發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的培養(yǎng)基組合物，且更具體地，涉及用于培養(yǎng)能夠生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的梭菌屬(clostridium)的菌株的培養(yǎng)基組合物。本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物包含至少一種選自下組的植物來(lái)源的蛋白胨：豌豆(gardenpea)水解物、棉籽水解物和小麥面筋(wheatgluten)水解物。

發(fā)明背景

自19世紀(jì)90年代以來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了分泌神經(jīng)毒性毒素的多種梭菌屬菌種(clostridiumsp.)菌株，并且過(guò)去70年已經(jīng)進(jìn)行從這些細(xì)菌分泌的毒素的表征(schant,e.j.等,microbiol.rev.,56:80,1992)。

自梭菌屬菌種衍生的神經(jīng)毒素，即肉毒桿菌毒素，根據(jù)其血清學(xué)性質(zhì)，分為七種血清型(血清型a至g)。每種毒素具有大小約150kda的毒素蛋白質(zhì)，并且天然含有與其結(jié)合的幾種無(wú)毒性蛋白質(zhì)的復(fù)合物。中等復(fù)合物(300kda)由毒素蛋白質(zhì)和無(wú)毒性非血凝素蛋白組成，而大復(fù)合物(450kda)和非常大的復(fù)合物(900kda)由與血凝素結(jié)合的中等大小的復(fù)合物組成(sugiyama,h.,microbiol.rev.,44:419,1980)。已知此類(lèi)無(wú)毒性血凝素蛋白功能為保護(hù)毒素免受腸中的低ph和各種蛋白酶作用。

毒素在細(xì)胞中以具有分子量約150kda的單一多肽合成，然后通過(guò)胞內(nèi)蛋白酶的作用或用人工酶如胰蛋白酶處理從n端末端開(kāi)始的1/3的位置處切割成兩個(gè)單元：輕鏈(l；分子量：50kda)和重鏈(h；分子量：100kda)。與單個(gè)多肽相比，切割的毒素具有大大增加的毒性。兩個(gè)單元通過(guò)二硫鍵彼此連接并具有不同的功能。重鏈結(jié)合靶細(xì)胞的受體(park.m.k.等,femsmicrobiol.lett.,72:243,1990)，并且功能為在低ph(ph4)與生物膜相互作用以形成通道(mantecucco,c.等,tibs.,18:324,1993)，并且輕鏈當(dāng)其可滲透細(xì)胞或通過(guò)電穿孔等導(dǎo)入時(shí)具有干擾神經(jīng)遞質(zhì)分泌的藥理活性(poulain,b.等,proc.natl.acad.sci.usa.,85:4090,1988)。

毒素抑制在神經(jīng)肌肉接頭的膽堿能前突觸處的乙酰膽堿胞吐以引起虛弱。已認(rèn)為甚至用非常少量的毒素的處理表現(xiàn)出毒性，這提示了毒素具有任何酶活性(simpson,l.l.等,ann.rev.pharmacol.toxicol.,26:427,1986)。

根據(jù)最近的報(bào)道，毒素具有金屬肽酶活性，并且其底物包括突觸泡蛋白(synaptobrevin)、突觸融合蛋白(syntaxin)，25kda突觸小體相關(guān)蛋白(snap25)等，它們是胞吐機(jī)構(gòu)復(fù)合物的單元蛋白質(zhì)。每種類(lèi)型的毒素使用上述三種蛋白質(zhì)之一作為其底物，并且已知b、d、f和g型毒素在特定位點(diǎn)處切割突觸泡蛋白，a和e型毒素在特定位點(diǎn)處切割snap25，并且c型在特定位點(diǎn)處切割突觸融合蛋白(binz,t.等,j.biol.chem.,265:9153,1994)。

特別地，已知a型肉毒桿菌毒素可溶于ph4.0-6.8的稀水溶液中。已知穩(wěn)定的無(wú)毒性蛋白質(zhì)在約7以上的ph與神經(jīng)毒素分離，并且因此毒性逐漸喪失。特別地，已知毒性隨著ph和溫度升高而降低。

肉毒桿菌毒素即使少量也是對(duì)人體致命的，并且容易大量生產(chǎn)。因此，它與炭疽芽孢桿菌(bacillusanthracis)、鼠疫耶爾森菌(yersiniapestis)和天花病毒(smallpoxvirus)一起構(gòu)成四大生物恐怖武器。然而，發(fā)現(xiàn)當(dāng)a型肉毒桿菌毒素以不系統(tǒng)地影響人體的劑量注射時(shí)，它可以使注射部位中的局部肌肉癱瘓?；谶@一特點(diǎn)，a型肉毒桿菌毒素可用于寬范圍的應(yīng)用，包括除皺劑(winkleremovingagent)、治療痙攣性偏癱和大腦性癱瘓的藥劑等。因此，對(duì)a型肉毒桿菌毒素的需求已經(jīng)增加，并已經(jīng)積極開(kāi)展關(guān)于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的方法的研究以滿足需求。

