本發(fā)明涉及青春雙歧桿菌(bifidobacteriumadolescentis)的新型分離菌株，其能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter；ii)誘導il-10分泌>200pg/ml；和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所述菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。此外，本發(fā)明涉及這些菌株用于改善腸道屏障功能和/或引發(fā)抗炎免疫應答的用途。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種青春雙歧桿菌菌株，其發(fā)酵d-核糖，不發(fā)酵d-山梨糖醇，并且具有包含以下的16s核糖體基因序列：seqidno:1或2；seqidno:3、4或5；seqidno:6、7、8或9；以及seqidno:10或11。
背景技術：
：：雙歧桿菌是胃腸道的天然棲居者，其具有遺傳適應性使其能夠定殖此苛刻且復雜的生境。雙歧桿菌與腸道功能的關鍵要素相互作用并且有助于維持體內平衡。近期的科學進展顯示雙歧桿菌通過與宿主的菌株依賴性相互作用可降低粘膜抗原負載，改善腸道屏障并且誘導局部和全身免疫應答的調節(jié)。由于其對人類健康公認的益處，雙歧桿菌被用作益生菌。益生菌是“活的微生物，當其以足量施用時，向宿主提供健康益處”(fao/who,2001)?？缮藤彨@得約一打具有臨床上記錄的效果的雙歧桿菌屬菌株。這些中的一半是動物雙歧桿菌乳酸亞種(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)菌株并且其余是長雙歧桿菌長亞種(bifidobacteriumlongumsubsp.longum)、長雙歧桿菌嬰兒亞種(b.longumsubsp.infantis)、或短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)菌株。青春雙歧桿菌的模式菌株(atcc15703t)是從成人的腸道中分離(reuter,1971)。青春雙歧桿菌菌株經常在成人腸道中檢測到(turroni等人,2009)。腸道上皮是覆蓋小腸和大腸的柱狀且無纖毛的細胞層。腸道上皮層構成了針對外界環(huán)境的最大且最重要的屏障并且維持上皮完整性對保持健康必不可少。上皮襯層是由被由特化的杯狀細胞產生的多層粘液覆蓋的單層上皮細胞組成。在上皮細胞下面是含有多種免疫細胞的固有層(腸相關淋巴組織；galt)。上皮細胞通過其中緊密連接(tj)在防止分子進入細胞之間的上皮中起主要作用的細胞連接結合在一起。tj負責限制蛋白質、脂質及小溶質的細胞旁(細胞之間)擴散。因此，在健康上皮中，僅水和小分子(離子)細胞旁滲透，而較大分子的轉運是通過細胞攝取機制來調節(jié)。tj是由跨越兩個鄰近腸道上皮細胞之間的空間的蛋白質組成。tj是參與發(fā)育、生理及病理過程的動態(tài)結構。各種應激物可致使tj削弱，由此增強分子向粘膜中的細胞旁(未經調節(jié)的)轉運。受損的腸道屏障功能的特征是腸粘膜對腔內大分子、抗原及毒素的滲透性增加，由此可引起粘膜的發(fā)炎、變性和/或萎縮。此病狀，有時稱為‘腸漏綜合征’，取決于嚴重性而與許多癥狀有關。來源于腸道中的革蘭氏陰性細菌的脂多糖(lps)是非常有效的免疫應答激活劑。一旦粘膜免疫系統(tǒng)被激活，促炎介質便加劇tj的開放，從而導致增加的滲透性和發(fā)炎的惡性循環(huán)。已顯示益生菌菌株在體外(anderson等人,2010；karczewski等人,2010；liu等人,2010a；liu等人,2010b；donato等人,2010)、在小鼠模型中(generoso等人,2010；liu等人,2011；miyauchi等人,2009)、以及在人中(karczewski等人,2010)降低腸上皮滲透性。已經發(fā)現(xiàn)了體外與體內結果之間的一般良好一致性。參與屏障功能的益生菌改善的機制包括tj蛋白的增加表達，如閉合蛋白(occludin)、密封蛋白(claudin-1)、f11受體(f11r)及閉鎖小帶1(zo-1)和2(anderson等人,2010；liu等人,2010a；liu等人,2010b；miyauchi等人,2009；ukena等人,2007。閉合蛋白和zo-1向tj結構附近的增加定位見于用植物乳桿菌wcfs1(karczewski等人,2010)或鼠李糖乳桿菌lgg(donato等人,2010)處理的人活體組織活檢(karczewski等人,2010)以及caco-2單層中，可能涉及toll樣(tlr)受體2信號傳導(karczewski等人,2010)。在壞死性小腸結腸炎(nec)的新生小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)腸道滲透性增加先于nec，而嬰兒雙歧桿菌bb-02施用削弱了腸道滲透性增加，保留閉合蛋白及密封蛋白2和4在tj處的定位，并且降低nec發(fā)病率(bergmann等人,2013)。與小鼠中的結腸炎有關的腸道滲透性增加通過益生菌(vsl#3)抵消閉合蛋白、zo-1、以及密封蛋白-1、-3、-4及5的表達減少和再分布而得以完全預防(mennigen等人,2009)。所提出的細菌信號組分包括植物乳桿菌表層蛋白質(liu等人,2010a)和吲哚(bansal等人,2010)。在體內，屏障功能可通過各種非侵入性測定法通過施用大丸劑的例如credta或兩種非代謝糖(例如，乳果糖和甘露糖醇)接著分別測定在尿中的cr或兩種糖的比率來測量。甘露糖醇是單糖且因此容易吸收并充當跨細胞攝取的標記物，而二糖的乳果糖通過細胞襯里被排除且由此僅稍微吸收并充當粘膜完整性的標記物。乳果糖和甘露糖醇測試由于糖在大腸中的細菌分解而提供僅與小腸有關的完整性信息，而credta更穩(wěn)定并優(yōu)先提供有關結腸上皮的信息，因為這里是化合物存在時間最久的地方(arrieta等人,2006)。不足的腸道屏障功能與腸道及全身臨床表現(xiàn)有關。腸道滲透性在炎性腸病(ibd)和腸易激綜合征(ibs)的情形中被研究得最廣泛。炎性腸病(ibd；克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎)的特征是慢性復發(fā)性腸炎，伴有先天和適應性免疫系統(tǒng)的參與(zhang和li,2014)。涉及細胞因子白介素23(il-23)和t輔助17(th17)細胞的促炎途徑在患有潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病的患者中是增加的(song等人,2013)，這得到了提示il23r基因中的基因變體與ibd之間的關聯(lián)的遺傳研究的支持(beaudoin等人,2013)。ibd的病因學是未知的，但在ibd中存在腸道屏障功能受損的廣泛支持數(shù)據(gecse等人,2011；gerova等人,2011；odenwald和turner,2012)。在具有活動性疾病的克羅恩氏病患者中發(fā)現(xiàn)腸道滲透性提高(ukabam等人,1983)并且患有克羅恩氏病的患者的10-20％的健康親屬具有增加的滲透性(hollander等人,1986)。ibd發(fā)病機理的一個理論提示增加的腸道滲透性將下層的galt暴露于通常被排除的物質，由此產生自身延續(xù)性炎癥過程(poritz等人,2007)。在葡聚糖硫酸鈉(dss)結腸炎小鼠模型中，已顯示增加的腸道滲透性發(fā)生在顯著的腸炎進展之前(poritz等人,2007)。腸易激綜合征(ibs)的癥狀包括腹絞痛和腹痛，其常常與伴有腹瀉、便秘或兩者交替發(fā)作的異常排便習慣同時出現(xiàn)。ibs的病因學和病理生理學是未知的。若干研究已顯示在ibs中腸道滲透性增加(camilleri等人,2007；camilleri等人,2012；gecse等人,2011；martinez等人,2012；piche等人,2009)。增加的滲透性是由tj蛋白質密封蛋白-1、zo-1及閉合蛋白的正常頂端表達的破環(huán)引起(camilleri等人,2012)。增加的腸道滲透性伴隨有腸道中的持續(xù)性低級免疫激活。先前研究發(fā)現(xiàn)在ibs患者中升高的糞便鈣衛(wèi)蛋白(goepp等人,2014)指示增強的炎癥。細胞因子失調也可參與炎癥過程并且近期的元分析顯示了il-10和腫瘤壞死因子α(tnfα)基因多態(tài)性與ibs之間的關聯(lián)(qin等人,2013；schmulson等人,2013；bashashati等人,2012)。與對照相比在ibs中觀察到tnfα細胞因子的血清/血漿不平衡(bashashati等人2014)并且在腹瀉型ibd患者中il-6和tnfα的血清水平與對照相比顯著較高(rana等人,2012)?？傊?，這提示朝向更高促炎階段的免疫移位。用益生菌發(fā)酵的牛奶(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌及長雙歧桿菌)的處理顯著降低ibs患者中的小腸滲透性并且改善平均總ibs分數(shù)(zeng等人,2008)。慢性肝病與腸道中的變化有關并且肝病與腸道微生物的變化有關(schnabl和brenner,2014)。微生物組成的這些變化可經由識別微生物產物的tlr受體和nod樣受體(nlr)引起粘膜免疫系統(tǒng)的激活，隨后活化的b細胞的核因子κ輕鏈增強子(nf-kb)激活引發(fā)免疫細胞募集(chassaing等人2014)。遺傳修飾的動物如tlr4突變小鼠與野生型小鼠相比在膽管結扎之后發(fā)生顯著較輕的肝臟纖維化和肝臟巨噬細胞募集，表明tlr4途徑參與慢性肝病的發(fā)展(seki等人2007)。顯示膽汁淤積性肝病與腸道固有層中的局部炎癥之間的聯(lián)系是通過分泌tnfα的tlr2陽性單核細胞所介導，這也與tj蛋白質zo-1和密封蛋白-4的破壞有關(hartmann等人2012)。細菌或其產品例如lps向腸系膜淋巴結及腸外部位的移位在具有肝硬化的患者中由于增加的腸道滲透性而較為常見(seo和shah,2012)，并且在具有慢性肝病和伴有細菌移位的腸道細菌過度生長的患者中，疾病嚴重度與全身lps水平有關(lin等人1995)。在動物模型和慢性肝病患者兩者中，抗生素治療通過減小細菌負荷和內毒素血癥來降低疾病嚴重度(seki等人2007；cirera等人2001)。然而，腸漏和微生物產品的移位也出現(xiàn)在疾病初期并且患有肝病的患者具有受到破壞的腸道屏障，且在體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)細菌產物。微生物產物經由門靜脈或淋巴導管到達肝臟，在那里它們激活了先天免疫系統(tǒng)的肝臟受體(schnabl,2013)。由miele等人(2009)在非酒精性脂肪肝病(nafld)患者中進行的實驗強烈地提示nafld與增加的腸道滲透性和小腸細菌過度生長有關。細菌移位與促炎細胞因子的血漿水平及氧化氮合酶的活化有關(frances等人,2010)，這可造成肝損傷。因此，減少細菌移位可代表減輕肝病的治療。細菌向腸系膜淋巴結、門脈及動脈血液中移位的減少見于在用乳桿菌屬(嗜酸乳桿菌nm1、鼠李糖乳桿菌gg、植物乳桿菌299v、鼠李糖乳桿菌271及動物乳桿菌nm2)的組合處理之后的急性肝損傷大鼠模型中。另外，降低水平的腸桿菌科(革蘭氏陰性細菌)見于盲腸和結腸中。通過血清丙氨酸轉氨酶水平的降低指示肝細胞損傷的減輕(adawi等人,2001)。益生菌處理不僅減少細菌移位，而且減輕由內毒素(主要是來源于革蘭氏陰性細菌的lps)所引起的內毒素血癥。似乎合理的是，內毒素經由枯否細胞刺激和tnfα產生而對nafld及非酒精性脂肪性肝炎(nash)的發(fā)展很重要(osman等人,2007)。降低的血漿內毒素水平可以是減小的腸道滲透性的結果。在用兩種益生菌混合物(雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌及腸球菌或枯草芽孢桿菌和屎腸球菌)(wigg等人,2001)、或合生素產物的治療(戊糖片球菌5-33:3、腸膜明串珠菌32-77:1、副干酪乳桿菌副干酪亞種f19、植物乳桿菌2592+生物活性的可發(fā)酵纖維；medipharm)、或益生菌混合物單獨的治療(zhao等人,2004)之后，在肝硬化患者中發(fā)現(xiàn)降低濃度的血漿內毒素。在肝硬化患者中，與安慰劑相比在用大腸桿菌nissle1917治療之后發(fā)現(xiàn)內毒素血癥的微小降低。眾所周知，酒精增加腸道滲透性并且這可以通過增加門脈循環(huán)內毒素(lps)加速肝病的進展。發(fā)現(xiàn)來自鼠李糖乳桿菌lgg的可溶性因子減少酒精誘導的腸道滲透性增加和內毒素移位，并且改善小鼠模型中急性酒精誘發(fā)的肝損傷(wang等人,2012)。通過益生菌改善腸道屏障已在體外和體內得到充分證明。鑒于細菌移位和內毒素血癥對肝病發(fā)展的重要性，似乎可能的是具有腸道屏障加強性質的益生菌將對nafld和nash具有有益效應。代謝失調(2型糖尿病和胰島素抗性)和肥胖癥與炎癥緊密相關。最近有證據提示高脂飲食與細菌之間的相互作用，并且腸粘膜可以促進小腸炎癥作為在肥胖癥和胰島素抗性發(fā)展中的早期事件(ding和lund,2011)。動物研究顯示在體重和脂肪增加之前，在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠的回腸中tnfα的上調變得明顯，并且nf-kb的促炎途徑也在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠的回腸中上調且在結腸中以較小程度上調(ding等人,2010)。