(guān)性時(shí)可知：損傷部位遠(yuǎn)處的骨髓源性細(xì)胞移動(dòng)至骨折部分進(jìn)行損傷組織的修復(fù)。
[0015] 進(jìn)而，使用骨折模型小鼠評(píng)價(jià)HMGBl靜脈投予所產(chǎn)生的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷 部位的動(dòng)員活性時(shí)可知：通過HMGBl的靜脈內(nèi)投予，已被動(dòng)員至血中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 聚集至骨折部分。
[0016] 本申請(qǐng)基于上述所知而提供以下的發(fā)明。
[0017] (1) 一種藥劑，其為含有以下（a)~（q)中任一項(xiàng)所述的物質(zhì)的組織再生促進(jìn)劑， 且其被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0018] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0019] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0020] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0021] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0022] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0023] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0024] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0025] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0026] (i)插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0027] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0028] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0029] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0030] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0031] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0032] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0033] (ρ)細(xì)胞或組織的提取液
[0034] (q)細(xì)胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級(jí)分。
[0035] (2)上述（1)所述的藥劑，其被非經(jīng)口投予。
[0036] (3)上述（2)所述的藥劑，其為注射投予。
[0037] (4)上述⑴所述的藥劑，其被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0038] (5)上述（1)~（4)任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，細(xì)胞或組織的提取液是通過包含將 細(xì)胞或組織浸漬在溶劑中的工序的方法來制造。
[0039] (6)上述⑴~⑷任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，細(xì)胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級(jí) 分是通過包含以下工序的方法來制造：
[0040] (a)將細(xì)胞或組織浸漬在溶劑中的工序、
[0041] (b)使工序（a)中獲得的提取液與固定化肝素接觸的工序、和
[0042] (C)從固定化肝素中洗脫肝素結(jié)合級(jí)分的工序。
[0043] (7)上述（1)~（6)任一項(xiàng)所述的藥劑，其被用于神經(jīng)組織、骨組織或皮膚組織的 再生促進(jìn)。
[0044] (8) -種組織再生促進(jìn)試劑盒，其包含含有以下（a)~（q)中任一項(xiàng)所述的物質(zhì)的 組合物，該組合物被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0045] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0046] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0047] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0048] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0049] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0050] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0051] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0052] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0053] ⑴插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0054] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0055] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0056] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0057] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0058] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0059] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體 [0060] (P)細(xì)胞或組織的提取液