目前典型的商業(yè)產(chǎn)品是可從allergan,inc.,usa商購(gòu)的(a型肉毒桿菌毒素的純化神經(jīng)毒素復(fù)合物)。100單位的小瓶由約5ng的a型肉毒桿菌毒素的純化神經(jīng)毒素復(fù)合物、0.5mg人血清白蛋白和0.9mg氯化鈉組成，并使用無(wú)防腐劑的無(wú)菌鹽水(0.9％氯化鈉注射液)重建。其它商業(yè)產(chǎn)品包括可購(gòu)自ipsenltd.,uk的(肉毒梭菌a型毒素和血凝素的復(fù)合物，其在包含肉毒桿菌毒素的藥物組合物中具有乳糖和人血清白蛋白，并且在使用前使用0.9％氯化鈉重建)，可購(gòu)自solsticeneurosciences,inc的(包含b型毒素毒素、人血清白蛋白、琥珀酸鈉和氯化鈉的可注射溶液(約5.6的ph))。

用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基含有動(dòng)物成分，所述培養(yǎng)基通常用于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的方法，如韓國(guó)專(zhuān)利no.10-1339349中公開(kāi)。因此，如果稱(chēng)為引起傳染性海綿狀腦病的作用劑的動(dòng)物異常朊病毒由于污染而被包含在動(dòng)物成分中，則它在用于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的過(guò)程中造成問(wèn)題。

傳染性海綿狀腦病(tse)稱(chēng)為導(dǎo)致神經(jīng)元嚴(yán)重變性的神經(jīng)變性性疾病，并且其實(shí)例包括牛海綿狀腦病(bse)、羊瘙癢癥(scrapie)、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布(creutzfeldt-jakob)病(cjd)、杰茨曼-斯脫司勒-史茵克(gerstmann-straussler-scheinker)綜合征、庫(kù)魯病(kuru)、傳染性水貂腦病(transmissibleminkencephalopathy)、慢性消耗性疾病(chronicwastingdisease)、貓海綿狀腦病(felinespongiformencephalopathy)等，其影響人和動(dòng)物。報(bào)道了bse通過(guò)物種屏障，甚至傳染人類(lèi)。

引起傳染性海綿狀腦病(tse)的作用劑具有的特征在于它沒(méi)有免疫原性，并且潛伏期(incubationperiod)長(zhǎng)。從bse影響的牛腦組織的組織病理學(xué)分析可以看出，由于對(duì)神經(jīng)元的損傷和異常蛋白質(zhì)纖維的沉積，腦中形成了特殊的海綿狀空泡。

tse的原因是稱(chēng)為異常朊病毒的蛋白質(zhì)性感染性顆粒。與需要核酸的一般病毒不同，異常朊病毒是由不含核酸的單獨(dú)蛋白質(zhì)組成的感染性顆粒。關(guān)于tse，已知當(dāng)作為感染性顆粒的異常朊病毒(prpsc)與正常朊病毒(prpc)結(jié)合時(shí)，將其轉(zhuǎn)化為病原性朊病毒，然后將其積聚在腦中(prusinersb,alzheimerdisassocdisord.,3:52-78,1989)。

克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病是一種罕見(jiàn)的人類(lèi)傳染性海綿狀腦病(tse)的神經(jīng)變性性疾病，其中傳染原顯然是朊病毒蛋白的異常亞型(isoform)。在六個(gè)月內(nèi)，具有克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病的個(gè)體可從表面完全健康狀況惡化到運(yùn)動(dòng)不能性緘默(akineticmutism)。因此，可存在從含有使用動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品獲得的生物制劑如肉毒桿菌毒素的藥物組合物的施用中獲得朊病毒介導(dǎo)的疾病(如克雅氏綜合征)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，如果藥物組合物由使用動(dòng)物來(lái)源的成分生產(chǎn)的藥物物質(zhì)制備，則它可使患者受到接受各種病原體或傳染原的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

在此技術(shù)背景下，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將包含無(wú)傳染性海綿狀腦病(tse)的植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)成分的培養(yǎng)基用于肉毒梭菌的培養(yǎng)以防止發(fā)生上述朊病毒介導(dǎo)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，可以排除發(fā)生可在目前使用的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)中存在的朊病毒介導(dǎo)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并且肉毒梭菌在該培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率與目前使用的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)速率相比可為增加的，由此完成本發(fā)明。