在嚴重肥胖兒童中，糞便鈣衛(wèi)蛋白在47％的患者中增加，而直腸硝酸在88％的肥胖兒童中病理性地較高，并且在100％糖尿病患者中支持遠端腸炎牽涉于肥胖癥和糖尿病中的假說(spagnuolo等人,2010)。在肥胖女性的研究中，促炎途徑的基因表達在飲食誘發(fā)的體重減輕平均10％之后顯著下調，伴隨有tnfα、il-1β、il-8及單核細胞趨化蛋白1和巨噬細胞浸潤的減少(pendyala等人,2011)。總而言之，這些數(shù)據意味著在肥胖受試者和糖尿病患者中的腸道與健康受試者相比具有增強的炎癥狀態(tài)，并且這可以推進體重增加和葡萄糖/胰島素失衡的發(fā)展。無菌小鼠受到保護以免暴露于高脂/高精制糖‘西方’飲食而發(fā)生代謝并發(fā)癥。移位的細菌lps已被鑒定為低級慢性炎癥(稱為‘代謝型內毒素血癥’)的觸發(fā)因子(cani等人,2007)。根據此模型，lps是從腸道中溶解的革蘭氏陰性細菌中釋放并且當(例如由于含有高脂肪的飲食)屏障受損時移位穿過上皮。提高的血漿lps水平(2-3倍)引起稍微增強但持續(xù)性的炎性狀態(tài)，這觸發(fā)了體重增加和胰島素抗性(cani等人,2007)。lps和腸道滲透性標記物(連蛋白)的提高的循環(huán)水平見于具有2型糖尿病(hawkesworth等人,2012；jayashree等人,2014)以及1型糖尿病(dekort等人,2011；vaarala等人,2008)的患者中。連蛋白上調，即提高的腸道滲透性，似乎先于1型糖尿病的發(fā)病出現(xiàn)(sapone等人,2006)。雙歧桿菌的腸道定殖通過增加zo-1和閉合蛋白的表達增強腸道屏障功能，并且顯著并積極地改善葡萄糖耐量、葡萄糖誘導的胰島素分泌并且正?；装Y狀態(tài)(cani等人,2007)。由于腸道屏障完整性喪失所致的代謝型內毒素血癥激活tlr4介導的炎癥并誘導氧化應激，氧化應激與增加的心血管風險和死亡有關。lps穿過腸道屏障的移位增加造成較高的lps循環(huán)水平，這促進了動脈粥樣硬化(neves等人,2013)。全身炎癥標記物如循環(huán)lps在具有慢性感染的患者中升高并且是增加的動脈粥樣硬化風險的有力預測因子(kiechl等人,2001)。自身免疫性疾病的關鍵要素是適應性免疫和在th1與th2免疫應答之間的不平衡。在新生兒中，微生物抗原可誘導th1免疫應答，其抵消了通常占主導的th2免疫應答。th1免疫應答是自身免疫性和炎性疾病的特征。近來，已提出受損的腸道屏障牽涉于自身免疫性疾病的發(fā)展中(fasano和shea-donohue,2005)。根據此假說，在自身免疫性疾病的發(fā)病機理中存在三個關鍵要素。1.先天與適應性免疫之間的錯誤溝通。2.非自身抗原(環(huán)境觸發(fā)物)的連續(xù)刺激使該過程延續(xù)。3.與環(huán)境相互作用的粘膜屏障的保護功能的喪失(胃腸及肺粘膜)。乳糜瀉的病理學是一個例子。在乳糜瀉發(fā)展的初期，tj開放且腸組織損傷發(fā)生。醇溶蛋白以myd88依賴性方式觸發(fā)連蛋白先天免疫途徑，所述方式引發(fā)了tj的開放并誘發(fā)腸粘膜中的促炎(th1)反應。一旦將醇溶蛋白(谷蛋白)從飲食中除去，血清連蛋白水平便降低，腸道恢復其基線屏障功能，自身抗體滴度被歸一化，并且自身免疫過程關閉(fasano和shea-donohue,2005；fasano,2012)。包括1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥及類風濕性關節(jié)炎的若干其他自身免疫性疾病的特征是增加的腸道滲透性，這允許抗原從腸道微生物群通過，攻擊免疫系統(tǒng)以產生免疫應答，該免疫應答可以靶向遺傳易感個體中的任何器官或組織(通過分子模擬)(fasano,2012)。此外，已認識到尤其是小腸的免疫系統(tǒng)誘發(fā)針對例如食物抗原或可參與自身免疫性疾病發(fā)展的共生體的耐受性應答。小腸被確認重定向并控制促炎th17細胞(esplugues等人2011)并且已提出益生菌可通過調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)起作用并因此抑制類風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥的動物模型中的病情發(fā)展和嚴重性(so等人,2008；kwon等人,2013)。無菌小鼠與常規(guī)小鼠相比具有針對應激的放大的下丘腦-垂體-腎上腺反應，這可通過與嬰兒雙歧桿菌的單一聯(lián)合來逆轉，提示腸道細菌與大腦之間的串擾(cross-talk)(sudo等人,2004)。增加的腸道滲透性、細菌移位及tlr4途徑的激活暗示為心理障礙與軀體疾病(包括心境障礙、認知障礙及慢性疲勞綜合征)之間的聯(lián)系。tlr4途徑標記物的增加的表達見于診斷有嚴重抑郁癥的患者中，伴隨增加的細菌穿過腸道屏障的移位(keri等人,2014)。移位的革蘭氏陰性腸道細菌及l(fā)ps激活免疫細胞以引發(fā)iga和igm應答，這引起了與神經炎癥和神經進展有關的以及與憂郁癥狀發(fā)作有關的免疫途徑的進行性放大，所述憂郁癥狀例如快感缺乏、厭食、體量下降、精神運動性阻滯、焦慮及疲乏(maes等人,2012)。跨上皮電阻(ter)上皮細胞單層的屏障性能在很大程度上取決于位于細胞間隙中的tj，在所述細胞間隙處，tj在頂端與基底外側膜結構域之間形成密封并且調節(jié)分子的細胞旁穿過。屏障功能不是靜態(tài)的但可通過暴露于特定的刺激而有意地調節(jié)。所獲得的tj網狀結構的動態(tài)性質可方便地通過測量跨上皮電阻(ter)來追蹤。caco-2是來源于人結腸腺癌的構建成熟的細胞系，其通常被用作腸道滲透性模型。當完全分化，caco-2單層形成tj，限制離子轉移且由此產生跨過單層的電阻。bdtm細胞計數(shù)珠陣列(cba)內襯于人胃腸道中的粘膜相關淋巴組織含有免疫細胞的網絡。樹突細胞(dc)通過腸內容物的取樣并經由模式識別受體信號傳導、細胞因子分泌及其在引流淋巴結中將抗原遷移并遞呈給幼稚t細胞的能力引發(fā)對腔內抗原的適當免疫應答來控制免疫力與耐受性之間的平衡。在體內平衡時，腸粘膜中的dc受到共生微生物的調節(jié)以促進foxp3+調節(jié)性t細胞(treg)的增殖，所述treg是促成腸道耐受性的抗炎il-10的強產生者。移位穿過上皮細胞層的腔內抗原結合至dc上表達的模式識別受體并且激活信號傳導途徑，造成具有不同炎性效應的廣泛多種趨化因子和細胞因子的產生與分泌。在此情形中，dc分泌炎性細胞因子如tnfα、il-1b、il-6及il-12對于涉及將嗜中性白細胞和巨噬細胞吸引到感染部位的急性、先天炎性應答很重要。另外，dc是適應性免疫應答調節(jié)中的重要參與者，因此，對于il-10分泌表型的dc調節(jié)有助于treg應答的誘發(fā)，該應答促進腸道耐受性(smith等人,2014)。基于流式細胞術原理的多路免疫測定允許以極少樣品體積同時測定許多可溶性蛋白質。高通量與印象深刻的準確度、靈敏度及重現(xiàn)性的組合使得這些實驗技術與其中多種化合物的快速定量很重要的篩選目的高度相關。dss結腸炎模型嚙齒動物葡聚糖硫酸鈉(dss)結腸炎模型的特征是不受控制的結腸炎癥。在許多方面其類似于ibd，包括潰瘍性結腸炎(uc)和克羅恩氏病，其全世界發(fā)病率和發(fā)生率已顯示增加(molodecky等人,2012)。dss結腸炎的潛在病理生理機制包括腸道屏障功能的最初破環(huán)，接著是炎癥和小囊損失(cooper等人,1993；iwaya等人,2012；poritz等人,2007)。dss結腸炎中的疾病癥狀對應于在人uc中所觀察到的，包括體重損失、腹瀉及便血(herias等人,2005)。dss借此誘發(fā)結腸炎的確切機制尚未闡明，然而，已經認識到dss與存在于結腸腔中的中鏈長度脂肪酸有關，并形成能夠與結腸上皮細胞膜融合的小囊，這引起細胞質中的炎性信號傳導途徑的激活(laroui等人,2012)。近期的研究結果還顯示內結腸粘液層(通常不含細菌)的厚度在dss暴露之后僅15分鐘減小并變得對細菌可滲透。。dss暴露之后12小時內，觀察到細菌與上皮層的相互作用，這可激活炎癥(johansson等人,2010)。如同在健康的嚙齒動物中，細菌明顯地與健康人中的上皮結腸層分離，而在具有急性炎癥的潰瘍性結腸炎患者中，細菌滲透內粘液層(johansson等人,2014)，表明在dss誘發(fā)的結腸炎模型與人炎性gi病癥之間的共同病理。dss誘發(fā)的病理的一個早期事件是緊密連接zo-1的損失和腸道滲透性的增加，先于腸炎出現(xiàn)(poritz等人,2007)，這可表明dss破壞腸道屏障功能，允許毒素、抗原以及維持炎癥的細菌的全部或部分的滲透。這也非常符合人類研究結果，其中在腸道發(fā)炎狀況期間，腸道滲透性受損，連同tj基因明顯下調(koltun等人,1998；gassler等人,2001)。有趣的是，在潰瘍性結腸炎患者中，在嗜中性白細胞活躍遷移的結腸粘膜區(qū)域，發(fā)現(xiàn)像zo-1、密封蛋白-1、jam、β-連環(huán)蛋白及閉合蛋白的tj基因下調(kucharzik等人,2001)，提示在tj的破壞與炎癥之間的密切聯(lián)系。雙歧桿菌、乳桿菌及混合物已顯示在小鼠和大鼠的dss誘發(fā)的結腸炎中的功效(chen等人,2009；kim等人,2010；geier等人,2007；mennigen等人,2009)。已提出不同的益生菌作用模式涉及強化腸道上皮屏障和調節(jié)炎性途徑如細胞因子信號傳導。舉例來說，除疾病活動指數(shù)之外，羅伊氏乳桿菌還抑制細菌從腸移位到腸系膜淋巴結(dicksved等人,2012)，這可提示增加的屏障功能作為疾病嚴重度抑制機制的一部分。大腸桿菌nissle1917也顯示通過加強腸道滲透性和tj蛋白表達如zo-1抑制dss誘發(fā)的結腸炎(ukena等人,2007)。雖然此作用模式到目前為止沒有在人類中得到直接證實，但大腸桿菌nissle1917已被報道在預防潰瘍性結腸炎復發(fā)中是有效的(kruis等人,1997；kruis等人,2004)，表明在嚙齒動物與人類之間機制的相似性。通過利用益生菌在dss誘導的結腸炎期間來調節(jié)炎性途徑也顯示有效地抑制疾病嚴重度。yao和同事用含有il-10的質粒轉染長雙歧桿菌并且向暴露于dss的小鼠給予細菌。轉染過的細菌通過下調nf-kb途徑減輕結腸炎癥狀，否則將導致各種促炎細胞因子的產生(yao等人,2011)。另一方面，miyauchi及其他人指出長雙歧桿菌嬰兒亞種能夠通過抑制結腸組織中的1型輔助t(th1)特異性細胞因子和產il-17的輔助t(th17)特異性細胞因子減輕結腸炎嚴重性(miyauchi等人,2013)。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及青春雙歧桿菌的分離菌株。在屬于青春雙歧桿菌的細菌分離株之中，可通過基因組和表型特征鑒定先前未描述的四種分類亞組。這些分類亞組明顯不同于模式菌株(青春雙歧桿菌atcc15703t)。青春雙歧桿菌的四種分類亞組通過16srrna基因序列中的特定特征而與青春雙歧桿菌模式菌株相區(qū)分。16srrna特征還將四個亞組彼此區(qū)分開。由于不存在種水平下的確切分類定義，所以將這些亞組稱為核種(ribospecies)2、3、4及5。核種1是青春雙歧桿菌atcc15403t。16s核糖體rna序列分析是細菌分類多相法中的中心要素并且用于描述來自種系發(fā)育鄰近物種的分類群。然而，在16srrna基因序列相似性超過98.7％時，此方法不能清楚地區(qū)分獨特的分類群并且推薦dna-dna相關性的測定。由于分離菌株與模式菌株的序列相似性全部超過99.87％，所以決定測定dna-dna相關性。各亞組代表菌株與青春雙歧桿菌模式菌株的dna-dna復性(reassociation)研究顯示代表菌株與模式菌株之間大于70％的dna-dna相關性，且由此證實代表菌株確實屬于青春雙歧桿菌物種。綜合這些數(shù)據顯示分離菌株是青春雙歧桿菌的新型亞組，這在以前并未描述過。四個亞組通過僅存在于核種2、3、4及5中而不存在于模式菌株中的蛋白質編碼dna序列(cds)進一步與青春雙歧桿菌atcc15403t相區(qū)分。獨特的蛋白質編碼序列將各核種彼此區(qū)分開，而其他蛋白質編碼序列為核種2+5或核種3+4所特有。發(fā)酵淀粉和糖原的能力將所述核種與青春雙歧桿菌atcc15403t相區(qū)分以及將核種2+5與核種3+4相區(qū)分。因此，核種2和5發(fā)酵糖原作為唯一的碳源，而青春雙歧桿菌atcc15403t和核種3+4不是如此，同時核種2+5和青春雙歧桿菌atcc15403t可發(fā)酵淀粉，而核種3+4不是如此。因此，已發(fā)現(xiàn)通過特定的16srrna基因序列特征、特定的蛋白質編碼dna序列以及發(fā)酵糖原和淀粉的能力，可將青春雙歧桿菌的四種核種(分類亞組)與青春雙歧桿菌atcc15703t明確地區(qū)分開以及彼此明確地區(qū)分開。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種青春雙歧桿菌的分離菌株，其具有包含以下的16s核糖體基因序列：seqidno:1或2；seqidno:3、4或5；seqidno:6、7、8或9；以及seqidno:10或11。許多人類疾病和病狀的常見共同特征是受損的腸道屏障功能和粘膜免疫系統(tǒng)由于細菌和lps穿過腸道上皮的移位增加而造成的促炎激活。