本發(fā)明涉及1,4-二惡烷降解菌的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、利用1,4-二惡烷降解菌的1,4-二惡烷處理方法。

背景技術(shù)：

1,4-二惡烷是下式(1)所表示的環(huán)狀醚。1,4-二惡烷與水、有機(jī)溶劑的相溶性?xún)?yōu)異，主要作為有機(jī)合成的反應(yīng)溶劑來(lái)使用。

2010年度日本的1,4-二惡烷的制造·進(jìn)口量約4500t/年，推測(cè)有約300t/年被排放到環(huán)境中。由于1,4-二惡烷為水溶性，如被排放到水環(huán)境中則會(huì)大范圍擴(kuò)散。另外，由于揮發(fā)性、對(duì)固體的吸附性、光降解性、水解性、生物降解性均低，故而難以從水中除去。由于1,4-二惡烷除具有急性毒性及慢性毒性之外，還被指出有致癌性，所以擔(dān)心1,4-二惡烷引起的水環(huán)境的污染會(huì)對(duì)人及動(dòng)植物造成不良影響。因此，在日本關(guān)于1,4-二惡烷有自來(lái)水質(zhì)基準(zhǔn)(0.05mg/l以下)、環(huán)境基準(zhǔn)(0.05mg/l以下)及排水基準(zhǔn)(0.5mg/l以下)的規(guī)定。

通過(guò)以往的活性污泥法或活性碳吸附法等的處理方法，無(wú)法從水中充分除去1,4-二惡烷。只有通過(guò)添加過(guò)氧化氫的臭氧處理(o3/h2o2)、在紫外線照射下的臭氧處理(o3/uv)、在放射線或超聲波照射下的臭氧處理等合用了多種物理化學(xué)氧化方法的促進(jìn)氧化法被確認(rèn)具有1,4-二惡烷處理的有效性。然而，由于促進(jìn)氧化法的起始成本及運(yùn)營(yíng)成本高而沒(méi)有普及。另外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中報(bào)道了存在1,4-二惡烷以外的有機(jī)物時(shí)，通過(guò)促進(jìn)氧化法的1,4-二惡烷的處理效率降低。

尋求低成本且能穩(wěn)定地處理包含1,4-二惡烷的水的方法，在專(zhuān)利文獻(xiàn)1、非專(zhuān)利文獻(xiàn)2中提出了通過(guò)1,4-二惡烷降解菌進(jìn)行生物處理。

1,4-二惡烷降解菌可大致分為以下2種：可將1,4-二惡烷作為唯一碳源進(jìn)行降解及同化的菌(同化菌)；及在四氫呋喃等其他成分的存在下通過(guò)共代謝反應(yīng)進(jìn)行1,4-二惡烷的降解的菌(共代謝菌)，根據(jù)有無(wú)1,4-二惡烷降解酶的誘導(dǎo)，同化菌可進(jìn)一步分為誘導(dǎo)型與組成型。非專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4中報(bào)道了上述1,4-二惡烷降解菌所具有的thf單加氧酶參與1,4-二惡烷的降解。thf單加氧酶是分類(lèi)于承擔(dān)多種烴類(lèi)的初始氧化的可溶性鐵(ii)單加氧酶(sdimo)的一種，sdimo中另外還包括甲烷/丙烷單加氧酶等(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。另外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)6中報(bào)道了具有thf單加氧酶以外的sdimo的菌也有降解1,4-二惡烷的可能性。

由于1,4-二惡烷降解菌的增殖極慢，若混入其他微生物則其他的微生物優(yōu)先增殖，故而培養(yǎng)1,4-二惡烷降解菌時(shí)，需要事先充分對(duì)培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌以防混入其他雜菌。滅菌處理有使用高壓滅菌器的蒸汽滅菌、用加熱爐等進(jìn)行加熱的干熱滅菌、使用γ射線的放射線滅菌、使用環(huán)氧乙烷氣體的化學(xué)滅菌等的方法。然而，在成本·安全性方面存在如下問(wèn)題：用于滅菌的設(shè)備過(guò)于龐大、耗費(fèi)過(guò)多能量成本、使用的藥品量巨大等，任一滅菌方法均難以大規(guī)模進(jìn)行。因此，在實(shí)際的1,4-二惡烷污染現(xiàn)場(chǎng)，供給所需程度的大量的1,4-二惡烷降解菌存在困難。

專(zhuān)利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)2008-306939號(hào)公報(bào)

非專(zhuān)利文獻(xiàn)1：k.kosaka,h.yamada,s.matsui,andk.shishida:theeffectsoftheco-existingcompoundsonthedecompositionofmicropollutantsusingtheozone/hydrogenperoxideprocess.watersci.technol.,42,pp.353-361,2000.

非專(zhuān)利文獻(xiàn)2：清和成，池道彥：使用1,4-二惡烷降解菌的污染地下水的生物處理·凈化技術(shù)的可能性，使用水及廢水，vol.53,no.7,2011.

非專(zhuān)利文獻(xiàn)3：h.masuda,k.mcclay,r.j.steffan,andg.j.zylstra:biodegradationoftetrahydrofuranand1,4-dioxanebysolublediironmonooxygenaseinpseudonocardiasp.strainenv478.j.mol.microbiol.biotechnol.22(5),pp.312-316,2012.