發(fā)明概述

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的目的是提供培養(yǎng)基組合物，其包含沒(méi)有傳染性海綿狀腦病(tse)感染風(fēng)險(xiǎn)的植物來(lái)源的蛋白胨，以及生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的方法，其通過(guò)在培養(yǎng)基組合物中培養(yǎng)肉毒梭菌來(lái)改善肉毒桿菌毒素的生產(chǎn)。

技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基組合物，所述培養(yǎng)基組合物包含：至少一種選自下組的植物來(lái)源的蛋白胨：豌豆水解物、棉籽水解物和小麥面筋水解物。

本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的方法，包括以下步驟：(a)使用上述培養(yǎng)基組合物培養(yǎng)肉毒梭菌以生產(chǎn)肉毒桿菌毒素；并且(b)回收生產(chǎn)的肉毒桿菌毒素。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了含有植物來(lái)源的蛋白胨的培養(yǎng)基(apf培養(yǎng)基)中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

圖2顯示了在含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

圖3顯示檢查含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素的培養(yǎng)基滅菌后是否形成沉淀物的結(jié)果。

圖4顯示檢查含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基滅菌后是否形成沉淀物的結(jié)果。

圖5顯示通過(guò)對(duì)用于培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基(其含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì))另外添加維生素、氨基酸和“無(wú)葡萄糖和l-谷氨酰胺的bdrecharge^tm”獲得的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

圖6顯示了用于培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基(其含有各種種類(lèi)的植物來(lái)源的蛋白胨)中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

圖7顯示了用于礦物質(zhì)篩選的ffd等值線圖和響應(yīng)優(yōu)化。圖7a高設(shè)置的等值線圖；圖7b中間設(shè)置的等值線圖；圖7c低設(shè)置的等值線圖；和圖7d最大od的響應(yīng)優(yōu)化。

圖8顯示了用于礦物質(zhì)篩選的ffd等值線圖和響應(yīng)優(yōu)化。圖8a高設(shè)置的等值線圖；圖8b中間設(shè)置的等值線圖；圖8c低設(shè)置的等值線圖；和圖8d最大od的響應(yīng)優(yōu)化。

圖9顯示了用于植物蛋白胨篩選的等值線圖和響應(yīng)優(yōu)化。圖9a中間設(shè)置的等值線圖；圖9b低設(shè)置的等值線圖；和圖9c最大od的響應(yīng)優(yōu)化。

圖10顯示了最終選擇的apf培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)曲線，和毒素濃度的變化。

實(shí)施發(fā)明的最佳方式

在本發(fā)明中，嘗試制備與目前使用的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)相比進(jìn)一步增加肉毒梭菌的生長(zhǎng)速度，并且沒(méi)有tse等感染的風(fēng)險(xiǎn)的培養(yǎng)基。因此，使用含有植物來(lái)源的蛋白胨的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)(apf)培養(yǎng)基，并檢查apf培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)。結(jié)果，與目前使用的培養(yǎng)基相比，apf培養(yǎng)基顯示細(xì)菌生長(zhǎng)速度增加。因此，如果使用apf培養(yǎng)基，則可以通過(guò)在無(wú)tse的條件下以安全的方式培養(yǎng)細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)高濃度的肉毒桿菌毒素。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“目前使用的培養(yǎng)基或初始培養(yǎng)基”意指包含酪蛋白水解物、酵母提取物和硫代乙醇酸鹽(thioglycollate)培養(yǎng)基(其為動(dòng)物來(lái)源的培養(yǎng)基成分)的培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)“apf培養(yǎng)基(無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基)”意指不含動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)，并且含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)和葡萄糖的培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的實(shí)例中，為了通過(guò)在無(wú)傳染性海綿狀腦病(tse)的條件下培養(yǎng)肉毒梭菌來(lái)生產(chǎn)肉毒桿菌毒素，制備包含無(wú)tse的植物來(lái)源的蛋白胨的apf培養(yǎng)基，并且與目前使用的培養(yǎng)基(含有動(dòng)物成分)比較。結(jié)果，可以看出，用于培養(yǎng)肉毒梭菌的最佳培養(yǎng)基組合物是包含植物來(lái)源的蛋白胨、至少一種選自kh2po4、k2hpo4和na2hpo4的礦物質(zhì)，和碳源(例如葡萄糖)的培養(yǎng)基，并且發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基中細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)。結(jié)果，如表13中所示，確定了用于培養(yǎng)肉毒梭菌的最終選擇的培養(yǎng)基組合物中的植物來(lái)源的蛋白胨的最佳含量為5g/lhy-pea^tm7404、10g/lultrapep^tm棉和5g/lhypep^tm4601n，并且培養(yǎng)基組合物中礦物質(zhì)的最佳含量為5.5g/lk2hpo4和3g/lna2hpo4。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，測(cè)量了包含植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的最終選擇的apf培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)模式和毒素濃度。結(jié)果，如表12和圖10中所示，肉毒梭菌的12小時(shí)培養(yǎng)后od值開(kāi)始增加，并在培養(yǎng)的24小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基顯示3.5465的od540nm和3.0695的od600nm。然后，od值逐漸降低，并且在培養(yǎng)的48小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基顯示0.792的od540nm和0.7224的od600nm。肉毒梭菌培養(yǎng)上清液中的毒素濃度在培養(yǎng)5小時(shí)后開(kāi)始增加，并顯示31.41μg/ml的最終值。當(dāng)破裂細(xì)菌后測(cè)量毒素濃度時(shí)，培養(yǎng)5小時(shí)后開(kāi)始產(chǎn)生毒素，并且毒素濃度持續(xù)增加，培養(yǎng)28小時(shí)后維持于一致的水平，并且顯示38.39μg/ml的最終值。