疾病包括但不限于炎性腸病，如ibd和ibs；肝病，包括nafld、nash、肝硬化及酒精相關性肝??；代謝失調，如代謝綜合征、胰島素抗性、2型糖尿病、肥胖癥、心血管動脈粥樣硬化；自身免疫性疾病，例如乳糜瀉、1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥及類風濕性關節(jié)炎；以及心理病狀，包括嚴重抑郁癥、心境障礙、認知病癥、慢性疲勞綜合征、及焦慮。青春雙歧桿菌核種2、3、4及5的菌株能夠改善腸道屏障功能和/或誘導免疫應答的調節(jié)元件。某些青春雙歧桿菌核種2、3、4及5菌株在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，且由此改善腸道屏障功能。某些青春雙歧桿菌核種2、3、4及5菌株當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10分泌>200pg/ml和/或誘導il-10:il-12比率>1，且由此引發(fā)抗炎免疫應答。某些青春雙歧桿菌核種2、3、4及5菌株將caco-2細胞單層中的ter增至>120％相對于處理開始時的ter和/或誘導il-10分泌大于200pg/ml和/或誘導il-10:il-12比率>1，且由此可即改善腸道屏障功能又引發(fā)抗炎免疫應答。本發(fā)明涉及用青春雙歧桿菌核種2、3、4或5的菌株預防、減輕癥狀、以及治療具有潛在受損的腸道屏障功能和/或粘膜的促炎激活的疾病或病狀，所述核種如通過將caco-2細胞單層中的ter增至>120％相對于處理開始時的ter的能力所確定改善腸道屏障功能，如通過誘導il-10分泌>200pg/ml和/或誘導源自人pbmc的樹突細胞中的il-10:il-12比率>1的能力所確定誘導抗炎免疫應答，或優(yōu)選地，上述一種、兩種或所有的屏障改善和抗炎免疫應答的組合。屏障改善與抗炎免疫應答的組合效果也可通過將各自擅長這些作用之一的菌株組合來實現(xiàn)。具體實施方式表征本發(fā)明的青春雙歧桿菌菌株的一種方式是其發(fā)酵實施例4中所列的特定碳水化合物源和在所述特定碳水化合物源上生長的能力。表2提供本發(fā)明的許多青春雙歧桿菌菌株的生長特征的概述。表中提供的菌株僅被認為是本發(fā)明菌株的非限制性實例。如從表中可見，許多菌株具有發(fā)酵d-核糖而非d-山梨糖醇的能力，尤其是bif084(dsm29106)、bif046(dsm29111)、bif106(dsm29107)、bif123(dsm29102)bif129(dsm29104)及bif038(dsm29103)。本發(fā)明的一個目標是提供能夠改善腸道屏障功能和/或引發(fā)抗炎免疫應答的青春雙歧桿菌菌株，因為這些特征涉及許多具有潛在受損的腸道屏障功能和/或粘膜的促炎激活的疾病或病狀。如從實施例中可見，某些青春雙歧桿菌菌株在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，且由此改善腸道屏障功能。某些青春雙歧桿菌菌株當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10分泌>200pg/ml和/或誘導il-10:il-12比率>1，且由此引發(fā)抗炎免疫應答。在一個實施方案中，本發(fā)明的分離菌株能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter；ii)誘導il-10分泌>200pg/ml；和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所述菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。表9提供滿足一種或多種以上特征的本發(fā)明的所選青春雙歧桿菌菌株的體外數(shù)據的概述。如由表9明顯的是，所有菌株都引發(fā)抗炎免疫應答，并且dsm29102、dsm29107及dsm29103進一步改善腸道屏障。本發(fā)明涉及一種本發(fā)明的青春雙歧桿菌菌株，其是用于預防、減輕癥狀、以及治療具有潛在受損的腸道屏障功能和/或粘膜的促炎激活的疾病或病狀。其中本發(fā)明的青春雙歧桿菌菌株預期具有作用的疾病或病狀的實例是炎性腸病如ibd和ibs；肝病如nafld、nash、肝硬化及酒精相關性肝病；代謝失調如代謝綜合征、胰島素抗性、2型糖尿病、肥胖癥、心血管動脈粥樣硬化；自身免疫性疾病如乳糜瀉、1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥及類風濕性關節(jié)炎；以及心理病狀如嚴重抑郁癥、心境障礙、認知障礙、慢性疲勞綜合征、及焦慮?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的青春雙歧桿菌菌株預防或減輕的癥狀的實例是厭食、便血、腹絞痛和腹痛、腹瀉、便秘、或兩者交替發(fā)作。實施例8提供一種本發(fā)明菌株，即青春雙歧桿菌dsm29103對dss誘發(fā)的結腸炎的作用的結果，這表明青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)預防和/或抑制胃腸道中的炎癥和組織損傷以及抑制腹瀉并誘導就體重而言的總體健康促進效果?；诎l(fā)現(xiàn)，可以預期dsm29103及具有如本文所述的類似性質的其他菌株將能預防或減輕至少某些以上所列舉的胃腸道癥狀。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種用于改善腸道屏障功能的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用治療有效劑量的根據本發(fā)明的分離菌株或根據本發(fā)明的益生菌產品。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種引發(fā)抗炎免疫應答的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用治療有效劑量的根據本發(fā)明的分離菌株或根據本發(fā)明的益生菌產品。在一個實施方案中，所述方法誘導il-10的分泌和/或il-10:il-12比率>1。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于預防以下疾病、減輕以下疾病的癥狀、或治療以下疾病的方法：炎性腸病如ibd或ibs；肝病如nafld、nash、肝硬化或酒精相關性肝病；代謝失調如代謝綜合征、胰島素抗性、2型糖尿病、肥胖癥、心血管動脈粥樣硬化；自身免疫性疾病如乳糜瀉、1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥或類風濕性關節(jié)炎；和/或心理病狀如嚴重抑郁癥、心境障礙、認知障礙、慢性疲勞綜合征或焦慮，所述方法包括向有此需要的個體施用治療有效劑量的根據本發(fā)明的分離菌株或益生菌產品。雖然本發(fā)明的方法和菌株用途與人尤其相關，但動物如寵物，例如貓、狗及馬也包括在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明涉及一種青春雙歧桿菌的分離菌株，特征在于：a)序列包含seqidno:1或2；seqidno:3、4或5；seqidno:6、7、8或9；以及seqidno:10或11，及b)序列編碼與選自以下任一種的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質：seqidno:12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及25。在b)的一個實施方案中，所述序列編碼與選自seqidno:12、13及14的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質。在b)的另一實施方案中，所述序列編碼與選自seqidno18和19的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質。在b)的又一實施方案中，所述序列編碼與選自seqidno20和21的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質。在b)的另一實施方案中，所述序列編碼與選自seqidno15、16及17的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質。在b)的另一實施方案中，所述序列編碼與選自seqidno22和23的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質。在b)的又一實施方案中，所述序列編碼與選自seqidno24和25的至少一種蛋白質具有至少90％序列同一性的蛋白質。在具體的實施方案中，所述菌株包含編碼與至少一種選自seqidno12-25的至少一種蛋白質具有至少90％同一性的蛋白質的核酸序列，如編碼與seqidno12-25中的一種或多種具有至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的蛋白質的序列。在一個實施方案中，所述菌株包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含seqidno12-25中的一種或多種的氨基酸序列。出于本發(fā)明的目的，兩個核苷酸序列或兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度是使用以下方法來測定：分別對于核苷酸序列(dna)或氨基酸序列(蛋白質)的clustalw第2版(clustalw2)的序列比對方法，如由larkin等人(2007,bioinformatics23:2947-2948)和goujon等人(2010,nucleicacidsresearch38增刊:w695-699)所述的雙序列比對，采用默認參數(shù)(比對類型：慢；dna權矩陣：iub；蛋白質權矩陣：gonnet；缺口開放：10；缺口延伸：0.1)，在www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/可獲得。一個實施方案涉及能夠在作為唯一碳水化合物來源的淀粉或糖原上生長的分離菌株。某些所述菌株的特征在于其包含seqidno:2、4、7、8及10。這類菌株的實例是dsm29103、dsm29102、dsm29104、dsm29105及從中衍生的菌株。其他所述菌株的特征在于其包含seqidno:2、3、8及10。這類菌株的實例是dsm29107及從中衍生的菌株。另一實施方案涉及能夠在作為唯一碳水化合物來源的海藻糖上生長但不能發(fā)酵淀粉或糖原的分離菌株。某些所述菌株的特征在于其包含seqidno:1、3、6及11。這類菌株的實例是dsm29106、dsm29111及從中衍生的菌株。其他所述菌株的特征在于其包含seqidno:1、5、9及11。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29103在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29103的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter,ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生的菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29102在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29102的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter,ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29104在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29104的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29105在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29105的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29106在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29106的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29107在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29107的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。本發(fā)明還涉及以保藏號dsm29111在2014年7月16日保藏于dsmz-德國微生物保藏中心,布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)的青春雙歧桿菌菌株或衍生于dsm29111的菌株，其中衍生菌株的特征是能夠i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter，ii)誘導il-10分泌>200pg/ml，和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。