非專(zhuān)利文獻(xiàn)4：a.grostern,c.m.sales,w.-q.zhuang,o.erbilgin,andl.alvarez-cohen:glyoxylatemetabolismisakeyfeatureofthemetabolicdegradationof1,4-dioxanebypseudonocardiadioxanivoransstraincb1190.appl.environ.microbiol.,78(9),pp.3298-3308,2012.

非專(zhuān)利文獻(xiàn)5：n.v.coleman,n.b.bui,anda.j.holmes:solubledi-ironmonooxygenasegenediversityinsoils,sedimentsandethaneenrichments.environ.microbiol.,8(7),pp.1228-1239,2006.

非專(zhuān)利文獻(xiàn)6：s.mahendra,andl.alvarez-cohen:kineticsof1,4-dioxanebiodegradationbymonooxygenase-expressingbacteria.environ.sci.technol.,40(17),pp.5435-5442,2006.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明在于提供1,4-二惡烷降解菌的高效的培養(yǎng)方法。

1.一種1,4-二惡烷降解菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，使用含有1.0wt％以上、10.0wt％以下濃度的二乙二醇的培養(yǎng)基使1,4-二惡烷降解菌增殖。

2.根據(jù)1.所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基。

3.根據(jù)1.或2.所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有玉米漿、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨中的至少1種。

4.根據(jù)1.～3.中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述1,4-二惡烷降解菌為分枝桿菌屬即mycobacteriumsp.或假諾卡氏菌屬即pseudonocardiasp.。

5.根據(jù)1.～4.中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述1,4-二惡烷降解菌為分枝桿菌屬d11即mycobacteriumsp.d11，保藏號(hào)：nitebp-01926；假諾卡氏菌屬d17即pseudonocardiasp.d17，保藏號(hào)：nitebp-01927；食二氯雜環(huán)己烷假諾卡氏菌cb1190即pseudonocardiadioxanivoranscb1190中的至少1種。

6.根據(jù)2.～5.中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，進(jìn)行一邊供給液體培養(yǎng)基一邊取出與該液體培養(yǎng)基的供給量相同的培養(yǎng)液的連續(xù)培養(yǎng)。

7.一種培養(yǎng)基，其特征在于，含有1.0wt％以上、10.0wt％以下濃度的二乙二醇。

8.根據(jù)7.所述的培養(yǎng)基，其特征在于，為液體培養(yǎng)基。

9.根據(jù)7.或8.所述的培養(yǎng)基，其特征在于，含有玉米漿、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨中的至少1種。

10.一種水處理方法，其特征在于，在包含1,4-二惡烷的水中注入用1.～6.中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的1,4-二惡烷降解菌。

11.根據(jù)10.所述的水處理方法，其特征在于，在注入所述1,4-二惡烷降解菌的同時(shí)注入二乙二醇。

12.一種土壤處理方法，其特征在于，在包含1,4-二惡烷的土壤中注入用1.～6.中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的1,4-二惡烷降解菌。

13.根據(jù)12.所述的土壤處理方法，其特征在于，在注入所述1,4-二惡烷降解菌的同時(shí)注入二乙二醇。

14.一種1,4-二惡烷降解菌，其特征在于，通過(guò)1.～6.中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

15.一種固定化載體，其特征在于，將14.所述的1,4-二惡烷降解菌固定化。

16.一種1,4-二惡烷處理方法，其特征在于，在包含1,4-二惡烷的水或土壤中注入二乙二醇，從而促進(jìn)在所述包含1,4-二惡烷的水或土壤中存在的1,4-二惡烷降解菌的增殖。

通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)方法能夠使1,4-二惡烷降解菌高效增殖。即使存在其他的微生物也能夠使1,4-二惡烷降解菌優(yōu)先增殖，由于不需要滅菌設(shè)備，故而能夠用大規(guī)模設(shè)備使1,4-二惡烷降解菌增殖，能夠供給在下水處理場(chǎng)、工場(chǎng)排水處理設(shè)施、污染現(xiàn)場(chǎng)等的1,4-二惡烷處理中所需的大量的1,4-二惡烷降解菌。由于僅將培養(yǎng)的1,4-二惡烷降解菌注入水或土壤就能夠處理1,4-二惡烷，故而能夠方便且低成本地處理1,4-二惡烷。

通過(guò)在被1,4-二惡烷污染的水或土壤中注入二乙二醇，能夠促進(jìn)以往存在于污染環(huán)境下的降解菌的增殖，且能夠使降解菌優(yōu)先增殖。其次，通過(guò)使降解菌的菌體量增加，可促進(jìn)由降解菌進(jìn)行的1,4-二惡烷處理。由于僅加入二乙二醇即可，故而成本非常低。另外，由于僅使以往存在的降解菌增殖，故而能夠抑制對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響。