[0061] (q)細(xì)胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級(jí)分。
[0062] (9)上述⑶所述的試劑盒，其被非經(jīng)口投予。
[0063] (10)上述（9)所述的試劑盒，其為注射投予。
[0064] (11)上述⑶所述的試劑盒，其被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0065] (12)上述⑶~（11)任一項(xiàng)所述的試劑盒，其被用于神經(jīng)組織、骨組織或皮膚組 織的再生促進(jìn)。
[0066] (13) -種促進(jìn)組織再生的方法，其包含：將有效量的含有以下（a)~（q)中任一 項(xiàng)所述的物質(zhì)的組合物投予至與需要再生的組織不同的組織的工序；
[0067] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0068] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0069] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0070] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0071] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0072] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0073] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0074] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0075] ⑴插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0076] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0077] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0078] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0079] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0080] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0081] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0082] (ρ)細(xì)胞或組織的提取液
[0083] (q)細(xì)胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級(jí)分。
[0084] (14)上述（13)所述的方法，其中，為非經(jīng)口投予。
[0085] (15)上述（14)所述的方法，其中，為注射投予。
[0086] (16)上述（13)所述的方法，其中，向血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)進(jìn)行投 予。
[0087] (17)上述（13)~（16)任一項(xiàng)所述的方法，其促進(jìn)神經(jīng)組織、骨組織或皮膚組織的 再生。
[0088] (18) -種含有以下（a)~（q)中任一項(xiàng)所述的物質(zhì)的組合物在組織再生促進(jìn)劑的 制造中的用途，其中，該組織再生促進(jìn)劑被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0089] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0090] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0091] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0092] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0093] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0094] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0095] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0096] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0097] (i)插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0098] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0099] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0100] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0101] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0102] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0103] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0104] (P)細(xì)胞或組織的提取液
[0105] (q)細(xì)胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級(jí)分。
[0106] (19)上述（18)所述的用途，其中，所述組織再生促進(jìn)劑被非經(jīng)口投予。
[0107] (20)上述（19)所述的用途，其中，為注射投予。