所衍生菌株可具有這些能力中的一種、兩種或所有三種。如本文所用的細菌“菌株”是指當生長或增殖時保持遺傳不變的細菌。包括多個相同的細菌?！耙吧途辍笔侵讣毦姆峭蛔冃问?，如在自然界中所發(fā)現(xiàn)的。在本文中，術語“衍生菌株”應被理解為借助于例如遺傳工程、輻射和/或化學處理、和/或選擇、匹配、篩選等衍生于母菌株的菌株。在具體的實施方案中，衍生菌株是功能上等效的突變體，例如，具有與母菌株基本上相同或改善性質(例如，關于益生菌性質)的突變體。這種衍生菌株是本發(fā)明的一部分。術語“衍生菌株”包括通過使本發(fā)明菌株經受任何常規(guī)使用的誘變處理(包括用如乙烷甲烷磺酸鹽(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg)的化學誘變劑、紫外光的處理)或包括自發(fā)突變體。“突變細菌”或“突變菌株”是指天然(自發(fā)、天然出現(xiàn)的)突變細菌或誘導突變的細菌，在其基因組(dna)中包含野生型dna中所不存在的一個或多個突變。“誘導的突變體”是其中突變通過人類處理誘導的細菌，如用任何常規(guī)使用的誘變處理的處理，包括用化學誘變劑的處理，如選自以下的化學誘變劑：(i)與dna締合或并入其中的誘變劑，如堿基類似物，例如2-氨基嘌呤或嵌入螯合劑(interchelatingagent)如icr-191；(ii)與dna反應的誘變劑，包括烷化劑，如亞硝基胍或羥胺、或乙烷甲基磺酸酯(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg)，uv-或γ幅射等。相比之下，“自發(fā)突變體”或“天然存在的突變體”還不曾被人類誘變。衍生菌株(如突變體)可已經受若干誘變處理(單次處理應被理解為一個誘變步驟，繼之以篩選/選擇步驟)，但通常處理不超過20次、不超過10次、或不超過5次處理。在衍生菌株(如突變體)的具體實施方案中，與母菌株相比，細菌基因組中小于1％、小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已經變化(如通過取代、插入、缺失或其組合變化)。如上所述的突變細菌是非gmo，即沒有通過重組dna技術進行修飾。作為通過隨機誘變提供突變體的以上優(yōu)選方法的一個替代方案，還可能通過定點誘變提供這種突變體，例如通過使用適當設計的pcr技術或通過使用可整合在細菌復制子中的轉座元件。當突變體作為自發(fā)突變體提供時，上述野生型菌株在沒有任何事先誘變處理的情況下經受選擇步驟。登記號為dsm29103、dsm29104、dsm29106、dsm29107、dsm29111、dsm29102及dsm29105的任何青春雙歧桿菌菌株的突變菌株可通過使所述菌株經受如所述的誘變處理以獲得突變菌株并選出具有所需性質的突變菌株而獲得?；蛘撸槍ψ园l(fā)突變進行選擇。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種分離菌株，其選自由以下組成的組：dsm29103、dsm29104、dsm29106、dsm29107、dsm29111、dsm29102及dsm29105以及能夠實現(xiàn)以下各項的所述保藏菌株的任一種的突變體：i)在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter；ii)誘導il-10分泌>200pg/ml；和/或iii)當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時誘導il-10:il-12比率>1。術語“益生菌產品”意指包含益生菌的任何產品。包含根據本發(fā)明的菌株的益生菌產品可以食物產品或膳食補充劑形式施用。青春雙歧桿菌可例如并入乳制品如牛奶中，且尤其是發(fā)酵的乳制品中，任選地其他乳酸菌組合，例如與酸奶發(fā)酵物，或在其他食物產品如快餐或飲料如果汁中。包含青春雙歧桿菌的益生菌產品還可作為膳食補充劑以如下形式提供：粉劑、片劑如錠劑或泡騰片、軟錠劑、膠囊、咀嚼膠、以單獨的小藥囊或作為更一般組合物如油滴劑、乳劑或糊劑的組分，，或以由本領域技術人員確定為對活微生物有效的載體的任何其他合適的載體。益生菌是活的微生物，這在益生菌產品配制和儲存期間可以是一種挑戰(zhàn)。益生菌對溫度、水分含量、以及氧和配制基質中的其他成分尤其敏感。優(yōu)選的是本發(fā)明細菌在長期儲存之后保持存活，以便當向有此需要的個體施用本發(fā)明的益生菌產品時所述細菌發(fā)揮其有益的作用。術語“存活”意指細胞是活的并且能夠在傾注鋪板或涂布鋪板期間在陪替氏培養(yǎng)皿中形成菌落。存活的益生細菌數(shù)量被測定為通過傾注鋪板或涂布鋪板法在適合益生菌菌株生長的條件下培育的菌落形成單位(cfu)的數(shù)量。通過此方法，將計數(shù)能夠生長并形成菌落的細胞。當數(shù)值在本說明書和權利要求書中給出時，除非上下文另外指示，其應被理解為cfu/g。在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌產品在儲存期末(eos)時包含至少109cfu/單位。儲存期末可以是至少3個月，如至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、或至少24個月。使用低水活度確保了產品儲存期間益生細菌的較佳存活率。水活度(aw)被定義為在規(guī)定溫度下組合物中水的分蒸氣壓除以在相同溫度下水的標準狀態(tài)分蒸氣壓。水活度因此用作組合物中自由(即未結合的)水的量的量度。其可計算為：aw＝p/p0其中p是組合物中水的分蒸氣壓且p0是在相同溫度下純水的蒸氣壓。在益生菌產品中，水活度(aw)一般優(yōu)選在0.1-0.2的范圍。有待用于本發(fā)明的益生菌產品中的益生細菌一般被冷凍或冷凍干燥。為了獲得高存活力，將細菌在冷凍或冷凍干燥之前與冷凍保護劑混合。術語“冷凍保護劑”表示能改善冷凍和/或干燥期間的存活率并改善細菌的儲存穩(wěn)定性的物質。在本文中使用的冷凍保護劑一般包含糖。該糖可以是單、二、寡或多糖，或至少兩種糖的混合物。組合物甚至可包含三種、四種或更多種糖。在一些實施方案中，組合物包含至少一種單糖或二糖與至少一種寡糖的混合物。在其他實施方案中，組合物包含至少一種單糖或二糖與至少一種多糖的混合物。適用于本發(fā)明的益生菌產品中的單糖包括葡萄糖(也稱為右旋糖)、果糖、核糖及半乳糖。適用于本發(fā)明的益生菌產品中的二糖尤其包括蔗糖、海藻糖、麥芽糖及乳糖。組合物可包含一種或多種單糖或二糖，如一種、兩種或三種或甚至更多種不同的糖。在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌產品包含至少一種寡糖。寡糖是含有三至九種單糖的糖聚合物。見于許多植物中的果糖-寡糖(fos)是由短鏈的果糖分子組成的。同樣天然出現(xiàn)的低聚半乳糖(gos)是由短鏈的半乳糖分子組成的。這些化合物僅可由人類部分消化。該組合物可包含一種、兩種或甚至更多種不同寡糖。在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌產品包含至少一種多糖。多糖是由大于十個單糖單位通過糖苷鍵結合在一起構成的聚合碳水化合物分子并且一旦水解便得到組成單糖或寡糖。其在結構上的范圍是從線性到高度分支。有待用于本發(fā)明的益生菌產品中的多糖的實例是麥芽糖糊精、環(huán)糊精、藻酸鹽、果膠、殼聚糖、淀粉及菊粉。該組合物可包含一種、兩種、三種或甚至更多種不同多糖。舉例來說，冷凍保護劑可包含二糖如蔗糖或葡萄糖與多糖如麥芽糖糊精的混合物。寡糖或多糖如fos、gos、菊粉及其他多糖的添加可有助于降低水活度并且具有進一步優(yōu)點，即寡糖和多糖不如單糖和二糖那么甜且此外它們將纖維添加到組合物中。多元醇(糖醇)具有通式hoch2(choh)nch2oh。它們因為與糖相比的較低含熱量和較低甜度而通常被添加到食品中。此外，其不被口腔中的細菌分解或代謝成為酸，因此不會促成齲齒。組合物可進一步包含至少一種多元醇，如赤蘚糖醇(erythriol)、肌醇、異麥芽酮糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、山梨糖醇、或木糖醇、或其混合物。優(yōu)選的多元醇是木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。該組合物可包含一種、兩種、三種或甚至更多種不同多元醇。該冷凍保護劑可進一步包含肽、蛋白質、蛋白質水解物或其混合物。有待用于本文中的肽和蛋白質的實例是酪蛋白、豌豆、乳清、白蛋白、大豆蛋白、谷氨酸或明膠、以及其任何分離物或水解物。也可存在其他添加劑，例如抗氧化劑，如抗壞血酸鹽、檸檬酸鈉、沒食子酸丙酯。本發(fā)明還涉及一種益生菌，其包含根據本發(fā)明的分離菌株和冷凍保護劑，如糖?？墒褂靡嫔毦娜舾煞N或菌株的組合，即2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或甚至更多種本文中所列的種和菌株。在目前優(yōu)選的實施方案中，僅一種、兩種、三種、四種或五種不同菌株存在于本發(fā)明的益生菌產品中。除益生細菌之外，選自由以下組成的組的一種或多種其他活性成分，例如一種、兩種、三種、四種或更多種活性成分可包括在益生菌產品中：維生素，如維生素a、d、e、k2、c、b2、b6、b12、生物素、煙酸、葉酸；礦物質，如鋅、硒、鉻、銅、鈣、氯化物；以及蔬菜提取物，如曼越桔提取物/汁液；蜂王漿?？梢灶A期，為了獲得治療效果，益生菌產品應當每日施用持續(xù)至少一周，且有利地持續(xù)更長時間，如至少2周、至少4周、至少6周、至少9周、優(yōu)選地至少12周，數(shù)量對應于至少106cfu，如至少107cfu、優(yōu)選地至少108cfu，一般109cfu至1012cfu的青春雙歧桿菌。在本研究中，益生菌產品包含青春雙歧桿菌作為活性成分。青春雙歧桿菌可用作唯一活性成分?；蛘撸绫疚乃龅囊嫔a品可包含所關注的其他化合物，如其他菌株、維生素、益生元、纖維或可具有有益健康效果的其他化合物。其他細菌可選自由以下組成的組:乳酸雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸明串珠菌、腸膜明串珠菌乳脂亞種、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰變種、干酪乳桿菌干酪亞種、嗜熱鏈球菌、長雙歧桿菌、乳酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種及嗜酸乳桿菌。因此，組合物可進一步包含選自包含以下的組的乳酸菌的一個或多個菌株：保藏為dsm15954的動物雙歧桿菌乳酸亞種(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)、保藏為dsm13241的嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、保藏為atcc53103的鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)、保藏為atcc55826的鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)、保藏為atcc55845的羅伊氏乳桿菌(lactobacillusreuteri)、保藏為atcc55544的副干酪乳桿菌副干酪亞種(lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)、保藏為lmg-17806的副干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)、保藏為dsm15957的嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophilus)、保藏為nm02/31074的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)、保藏為cctccm204012的副干酪乳桿菌副干酪亞種(lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)。除非在本文中另有指示或明顯與上下文矛盾，術語“a/an(一)”和“所述”及類似指示物在描述本發(fā)明的上下文中(特別是以下權利要求書的上下文中)的使用應被視為包括單數(shù)和復數(shù)兩者。除非另作說明，術語“包含”、“具有”、“包括”及“含有”應被視為開放式術語(即意指“包括但不限于”)。除非本文中另有指示，在此對數(shù)值范圍的敘述僅僅用作一種速記方法，分別涉及落入范圍內的各單獨數(shù)值，并且各單獨數(shù)值包含在說明書內，如同在本文中個別列舉一樣。除非本文中另有指示或另外明顯與上下文矛盾，本文所述的所有方法都可以任何合適的順序進行。除非另外要求權利保護，本文所提供的任何及所有實施例或示例性語言(例如，“如”)的使用僅旨在更好地闡明本發(fā)明并且不作為對本發(fā)明范圍的限制。說明書中的任何語言均不應解釋為將任何未要求權利保護的特征作為實施本發(fā)明的必要特征。附圖說明圖1.通過鄰近連接方法生成的青春雙歧桿菌樣菌株部分16srdna序列的樹狀圖。也包括模式菌株青春雙歧桿菌atcc15703t。圖2.來自青春雙歧桿菌樣菌株和模式菌株青春雙歧桿菌atcc15703t的16srdna共有序列的部分比對。