附圖說(shuō)明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)活性污泥法中的污染水處理流程圖。

圖2為表示1,4-二惡烷降解菌在二乙二醇存在下的增殖性的圖。

圖3為表示1,4-二惡烷降解菌的1,4-二惡烷降解活性的經(jīng)時(shí)變化的圖。

圖4為含有(右)二乙二醇、(左)葡萄糖的培養(yǎng)液中的1,4-二惡烷降解菌在培養(yǎng)中的反應(yīng)器的照片。

圖5為表示培養(yǎng)液中的二乙二醇濃度與1,4-二惡烷降解菌的δ菌體濃度的關(guān)系的圖。

圖6為表示在1,4-二惡烷降解菌的培養(yǎng)中添加玉米漿時(shí)的1,4-二惡烷降解活性的經(jīng)時(shí)變化的圖。

圖7為表示在1,4-二惡烷降解菌的培養(yǎng)中添加玉米漿時(shí)的二乙二醇濃度與菌體濃度的經(jīng)時(shí)變化的圖。

圖8為表示添加了二乙二醇的液體培養(yǎng)基中的土壤試樣1～7的培養(yǎng)前后(0天、6天后)中的sdimo基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果的圖。

具體實(shí)施方式

以下，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。

本發(fā)明的特征在于使用含有二乙二醇的培養(yǎng)基使1,4-二惡烷降解菌增殖。

以往，為了使1,4-二惡烷降解菌(以下，稱(chēng)為降解菌。)增殖，需要事先充分滅菌以防其他的微生物混入。

本發(fā)明基于以下迄今為止未知的全新的認(rèn)知上，降解菌在二乙二醇存在下顯示出比其他的微生物優(yōu)異的增殖性。降解菌在二乙二醇存在下增殖性?xún)?yōu)異的理由并不明確，但推測(cè)是由于降解菌比其他微生物利用二乙二醇作為碳源的能力優(yōu)異，故而在二乙二醇存在下能夠優(yōu)先增殖。因此，在二乙二醇存在下，即使其他的微生物生存也能夠使降解菌增殖。即，在二乙二醇存在下不殺滅其他的微生物，而能夠使降解菌增殖。

二乙二醇為下述式(2)所表示的二元醇。

二乙二醇為在環(huán)境中可被降解的生物降解性?xún)?yōu)異的化合物。環(huán)境中存在的大多數(shù)微生物均能夠利用二乙二醇作為碳源，降解菌當(dāng)然也能夠利用二乙二醇作為碳源。其次，降解菌與不具有二惡烷降解能力的微生物相比，利用二乙二醇作為碳源的能力優(yōu)異。

降解菌存在于自然界，將從被1,4-二惡烷污染的水中、土壤中采集的污泥等用只含有1,4-二惡烷作為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)從而可進(jìn)行篩選。作為在本發(fā)明中使用的降解菌沒(méi)有特別限制，可使用屬于分枝桿菌屬(mycobacteriumsp.)、假諾卡氏菌屬(pseudonocardiasp.)、阿菲波菌屬(afipiasp.)、紅球菌屬(rhodococcussp.)、黃桿菌屬(flavobacteriumsp.)、甲基彎曲菌屬(methylosinussp.)、伯克霍爾德氏菌屬(burkholderiasp.)、羅爾斯頓菌屬(ralstoniasp.)、蟲(chóng)草菌屬(cordycepssp.)、黃桿菌屬(xanthobactersp.)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobactersp.)等的降解菌。

降解菌可大致分為以下2種：可將1,4-二惡烷作為唯一碳源進(jìn)行降解及同化的菌；及在四氫呋喃等其他成分的存在下通過(guò)共代謝反應(yīng)而進(jìn)行1,4-二惡烷的降解的菌。作為在本發(fā)明中使用的降解菌沒(méi)有特別限制，優(yōu)選分枝桿菌屬d11、假諾卡氏菌屬d17、分枝桿菌屬d6、食二氯雜環(huán)己烷假諾卡氏菌cb1190、阿菲波菌屬d1、分枝桿菌屬ph-06、食苯假諾卡氏菌b5、黃桿菌屬、假諾卡氏菌屬env478、pseudonocardiatetrahydrofuranoxydansk1、赤紅球菌t1、赤紅球菌t5、甲烷氧化菌ob3b、牝牛分枝桿菌job5、洋蔥伯克霍爾德菌g4、門(mén)多薩假單胞菌kr1、pseudonocardiatetrahydrofuranoxydansk1、皮氏羅爾斯頓菌pko1、紅球菌屬rr1、鮑曼不動(dòng)桿菌dd1、紅球菌屬219、pseudonocardiaantarcticadvs5a1、冬蟲(chóng)夏草a、rhodococcusaetherivoransjcm14343等。在上述中優(yōu)選1,4-二惡烷的降解能力相對(duì)較高的假諾卡氏菌屬d17、分枝桿菌屬d11及食二氯雜環(huán)己烷假諾卡氏菌cb1190。

分枝桿菌屬d11、假諾卡氏菌屬d17分別以保藏號(hào)nitebp-01926、保藏號(hào)nitebp-01927于2014年8月29日在日本獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專(zhuān)利微生物保藏中心(npmd)(日本千葉縣木更津市kazusa鐮足2-5-8(郵編292-0818))進(jìn)行國(guó)際保藏。

食二氯雜環(huán)己烷假諾卡氏菌cb1190(以下，稱(chēng)為cb1190菌株。)可從美國(guó)atcc購(gòu)入(atcc55486)。另外，除美國(guó)atcc之外，也可從jcm(日本獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所生物資源中心微生物材料開(kāi)發(fā)室)及德國(guó)的dsm購(gòu)入。

rhodococcusaetherivoransjcm14343可從jcm(日本獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所生物資源中心微生物材料開(kāi)發(fā)室)購(gòu)入(jcm14343)。另外，也可從德國(guó)的dsm、英國(guó)的ncimb、法國(guó)的cip購(gòu)入。

