專利名稱：用于純化非復合的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明大體上涉及用于從細胞培養(yǎng)物中純化游離的肉毒桿菌神經(jīng)毒素以產(chǎn)生高純度，高效價產(chǎn)品的色譜方法和系統(tǒng)。
背景技術：
肉毒桿菌毒素是由細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)以及其他梭菌屬物種，諸如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭菌(Clostridium baraffi)產(chǎn)生的 神經(jīng)毒性蛋白。該毒素阻斷神經(jīng)肌肉傳遞，并在人和動物中引起神經(jīng)性麻痹疾病，稱為肉毒中毒。肉毒梭菌及其孢子通常存在于土壤和腐敗的動物尸體中，并且可以在不適當滅菌或不適當密封的食物容器中生長，這是許多肉毒中毒病例的病因。肉毒中毒癥狀可以包括步行困難、吞咽困難和講話困難，并可發(fā)展成呼吸肌麻痹，和最終死亡。A型肉毒桿菌毒素是人類已知的最致命的天然物質。除了血清型A之外，還表征了六種其他常見的免疫上不同的肉毒桿菌毒素，即肉毒桿菌毒素血清型B、C1, D、E、F和G。不同的血清型可通過用類型特異性抗體中和來區(qū)分，并且在它們引起的麻痹的嚴重度和它們最經(jīng)常感染的動物物種方面不同。已知的肉毒桿菌毒素血清型的每ー種的肉毒桿菌毒素蛋白分子的分子量是約150kD，包括連接到約50kD輕鏈的約IOOkD重鏈。然而，肉毒桿菌毒素由梭菌細菌以150kD毒素與ー個或多個非毒素蛋白的復合物釋放。例如，A型肉毒桿菌毒素以900kD、500kD和300kD復合物(近似分子量)的形式存在。盡管已知毒性效應，但A型肉毒桿菌毒素在臨床上用于治療多種適應癥，包括例如以骨骼肌活動過度為特征的神經(jīng)肌肉障礙。例如，Β0Τ0Χ 是可商購自Irvine, Calif的Allergan, Inc.的A型肉毒桿菌毒素復合物的商標。A型肉毒桿菌毒素用于例如治療自發(fā)性瞼痙攣、斜視、頸部肌張カ障礙(cervical dystonia)和眉間紋(面部)皺紋。其他血清型也已在臨床上使用。例如，已表明B型肉毒桿菌毒素可用于治療頸部肌張カ障礙。肉毒桿菌毒素被認為以高親和カ結合于運動神經(jīng)元的突觸前膜，移位到神經(jīng)元，井隨后阻斷こ酰膽堿的突觸前釋放。用于臨床使用的肉毒桿菌毒素通常從細胞培養(yǎng)物分離，并已使用多種純化方法。歷史上，通過一系列沉淀和切向流過濾步驟，以復合形式純化毒素。參見例如SchantzE. J.等人,Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxinsin medicine (肉毒桿菌毒素和其他微生物神經(jīng)毒素在醫(yī)學中的性質和用途)，MicrobiolRev 1992年3月56(1) :80_99。然而，這種方法提供了相對低的收率，通常小于約10%。其他方法使用尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法和/或親和カ色譜法。參見例如SchmidtJ.J. #人，Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ionexchange chromatography (通過高效離子交換色譜法純化E型肉毒桿菌神經(jīng)毒素)，Anal. Biochem. 1986 年 7 月；156(1) :213-219 ;Simpson L. L.等人，Isolation andcharacterization of the botulinum neurotoxins (內(nèi)毒桿菌神經(jīng)毒素的分離和表征)，Harsman S 編輯.Methods in Enzymology (酶學方法)·第 165 卷，Microbial Toxins Tools in Enzymology (微生物韋素酶學中的工具)San Diego,Calif Academic Press ;第165 卷；第 76-85 頁(1988) ；Kannan K.等人，Methods development for the biochemicalassessment of Neurobloc (botulinum toxin type B)(肉韋韋素制劑(B 型肉韋桿菌韋素)的生物化學評價的方法開發(fā))，Mov Disord 2000 ;15(增刊2) =20(2000) ；ffang Y. C.，The preparation ana quality of botulinum toxin type A for injection(BTXA)andits clinical use (注射用A型肉毒桿菌毒素(BTXA)的制備和質量，及其臨床用途)，Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002 ;58 (2002);和美國專利申請公開 No. 2003/0008367。其他方法僅關注于毒素的重鏈或輕鏈之一，而不是完整的且有生物活性的肉毒桿菌毒素蛋白。例如，通過重組方法單獨合成鏈中的一條。參見例如Zhou L.