僅展示可變區(qū)。數(shù)字是大腸桿菌編號。區(qū)分4種核種和模式菌株的特征序列由陰影表示。圖3.在用青春雙歧桿菌樣菌株刺激之后caco-2細胞單層中的跨上皮電阻(ter)。將在transwell膜上生長的初始匯合、完全分化的caco-2單層置于cellzscope中。將單層用細菌培育16h并且每小時測量ter。結果表示為相對于培育開始之前最后一次測量的ter的ter(％)。圖4.在用青春雙歧桿菌樣菌株刺激之后caco-2細胞單層中的跨上皮電阻(ter)。將在transwell膜上生長的初始匯合、完全分化的caco-2單層置于cellzscope中并且每小時自動測量ter過夜。10h之后，ter已達到平臺期并且該點被用于比較通過青春雙歧桿菌樣菌株的ter的刺激。條形圖表示相對于培育開始之前最后一次測量的ter，在10h培育之后的ter(％)。圖5.在用青春雙歧桿菌樣菌株刺激之后，源自人pbmc的樹突細胞(dc)中的il-10表達及il-10:il-12表達比率。將dc用細菌在100:1(細菌:細胞)的比率下刺激20h，并且通過人炎性細胞因子細胞計數(shù)珠陣列(cba)試劑盒測量il-10和il-12的分泌。將細胞因子測量值歸一化為每個細胞因子和每個供體的平均表達。條形圖在左軸表示il-10分泌，星形圖在右軸表示il-10:il-12比率。圖6.炎性腸病的dss結腸炎模型中的大鼠體重。在通過口服管飼兩周給藥青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)或媒介物之后，3％dss被引入飲用水中持續(xù)9天。不接受dss的動物充當健康對照；dss，接受媒介物和dss；dss+bif038，接受青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)和dss。每天記錄體重。健康對照：圖7.在炎性腸病的dss結腸炎模型中的大鼠糞便稠度評分。在通過口服管飼兩周給藥青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)或媒介物之后，3％dss被引入飲用水中持續(xù)9天。不接受dss的動物充當健康對照；dss，接受媒介物和dss；dss+bif038，接受青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)和dss。圖8.在炎性腸病的dss結腸炎模型中的大鼠便血評分。在通過口服管飼兩周給藥青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)或媒介物之后，3％dss被引入飲用水中持續(xù)9天。不接受dss的動物充當健康對照；dss，接受媒介物和dss；dss+bif038，接受青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)和dss。健康對照：圖9.在炎性腸病的dss結腸炎模型中的大鼠全腸道滲透性。在通過口服管飼兩周給藥青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)或媒介物之后，3％dss被引入飲用水中持續(xù)9天。不接受dss的動物充當健康對照；dss，接受媒介物和dss；dss+bif038，接受青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)和dss。滲透性被測定為尿credta排泄。健康對照：圖10.在炎性腸病的dss結腸炎模型中的大鼠結腸組織的組織評分。在通過口服管飼兩周給藥青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)或媒介物之后，3％dss被引入飲用水中持續(xù)9天。不接受dss的動物充當健康對照；dss，接受媒介物和dss；dss+bif038，接受青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)和dss。圖11.在炎性腸病的dss結腸炎模型中的大鼠腸道的肉眼評分。在通過口服管飼兩周給藥青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)或媒介物之后，3％dss被引入飲用水中持續(xù)9天。不接受dss的動物充當健康對照；dss，接受媒介物和dss；dss+bif038，接受青春雙歧桿菌bif038(dsm29103)和dss。序列表簡述序列表包括圖2的11個序列以及由表3至8中所列的cds所編碼的蛋白質。seqidno:1列出對atcc15703t及核種3和4的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:2列出對核種2和5的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:3列出對atcc15703t及核種5和3的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:4列出對核種2的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:5列出對核種4的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:6列出對atcc15703t及核種3的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:7列出對核種2的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:8列出對核種5的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:9列出對核種4的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:10列出對atcc15703t及核種2和5的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:11列出對核種3和4的菌株特異的16srrna基因序列。seqidno:12列出表3中的cds2439。seqidno:13列出表3中的cds2454。seqidno:14列出表3中的cds2458。seqidno:15列出表4中的cds2027。seqidno:16列出表4中的cds2312。seqidno:17列出表4中的cds2314。seqidno:18列出表5中的cds2406。seqidno:19列出表5中的cds2425。seqidno:20列出表6中的cds3350。seqidno:21列出表6中的cds3351。seqidno:22列出表7中的cds3166。seqidno:23列出表7中的cds3123。seqidno:24列出表8中的cds2293。seqidno:25列出表8中的cds2334。實施例實驗流程的概述雙歧桿菌是從來自健康志愿者的人糞便中分離。通過16srdna測序和種系發(fā)生分析測定純化的分離株的物種特征。16s種系發(fā)生分析顯示4簇菌株(核種)的存在與模式菌株青春雙歧桿菌atcc15703t最密切相關，然而明顯不同于模式菌株(青春雙歧桿菌樣菌株)。進一步研究此亞組雙歧桿菌分離株以確定其在青春雙歧桿菌組內的分類關系。通過雜交來研究的dna:dna相關性顯示所述菌株屬于青春雙歧桿菌物種；然而，基因組測序鑒別了區(qū)分4簇菌株的編碼序列(基因)，所述4簇菌株類似于與青春雙歧桿菌atcc15703t模式菌株不同的核種。使用api系統(tǒng)研究在各種碳水化合物來源上生長的能力。淀粉和糖原利用鑒別出不同于模式菌株的2個亞組。探究了與青春雙歧桿菌樣菌株的gi健康有關的功能特征。刺激上皮細胞中的tj的能力通過將活的細菌施用于caco-2細胞單層并測量跨上皮電阻(ter)來研究。大多數(shù)青春雙歧桿菌樣菌株提高ter；然而以不同的程度。免疫系統(tǒng)的局部刺激通過將細菌施用于源自人pbmc的樹突細胞并測量細胞因子產生來測定。若干菌株誘導高水平的il-10，其中il-10:il-12比率>1指示免疫調節(jié)應答。選出具有強ter誘導能力和高il-10誘導的一種青春雙歧桿菌樣菌株，并且施用于大鼠dss結腸炎模型中。所述菌株顯著地改善通過dss處理誘發(fā)的癥狀。實施例1-雙歧桿菌從健康人類中的分離雙歧桿菌是從由健康志愿者處收集的冷凍(-80℃)人糞便樣品中分離。從所有志愿者處獲得利用材料進行細菌分離的書面同意。將樣品解凍并且在兜袋中將4g樣品在35ml具有0.05％半胱氨酸氯化物的蛋白胨鹽水中以高速混合。充分混合之后，在蛋白胨鹽水中進行10倍連續(xù)稀釋。將來自105、106、107、108、及109稀釋液的100μl等分試樣平板接種于番茄汁/eugon瓊脂ph7.0上；(番茄汁，ph調節(jié)至7.0(400ml/1000ml)、45geugon瓊脂(difco)/1000ml、1％麥芽糖、0.05％半胱氨酸氯化物、0.0005％氯化血紅素、40mg/1000mlx-gal(5-溴代-4-氯代-3-吲哚-β-d-半乳糖苷))、以及columbia培養(yǎng)基ph7.0(調節(jié)的beerens培養(yǎng)基)瓊脂；(columbia培養(yǎng)基(difco)、0.005％葡萄糖、0.1％丙酸鈉鹽、0.05％半胱氨酸氯化物、40mgx-gal。將板在37℃下厭氧地培育。3天之后，挑取單個菌落。記錄菌落形態(tài)并且通過顯微鏡檢查確定單細胞形態(tài)。將具有擁有雙歧桿菌的v形或y形特征的細胞的菌落平板接種于具有0.05％半胱氨酸氯化物(merckkgaa,germany)的manrogosasharp(mrs)肉湯(oxoida/s,denmark)上并且在37℃下厭氧地培育。隨后通過在具有0.05％半胱氨酸氯化物的mrs板上劃線3次純化菌株。通過涂布于caso瓊脂(具有綿羊血的胰蛋白胨大豆瓊脂)上并在30℃下有氧地培育2天來測試菌株的純度。將在具有20％甘油的mrs中的純菌株保存在安瓿中在-80℃下。通過16srdna測序和種系發(fā)生分析測定糞便分離株的分類關系。從人糞便樣品中獲得127個雙歧桿菌分離株并且進一步表征。實施例2-16srdna測序和種系發(fā)生分析部分16srrna基因序列是通過用保守引物616v(5’-agrgtttgatyckggctcag-3’)和612r(5’-gtaaggttcttcgcgt-3’)擴增16srdna的部分且隨后用保守引物610r(5’-accgcggctgctggcac-3’)的對擴增產物進行測序來測定。通過lgcgenomics,berlin,germany)進行sanger測序反應。使用clustalomega(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)比對來自分離的雙歧桿菌屬菌株和青春雙歧桿菌atcc15703t的部分16srdna序列(大腸桿菌位置27至468；brosius等人,1978)。使用clustalw2-phylogeny(http://www.ebi.ac.uk/tools/phylogeny/clustalw2_phylogeny/)，通過鄰近連接生成種系發(fā)生樹文件，并且使用phylodendron種系發(fā)生樹打印機(http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html)呈現(xiàn)該樹。結果基于16srdna種系發(fā)生分析，36個雙歧桿菌屬菌株與青春雙歧桿菌最密切相關。然而，所有菌株具有與模式菌株、青春雙歧桿菌atcc15703t不同的16srdna序列。將菌株聚類到不同于青春雙歧桿菌atcc15703t的4個不同組中，如圖1的樹狀圖中所示。4個簇被標記為核種2、3、4及5。20個菌株構成單一簇(核種2)，12個其他菌株聚類在一起(核種5)，并且2個和3個菌株分別形成2個簇(核種3及核種4)。鑒別出將核種彼此并與模式菌株明顯區(qū)分開的16srdna特征序列(圖2)。特征序列標記于圖2上。所有特異性16srdna序列(特征)一致地見于菌株中并且導致菌株的聚類。因此，核種2和5二者在堿基74-75和90-93(大腸桿菌編號)處具有特異性序列，這將它們與模式菌株及核種3和4相區(qū)別。核種2可通過acc特征(堿基192-194)并且通過在堿基212-215、226-232處的特征與核種5區(qū)分。在堿基262-267和287-293處的特征序列將核種3和4與模式菌株及核種2和5相區(qū)分。核種4通過位于堿基187-191處的特征gacau而不同于其他核種及模式菌株。因此，這四種核種可清楚地彼此并且與青春雙歧桿菌atcc15703t通過單特征序列或通過特征的組合相區(qū)分。16srdna種系發(fā)生分析顯示在從人糞便中分離的菌株中存在4簇(核種)雙歧桿菌與青春雙歧桿菌最密切相關；然而，具有非常一致且特異性的特征序列將分離株與模式菌株相區(qū)分。為了確定這些核種的分類地位，從每個組中選出代表性菌株并且使其經受與屬于青春雙歧桿菌組的模式菌株的dna-dna復性分析。實施例3–dna-dna復性青春雙歧桿菌樣菌株的集合與雙歧桿菌屬模式菌株的dna-dna相關性是通過bccmtm/lmg,bacteriacollectionlaboratoriumvoormicrobiologieuniversiteitgent(bccmtm/lmg細菌保藏，微生物實驗室，根特大學)來測定。