使降解菌增殖的條件只要是存在二乙二醇的環(huán)境就沒(méi)有特別限制。例如，可列舉液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基。另外，不進(jìn)行滅菌處理而存在其他的微生物也可。作為培養(yǎng)基，只要能夠培養(yǎng)降解菌就沒(méi)有特別限定，也可使用在mgy培養(yǎng)基、cgy培養(yǎng)基等公知的培養(yǎng)基中添加了二乙二醇的培養(yǎng)基。

為了使降解菌大量增殖可優(yōu)選使用液體培養(yǎng)基，進(jìn)一步優(yōu)選通過(guò)一邊供給液體培養(yǎng)基一邊取出與液體培養(yǎng)基的供給量相同的包含降解菌的培養(yǎng)液的連續(xù)培養(yǎng)來(lái)使1,4-二惡烷降解菌增殖。

使降解菌增殖時(shí)的二乙二醇濃度沒(méi)有特別限定，只要是液體培養(yǎng)基，則優(yōu)選0.01mg/l以上、100g/l以下(1.0×10^-8wt％以上、10.0wt％以下)。更優(yōu)選液體培養(yǎng)基的二乙二醇濃度的下限值為1g/l以上(0.1wt％以上)，更優(yōu)選5g/l以上(0.5wt％以上)，最優(yōu)選10g/l以上(1.0wt％以上)。更優(yōu)選二乙二醇濃度的上限值為60g/l以下(6.0wt％以下)，進(jìn)一步優(yōu)選30g/l以下(3.0wt％以下)，最優(yōu)選20g/l(2.0wt％以下)以下。另外，只要是固體培養(yǎng)基，則優(yōu)選0.1wt％以上、10.0wt％以下。更優(yōu)選固體培養(yǎng)基的二乙二醇濃度的下限值為1.0wt％以上，更優(yōu)選1.5wt％以上，最優(yōu)選2.0wt％以上。更優(yōu)選二乙二醇濃度的上限值為9.0wt％以下，進(jìn)一步優(yōu)選8.0wt％以下，最優(yōu)選7.0wt％以下。

使降解菌增殖時(shí)，可添加用于降解菌活動(dòng)所必需的無(wú)機(jī)物質(zhì)、有機(jī)物質(zhì)。由于微生物的活動(dòng)量受必需營(yíng)養(yǎng)素等因子中的最少因子的限制，故而通過(guò)添加不足的營(yíng)養(yǎng)素能夠促進(jìn)增殖。作為添加的無(wú)機(jī)物沒(méi)有特別限制，可列舉k2hpo4、(nh4)2so4、mgso4·7h2o、fecl3、cacl2、nacl等。

作為添加的有機(jī)物質(zhì)，沒(méi)有特別限制，優(yōu)選玉米漿、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨。通過(guò)添加二乙二醇以外的有機(jī)物質(zhì)，能夠加快降解菌的增殖速度。二乙二醇與二乙二醇以外所添加的有機(jī)物質(zhì)的重量比優(yōu)選60：40～99：1，更優(yōu)選70：30～98：2，進(jìn)一步優(yōu)選75：25～95：5，最優(yōu)選80：20～90：10。

降解菌的培養(yǎng)優(yōu)選在15～45℃下進(jìn)行。更優(yōu)選20～40℃，最優(yōu)選25～35℃。另外，優(yōu)選ph為5～8，更優(yōu)選6～8。培養(yǎng)時(shí)間只要可得到所需的菌體量，就沒(méi)有特別限制。在封閉系統(tǒng)中使降解菌增殖的情況下優(yōu)選3～30天。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法不殺滅其他的微生物而能夠使降解菌增殖，故而不需要滅菌裝置。因此，大規(guī)模的培養(yǎng)較為容易，在下水處理場(chǎng)、工場(chǎng)排水處理設(shè)施、污染土壤的處理現(xiàn)場(chǎng)等能夠供給1,4-二惡烷處理所需的大量的菌體。

二惡烷降解菌能夠以如下任意的形態(tài)用于1,4-二惡烷處理：從培養(yǎng)液濾出的菌體、冷凍保存的菌體、l-干燥保存的菌體、冷凍干燥的菌體、將二惡烷降解菌固定化于樹(shù)脂等的固定化載體、或培養(yǎng)液或其濃縮液等包含二惡烷降解菌的混懸液等。

通過(guò)將培養(yǎng)的降解菌注入被1,4-二惡烷污染的水中并在需氧環(huán)境下，能夠進(jìn)行由降解菌進(jìn)行的1,4-二惡烷的生物處理。通常，下水、工場(chǎng)排水等的水中大多包含k2hpo4、(nh4)2so4、mgso4·7h2o、fecl3、cacl2、nacl等的營(yíng)養(yǎng)鹽類(lèi)，若營(yíng)養(yǎng)鹽類(lèi)的濃度低，通過(guò)注入必需的營(yíng)養(yǎng)鹽類(lèi)，就能夠促進(jìn)由降解菌的代謝·同化進(jìn)行的1,4-二惡烷處理。另外，通過(guò)在注入降解菌的同時(shí)注入二乙二醇，即使在也存在其他微生物的水中也能夠維持降解菌的1,4-二惡烷降解活性。且，由于二乙二醇的生物降解性?xún)?yōu)異，在環(huán)境中能被快速降解，故而二乙二醇造成的環(huán)境負(fù)擔(dān)非常小。