基于此，一方面，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基組合物，所述培養(yǎng)基組合物包含：至少一種選自下組的植物來(lái)源的蛋白胨：豌豆水解物、棉籽水解物和小麥面筋水解物。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“植物來(lái)源的蛋白胨”是指從豌豆、棉籽或小麥面筋提取的蛋白胨。優(yōu)選地，植物來(lái)源的蛋白胨可為可商購(gòu)的hy-pea^tm7404、ultrapep^tm棉、hypep^tm7504或hypep^tm4601n，但不限于此。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“植物來(lái)源的蛋白胨”或“植物來(lái)源的水解物”意指通過(guò)降解從植物分離的蛋白質(zhì)而獲得的產(chǎn)物。例如，豌豆蛋白胨(豌豆水解物)意指通過(guò)降解從豌豆中分離的總蛋白而獲得的產(chǎn)物。

植物來(lái)源的蛋白質(zhì)的降解優(yōu)選通過(guò)部分消化來(lái)進(jìn)行。蛋白質(zhì)的降解優(yōu)選通過(guò)酸處理、堿處理、酶處理、高壓處理、熱處理或物理處理進(jìn)行。更優(yōu)選地，植物來(lái)源的蛋白胨可以是通過(guò)酶處理獲得的。物理處理是例如研磨。

用于本發(fā)明的植物來(lái)源的蛋白胨是植物來(lái)源的蛋白質(zhì)的部分降解產(chǎn)物，是不僅包含作為單一分子的氨基酸，而且還包含由幾至數(shù)十個(gè)氨基酸組成的肽，和完整的蛋白質(zhì)分子的混合物。

在本發(fā)明中，培養(yǎng)基組合物中植物來(lái)源的蛋白胨的含量可為0.1-10w/v％(1-100g/l)，優(yōu)選0.2-5w/v％(2-50g/l)，更優(yōu)選0.5-2w/v％(5-20g/l)。

在本發(fā)明中，培養(yǎng)基組合物包含所有豌豆水解物、棉籽水解物和小麥面筋水解物，并且培養(yǎng)基組合物中豌豆水解物、棉籽水解物和小麥面筋水解物的含量比可為按重量計(jì)1:0.24-43.62:0.01-50.57，優(yōu)選按重量計(jì)1:0.68-14.46:0.09-9.87，更優(yōu)選按重量計(jì)1:1.6-2.4:0.6-1.4。

在本發(fā)明中，用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基組合物還可以含有碳源和至少一種選自k2hpo4(磷酸氫二鉀)、na2hpo4(磷酸二氫鈉)和kh2po4(磷酸二氫鉀)的礦物質(zhì)。

在本文中，碳源的實(shí)例包括但不限于單糖(例如葡萄糖，果糖等)、二糖(例如麥芽糖，蔗糖等)、寡糖、多糖(例如糊精、環(huán)糊精、淀粉等)，糖醇(例如，木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等)。

在本發(fā)明中，培養(yǎng)基組合物中礦物質(zhì)的含量可為0.05-3.5w/v％(0.5-35g/l)，優(yōu)選0.1-1.75w/v％(1-17.5g/l)，且更優(yōu)選0.25-0.7w/v％(2.5-7g/l)。

另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的方法，包括以下步驟：(a)使用上述培養(yǎng)基組合物培養(yǎng)肉毒梭菌以生產(chǎn)肉毒桿菌毒素；并且(b)回收生產(chǎn)的肉毒桿菌毒素。