以下培養(yǎng)物是所研究的bif122、dsm29103(bif038)、dsm29107(bif106)、bif107、青春雙歧桿菌lmg10502t、糞便雙歧桿菌(b.stercoris)lmg27438t、反芻雙歧桿菌(b.ruminantium)lmg21811t、齒雙歧桿菌(b.dentium)lmg11045t、及角雙歧桿菌(b.angulatum)lmg11039t。這些物種全部隸屬于青春雙歧桿菌組。將細菌在lmg培養(yǎng)基144上培養(yǎng)，并且在厭氧條件下在37℃下培育之后檢查純度。根據gevers等人(2001)的程序的修改版提取基因組dna。根據由ezaki等人(1989)所述的方法的修改版(goris等人,1998；cleenwerck等人,2002)在49℃下在50％甲酰胺存在下進行雜交。進行交互反應(axb和bxa)并且axb和bxa的平均值之間的差異針對每個dna對在表1中在括號之間示出。結果對于bif122，axb的平均值和bxa的平均值之間的差異一般不在此方法的限度內(表1)，因此bif122的dna:dna雜交結果并不明確。dsm29103(bif038)、dsm29107(bif106)、bif107顯示大于70％的dna-dna相關性，這通常被認為是對彼此及與青春雙歧桿菌和糞便雙歧桿菌的模式菌株中的物種界定的限制(wayne等人,1987)。之前被描述為新物種的糞便雙歧桿菌不再被認為是離散物種，而是被包括在青春雙歧桿菌內(killer等人2013)。反芻雙歧桿菌的模式菌株顯示與dsm29103(bif038)、dsm29107(bif106)、bif107、青春雙歧桿菌及糞便雙歧桿菌的模式菌株在36至45％范圍的dna-dna相關性(表1)?？傊?，結果清楚地顯示dsm29103(bif038)、dsm29107(bif106)、bif107屬于物種青春雙歧桿菌并且所鑒別的核種是此物種的不同亞組。因為不存在亞種的確切定義，我們對這些簇保留了術語核種(ribospecies)。表1青春雙歧桿菌樣菌株與青春雙歧桿菌組中的模式菌株的dna-dna相關性。(％dna相關性)對于每個dna對，axb和bxa的平均值之間的差異在此方法的限度內，與bif122的dna進行dna:dna雜交的情況除外，其差異一般較高(*)。括號之間的高值歸因于“交互”dna的固定中的差異。在此研究中，bif122的dna以比其他dna更低的量固定于微孔板的孔上。其原因尚不清楚。實施例4-碳水化合物的發(fā)酵使用api50ch測定研究青春雙歧桿菌模式菌株及4種核種的代表在不同碳水化合物來源上的生長。研究分離的青春雙歧桿菌樣菌株的亞組在amidon(淀粉)、扁桃苷、熊果苷、d-纖維二糖、d-果糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-乳糖(牛)、d-麥芽糖、d-甘露糖醇、d-甘露糖、d-蜜二糖、d-松三糖、d-核糖、d-蔗糖(saccarose/sucrose)、d-山梨糖醇、d-海藻糖、d-松二糖、d-木糖、龍膽二糖、糖原、菊粉、2-酮戊二酸鉀、葡糖酸鉀、l-阿拉伯糖、甲基-αd-吡喃葡萄糖苷、n-乙酰氨基葡萄糖、水楊苷、d-阿東糖醇、d-阿拉伯糖、d-阿糖醇、d-巖藻糖、d-來蘇糖、d-棉子糖、d-塔格糖、半乳糖醇、赤蘚糖醇、七葉甙檸檬酸鐵(esculinferricitrat)、甘油、肌醇、5-酮戊二酸鉀、l-阿糖醇、l-巖藻糖、l-鼠李糖、l-山梨糖、l-木糖、甲基-βd-吡喃木糖苷、甲基-αd-吡喃甘露糖苷以及木糖醇上生長的能力并且與模式菌株青春雙歧桿菌atcc15703t相比。將來自過夜培養(yǎng)物的雙歧桿菌接種于具有0.05％半胱氨酸氯化物(merckkgaa,德國)的manrogosasharp(mrs)肉湯(oxoida/s,丹麥)上并在37℃下厭氧地培育。2天之后，使用拭子從板上收集細菌并懸浮在具有0.5％半胱氨酸氯化物的api50chl培養(yǎng)基中，并且根據制造商說明書將細菌懸液分配到api50ch條帶中。將條帶在37℃下厭氧地接種。5天培育之后讀取條帶并且將顯色情況記錄為+或-。結果由青春雙歧桿菌模式菌株和糞便分離株差異性地發(fā)酵18種碳水化合物(表2)。模式菌株及屬于核種2和5的菌株能夠在作為唯一碳水化合物來源的淀粉上生長，而核種3和4的菌株不能發(fā)酵淀粉。模式菌株及核種3和4不在糖原上生長，而核種2和5在此碳水化合物來源上生長。核種3和4的所有菌株都能夠在海藻糖上生長，而模式菌株及38％的核種2和5可在海藻糖上生長。模式菌株及54％屬于核種2和5的菌株在山梨糖醇上生長，而核種3和4不在山梨糖醇上生長。發(fā)酵特定的碳水化合物來源并在其上生長的能力顯示在人分離株之中存在不同于模式菌株的兩個簇的青春雙歧桿菌菌株。具體說來，在淀粉和糖原上的生長將兩個亞組彼此并與模式菌株區(qū)分開。實施例5-基因組測序借助于dneasyblood&tissue試劑盒(qiagen,hilden,德國)從每核種的兩個代表的過夜培養(yǎng)物中提取dna：bif038(dsm29103)和bif060，核種2；bif137和bif107，核種3；bif122和bif046(dsm29111)，核種4；以及bif016和bif106(dsm29107)，核種5。使用ngs平臺illumina,2000(sandiego,美國)在香港的北京基因組研究所進行基因組測序。為每個菌株獲得200兆堿基數(shù)據，其是由100bp成對末端讀段和500bp間隔區(qū)組成。借助于clc生物信息學軟件(丹麥)進行測序讀段的從頭裝配。借助于采用結合有glimmer算法的genostarsuite4.0(grenoble,法國)模塊genoannot在所得的重疊群集合中鑒別編碼序列。在genostarsuite4.0的pathwayexplorer模塊中的泛基因組功能被用于構造八個測序菌株及青春雙歧桿菌atcc15703t(genbank登記號nc_008618.1)的泛基因組。結果在每種核種中鑒別獨特的編碼dna序列(cds)。因此，發(fā)現(xiàn)cds存在于測序的青春雙歧桿菌樣菌株中，而不存在于青春雙歧桿菌atcc15703t中。發(fā)現(xiàn)特異性cds限定核種2和5、核種3和4、以及個別核種(2、3、4及5)。通過搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)確定由這些cds編碼的氨基酸序列與任何已知蛋白質的相似性。使用針對所有非冗余genbankcds翻譯+pdb+swissprot+pir+prf(除去來自wgs項目的環(huán)境樣品)的blastp完成搜索。表3列出了僅見于核種2和5中的3個cds。cds2439編碼91個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質[鏈狀雙歧桿菌(bifidobacteriumcatenulatum)]；wp_003834978.1”(e-評分：3e-22；同一性：67％)。沒有發(fā)現(xiàn)保守結構域，并且沒有發(fā)現(xiàn)與已知蛋白質的顯著比對。cds2454編碼107個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質bmou_0229[bifidobacteriummoukalabensedsm27321]；gbety72215.1”(e-評分：5e-41；同一性：65％)，無保守結構域。與非假定蛋白質的最佳比對是“核轉運因子2[mycobacteriumtusciae]；wp_006241648.1”(e-評分：0.004；同一性：32％)，具有1個結構域(25-138)，“核轉運因子2(ntf2樣)超家族”。cds2458編碼206個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“細菌ig-樣結構域，2組[bifidobacteriummoukalabensedsm27321]；ety72212.1”(e-評分：1e-119；同一性：90％)。沒有發(fā)現(xiàn)保守結構域。表4列出了僅見于核種3和4中的3個cds。cds2027編碼427個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“多藥物轉運蛋白mate[鏈狀雙歧桿菌]；wp_003834477.1”(e-評分：0.0；同一性：98％)，具有保守結構域“mate外流家族蛋白(mateeffluxfamilyprotein)[鏈狀雙歧桿菌dsm16992＝jcm1194＝lmg11043]”。cds2312編碼330個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“多物種：核糖核苷酸-二磷酸還原酶亞單位β[雙歧桿菌屬]；wp_003835055.1”(e-評分：0.0；同一性：97％)，具有保守結構域(20-291)，“核糖核苷酸還原酶，r2/β亞單位，鐵蛋白樣二鐵-結合結構域；cd01049”。同源蛋白質已見于各種雙歧桿菌中，但不見于青春雙歧桿菌中。另外，cds2314編碼766個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“核糖核苷酸-二磷酸還原酶亞單位α[假小鏈雙歧桿菌(bifidobacteriumpseudocatenulatum)]；wp_004221779.1”(e-評分：0.0；同一性：91％)。因此，編碼序列存在于核種3和4中，編碼此蛋白的α和β亞單位兩者。表5列出了僅見于核種2中的2個cds。cds2406編碼362個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質[鏈狀雙歧桿菌]；wp_003835002.1”(e-評分：0.0；同一性：99％)，具有保守結構域(22-114)，“i型限制酶r蛋白n端(hsdr_n)”。cds2425編碼66個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質[布姆雙歧桿菌(bifidobacteriumboum)；wp_026502472.1]”(e-評分：1e-37；同一性：100％)，且無保守結構域來。與非假定蛋白質的最佳比對是“ompa家族膜蛋白[海王生絲單胞菌(hyphomonasneptunium)]；wp_011646448.1”(e-評分：0.87；同一性：48％)，具有2個保守結構域(411-536)，“外膜蛋白和相關肽聚糖-相關(脂)蛋白[細胞被膜生物起源，外膜]”；cog2885”；(430-534)，“類似于外膜蛋白ompa的c端結構域的肽聚糖結合結構域；cd07185”。表6列出了僅見于核種5中的2個cds。cds3350編碼60個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質[單偽棍狀桿菌(pseudoclavibactersoli)]；wp_028244556.1”(e-評分：7e-13；同一性：53％)，具有保守結構域(41-252)，“長醇-磷酸-甘露糖-蛋白質甘露糖轉移酶”。cds3351編碼462個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質[兩岐雙岐桿菌(bifidobacteriumbifidum)]；wp_003815303.1”(e-評分：4e-42；同一性：31％)，具有保守結構域(1-312)，“長醇-磷酸-甘露糖-蛋白質甘露糖轉移酶”。表7列出了僅見于核種3中的2個cds。cds3123編碼612個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“假定蛋白質[角雙歧桿菌]；wp_003826727.1”(e-評分：1e-170；同一性：98％)，具有保守結構域(12-213)，“羊毛硫抗生素保護abc轉運蛋白通透酶亞單位，mute/epie家族；tigr03732”。cds3166編碼612個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“含有菌毛異肽形成d2結構域的蛋白[短雙歧桿菌]；wp_016462071.1”(e-分數(shù)：0.0；同一性：95％)，具有3個結構域(225-407)，“菌毛異肽形成d2結構域；tigr04226”；(444-532)“cna蛋白b型結構域；pfam05738”；(577-610)，“l(fā)pxtg-基序細胞壁錨定結構域；tigr01167”。表8列出了僅見于核種4中的2個cds。cds2293編碼1156個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“atp-結合蛋白[反芻雙歧桿菌]；wp_026645899.1”(e-評分：0.0；同一性：97％)，具有2個保守結構域(627-842)，“未知功能的結構域duf87；cl19135”；(638-958)，“aaa樣結構域；pfam12846”。cds2334編碼141個氨基酸的蛋白質，顯著比對于“xre家族轉錄調節(jié)物[遲緩埃格特菌(eggerthellalenta)]；wp_015760296.1”(e-評分：3e-87；同一性：92％)，具有2個保守結構域(4-117)，“預測的轉錄調節(jié)物[轉錄]；cog1396”；(4-61)，“螺旋-轉角-螺旋xre家族樣蛋白”。實施例6-在細胞單層中的緊密連接的刺激通過菌株提高穿過caco-2細胞單層的電阻(跨上皮電阻；ter)的能力測量腸道屏障改善。