優(yōu)選污染水中的二乙二醇濃度為1.0×10^-8wt％以上、10.0wt％以下。更優(yōu)選二乙二醇濃度的下限值為0.1wt％以上，更優(yōu)選0.5wt％以上，最優(yōu)選1.0wt％以上。更優(yōu)選二乙二醇濃度的上限值為6.0wt％以下，進(jìn)一步優(yōu)選3.0wt％以下，最優(yōu)選2.0wt％以下。

圖1表示使用曝氣槽的標(biāo)準(zhǔn)活性污泥法中的污染水處理流程。在標(biāo)準(zhǔn)活性污泥法中，在曝氣槽中進(jìn)行由有用微生物進(jìn)行的生物處理。在曝氣槽上設(shè)置有散氣管，氣泡從散氣管被供給到曝氣槽內(nèi)的水中，氧從該氣泡溶于水中，通過(guò)由有用微生物進(jìn)行的代謝·同化來(lái)處理有機(jī)物。由于曝氣槽在需氧環(huán)境下，僅將降解菌注入曝氣槽就能夠處理污染水中所包含的1,4-二惡烷。圖1表示注入包含降解菌的培養(yǎng)液的流程，也可通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)將取出的培養(yǎng)液連續(xù)注入。另外，不僅是培養(yǎng)液，也可將從培養(yǎng)液濾出等的降解菌直接注入，也可作為冷凍保存的菌體、l-干燥保存的菌體、冷凍干燥的菌體、將降解菌固定化于樹(shù)脂等的固定化載體、或濃縮了培養(yǎng)液的混懸液等注入。

由于僅將培養(yǎng)的降解菌注入曝氣槽就能夠進(jìn)行1,4-二惡烷處理，故而以往的標(biāo)準(zhǔn)活性污泥法所使用的設(shè)備幾乎都能應(yīng)用。由于本發(fā)明的培養(yǎng)方法不需要用于滅菌處理的設(shè)備、藥品，故而起始成本、運(yùn)營(yíng)成本均可降低。因此，由通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的降解菌進(jìn)行的生物處理法與使用多個(gè)氧化劑的促進(jìn)氧化法相比成本低。另外，由于降解菌的培養(yǎng)裝置也能夠直接利用市售品，故而成本低。

能夠?qū)⑴囵B(yǎng)的降解菌注入被1,4-二惡烷污染的土壤中來(lái)處理1,4-二惡烷。通常的土壤處理方法需要進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)工廠的建設(shè)、土壤的挖掘、無(wú)害化、回填等而花費(fèi)巨大的精力與成本，在本發(fā)明的方法中僅將降解菌注入土壤中就能夠?qū)?,4-二惡烷進(jìn)行生物處理。由于通常土壤中營(yíng)養(yǎng)素不足，故而優(yōu)選在注入降解菌的同時(shí)注入二乙二醇。另外，也可注入k2hpo4、(nh4)2so4、mgso4·7h2o、fecl3、cacl2、nacl等的無(wú)機(jī)物質(zhì)、玉米漿、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨等的有機(jī)物質(zhì)等中的任一項(xiàng)或兩項(xiàng)。

優(yōu)選加入到污染土壤中的二乙二醇濃度成為0.1wt％以上、10wt％以下。更優(yōu)選二乙二醇濃度的下限值為1.0wt％以上，更優(yōu)選1.5wt％以上，最優(yōu)選2wt％以上。更優(yōu)選二乙二醇濃度的上限值為9.0wt％以下，進(jìn)一步優(yōu)選8.0wt％以下，最優(yōu)選7.0wt％以下。

如上所述，降解菌存在于自然界。通過(guò)在被1,4-二惡烷污染的水或土壤中注入二乙二醇，能夠促進(jìn)在自然界存在的降解菌的增殖，并能夠使降解菌優(yōu)先增殖。若降解菌的菌體量增加，則由降解菌進(jìn)行的1,4-二惡烷處理被促進(jìn)。由于僅加入二乙二醇即可，沒(méi)有必要培養(yǎng)降解菌，故而成本非常低。另外，由于僅使以往存在的降解菌增殖，而沒(méi)有引入新的降解菌，故而能夠抑制對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響。

此時(shí)，優(yōu)選注入到污染水或污染土壤中的二乙二醇濃度成為1.0×10^-8wt％以上、10.0wt％以下。更優(yōu)選二乙二醇濃度的下限值為0.1wt％以上，更優(yōu)選0.5wt％以上，最優(yōu)選1.0wt％以上。更優(yōu)選二乙二醇濃度的上限值為9.0wt％以下，進(jìn)一步優(yōu)選8.0wt％以下，最優(yōu)選7.0wt％以下。

且，也可培養(yǎng)污染環(huán)境中生存的降解菌、其他的降解菌從而在注入二乙二醇時(shí)一同注入。

接著，基于實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限定于這些實(shí)施例。

實(shí)施例

“實(shí)施例1”