在本發(fā)明中，培養(yǎng)可以在厭氧條件下進(jìn)行，并且肉毒桿菌毒素可以選自a、b、c、d、e、f、g型的肉毒桿菌毒素。

實(shí)施例

在下文中，參照實(shí)施例，更詳細(xì)描述本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些實(shí)施例僅僅是示例性的目的，而不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附權(quán)利要求書(shū)及其等同方案來(lái)限定。

實(shí)施例1：在植物來(lái)源的蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌

1-1：目前用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成

用于本發(fā)明的試劑和培養(yǎng)基組分購(gòu)自sigma(usa)、kerryinc.(usa)、bdbiosciences(usa)、gibcolifetechnologies(usa)和quest(usa)。

使用目前使用的培養(yǎng)基進(jìn)行肉毒梭菌的種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)以生產(chǎn)肉毒桿菌毒素，所述培養(yǎng)基具有包含2％酪蛋白水解物(20g/l)、1％酵母提取物(10g/l)、1％葡萄糖(10g/l)和0.5％硫代乙醇酸鹽培養(yǎng)基(5g/l)的組合物。每升目前使用的培養(yǎng)基的5g硫代乙醇酸鹽培養(yǎng)基由2.52g酪蛋白的酶消化物、0.84g酵母提取物、0.925g右旋糖、0.085g硫代乙醇酸鈉、0.42gnacl、0.085gl-半胱氨酸，0.00014g刃天青(resazurin)和0.125g細(xì)菌學(xué)瓊脂組成。

1-2：培養(yǎng)中使用的apf培養(yǎng)基的組成

通過(guò)從目前用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)中除去酪蛋白水解物、酵母提取物和硫代乙醇酸鹽培養(yǎng)基來(lái)制備陰性對(duì)照培養(yǎng)基，并且通過(guò)將四種植物來(lái)源的蛋白胨候選物(hy-pea^tm7404、ultrapep^tm棉、hypep^tm7504、和hypep^tm4601n)添加到陰性對(duì)照培養(yǎng)基中制備無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)(apf)培養(yǎng)基(表1)。

表1顯示了與目前使用的培養(yǎng)基相比，用于培養(yǎng)肉毒梭菌的含有植物來(lái)源的蛋白胨的apf培養(yǎng)基的組分。

表1

1-3：肉毒梭菌的種子培養(yǎng)

將20μl肉毒梭菌(韓國(guó)疾病預(yù)防控制中心登記號(hào)：4-029-cbb-is-001)接種到含有10ml無(wú)菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，所述無(wú)菌培養(yǎng)基具有實(shí)施例1-1和1-2中描述的每種組成，并在35℃在厭氧條件下進(jìn)行初級(jí)種子培養(yǎng)(靜止培養(yǎng))22-30小時(shí)。當(dāng)確認(rèn)了初級(jí)種子培養(yǎng)物中的細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，將8ml初級(jí)種子培養(yǎng)物接種到含有800ml具有相同培養(yǎng)基組成的無(wú)菌培養(yǎng)基的1升培養(yǎng)瓶中，并在35℃在厭氧條件下進(jìn)行二次種子培養(yǎng)(靜止培養(yǎng))8-15小時(shí)。

1-4：肉毒梭菌的主培養(yǎng)

為了通過(guò)培養(yǎng)肉毒梭菌生產(chǎn)肉毒桿菌毒素，進(jìn)行細(xì)菌的主培養(yǎng)。具體地，制備9.3l具有實(shí)施例1-1和1-2中所述的每種組成的培養(yǎng)基，并置于10升培養(yǎng)箱中，然后對(duì)培養(yǎng)基滅菌。供給氮以產(chǎn)生厭氧條件，并且在35℃的溫度和50rpm的攪拌速度下進(jìn)行細(xì)菌的生長(zhǎng)。

通過(guò)與10升培養(yǎng)箱的接種口連接的接種線將實(shí)施例1-3中的1升培養(yǎng)瓶中的二次種子培養(yǎng)物接種到10升培養(yǎng)箱中。在35℃和50rpm的條件下培養(yǎng)10升培養(yǎng)箱中的肉毒梭菌，監(jiān)測(cè)并記錄設(shè)定的培養(yǎng)條件。當(dāng)將細(xì)菌培養(yǎng)100小時(shí)以上時(shí)，終止主培養(yǎng)。

通過(guò)將四種植物來(lái)源的蛋白胨候選物(hy-pea^tm7404、ultrapep^tm棉、hypep^tm7504和hypep^tm4601n)添加到陰性對(duì)照中制備的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)(apf)培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)與通過(guò)從目前使用的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)(表1)中除去酪蛋白水解物、酵母提取物和硫代乙醇酸鹽培養(yǎng)基制備的陰性對(duì)照培養(yǎng)基中的細(xì)菌生長(zhǎng)比較。