培養(yǎng)caco-2細胞在培養(yǎng)箱中，在37℃、5％co2下將哺乳動物腸道上皮caco-2細胞系(dsmzacc169,萊布尼茲研究所dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克，德國(leibniz-institutdsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,braunschweig,germany))在補充有20％熱滅活的胎牛血清(gibco)、1x非必需氨基酸(thermoscientific)及1xpenstrep(biologicalindustries)的dmem(gibco)中培養(yǎng)。使用傳代15至25次的caco-2細胞。細胞當60-80％匯合時被胰蛋白酶消化。在dmem中制備105個細胞/ml的細胞懸液并且將500μl接種于12mm、0.4μm孔徑聚酯膜插入皿(corning,usa)的頂端隔室中，而將1.5ml培養(yǎng)基添加至基底外側隔室中。將細胞在插入皿上培養(yǎng)21天，每周兩次更換培養(yǎng)基。在第21天，將transwell插入皿移到(nanoanalytics,德國)。將培養(yǎng)基更換為無抗生素的培養(yǎng)基，且因此，將無抗生素的760μl和1.65mldmem分別添加至頂端和基底外側隔室中。將cellzscope置于培養(yǎng)箱中并且每小時監(jiān)測ter持續(xù)20-23小時，同時自動數(shù)據收集。雙歧桿菌的制備在具有0.05％半胱氨酸氯化物(merckkgaa,德國)的manrogosasharp(mrs)肉湯(oxoida/s,丹麥)中厭氧地培養(yǎng)雙歧桿菌過夜。通過離心(6000xg，2min)收集細菌，丟棄上清液并將細菌再懸浮于dmem中。通過離心再次收集細菌并重懸浮于dmem中以洗滌細胞。第三次離心之后，將細菌重懸浮于dmem中并測量od600。將細胞懸液稀釋至od600＝3.8。caco-2細胞的刺激為了用雙歧桿菌刺激caco-2細胞，將100μldmem輕輕地從transwell插入皿的頂端區(qū)域中除去并用100μl細菌懸液代替以得到0.5的最終od600。然后將cellzscope轉移回到培養(yǎng)箱中并且每小時記錄ter持續(xù)16小時。一式三份(3個獨立的transwell小室)完成所有刺激。無細菌補充的dmem被用作對照，即非刺激的caco-2單層。用鼠李糖乳桿菌lgg的刺激也包括在每個實驗中，這是一種強烈地刺激ter的菌株。lgg被用于歸一化個別實驗之間的數(shù)據。實驗開始之前ter的過夜測量允許測定每個個別孔中的基線ter并且確保電阻是穩(wěn)定的。相對于刺激之前記錄的最后的值(設定為100％)計算細菌刺激期間ter的變化。為了比較來自個別實驗的測量值，以lgg刺激之后測量的ter值對數(shù)據進行歸一化。結果在21個青春雙歧桿菌樣菌株中測試增加caco-2單層中的ter的能力。ter的連續(xù)測量顯示在刺激10小時之后，ter達到平臺期，隨后極少增加(圖3)。因此，記錄10h之后每個菌株改善ter的能力并且在此時點比較菌株。大多數(shù)青春雙歧桿菌樣菌株增加caco-2單層的ter，但以不同的程度(圖4)。六個菌株在10h之后將ter增加至大于120％刺激之前記錄的電阻(dsm29102(bif123)，148％；dsm29107(bif106)，146％；dsm29103(bif038)，142％；bif060，126％；bif113，124％；bif016，122％)。九個菌株將ter增加至相對于刺激之前的值的110％至120％，而六個菌株對ter沒有影響。將ter增加至≥120％刺激caco-2單層之前的電阻值的菌株被認為對上皮屏障具有顯著作用。在所有實驗中鼠李糖乳桿菌lgg將ter增加至155％±25％刺激之前的電阻。實施例7-樹突細胞的免疫調節(jié)通過確定刺激之后人樹突細胞中的細胞因子誘導來研究青春雙歧桿菌樣菌株的潛在免疫調節(jié)作用。雙歧桿菌的制備通過將雙歧桿菌接種在10ml具有0.05％半胱氨酸氯化物(merckkgaa,德國)的manrogosasharp(mrs)肉湯(oxoida/s,丹麥)中并在37℃下厭氧地培養(yǎng)過夜來制備用于樹突細胞(dc)刺激的冷凍雙歧桿菌培養(yǎng)物。次日，將1％過夜培養(yǎng)物接種在具有0.05％半胱氨酸氯化物的mrs中并在37℃下厭氧地生長過夜。為了挑取處于指數(shù)生長期的雙歧桿菌，將100μl新鮮的過夜培養(yǎng)物接種在10ml具有0.05％半胱氨酸氯化物的mrs(1％稀釋)中；五份連續(xù)10倍稀釋液(10-1至10-5)是由1％接種物制成并在37℃下厭氧地生長過夜。將細菌密度調節(jié)至od600＝5，并且在微量滴定托盤中將培養(yǎng)物在-80℃下于10％甘油中冷凍。源自單核細胞的dc生成通過6日程序在體外生成未成熟的源自單核細胞的dc。由丹麥哥本哈根的哥本哈根大學醫(yī)院(copenhagenuniversityhospital)的臨床免疫科供應來自健康供體的人白細胞層。沒有識別信息的人類樣品的使用是經thenationalcommitteeonhealthresearchandthedanishsocietyforclinicalimmunology批準的，并且所有供體在捐獻時都提交了書面的知情同意書。簡單說來，使用ficoll-paqueplus(gehealthcare,弗萊堡,德國)，通過密度梯度離心從白細胞層中獲得人外周血單核細胞。使用以cd14微珠(miltenyibiotec,貝爾吉施格拉德巴赫,德國)進行的磁性激活細胞分類術，通過針對cd14的陽性選擇分離單核細胞并且在37℃、5％co2下，以2x106個細胞/ml的密度在含有30ng/ml人重組il-4和20ng/ml人重組gm-csf(兩者均來自sigma-aldrich,圣路易斯,美國)的完全dc培養(yǎng)基(補充有10mmhepes(sigma-aldrich,施內爾多爾夫,德國)、50mm2-巰基乙醇(sigma-aldrich,施內爾多爾夫,德國)、2mml-谷氨酰胺(lifetechnologiesltd,佩斯里,uk)、10％熱滅活的胎牛血清(invitrogen,佩斯里,uk)、100u/ml青霉素(biologicalindustries,kibbutzbeit-haemek,以色列)、及100mg/ml鏈霉素(biologicalindustries,kibbutzbeit-haemek,以色列)的rpmi1640)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)三天之后添加含有全劑量的il-4和gm-csf的新鮮的完全dc培養(yǎng)基。在第6日，通過表面標記表達分析(cd11c>90％表達；cd1a>75％表達)證實分化為未成熟的dc。dc刺激將不成熟的dc重懸浮于不含抗生素的新鮮的完全dc培養(yǎng)基中，以105個細胞/孔接種于96孔板中，并且允許在37℃、5％co2下適應環(huán)境，持續(xù)至少一小時之后刺激。在37℃、5％co2下，用解凍的雙歧桿菌以100:1的細菌:dc比率刺激dc持續(xù)20h。20h刺激之后，將dc上清液經由0.2μmacroprepadvance96孔濾板(pallcorporation,安阿伯市,密歇根州,美國)無菌過濾并在-80℃下儲存直到細胞因子定量之時。dc染色用于定量共刺激分子和趨化因子受體20h刺激時間之后立即收集dc，在200xg下離心5min，并且重懸浮于含有2％bsa的冷pbs中。使用以下單克隆抗體進行染色：fitc綴合的抗人cd80(克隆l307.4)、fitc綴合的抗人cd86(克隆2331)、apc綴合的抗人ccr6(克隆11a9)、fitc綴合的抗人ccr7(克隆150503)、以及適當?shù)耐N型對照(所有均來自bdbiosciences,erembodegem,比利時)。在冰上于避光的情況下用mab培育dc持續(xù)30min，接著使用1ml冷的pbs2％bsa重復洗滌步驟。最終，將dc重懸浮于pbs2％bsa中并且保持在冰上直到流式細胞分析。使用facsdiva軟件(bdbiosciences,圣何塞,加利福尼亞州,美國)，在lsrfortessa流式細胞儀(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)上獲取樣品。細胞因子定量通過人炎性細胞因子細胞計數(shù)珠陣列(cba)試劑盒(bdbiosciences,erembodegem,比利時，根據制造商說明書，定量il-10、il-12、tnfα、il-6及il-1β的分泌水平。簡單說來，將用單克隆捕捉抗體涂布的熒光珠粒與pe綴合的檢測抗體和重組標準或測試樣品混合并且使其在3h避光培育期間形成夾心復合物。在重復洗滌步驟之后，在lsrfortessa流式細胞儀(bdbiosciences,圣何塞,加利福尼亞州,美國)上獲取樣品并且使用fcaparray3軟件(bdbiosciences,圣何塞,加利福尼亞州,美國)進行數(shù)據分析。各細胞因子的檢測限值如下：1.9pg/mlil-12、3.7pg/mltnfα、3.3pg/mlil-10、2.5pg/mlil-6及7.2pg/mlil-1β。結果青春雙歧桿菌樣菌株誘導人樹突細胞中的細胞因子分泌。因為不能在單次篩選中測試所有青春雙歧桿菌樣菌株，所以使用來源于不同供體的dc。發(fā)現(xiàn)在供體之中的整體細胞因子反應的實質性變化，因此將細胞因子數(shù)據歸一化以便比較來自不同供體的結果。以每種細胞因子和每個供體的平均表達對原始細胞因子數(shù)據進行歸一化。十三個青春雙歧桿菌樣菌株刺激il-10分泌超過檢測極限并且顯著不同于非刺激的細胞(圖5)，其中尤其是dsm29111(bif046)、dsm29105(bif061)、dsm29106(bif084)、dsm29103(bif038)及dsm29104(bif129)。這些青春雙歧桿菌樣菌株中的十個另外引起大于1的il-10/il-12分泌比率，提示免疫調節(jié)的潛力(dsm29111(bif046)，2.1；dsm29106(bif084)，1.1；dsm29103(bif038)，1.1；dsm29104(bif129)，2.8；bif056，1.1；bif059，1.1；bif027，1.3；dsm29102(bif123)，1.1；bif016，1.1；dsm29107(bif106)，1.6)。所選體外結果的概述表9提供保藏菌株的體外結果的概述。選出能夠實現(xiàn)以下功能的菌株：在10h處理之后將caco-2細胞單層的跨上皮電阻(ter)增加至大于120％處理開始時的ter；當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時能夠誘導il-10分泌>200pg/ml；或當與源自人pbmc的樹突細胞共培育時能夠誘導il-10:il-12比率>1；或兩種或更多種這些功能的組合。實施例8-青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)對dss誘發(fā)的結腸炎的作用在體內，在大鼠的葡聚糖硫酸鈉(dss)結腸炎模型中測試青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)。dss結腸炎是炎性腸病的模型，包括潰瘍性結腸炎(uc)和克羅恩氏病，其全世界發(fā)病率和發(fā)生率已顯示增加(molodecky等人,2012)。dss結腸炎的潛在病理生理機制包括炎癥、小囊破壞及腸道滲透性提高。dss結腸炎中的疾病癥狀對應于在人uc中所觀察到的，包括體重下降、腹瀉及便血(herias等人2005)。在此研究中，8周齡的雄性wistar大鼠(每dss組n＝18，對于健康對照n＝6)接受半純化的人源化飲食(高脂、低纖維)以模擬人類條件。將動物單獨圈養(yǎng)在具有不銹鋼地板的代謝籠中以便于完全單獨地收集糞便和尿液。代謝籠具有飼料通道以避免飼料溢出并且確保飼料攝入量的正確測量。大約1010cfu/日的青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)或安慰劑作為懸浮在鹽水中的冷凍干燥粉劑給予。在通過口服管飼兩周的青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)或媒介物(鹽水)給藥之后，通過在飲用水中添加3％dss持續(xù)9天引入結腸炎。在dss暴露期間，每天記錄體重以測量炎癥誘發(fā)的厭食。在結腸炎期間每天對糞便稠度和便血進行評分作為疾病嚴重性的量度。根據以下參數(shù)對糞便稠度評分：0，成形且堅硬的糞便；1，成形但柔軟的糞便；2，稀便；3，輕度腹瀉(水樣)及4，嚴重腹瀉。將惰性鉻credta(2g/kg飼料)添加至飲食中以量化胃腸道滲透性。通過稱重動物的飼料每天測定飲食credta攝入并且通過在24小時尿樣品中在之前(第-1/-2日)一次且在結腸炎期間(第4/5日和第7/8日)兩次測定credta來評價胃腸道滲透性。對于cr測量，將尿用50g/l三氯乙酸酸化，在14.000g下離心2min并用0.5g/lcscl稀釋。通過感應耦合等離子體-原子發(fā)射分光光度測定法分析鉻。在結束時，檢查結腸以根據wallace標準(wallace等人,1989)評價肉眼病變，這是基于腸的腹瀉、粘附、充血、增厚以及潰瘍的程度。此外，從結腸的中部切出2cm片段，保存在4％多聚甲醛中，包埋入石蠟中，切片并用蘇木精和曙紅染色。對組織載玻片盲檢并根據cooper分數(shù)(cooper等人,1993)評分。結果表示為平均值+sem并且如下進行數(shù)據的統(tǒng)計學評價：對于成對數(shù)據，針對給予細菌的組及對比dss的健康對照(媒介物組)進行非參數(shù)成對wilcoxon檢驗。