使用cb1190株、d11株、d17株作為1,4-二惡烷降解菌。用包含500mg/l濃度的1,4-二惡烷的cgy培養(yǎng)基(酪胨：5g/l、甘油：5g/l、酵母提取物：1g/l)對(duì)各降解菌進(jìn)行10天培養(yǎng)。培養(yǎng)后用離心分離機(jī)集菌·清洗，將菌體與20ml生理食鹽水混合而作為菌接種液。且使用將濁度用分光光度計(jì)統(tǒng)一了的菌接種液(od600：大約10)。

在300ml容量的三角振蕩培養(yǎng)瓶中加入100ml液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：k2hpo4：1g/l、(nh4)2so4：1g/l、nacl：50mg/l、mgso4·7h2o：200mg/l、fecl3：10mg/l、cacl2：50mg/l、ph：7.3)，用高壓滅菌器進(jìn)行滅菌。其后，添加規(guī)定濃度的二乙二醇溶液成為1g/l后，加入1ml菌接種液，以28℃、120rpm進(jìn)行9天旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。

培養(yǎng)結(jié)束后通過(guò)抽濾將培養(yǎng)液中的菌體作為過(guò)濾物回收，于105℃干燥一晩后，測(cè)定菌體重量并求得菌體濃度(mg-干細(xì)胞/l)。通過(guò)從培養(yǎng)第9天的菌體濃度扣除了初始菌體濃度的δ菌體濃度來(lái)評(píng)價(jià)菌體的增殖性。

圖2表示各降解菌在二乙二醇存在下的增殖性。可確認(rèn)在所有的降解菌中菌體濃度均增加，降解菌可利用二乙二醇作為碳源來(lái)進(jìn)行增殖。尤其是，d17株顯示出非常高的增殖性。

“實(shí)施例2”

將d17株用mgy培養(yǎng)基(麥芽提取物：10g/l、葡萄糖：4g/l、酵母提取液：4g/l)培養(yǎng)2周。

在包含1,4-二惡烷的實(shí)地下水(ph：7.38、1,4-二惡烷：0.16mg/l、磷酸離子：0.08mg/l、總氮：36.5mg/l、總有機(jī)碳量：11mg/l、化學(xué)的氧要求量：33mg/l)中添加硫酸銨及磷酸氫二鉀使其分別成為1g/l的濃度后，加入二乙二醇并使其成為20g/l來(lái)制作培養(yǎng)液。

將650ml該培養(yǎng)液加入到1l容量的反應(yīng)器中，添加d17株(菌體濃度：157mg-干細(xì)胞/l)進(jìn)行6天培養(yǎng)。培養(yǎng)中控制在28℃、ph7.0，并進(jìn)行0.65l/分鐘的通氣。

“對(duì)比例1”

將二乙二醇改為葡萄糖，除此以外與實(shí)施例2同樣地培養(yǎng)降解菌。

“1,4-二惡烷降解活性的測(cè)定1”

從實(shí)施例2、對(duì)比例1的培養(yǎng)液分別取樣1ml，測(cè)定1,4-二惡烷降解活性。取樣為在剛剛培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)與培養(yǎng)開(kāi)始后第1天～第6天進(jìn)行。降解活性的測(cè)定方法如以下所示。

在100ml容量的三角振蕩培養(yǎng)瓶中加入包含100mg/l的1,4-二惡烷的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：k2hpo4：1g/l、(nh4)2so4：1g/l、nacl：50mg/l、mgso4·7h2o：200mg/l、fecl3：10mg/l、cacl2：50mg/l、ph：7.3)19ml與取樣的培養(yǎng)液1ml，以28℃、120rpm進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。且，總共準(zhǔn)備3個(gè)三角燒瓶，以同樣的步驟實(shí)施試驗(yàn)。

將培養(yǎng)結(jié)束后的溶液中的1,4-二惡烷濃度用頂空氣相色譜質(zhì)譜儀(島津制作所：gc/ms-qp2010plus、turbomatrixhs40)進(jìn)行測(cè)定。另外，不添加培養(yǎng)液的空白系統(tǒng)也用同樣的步驟實(shí)施試驗(yàn)，用下述式求得1,4-二惡烷的降解活性。在本測(cè)定方法中，降解活性表示1ml的培養(yǎng)液24小時(shí)所降解的1,4-二惡烷的量。測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值(n＝3)如圖3所示。另外，培養(yǎng)第3天的反應(yīng)器的照片如圖4所示。在圖4中，右側(cè)為使用二乙二醇的實(shí)施例2的反應(yīng)器，左側(cè)為使用葡萄糖的對(duì)比例1的反應(yīng)器。

1,4-二惡烷降解活性(mg-1,4-二惡烷/ml-培養(yǎng)液)＝

(c0-c24)×20ml/1000ml

c0(mg/l)：將未添加培養(yǎng)液的空白系統(tǒng)進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)后的1,4-二惡烷濃度。

c24(mg/l)：將添加了培養(yǎng)液的系統(tǒng)進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)后的1,4-二惡烷濃度。

關(guān)于將二乙二醇作為碳源的實(shí)施例2，剛剛培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)為0.04的降解活性隨著天數(shù)的經(jīng)過(guò)而上升，且在培養(yǎng)第6天上升至1.63。由于未進(jìn)行加熱等的滅菌處理，故而沒(méi)有殺滅在實(shí)地下水中生存的其他微生物，由于降解活性上升，故而表明在二乙二醇存在下d17株優(yōu)先增殖。另外，如圖4(右)所示，培養(yǎng)第3天的培養(yǎng)液有些許白濁，但具有透明性。

