本發(fā)明涉及在使用木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的過(guò)程中用于發(fā)酵糖化溶液的微生物。

特別涉及在使用木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的過(guò)程中能夠由五碳糖(下文中也稱(chēng)為c5)以及六碳糖(下文中也稱(chēng)為c6)有效地生產(chǎn)乙醇的微生物。

背景技術(shù)：

生物乙醇作為由生物質(zhì)產(chǎn)生的不會(huì)發(fā)生枯竭的可再生資源而倍受期待。另外，由于燃燒生物乙醇而產(chǎn)生的二氧化碳為碳中性的，因而據(jù)信通過(guò)進(jìn)行生物乙醇的利用可抑制作為地球溫室化的主要原因的二氧化碳的增加。

生物乙醇是將生物質(zhì)發(fā)酵并進(jìn)行蒸餾提純乙醇制得的。為了提高生物乙醇的收率，需要由糖化溶液中生成大多數(shù)的醇。在生物乙醇生產(chǎn)的過(guò)程中通常使用的酵母無(wú)法將木糖、阿拉伯糖等五碳糖轉(zhuǎn)換為醇，因而作為發(fā)酵原料，僅使用了六碳糖。

盡管根據(jù)原料而不同，但在代表性的生物質(zhì)中被認(rèn)為含有35％～45％的纖維素、25％～40％的半纖維素、15％～30％的木質(zhì)素。因而，在不僅可利用六碳糖聚合而成的纖維素作為底物、而且還可利用主要含有作為五碳糖的木糖等的半纖維素作為底物時(shí)，可有效地產(chǎn)生乙醇。

木糖被認(rèn)為是在生物質(zhì)中大量含有的糖，其含量?jī)H次于葡萄糖，有效地利用五碳糖是生物乙醇生產(chǎn)中的一大課題。

目前為止公開(kāi)了少量利用木糖的技術(shù)，其是通過(guò)經(jīng)基因重組而賦予木糖利用能力、或者利用木糖產(chǎn)生乙醇的微生物的利用等而實(shí)現(xiàn)的。

在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了下述發(fā)明：將具有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的基因?qū)氲剿拗骷?xì)胞中，從而將木糖(c5)轉(zhuǎn)換為木酮糖，整合在糖酵解系統(tǒng)的戊糖磷酸途徑中，在發(fā)酵中加以利用。

在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了利用被賦予了阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的酵母來(lái)生成醇的技術(shù)。與專(zhuān)利文獻(xiàn)1同樣地將阿拉伯糖(c5)經(jīng)阿拉伯糖醇、木酮糖而整合在糖酵解系統(tǒng)的戊糖磷酸途徑中，在發(fā)酵中加以利用。

在非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了通過(guò)將大腸桿菌來(lái)源的木糖同化基因重組到發(fā)酵單胞菌中而賦予木糖同化能力的內(nèi)容。

在非專(zhuān)利文獻(xiàn)2中記載了畢赤屬酵母可利用木糖生產(chǎn)乙醇的內(nèi)容。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專(zhuān)利文獻(xiàn)

專(zhuān)利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)2012-170422號(hào)公報(bào)

專(zhuān)利文獻(xiàn)2：美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2013/189788號(hào)說(shuō)明書(shū)

非專(zhuān)利文獻(xiàn)

非專(zhuān)利文獻(xiàn)1：zhang,m.,etal.,science,1995.vol.267,pp.240-243.