[0108] (21)上述（18)所述的用途，其中，所述組織再生促進(jìn)劑被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0109] (22)上述（18)~（21)任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述組織再生促進(jìn)劑為神經(jīng)組 織、骨組織或皮膚組織的再生促進(jìn)劑。
[0110] (23) -種組合物，其為用于在促進(jìn)組織再生的方法中使用的、含有以下（a)~（q) 中任一項(xiàng)所述的物質(zhì)的組合物，其被投予至與需要再生的組織不同的組織；
[0111] (a)HMGBl 蛋白質(zhì)
[0112] (b)分泌HMGBl蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0113] (c)插入有編碼HMGBl蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0114] (d)HMGB2 蛋白質(zhì)
[0115] (e)分泌HMGB2蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0116] (f)插入有編碼HMGB2蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0117] (g)HMGB3 蛋白質(zhì)
[0118] (h)分泌HMGB3蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0119] ⑴插入有編碼HMGB3蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0120] (j)S100A8 蛋白質(zhì)
[0121] (k)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0122] (1)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0123] (m)S100A9 蛋白質(zhì)
[0124] (η)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞
[0125] (〇)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體
[0126] (P)細(xì)胞或組織的提取液
[0127] (q)細(xì)胞或組織的提取液的肝素結(jié)合級(jí)分。
[0128] (24)上述（23)所述的組合物，其被非經(jīng)口投予。
[0129] (25)上述（24)所述的組合物，其中，為注射投予。
[0130] (26)上述（23)所述的組合物，其被投予至血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)。
[0131] (27)上述（23)~（26)任一項(xiàng)所述的組合物，其中，促進(jìn)組織再生的方法是促進(jìn)神 經(jīng)組織、骨組織或皮膚組織的再生的方法。
[0132] 發(fā)明效果
[0133] 作為損傷組織再生藥品，已知HGF、EGF、VEGF、FGF等細(xì)胞增殖因子，但這些物質(zhì)是 被直接投予至損傷部位及其附近組織以期待促進(jìn)細(xì)胞增殖來進(jìn)行使用的。
[0134] HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9具有動(dòng)員骨髓多能干細(xì)胞的活性。骨髓多能 干細(xì)胞除了能分化成間充質(zhì)細(xì)胞之外，還可分化成上皮系或神經(jīng)系的細(xì)胞。在大面積的組 織損傷時(shí)，只要能夠介由血流將骨髓多能干細(xì)胞動(dòng)員至損傷部位，則可期待促進(jìn)骨髓多能 干細(xì)胞所帶來的生理性損傷組織的修復(fù)再生。
[0135] 通過本發(fā)明，提供了下述方法：通過利用靜脈內(nèi)投予等方法將作為骨髓多能干細(xì) 胞動(dòng)員因子的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9投予至遠(yuǎn)離損傷部位的遠(yuǎn)處部位，從而 將骨髓多能干細(xì)胞動(dòng)員至末梢血中，由此促進(jìn)損傷組織修復(fù)。例如，在治療如腦梗塞那樣的 體內(nèi)深部器官的疾病時(shí)，很難將治療藥直接投予至損傷部位（腦）。而本發(fā)明中，由于使在 通常診療中廣泛實(shí)施的靜脈投予的治療成為可能，因而可以以任意的次數(shù)、濃度將治療藥 安全且簡(jiǎn)便地投予，這是比現(xiàn)有的治療方法更優(yōu)異的效果。
[0136] 另外，作為最近開發(fā)出的使用了骨髄細(xì)胞的腦梗塞的治療方法，已知從患者本人 的骨髄采集細(xì)胞并再次投予到血液循環(huán)中的方法是有效的，但在采集骨髄細(xì)胞時(shí)由于需要 將很粗的針刺入體內(nèi)深部的骨髄進(jìn)行抽吸，因而不可避免地伴有嚴(yán)重的侵襲。與此相對(duì)，在 本發(fā)明中，通過將藥劑進(jìn)行靜脈內(nèi)投予，可以將骨髄細(xì)胞直接動(dòng)員至血液循環(huán)中，因而即便 多次向腦梗塞患者投予，也不會(huì)伴有嚴(yán)重的侵襲。
[0137] 骨髄來源的多能干細(xì)胞具有分化成間充質(zhì)細(xì)胞、上皮系細(xì)胞、神經(jīng)系細(xì)胞等多種 細(xì)胞的潛在能力，認(rèn)為在移動(dòng)至損傷部位后根據(jù)周圍的微環(huán)境進(jìn)行分化并誘導(dǎo)組織修復(fù)。 在再生醫(yī)療或細(xì)胞治療中，是在生物體外將稀少的骨髓多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并使其增殖 后用于治療，但與以往的藥品不同，由于具有在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生的細(xì)胞的劣化（癌化 或細(xì)菌、病毒等的污染）的危險(xiǎn)，因而需要充分的安全管理。本發(fā)明中，通過投予HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9而將骨髓多能干細(xì)胞動(dòng)員至末梢循環(huán)血內(nèi)，但由于不需要將 細(xì)胞取出至體外以施加人工操作，因而是安全性高的治療方法。