關(guān)于將葡萄糖作為碳源的對(duì)比例1，培養(yǎng)期間中的降解活性在0.15～0.29的范圍內(nèi)變動(dòng)，然而未發(fā)現(xiàn)降解活性的上升。這是由于d17株比在實(shí)地下水中存在的其他微生物利用葡萄糖的能力差，從而d17株無(wú)法增殖的緣故。另外，培養(yǎng)液慢慢開(kāi)始渾濁，第3天的培養(yǎng)液如圖4(左)所示顯著白濁。這是由于其他的微生物優(yōu)先增殖的緣故。

關(guān)于培養(yǎng)第6天的降解活性，實(shí)施例2為1.63、對(duì)比例1為0.20，實(shí)施例2比對(duì)比例1優(yōu)異8倍以上。認(rèn)為這是由于d17株比其他微生物利用二乙二醇作為碳源的能力優(yōu)異，從而d17株的菌體量增加的緣故。

“實(shí)施例3”

在300ml容量的三角振蕩培養(yǎng)瓶中加入包含1g/l二乙二醇的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：k2hpo4：1g/l、(nh4)2so4：1g/l、nacl：50mg/l、mgso4·7h2o：200mg/l、fecl3：10mg/l、cacl2：50mg/l、ph：7.3)100ml，將事先用mgy培養(yǎng)基培養(yǎng)的d17株進(jìn)行接種(初始菌體濃度：111mg-干細(xì)胞/l)，以28℃、120rpm進(jìn)行7天旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。

“實(shí)施例4”

液體培養(yǎng)基中的二乙二醇的濃度為5g/l，除此以外與實(shí)施例3同樣地培養(yǎng)降解菌。

“實(shí)施例5”

液體培養(yǎng)基中的二乙二醇的濃度為10g/l，除此以外與實(shí)施例3同樣地培養(yǎng)降解菌。

“實(shí)施例6”

液體培養(yǎng)基中的二乙二醇的濃度為20g/l，除此以外與實(shí)施例3同樣地培養(yǎng)降解菌。

“實(shí)施例7”

液體培養(yǎng)基中的二乙二醇的濃度為30g/l，除此以外與實(shí)施例3同樣地培養(yǎng)降解菌。

“菌體濃度測(cè)定”

培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)抽濾將培養(yǎng)液中的菌體作為過(guò)濾物回收，于105℃干燥一晩后，測(cè)定回收的菌體重量。從測(cè)定的菌體重量值求得菌體濃度(mg-干細(xì)胞/l)。且，在各實(shí)施例中準(zhǔn)備2個(gè)相同的試驗(yàn)系統(tǒng)，將其平均值作為菌體密度。通過(guò)從培養(yǎng)第7天的菌體濃度扣除初始菌體濃度的δ菌體濃度來(lái)評(píng)價(jià)菌體的增殖性。圖5表示δ菌體濃度。

隨著二乙二醇濃度變濃而成為1g/l～10g/l，菌體濃度也上升。在二乙二醇濃度為10g/l～30g/l的實(shí)施例5～7中，即使二乙二醇濃度變大，菌體濃度也幾乎沒(méi)有改變。測(cè)定實(shí)施例5～7的培養(yǎng)結(jié)束后的ph時(shí)，顯示出ph為3.42～3.91，推測(cè)由于ph降低會(huì)引起增殖被抑制，故而菌體濃度為相同程度。

“實(shí)施例8”

在實(shí)施例2所使用的包含1,4-二惡烷的實(shí)地下水中添加硫酸銨及磷酸氫二鉀使其分別成為1g/l的濃度后，加入規(guī)定濃度的二乙二醇溶液并成為10g/l來(lái)制作培養(yǎng)液。

將8l該培養(yǎng)液加入到10l容量的反應(yīng)器中，一邊添加d17株(初始菌體濃度：43.2mg-干細(xì)胞/l)進(jìn)行4l/分鐘的通氣，一邊于28℃培養(yǎng)9天。另外，在培養(yǎng)第4天，僅添加一次玉米漿而使其濃度成為5g/l。且，培養(yǎng)期間中將ph控制為7.0±0.2。

“1,4-二惡烷降解活性的測(cè)定2”

從培養(yǎng)液取樣1ml，并與上述“1,4-二惡烷降解活性的測(cè)定1”同樣地測(cè)定1,4-二惡烷降解活性。取樣為在剛剛培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)與培養(yǎng)開(kāi)始后第1、2、3、4、5、7、9天進(jìn)行。且，第4天的取樣在馬上要添加csl前進(jìn)行。測(cè)定結(jié)果如圖6所示。

“二乙二醇濃度的測(cè)定”

使用高效液相色譜(watersalliance2695檢測(cè)器：rid)測(cè)定在上述“1,4-二惡烷降解活性的測(cè)定2”中取樣的培養(yǎng)液中的二乙二醇濃度。

“菌體濃度的測(cè)定”

在剛剛開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)與培養(yǎng)開(kāi)始后第4天與第9天取樣150ml培養(yǎng)液，用量筒正確量取100ml后，通過(guò)抽濾回收·清洗全部的菌體，于105℃干燥一晩。且，第4天的取樣在馬上要添加玉米漿前進(jìn)行。其后，測(cè)定干燥重量，算出菌體濃度。