非專(zhuān)利文獻(xiàn)2：bicho,p.a.,etal.,appl.environ.microbiol.,1988,vol.54,pp.50-54.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

但是，在專(zhuān)利文獻(xiàn)1的發(fā)明中，是將季也蒙假絲酵母(candidaguilliermondii)來(lái)源的具有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的蛋白質(zhì)導(dǎo)入到作為宿主的釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中。即進(jìn)行了外來(lái)基因的導(dǎo)入。

另外，在專(zhuān)利文獻(xiàn)2的發(fā)明中，盡管轉(zhuǎn)運(yùn)基因不同，但也是向宿主中導(dǎo)入不同種基因的發(fā)明。

另外，非專(zhuān)利文獻(xiàn)1所記載的技術(shù)是導(dǎo)入木糖同化基因的技術(shù)，與上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2的技術(shù)思想不同，但導(dǎo)入外來(lái)基因這一點(diǎn)不變。

因此，上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2、非專(zhuān)利文獻(xiàn)1均需要采取用于實(shí)施聯(lián)合國(guó)所采納的“關(guān)于生物多樣性公約的卡塔赫納生物安全議定書(shū)”的封鎖對(duì)策。從而需要用于保證生物安全的設(shè)施，因而利用該菌體生產(chǎn)乙醇從成本方面考慮是不利的。

另外，根據(jù)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2記載的技術(shù)，利用了畢赤屬酵母，這由于野生型的畢赤屬酵母的木糖利用性低，因而乙醇產(chǎn)生效率并不那么高。

本發(fā)明的課題在于在不導(dǎo)入外來(lái)基因的條件下得到乙醇產(chǎn)生效率高的發(fā)酵菌。

解決課題的手段

本發(fā)明涉及一種由五碳糖和六碳糖有效地產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵菌，其特征在于，其在2014年11月19日(保藏日)以保藏編號(hào)nitebp-01964(下文中也稱(chēng)為bp-01964菌株)被保藏于專(zhuān)利微生物保藏中心(獨(dú)立行政法人日本國(guó)家技術(shù)與評(píng)價(jià)研究所專(zhuān)利微生物保藏中心日本國(guó)〒292-0818千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8122號(hào)室)。

野生型季也蒙畢赤酵母具備木糖同化能力。但并不是說(shuō)其具備對(duì)于生物乙醇生產(chǎn)為充分的木糖利用能力。bp-01964菌株是通過(guò)對(duì)季也蒙畢赤酵母進(jìn)行菌株育種，選擇出五碳糖的利用效率高的菌而得到的。其結(jié)果選擇出了具備相對(duì)于親株為約2倍的乙醇生產(chǎn)率的菌。

另外，本發(fā)明的特征在于，其是在上述季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii)株中導(dǎo)入了自克隆的轉(zhuǎn)醛醇酶、醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、甲酸脫氫酶基因而得到的。

在導(dǎo)入季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii)自身的酶基因時(shí)，依據(jù)卡塔赫納法的封鎖對(duì)策是不必要的。因而，其不需要用于生物安全的特殊設(shè)施，能夠使用現(xiàn)有的設(shè)備。

附圖說(shuō)明

圖1是示出bp-01964菌株與親株(n株)的乙醇生成量的圖。

圖2是示出漿液發(fā)酵中的葡萄糖、木糖同化能力的圖。

圖3是示出漿液發(fā)酵、澄清液發(fā)酵中的發(fā)酵收率的圖。

圖4是示出bp-01964菌株在玉米秸稈澄清液中的乙醇產(chǎn)生能力的圖。

具體實(shí)施方式

作為子囊菌酵母的季也蒙畢赤酵母具備木糖同化能力。將季也蒙畢赤酵母的n株作為親株，誘發(fā)變異并選擇變異株進(jìn)行育種，從而得到保藏編號(hào)nitebp-01964的菌。

通常，在變異的誘發(fā)中使用紫外線(xiàn)或放射線(xiàn)照射、n-亞硝基-n-乙基脲(enu)、甲磺酸乙酯(ems)等烷基化劑、brdu等堿類(lèi)似化合物、硝基胺或亞硝基胍等亞硝基化合物等。在本發(fā)明中，通過(guò)uv照射或ems等化學(xué)藥品的添加來(lái)誘發(fā)變異。