因此，如表1和圖1中所示，肉毒梭菌在陰性對(duì)照培養(yǎng)基中未生長(zhǎng)，但在接種細(xì)菌后24小時(shí)開(kāi)始在初始培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)，并且在接種細(xì)菌后30小時(shí)開(kāi)始在含有植物來(lái)源的蛋白胨的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

實(shí)施例2：在含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌

由于在實(shí)施例1中通過(guò)添加四種植物來(lái)源的蛋白胨制備的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)比初始培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)慢，如下提供了其解決方案。

1)為了檢查功能為產(chǎn)生厭氧條件的硫代乙醇酸鹽的效果，從初始培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基)中除去硫代乙醇酸鹽，并且分析無(wú)硫代乙醇酸鹽的培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)速率的變化。

2)由于較慢的生長(zhǎng)速率可以是由于氮源缺乏所致，將用于細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的蛋白胨濃度增加2倍。

3)將通過(guò)將礦物質(zhì)、氨基酸和維生素添加到含有植物來(lái)源的蛋白胨的培養(yǎng)基獲得的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)與美國(guó)專(zhuān)利no.8,012,716(allergan)中公開(kāi)的apf培養(yǎng)基(表2)中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)比較。

表2顯示了用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基的成分，其含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素。

表2

結(jié)果，如表2和圖2中所示，當(dāng)在目前使用的不含硫代乙醇酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)速度比含硫代乙醇酸鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度慢，指示硫代乙醇酸鹽影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速率。當(dāng)將培養(yǎng)基中的蛋白胨濃度增加兩倍時(shí)，細(xì)菌在培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。當(dāng)對(duì)含有蛋白胨的培養(yǎng)基添加礦物質(zhì)成分、氨基酸和維生素的情況下，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度與目前使用的培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)速度相似，但培養(yǎng)基滅菌后形成沉淀物。此外，看到allergan的apf培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)速度與目前使用的培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)速度相似。

實(shí)施例3：通過(guò)滅菌含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素的培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀物

在實(shí)施例2中，觀察到表2中所示的apf培養(yǎng)基候選物2至4中含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)速度與目前使用的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的生長(zhǎng)速度相似。然而，在培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)沉淀物的形成，因此檢查其原因(表3)。

表3顯示了在滅菌中使用并含有植物來(lái)源的蛋白胨、礦物質(zhì)、氨基酸和維生素的用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基的組分。

表3

結(jié)果，如表3和圖3中所示，僅在對(duì)含有植物來(lái)源的蛋白胨的培養(yǎng)基添加礦物質(zhì)的情況下，培養(yǎng)基滅菌后才形成沉淀物，指示沉淀物形成的主要原因?yàn)榈V物質(zhì)。這被認(rèn)為是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基滅菌期間在高溫和高壓條件下，礦物質(zhì)成分相互作用。

實(shí)施例4：通過(guò)滅菌含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基形成沉淀物

為了鑒定如實(shí)施例3中確認(rèn)的通過(guò)滅菌引起的沉淀物形成中牽涉的礦物質(zhì)成分，將不同成分的各種組合添加到培養(yǎng)基中，然后滅菌(表4)。

表4顯示了含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基的成分，以及培養(yǎng)基滅菌的結(jié)果。

表4

結(jié)果，如表4和圖4中所示，在含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基中，含有mgso4·7h2o和k2hpo4的培養(yǎng)基以及含有mgso4·7h2o和na2hpo4的培養(yǎng)基在滅菌后形成沉淀物。

實(shí)施例5：在apf培養(yǎng)基中不形成沉淀物的條件下培養(yǎng)肉毒梭菌

當(dāng)將維生素和氨基酸另外添加到含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的實(shí)施例4的apf培養(yǎng)基中時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定肉毒梭菌的培養(yǎng)是否可能。此外，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以檢查細(xì)菌的培養(yǎng)在不含植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)并含有維生素、氨基酸和/或“不含葡萄糖和l-谷氨酰胺的bdrecharge^tm”(產(chǎn)品目錄編號(hào)670002，bdbioscience)(不含葡萄糖和l-谷氨酰胺的基于酵母提取物的培養(yǎng)基成分)的培養(yǎng)基中是否可能(表5)。

表5顯示通過(guò)對(duì)含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基另外添加維生素、氨基酸和“不含葡萄糖和l-谷氨酰胺的bdrecharge^tm”獲得的培養(yǎng)基組分，以及細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度。