二乙二醇濃度及菌體濃度的經(jīng)時(shí)變化如圖7所示。

剛剛培養(yǎng)時(shí)的降解活性小至0.02，培養(yǎng)第1天的降解活性為0.38、培養(yǎng)第4天上升至0.93。添加玉米漿24小時(shí)后的培養(yǎng)第5天的降解活性上升至高達(dá)1.61，第7天、第9天的降解活性為1.73。第7天以后的降解活性實(shí)際上進(jìn)一步上升，但由于1,4-二惡烷濃度降低至小于定量臨界值，故而無(wú)法算出正確的活性值。由此，可確認(rèn)通過(guò)添加玉米漿1,4-二惡烷的降解活性提高。且，本試驗(yàn)方法中的1,4-二惡烷的下料濃度為100mg/l，考慮到在空白系統(tǒng)的減少，降解活性值的上限為約1.73。

二乙二醇濃度從試驗(yàn)開(kāi)始到第4天為止緩慢減少?？纱_認(rèn)培養(yǎng)第4天以后二乙二醇濃度的降低迅速，通過(guò)添加玉米漿使二乙二醇的同化速度即降解菌的增殖速度變快。

菌體濃度在培養(yǎng)第0天為94mg-干細(xì)胞/l，第4天為288mg-干細(xì)胞/l，培養(yǎng)第9天增加至2043mg-干細(xì)胞/l。因此，表明通過(guò)添加二乙二醇以外的有機(jī)物質(zhì)，可得到高濃度包含降解菌的培養(yǎng)液。

“實(shí)施例9”

在從1,4-二惡烷污染位點(diǎn)不同的場(chǎng)所采集的7種土壤中，調(diào)查用添加了二乙二醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)所引起的sdimo攜帶菌的增殖。且，將sdimo攜帶菌的增殖通過(guò)來(lái)自編碼sdimo的基因(sdimo基因)的約420bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的增加來(lái)評(píng)價(jià)。

在加入了90ml液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：k2hpo4：1g/l、(nh4)2so4：1g/l、nacl：50mg/l、mgso4·7h2o：200mg/l、fecl3：10mg/l、cacl2：50mg/l、ph：7.0)的300ml三角燒瓶中投入濕重10g的土壤，并添加二乙二醇使其終濃度成為20g/l，以28℃、120rpm進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。

剛剛添加二乙二醇時(shí)及6天后采集5ml，通過(guò)離心分離(10，000×g、4℃、5分鐘)除去上清后，從土壤0.5g(濕重)回收dna。dna提取使用土壤dna提取試劑盒(株式會(huì)社nippongene制，商品名：isoilforbeadsbeating)，提取的dna使用dna片段純化試劑盒(日本東洋紡織株式會(huì)社制，商品名：magextractor-pcr&gelcleanup-)進(jìn)行純化。

sdimo基因的檢測(cè)通過(guò)使用了上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)5所記載的引物組[nvc57，nvc66]的pcr來(lái)進(jìn)行。通過(guò)使用了該引物組的pcr，試樣中存在sdimo基因時(shí)，約420bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物特異性地?cái)U(kuò)增。pcr的反應(yīng)系統(tǒng)為50μl(sapphireampfastpcrmastermix(takarabio株式會(huì)社制)25μl、引物各0.5μm、dna1μl，用滅菌超純水定容至50μl)，pcr擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施：在94℃、5分鐘的熱變性后，重復(fù)35次94℃、30秒的熱變性，57℃、30秒的退火，72℃、1分鐘的延伸的循環(huán)，最后進(jìn)行72℃、5分鐘的延伸。pcr后的樣品進(jìn)行使用了1.5％瓊脂糖凝膠的電泳(100v、30分鐘)，通過(guò)sybrgreeni染色15分鐘后照射紫外線，調(diào)查約420bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)及強(qiáng)度。圖8表示添加了二乙二醇的液體培養(yǎng)基中的土壤試樣1～7的培養(yǎng)前后(0天、6天后)的sdimo基因的pcr擴(kuò)增結(jié)果。且，在圖8中，m所表示的泳道為dnaladdermarker(takarabio株式會(huì)社制，商品名：100bpdnaladder)，p所表示的泳道為屬于1,4-二惡烷同化菌的假諾卡氏菌屬d17的dna，n所表示的泳道為沒(méi)有dna的陰性對(duì)照。

在培養(yǎng)前的土壤中，多數(shù)情況為僅檢測(cè)到極少的約420bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。另一方面，在培養(yǎng)后的土壤中，在所有的試樣中均明確地檢測(cè)到了約420bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)比培養(yǎng)前后的約420bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物量時(shí)，可確認(rèn)除培養(yǎng)前擴(kuò)增產(chǎn)物量多的土壤試樣4以外，培養(yǎng)后擴(kuò)增產(chǎn)物量顯著增加。從以上結(jié)果可確認(rèn)通過(guò)使用二乙二醇進(jìn)行培養(yǎng)，能夠使土壤中以極少量存在的sdimo攜帶菌優(yōu)先增殖。即，可確認(rèn)通過(guò)在被1,4-二惡烷污染的水或土壤中注入二乙二醇，能夠使以往存在于污染環(huán)境下的降解菌優(yōu)先增殖，因降解菌的菌體量增加從而可促進(jìn)1,4-二惡烷的降解。