下面對(duì)菌株的獲得方法進(jìn)行說(shuō)明。

實(shí)施例

1.菌株的分離

使用稻稈來(lái)源的糖液對(duì)季也蒙畢赤酵母的親株進(jìn)行培養(yǎng)。將熊谷產(chǎn)的稻稈浸入在等量的25％氨水中，于80℃浸入3小時(shí)后，將氨解吸出。將處理后的生物質(zhì)利用10％naoh調(diào)整成ph4后，添加支頂孢屬纖維素酶(アクレモニウムセルラーゼ，acremoniumcellulase)(meijiseikapharma公司制造)，于50℃進(jìn)行72小時(shí)酶糖化。將所制作的漿液通過(guò)壓濾法進(jìn)行固液分離，回收液體。使用該液體(下文中也稱(chēng)為澄清液)，加入誘變劑進(jìn)行19個(gè)月馴化培養(yǎng)，分選出發(fā)酵性能提高株。分選以一定時(shí)間后的乙醇量為基準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行。將發(fā)酵性能高的菌株以保藏編號(hào)nitebp-01964保藏于獨(dú)立行政法人日本國(guó)家技術(shù)與評(píng)價(jià)研究所專(zhuān)利微生物保藏中心。

2.菌株的性質(zhì)

2.1乙醇產(chǎn)生能力

圖1示出了bp-01964菌株相對(duì)于作為親株的n株的乙醇產(chǎn)生量。對(duì)玉米秸稈進(jìn)行稀硫酸處理，將所得到的糖化液利用naoh水溶液調(diào)整為ph6來(lái)使用，按照培養(yǎng)基的od600為2.0來(lái)添加同株的培養(yǎng)液，圖1中示出了于30℃培養(yǎng)96小時(shí)后的培養(yǎng)液中的乙醇量。糖化溶液的葡萄糖為63.2g/l、木糖為34.5g/l。乙醇測(cè)定使用gc-fid(glsciences公司制造：gc390b)。

由圖1可明確，得到了相對(duì)于野生型產(chǎn)生2倍以上乙醇的菌株。由于相對(duì)于野生株乙醇產(chǎn)生量提高，因而認(rèn)為作為c5的木糖的同化能力提高。因此確認(rèn)到了該菌株的葡萄糖和木糖同化能力。

其次，將稻稈利用氨水進(jìn)行與上述氨處理同樣的處理后，添加支頂孢屬纖維素酶，于50℃進(jìn)行72小時(shí)酶糖化，使用所制作的漿液進(jìn)行發(fā)酵。

漿液發(fā)酵槽呈夾套結(jié)構(gòu)，使溫水在夾套部循環(huán)來(lái)進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)。另外，在底部設(shè)置通氣口，將規(guī)定量的通過(guò)了過(guò)濾器的空氣持續(xù)由底部的通氣口持續(xù)通入，在利用與馬達(dá)聯(lián)動(dòng)的刮刀進(jìn)行攪拌的同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。

進(jìn)行漿液中所含有的葡萄糖、木糖、乙醇的量的經(jīng)時(shí)性變化的分析。關(guān)于葡萄糖、木糖，對(duì)漿液進(jìn)行取樣，對(duì)于通過(guò)離心得到的上清施以hplc測(cè)定來(lái)進(jìn)行測(cè)定。關(guān)于乙醇，與上述同樣地使用gc-fid(glsciences公司制造：gc390b)。將結(jié)果示于圖2。

作為c6的葡萄糖先被消耗，其后，隨著漿液中的葡萄糖減少，作為c5的木糖被消耗，產(chǎn)生乙醇。所得到的菌對(duì)c5、c6均具備同化能力，因而能夠有效地產(chǎn)生乙醇。因此是在工業(yè)生產(chǎn)中也有用的菌株。

2.2漿液發(fā)酵能力、澄清液發(fā)酵能力

優(yōu)選為在進(jìn)行生物乙醇產(chǎn)生時(shí)不論使用漿液、澄清液中的哪一種的情況下均可有效地發(fā)酵的菌。因此，使用漿液、澄清液對(duì)發(fā)酵收率進(jìn)行比較。發(fā)酵收率通過(guò)下式計(jì)算。