表5

結(jié)果，如表5和圖5中所示，僅在含有植物來(lái)源的蛋白胨和kh2po4、k2hpo4和na2hpo4的兩種或更多種礦物質(zhì)的組合以及進(jìn)一步含有維生素和氨基酸的培養(yǎng)基的情況下，肉毒梭菌在細(xì)菌接種后24小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)。此外，在培養(yǎng)基不含植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)并含有維生素、氨基酸和“不含葡萄糖和l-谷氨酰胺的bdrecharge^tm”的情況下，細(xì)菌在細(xì)菌接種后48小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)?？傊?，對(duì)于培養(yǎng)肉毒梭菌的最合適的培養(yǎng)基組合物包括植物來(lái)源的蛋白胨、kh2po4、k2hpo4、na2hpo4、氨基酸和維生素。

實(shí)施例6：在含有不同植物來(lái)源的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以檢查當(dāng)在對(duì)實(shí)施例5的apf培養(yǎng)基添加植物來(lái)源的蛋白胨的不同組合時(shí)肉毒梭菌的培養(yǎng)是否可能。

表6顯示了含有不同植物來(lái)源的蛋白胨的用于培養(yǎng)肉毒梭菌的培養(yǎng)基的成分，以及檢查細(xì)菌是否在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的結(jié)果。

表6

結(jié)果，如表6和圖6中所示，即使在對(duì)培養(yǎng)基添加四種植物來(lái)源的蛋白胨中僅一種或兩種時(shí)，肉毒梭菌的培養(yǎng)是可能的。

考慮到實(shí)施例5和6的結(jié)果，可以看出培養(yǎng)基中應(yīng)該含有至少一種植物來(lái)源的蛋白胨，并且植物來(lái)源的蛋白胨不能用“不含葡萄糖和l-谷氨酰胺的bdrecharge^tm”(產(chǎn)品目錄編號(hào)670002，bdbioscience)(不含葡萄糖和l-谷氨酰胺的基于酵母提取物的培養(yǎng)基成分)替代。

實(shí)施例7：用于選擇培養(yǎng)基中含有的三類(lèi)礦物質(zhì)中的兩種的實(shí)驗(yàn)

在實(shí)施例1至7中，確定用于肉毒梭菌培養(yǎng)的apf培養(yǎng)基組合物包含葡萄糖、氯化鈉(nacl)、四種植物來(lái)源的蛋白胨、三種礦物質(zhì)、氨基酸和維生素。在這些培養(yǎng)基成分中，除去對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響的培養(yǎng)基成分，以減少培養(yǎng)基成分的數(shù)目。因此，判斷氨基酸和維生素對(duì)肉毒梭菌的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，并且在此判斷下，從培養(yǎng)基成分中除去氨基酸和維生素。另外，為了從三類(lèi)礦物質(zhì)中選出兩種，使用表7中所示的培養(yǎng)基組合物培養(yǎng)細(xì)菌，并測(cè)量接種細(xì)菌后24小時(shí)和48小時(shí)的od(540nm和600nm)值并比較。

表7顯示了源自礦物質(zhì)的第一階段選擇的培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

表7

結(jié)果，如表7中所示，在細(xì)菌接種后24小時(shí)，目前使用的培養(yǎng)基顯示0.942的od(540nm)值，并且含有k2hpo4和na2hpo4的apf培養(yǎng)基顯示apf培養(yǎng)基中的4.964的最高od(540nm)值。另外，在細(xì)菌接種后48小時(shí)，含有kh2po4和na2hpo4的apf培養(yǎng)基顯示最高的od值和活躍的細(xì)菌生長(zhǎng)。

同時(shí)，如圖7a至7d中所示，繪出了顯示高主效應(yīng)的k2hpo4和na2hpo4的等值線圖。因此，隨著k2hpo4和na2hpo4的濃度增加，od值增加。并且，當(dāng)以kh2po4＝0g/l、k2hpo4＝5.5g/l、和na2hpo4＝5g/l的濃度將礦物質(zhì)添加到培養(yǎng)基時(shí)，肉毒梭菌顯示最高的生長(zhǎng)。

同時(shí)，為了根據(jù)更精確的礦物質(zhì)添加來(lái)確認(rèn)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，使用響應(yīng)面法進(jìn)行第二階段實(shí)驗(yàn)。由于培養(yǎng)基組合物不能具有負(fù)值，使用ccf(中心復(fù)合面)設(shè)計(jì)計(jì)劃實(shí)驗(yàn)，并且通過(guò)在表8中所示的培養(yǎng)基組合物中培養(yǎng)細(xì)菌來(lái)進(jìn)行。然后，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前進(jìn)行的ffd的結(jié)果組合并且進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表8顯示了通過(guò)礦物質(zhì)的第二階段選擇獲得的培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