【附圖說明】
[0138] 圖1為表示HMGBl的純化過程的照片。將在HMGBl的N末端側(cè)含有利用GST-標(biāo) 簽6XHis-標(biāo)簽HRV3C獲得的剪切序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293。使培養(yǎng)上清結(jié)合于鎳柱， 用咪唑?qū)Y(jié)合級(jí)分進(jìn)行洗脫。進(jìn)而，將鎳柱結(jié)合級(jí)分利用HRV3C從HMGBl中剪切GST-標(biāo) 簽6XHis標(biāo)簽后，使其結(jié)合在肝素親和柱上，利用氯化鈉進(jìn)行洗脫。使肝素結(jié)合級(jí)分結(jié)合在 Q柱上，利用氯化鈉進(jìn)行洗脫。為了檢測(cè)各個(gè)純化過程的純化度，對(duì)結(jié)合在柱上的級(jí)分進(jìn)行 SDS-PAGE后，進(jìn)行考馬斯染色。
[0139] 圖2為表示潰瘍閉合后的皮膚和皮膚的薄切片的GFP信號(hào)的照片。在GFP骨髄移 植小鼠的背中制作皮膚潰瘍，經(jīng)靜脈投予HMGBl或S100A8。經(jīng)靜脈投予了 HMGBl和S100A8 的小鼠的皮膚上與對(duì)照相比，檢測(cè)到更多量的為GFP陽性的骨髓源性細(xì)胞。
[0140] 圖3為表示經(jīng)時(shí)測(cè)定的皮膚潰瘍面積的曲線。在小鼠的背中制作皮膚潰瘍，經(jīng)靜 脈投予HMGBl或S100A8。制作潰瘍后第3天，與對(duì)照組相比，在HMGBl投予組中可見皮膚 潰瘍的縮小效果。在制作潰瘍后第7天，與對(duì)照組相比，在S100A8投予組中可見皮膚潰瘍 的縮小效果（縱軸：潰瘍面積+皮膚潰瘍制作時(shí)的面積X 100,橫軸：皮膚潰瘍制作后的天 數(shù)）。
[0141] 圖4為表示皮膚潰瘍閉合后對(duì)皮膚的薄切片進(jìn)行了蘇木精伊紅染色（HE)、Masson 三色染色（MT)后的結(jié)果的照片。在小鼠的背中制作皮膚潰瘍，經(jīng)靜脈投予HMGB1。在對(duì)照 小鼠中可見膠原纖維異常增加，而經(jīng)靜脈投予了 HMGBl的小鼠中抑制了膠原纖維的異常增 加。
[0142] 圖5為表示巢蛋白（神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物）和β III微管蛋白（神經(jīng)元標(biāo)記物）表 達(dá)細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果的照片。在GFP骨髄移植小鼠中制作腦梗塞，經(jīng)靜脈投予HMGBl來進(jìn)行 治療。治療結(jié)束后，制作腦的薄切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)。左側(cè)照片的箭頭所示的細(xì)胞為GFP 陽性且巢蛋白陽性的細(xì)胞。右側(cè)照片的箭頭所示的細(xì)胞為GFP陽性且MII微管蛋白陽性 的細(xì)胞。確認(rèn)了骨髄來源的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記物。
[0143] 圖6為表示梗塞部位的檢測(cè)結(jié)果的照片。制作腦梗塞疾病模型小鼠，經(jīng)靜脈投予 HMGB1。治療結(jié)束后，制作腦的薄切片，進(jìn)行尼氏染色。在PBS投予例（對(duì)照）中皮質(zhì)可見 壞死的組織，在HMGBl治療例中皮質(zhì)未見壞死的組織。
[0144] 圖7為表示腦梗塞制作后7天的存活率的曲線。制作腦梗塞疾病模型小鼠（缺血 45分鐘、缺血60分鐘）后，進(jìn)行經(jīng)靜脈投予HMGBl所實(shí)施的治療。在缺血45分鐘、缺血60 分鐘的任一情況下，都確認(rèn)了通過利用HMGBl的治療所帶來的存活率的改善。
[0145] 圖8為表示在通過皮膚結(jié)合的GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠中，GFP骨髄嵌合 體小鼠的骨髄細(xì)胞移動(dòng)至野生型小鼠的右足骨折部位并分化成成骨細(xì)胞的照片。通過皮膚 將GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠結(jié)合、在野生型小鼠中制作骨折。在骨折部位的治愈后， 在表達(dá)骨鈣素的成骨細(xì)胞中存在GFP陽性細(xì)胞。教示了：在骨折的治愈過程中，距離損傷部 位遠(yuǎn)的骨髓源性細(xì)胞移動(dòng)至骨折部位并分化成成骨細(xì)胞，從而進(jìn)行生理性損傷治愈。
[0146] 圖9為表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮膚后所觀察到的對(duì)移植皮膚片的 GFP熒光聚集的照片。上面左側(cè)的照片表示皮膚移植部的肉眼圖像、上面中央的照片表示在 移植皮膚與受體皮膚的邊界部（用"丨"表示的部分）附近處受體皮膚的HE組織圖像、上 面右側(cè)照片表示植皮皮膚的HE組織圖像。另外，下面左側(cè)照片表示對(duì)植皮皮膚的GFP熒光 的聚集、下面中央的照片表示植皮部的放大圖像、下面右側(cè)照片表示對(duì)該放大部皮膚的GFP 熒光的聚集。
[0147] 圖10為表示在GFP骨髄移植小鼠背部上的移植皮膚片中聚集的骨髄來源的表皮 細(xì)胞、骨髄來源的真皮成纖維細(xì)胞的照片。左側(cè)開始第1列是DAPI染色（核染色），上面 的照片表示植皮部皮膚的弱放大圖像（100倍）；中間照片以其強(qiáng)放大圖像（200倍）表示 表皮/真皮邊界部；下面以其強(qiáng)放大圖像（200倍）表示毛囊部。左側(cè)開始第2列表示第1 列的各個(gè)區(qū)域的GFP熒光圖像、左側(cè)開始第3列表示其角蛋白5 (K5)的免疫染色圖像、左側(cè) 開始第4列表示將各個(gè)熒光重疊后的圖像（Merge)。觀察到了多個(gè)GFP陽性表皮細(xì)胞和真 皮成纖維細(xì)胞。
[0148] 圖11為表示使用了 Boyden小室的皮膚提取液的骨髄來源間充質(zhì)干細(xì)胞迀移能力 活性測(cè)定結(jié)果的照片。上面左側(cè)照片是使用藍(lán)色色素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了染色的圖 像，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從Boyden小室的上槽內(nèi)通過硅膜上的微孔迀移至皮膚提取液 側(cè)