使用shapirowilk’s檢驗檢查非成對數(shù)據的正態(tài)性且甚至通過bartlett’s檢驗檢查組中的方差。當滿足標準時，在給予細菌的組與對比dss的健康對照之間進行學生t檢驗。如果不滿足標準，那么使用mannwhitneyu檢驗。結果在dss暴露期間每天記錄體重，青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)與dss組相比顯著地抑制dss誘發(fā)的體重損失(p＝0.002)(圖6)。青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)與dss組相比具有顯著較輕的(p＝0.048)稀便和腹瀉，在曲線下面積糞便稠度分數(shù)低大約10％(圖7)。并且，在結束時具有便血分數(shù)的動物數(shù)目減少了30％；在青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)中18個動物中有7個對比dss組中18個中有10個(圖8)。全腸道滲透性在dss攻擊期間增加，并且到第7.5天，每平均水攝入量尿中的credta在dss組中相比健康對照增加了129％。青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)臨界線在第7.5天將dss誘發(fā)的滲透性顯著地(p＝0.057)減小了30％(圖9)。當比較青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)組與dss組之間結束時的組織評分時還觀察到26％的統(tǒng)計上顯著差異(p＝0.049)，而結束時的肉眼評分在青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)組中相比dss降低了19％(分別是圖10和11)?？偟恼f來，用青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)的此干預相比單獨接受dss處理的大鼠使得在以下方面改善：疾病誘發(fā)的厭食、糞便稠度、動物數(shù)量、便血、肉眼和顯微鏡評分以及腸道滲透性。這些數(shù)據表明青春雙歧桿菌dsm29103(bif038)預防和/或抑制胃腸道中的炎癥和組織損傷并且還抑制腹瀉且誘導就體重而言的總體健康促進效果。保藏和專家解決方案申請人請求如下所述為本申請保藏的微生物樣品僅限于本領域中的專家，直到授予專利之日。chcc12845是在2014年7月16日以保藏號dsm29102保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。chcc12855是在2014年7月16日以保藏號dsm29103保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。chcc12867是在2014年7月16日以保藏號dsm29104保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。chcc12895是在2014年7月16日以保藏號dsm29105保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。chcc12957是在2014年7月16日以保藏號dsm29106保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。chcc12999是在2014年7月16日以保藏號dsm29107保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。chcc12876是在2014年7月16日以保藏號dsm29111保藏于dsmz-德國微生物保藏中心，布倫瑞克d-38124，因霍芬街7b(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)。保藏都是按照用于專利程序目的的關于微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約進行。參考文獻adawi,d.,ahrne,s.,molin,g.(2001)effectsofdifferentprobioticstrainsoflactobacillusandbifidobacteriumonbacterialtranslocationandliverinjuryinanacuteliverinjurymodel.int.jfoodmicrobiol70：213-220.anderson,r.c.,cookson,a.l.,mcnabb,w.c.,park,z.,mccann,m.j.,kelly,w.j.,roy,n.c.(2010)lactobacillusplantarummb452enhancesthefunctionoftheintestinalbarrierbyincreasingtheexpressionlevelsofgenesinvolvedintightjunctionformation.bmcmicrobiol10:316.arrieta,m.c.,bistritz,l.,meddings,j.b.(2006)alterationsinintestinalpermeability.gut.55:1512-1520.bansal,t.,alaniz,r.c.,wood,t.k.,jayaraman,a.(2010)thebacterialsignalindoleincreasesepithelial-celltight-junctionresistanceandattenuatesindicatorsofinflammation.proc.natl.acad.sci.u.s.a.107:228-233.bashashati,m.,rezaei,n.,bashashati,h.,shafieyoun,a.,daryani,n.e.,sharkey,k.a.,storr,m.(2012)cytokinegenepolymorphismsareassociatedwithirritablebowelsyndrome:asystematicreviewandmeta-analysis.neurogastroenterol.mol.24(12):1102-1111.bashashati,m.,rezaei,n.,shafieyoun,a.,mckernan,d.p.,chang,l.,ohman,l.,quigley,e.m.,schmulson,m.,sharkey,k.a.,simren,m.(2014)cytokineimbalanceinirritablebowelsyndrome:asystematicreviewandmeta-analysis.neurogastroenterol.motil.26:1036-1048.beaudoin,m.,goyette,p.,boucher,g.,lo,k.s.,rivas,m.a.,stevens,c.,alikashani,a.,ladouceur,m.,ellinghaus,d.,torkvist,l.,goel,g.,lagace,c.,annese,v.,bitton,a.,begun,j.,brant,s.r.,bresso,f.,cho,j.h.,duerr,r.h.,halfvarson,j.,mcgovern,d.p.,radford-smith,g.,schreiber,s.,schumm,p.l.,sharma,y.,silverberg,m.s.,weersma,r.k.,quebecibdgeneticsconsortium；nikkdibdgeneticsconsortium；internationalibdgeneticsconsortium,d’amato,m.,vermeire,s.,franke,a.,lettre,g.,xavier,r.j.,daly,m.j.,rioux,j.d.(2013)deepresequencingofgwaslociidentifiedrarevariantsincard9,il23randrnf186thatareassociatedwithulcerativecolitis.plosgenet,9(9):e1003723.bergmann,k.r.,liu,s.x.l.,tian,r.,kushnir,a.,turner,j.r.,li,h.-l.chou,p.m.,(2013)bifidobacteriastabilizeclaudinsattightjunctionsandpreventintestinalbarrierdysfunctioninmousenecrotizingenterocolitis.theamericanjournalofpathology,182,5:1595-1606.biavati,b.,mattarelli,p.,(1991)bifidobacteriumruminantiumsp.nov.andbifidobacteriummerycicumsp.nov.fromtherumentsofcattle.intjsystbacteriol.41:163-168.brosius,j.,palmer,m.l.,kennedy,p.j.,noller,h.f.(1978)completenucleotidesequenceofa16sribosomalrnagenefromescherichiacoli.procnatlacadsciusa.75(10):4801-5.camilleri,m.,gorman,h.(2007)intestinalpermeabilityandirritablebowelsyndrome.neurogastroenterolmotil19:545–552.camilleri,m.,madsen,k.,spiller,r.,greenwood-vanmeerveld,b.,verne,g.n.(2012)intestinalbarrierfunctioninhealthandgastrointestinaldisease.neurogastroenterolmotil.24(6):503-12.cani,p.d.,amar,j.,iglesias,m.a.,poggi,m.,knauf,c.,bastelica,d.,neyrinck,a.m.,fava,f.,tuohy,k.m.,chabo,c.,waget,a.,delmée,e.,cousin,b.,sulpice,t.,chamontin,b.,ferrières,j.,tanti,j.f.,gibson,g.r.,casteilla,l.,delzenne,n.m.,alessi,m.c.,burcelin,r.(2007)metabolicendotoxemiainitiatesobesityandinsulinresistance.diabetes.56(7):1761-72.chassaing,b.,etienne-mesmin,l.,gewirtz,a.t.(2014)microbiota-liveraxisinhepaticdisease.hepatology,59(1):328-339.chen,l-l.,wang,x-h.,cui,y.,lian,g-h.,zhang,j.,quyang,c-h.,andlu,f-g.(2009)therapeuticeffectsoffourstrainsofprobioticsonexperimentalcolitisinmice.world.j.gastroenterol.15(3):321-327.cirera,i.,bauer,t.m.,navasa,m.,vila,j.,grande,l.,taura,p.,fuster,j.,garcia-valdecasa,j.c.,lacy,a.,suarez,m.j.,rimola,a.,rodes,j.(2001)bacterialtranslocationofentericorganismsinpatientswithcirrhosis.jhepatol.34:32-37.cleenwerck,i.,vandemeulebroecke,k.,janssens,d.,swings,j.(2002)re-examinationofthegenusacetobacter,withdescriptionsofacetobactercerevisiasp.nov.andacetobactermalorumsp.nov.intjsystevolmicrobiol.52:1551-1558.cooper,h.s.,murthy,s.n.,shah,r.s.,sedergran,d.j.(1993)clinicopathologicstudyofdextransulfatesodiumexperimentalmurinecolitis.lab.invest.69:238-249.dekort,s.,keszthelyi,d.,masclee,a.a.(2011)akygutanddiabetesmellitus:whatisthelink？obesrev.12(6)：449-58.dicksved,j.,schreiber,o.,willing,b.,petersson,j.,rang,s.,phillipson,m.,holm,l.,roos,s.(2012)lactobacillusreuterim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