發(fā)酵收率＝所得到的乙醇量(g/l)/發(fā)酵開(kāi)始時(shí)的糖液中含有的葡萄糖+木糖量(g/l)/0.5114

如圖3所示，得到了不論在漿液發(fā)酵還是在澄清液發(fā)酵中均能夠發(fā)揮出同等性能的菌株。

2.3在玉米秸稈糖液中的乙醇產(chǎn)生能力

與稻稈同樣地，玉米秸稈也是多用于生物乙醇產(chǎn)生的生物質(zhì)。本菌株為使用由稻稈制造的澄清液進(jìn)行馴化并分離出的菌株，但在玉米秸稈中也同樣有效地產(chǎn)生生物乙醇。

將美國(guó)愛(ài)荷華州產(chǎn)的玉米秸稈浸在2倍量的3.7重量％硫酸水溶液中，于170℃處理10分鐘。回復(fù)常溫后，利用4m氫氧化鈉水溶液制備成ph4，添加生物質(zhì)糖化用酶(支頂孢屬纖維素酶等、meijiseikapharma公司制造)于50℃進(jìn)行72小時(shí)酶糖化。將所制作的漿液利用離心分離法進(jìn)行固液分離，回收液體(下文中稱(chēng)為玉米秸稈澄清液)。

使用將玉米秸稈澄清液利用naoh水溶液調(diào)整成ph6而得到的液體，使用本菌株進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)時(shí)性地測(cè)定乙醇產(chǎn)生量。將結(jié)果示于圖4。野性型(n株)在48小時(shí)后乙醇產(chǎn)生大致達(dá)到頂點(diǎn)，與此相對(duì)，本菌株直到72小時(shí)后仍繼續(xù)產(chǎn)生乙醇，最終能夠以約1.5倍左右的高產(chǎn)率產(chǎn)生乙醇。

另外，為了使本發(fā)明中得到的菌株更容易利用木糖，也可以導(dǎo)入下述酶的基因：作為戊糖磷酸途徑酶的轉(zhuǎn)醛醇酶、作為由乙醛生成乙醇的酶的醇脫氫酶、由丙酮酸生成作為醇脫氫酶底物的乙醛的丙酮酸脫羧酶。

例如，在基因?qū)霑r(shí)，可以進(jìn)行下述過(guò)程。對(duì)于希望導(dǎo)入的基因及其終止子部(下文中稱(chēng)為基因+終止子部)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。對(duì)導(dǎo)入中想要使用的啟動(dòng)子部進(jìn)行pcr擴(kuò)增。它們均由本發(fā)明中使用的菌株即季也蒙畢赤酵母的染色體進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

將pcr擴(kuò)增后的dna片段按照啟動(dòng)子、基因+終止子部的順序使用融合(in-fusion)法克隆到大腸桿菌用的市售載體中。將克隆后的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，進(jìn)行載體的擴(kuò)增。利用限制酶由擴(kuò)增后的載體切出啟動(dòng)子以及基因+終止子部，或者由擴(kuò)增后的載體進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而得到同源重組用的dna片段。

將所得到的dna片段同源重組到菌株中，得到所期望的菌株。同源重組中使用電穿孔法。通過(guò)該方法導(dǎo)入基因時(shí)，能夠在染色體上導(dǎo)入多個(gè)拷貝，因而能夠增強(qiáng)所導(dǎo)入的酶的活性。

作為同源重組用dna片段，例如可以使用木糖還原酶的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)醛醇酶+終止子。這是由于，通過(guò)使用在木糖同化時(shí)發(fā)揮功能的木糖還原酶的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)醛醇酶被認(rèn)為可有效地發(fā)揮出作用。