表8

繪制等值線圖并用于比較。如圖8a至8d中所示，隨著kh2po4濃度降低，od值增加。當(dāng)比較最佳條件時(shí)，結(jié)果由于曲率效應(yīng)而與ffd的結(jié)果不同，并且k2hpo4的值相同，但是na2hpo4的值從5g/l變化為3.1313g/l。因此，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析確認(rèn)了培養(yǎng)基的最佳礦物質(zhì)條件為5.5g/lk2hpo4和3g/lna2hpo4。

實(shí)施例8：用于選擇培養(yǎng)基中含有的植物來(lái)源的蛋白胨的實(shí)驗(yàn)

如表9和表10所示，根據(jù)混合物設(shè)計(jì)合并植物來(lái)源的蛋白胨，并檢查含有組合的植物來(lái)源的蛋白胨的培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

表9顯示了通過(guò)第一階段選擇植物來(lái)源的蛋白胨所獲得的培養(yǎng)基的組成和使用培養(yǎng)基的肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

表9

表10顯示了通過(guò)植物來(lái)源的蛋白胨的第二階段選擇獲得的培養(yǎng)基的組成合使用培養(yǎng)基的肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

表10

結(jié)果，如圖9a至9c中所示，繪制等值線圖并用于比較。確定對(duì)應(yīng)于組分c的hypep^tm7504對(duì)肉毒梭菌的生長(zhǎng)具有最低的影響。基于此測(cè)定，從培養(yǎng)基組分排除hypep^tm7504?？傊_定培養(yǎng)基中含有的最終選擇的植物來(lái)源的蛋白胨的組成包含5g/lhy-pea^tm7404、10g/lultrapep^tm棉和5g/lhypep^tm4601n。

實(shí)施例9：含有nacl或不含nacl的培養(yǎng)基中的肉毒梭菌的培養(yǎng)

實(shí)施例1至8中使用的培養(yǎng)基組合物含有少量(0.5g/l)nacl。為了根據(jù)nacl的濃度變化檢查肉毒梭菌的生長(zhǎng)，將培養(yǎng)基中nacl的含量調(diào)節(jié)至0至1g/l的范圍，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌。

表11顯示了用于培養(yǎng)肉毒梭菌的含有nacl的培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)。

表11

因此，如圖11中所示，無(wú)論培養(yǎng)基含有nacl與否，細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有差異。因此，從最終的apf培養(yǎng)基成分中排除nacl。

實(shí)施例10：測(cè)量最終選擇的apf培養(yǎng)基中肉毒梭菌的生長(zhǎng)模式和毒素濃度

將肉毒梭菌接種到基于實(shí)施例1至9的結(jié)果確定的最終選擇的肉毒梭菌培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、5g/lhy-pea^tm7404、10g/lultrapep^tm棉、5g/lhypep^tm4601n、5.5g/lk2hpo4、和3g/lna2hpo4)，然后測(cè)量細(xì)菌的生長(zhǎng)模式和毒素濃度。

表12顯示了在最終選擇的apf培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的肉毒梭菌的時(shí)間依賴(lài)性od值和毒素濃度。

表12

因此，如表12和圖10中所示，在培養(yǎng)肉毒梭菌12小時(shí)后od值開(kāi)始增加，并且培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)培養(yǎng)基顯示3.5465的od540nm和3.0695的od600nm。然后，od值逐漸降低，并且在培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基顯示0.792的od540nm和0.7224的od600nm。肉毒梭菌上清液中的毒素濃度在培養(yǎng)24小時(shí)后開(kāi)始增加，并且顯示最終值31.41μg/ml。當(dāng)破裂細(xì)菌后測(cè)量毒素濃度時(shí)，培養(yǎng)5小時(shí)后開(kāi)始生產(chǎn)毒素，并且毒素濃度持續(xù)增加，培養(yǎng)28小時(shí)后維持于一致的水平，并且顯示最終值38.39μg/ml。

總之，在表13中匯總了基于實(shí)施例1至10的結(jié)果確定的最終選擇的apf(無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基)組成。

表13

工業(yè)實(shí)用性

如上所述，當(dāng)將含有植物來(lái)源的蛋白胨和礦物質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基用于肉毒梭菌的培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)速度為目前使用的培養(yǎng)基中的細(xì)菌的生長(zhǎng)速度的約1.5-2倍高。此外，當(dāng)通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌生產(chǎn)肉毒桿菌毒素時(shí)，可通過(guò)阻斷動(dòng)物來(lái)源的成分的引入來(lái)防止傳染性海綿狀腦病(tse)等的感染。

盡管已經(jīng)參照具體特征詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是，本說(shuō)明書(shū)僅針對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案，而并不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附權(quán)利要求書(shū)及其等同方案來(lái)限定。