木糖還原酶的啟動(dòng)子具體地說(shuō)使用下述序列編號(hào)1和序列編號(hào)2的引物進(jìn)行擴(kuò)增，轉(zhuǎn)醛醇酶基因和終止子部分使用下述序列編號(hào)3和4的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

序列編號(hào)1：aaggcttgggaactttcttt

序列編號(hào)2：agcaattgatgattaatttt

序列編號(hào)3：atgaccaattctcttgaaca

序列編號(hào)4：aaattgtgccgtgtcaaact

另外，也可以使用gapdh的啟動(dòng)子、醇脫氫酶+終止子。gapdh是存在于糖酵解系統(tǒng)中的強(qiáng)力的啟動(dòng)子，因而通過(guò)將其用作醇脫氫酶(其為糖酵解系統(tǒng)的酶)的啟動(dòng)子，據(jù)信可有效地發(fā)揮出作用。醇脫氫酶具有將乙醛轉(zhuǎn)換為乙醇的作用，同時(shí)在nadh依賴(lài)性的情況下生成nad⁺，因而具有增強(qiáng)nad⁺依賴(lài)性木糖醇脫氫酶作用的作用。

gapdh的啟動(dòng)子具體地說(shuō)使用下述序列編號(hào)5和序列編號(hào)6的引物進(jìn)行擴(kuò)增，醇脫氫酶基因和終止子部分使用下述序列編號(hào)7和8的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

序列編號(hào)5：gttgtagcggaggctcaatt

序列編號(hào)6：tgtataatttaaatgtgggt

序列編號(hào)7：atgtcaattccagaatccat

序列編號(hào)8：caccttggctggaagtgctg

此外，為了使所得到的菌株對(duì)于制作糖液時(shí)所含有的乙酸等有機(jī)酸或糠醛等醛具有耐性，除了轉(zhuǎn)醛醇酶、醇脫氫酶以外，還可以在上述啟動(dòng)子中的任一者的下游克隆導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、甲酸脫氫酶等酶。

丙酮酸脫羧酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、甲酸脫氫酶可以通過(guò)下述引物進(jìn)行擴(kuò)增。

丙酮酸脫羧酶

序列編號(hào)9：atgacagaaattactttggg

序列編號(hào)10：acaaacaaatgctgaaaac

木糖還原酶(xr)

序列編號(hào)11：atgtctattactttgaactc

序列編號(hào)12：cacaaaagttggaatcttgt

木糖醇脫氫酶(xdh)

序列編號(hào)13：atgactcccaacccatcttt

序列編號(hào)14：ctcgggaccatctataataa

轉(zhuǎn)酮醇酶(tlk)

序列編號(hào)15：atgaccaccgacgactacga

序列編號(hào)16：aacagctagcaagtcctga

甲酸脫氫酶(fdh)

序列編號(hào)17：atgagtccagcaacaaaagg

序列編號(hào)18：tttcatcttgtgtctttcac

另外，通過(guò)該方法得到的菌株進(jìn)行了基因?qū)?，但為自克隆?dǎo)入，因而在卡塔赫納法上屬于被看作非重組菌的范疇。

如上所示，在bp-01964菌株中，野生型季也蒙畢赤酵母的木糖同化能力通過(guò)育種而得到增強(qiáng)，即使在使用作為生物質(zhì)的稻稈、玉米秸稈中的任一種的情況下也能夠有效地產(chǎn)生乙醇。

序列表

<110>本田技研工業(yè)株式會(huì)社（hondamotorco.,ltd.）

<120>高效乙醇發(fā)酵菌（highefficiencyethanol-zymocyte）

<130>pct140400

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>季也蒙畢赤酵母（meyerozymaguilliermondii）

<400>1

aaggcttgggaactttcttt20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>季也蒙畢赤酵母（meyerozymaguilliermondii）

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agcaattgatgattaatttt20

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>季也蒙畢赤酵母（meyerozymaguilliermondii）

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tttcatcttgtgtctttcac20

pct/ro/134表