等人，Expressionand purification of the light chain of Dotulinum neurotoxin A A single mutationabolishes its cleavage of SNAP—25 and neurotoxicity after reconstitution withthe heavy chain (A型肉毒桿菌毒素的輕鏈的表達和純化單突變?nèi)∠銼NAP-25裂解，及與重鏈重構后的神經(jīng)毒性)，Biochemistry 1995 ；34(46) :15175-81(1995);和 Johnson b. K.等人 bcale-up οι the fermentation and purification of the recombinationheavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichiapastoris (畢赤酵母中表達的肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型F的重組重鏈片段C的發(fā)酵和純化的放大)，Protein Expr and Purif 2003 ；32 :ト9(2003)。然而，這些方法需要額外步驟來重新形成完整的且具有生物活性的肉毒桿菌毒素蛋白。最新的ー種方法包括使用疏水相互作用色譜、混合模式和/或離子交換色譜純化復合物形式的肉毒桿菌毒素。參見例如美國專利No. 7，452，697和7，354，740，其通過引用在此并入。因此，本領域存在對用于分離穩(wěn)定的、具有生物活性但非復合形式的完整的肉毒桿菌毒素蛋白的改進的純化方法的需要。因此，本發(fā)明的目的是提供解決這些和其他需要的組合物和方法。提出以上討論僅是為了提供對本領域所面對的問題的性質的更好理解，并且以上討論不應以任何方式解釋為對現(xiàn)有技術的承認，并且也不應將本文中的任何參考文獻的引述理解為承認，這些參考文獻構成本申請的“現(xiàn)有技木”。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的系統(tǒng)和方法。在一個實施方案中，該方法包括純化粗制的非復合的肉毒桿菌毒素以得到純化的非復合的肉毒桿菌毒素。在該實施方案中，該方法包括，將粗制的非復合的肉毒桿菌毒素裝載到陰離子交換柱，以將非復合的肉毒桿菌毒素俘獲在陰離子交換柱上；用緩沖液洗脫非復合的肉毒桿菌毒素以得到包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液；用來自陰離子交換柱的洗脫液裝載陽離子交換柱，以允許俘獲非復合的肉毒桿菌毒素；和用另ー緩沖液洗脫非復合的肉毒桿菌毒素以得到洗脫液，由此獲得純化的非復合的肉毒桿菌毒素。在某些實施方案中，通過許多色譜步驟獲得肉毒桿菌毒素復合物本身。在ー些實施方案中，用于獲得肉毒桿菌毒素復合物的方法包括，獲得包含肉毒桿菌毒素復合物的樣品；用該樣品裝載疏水相互作用柱以允許俘獲毒素，其中俘獲的肉毒桿菌毒素包含復合的肉毒桿菌毒素；和洗脫復合的肉毒桿菌毒素。然后，從該復合物解離非復合的肉毒桿菌毒素，并且非復合的肉毒桿菌毒素根據(jù)上述方法純化。在一些實施方案中，樣品通過以下獲得使包含肉毒桿菌毒素的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)受酸以獲得酸沉淀物，其可經(jīng)受額外的色譜前純化步驟，所述色譜前純化步驟的非限制性實例包括切向流過濾(以濃縮沉淀物的不溶物質)、核酸酶消化、凈化離心和 /或過濾。在一些實施方案中，樣品在裝載到疏水相互作用柱前，經(jīng)歷核酸酶消化。優(yōu)選地，核酸酶源自不含動物產(chǎn)物的過程，且更加優(yōu)選地，整個純化過程不含動物產(chǎn)物或至少基本上不含動物產(chǎn)物。在一些實施方案中，色譜分離中使用的樣品優(yōu)選是上清液或濾液級分。純化的非復合的肉毒桿菌毒素包括A、B、Ci、D、F、F和G型肉毒桿菌毒素中的至少ー種，且優(yōu)選具有約150kD的分子量的A型肉毒桿菌毒素。在一些優(yōu)選的實施方案中，純化的非復合的肉毒桿菌毒素具有至少98%的純度；和/或具有至少200 LD5tl單位/ng的活性。在一些實施方案中，該方法產(chǎn)生至少約2mg/L發(fā)酵培養(yǎng)物的產(chǎn)量。在其他實施方案中，該方法產(chǎn)生約I至約2mg/L發(fā)酵培養(yǎng)物的產(chǎn)量。通過參考以下本發(fā)明的詳細描述，本發(fā)明的這些方面和其他方面將被更好地理解。附圖簡述圖I是對比用于直接純化非復合的肉毒桿菌毒素的根據(jù)本發(fā)明的方法的ー個實施方案(

圖1A)與用于純化復合的肉毒桿菌毒素的方法(圖1B)的概括流程圖。詳細描述本發(fā)明涉及用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的系統(tǒng)和方法。在某些實施方案中，該方法包括通過下列來純化粗制的非復合的肉毒桿菌毒素用粗制的非復合的肉毒桿菌毒素裝載陰離子交換柱以允許陰離子交換柱俘獲非復合的肉毒桿菌毒素。然后，非復合的肉毒桿菌毒素用緩沖液洗脫，以得到包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。將來自陰離子柱的洗脫液裝載到陽離子交換柱，以允許俘獲非復合的肉毒桿菌毒素，然后用緩沖液洗脫純化的非復合的肉毒桿菌毒素，從而獲得純化的非復合的肉毒桿菌毒素。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了以相對少的步驟純化非復合的肉毒桿菌毒素，以產(chǎn)生高產(chǎn)量、高純度和高效價的產(chǎn)物。本發(fā)明的范圍內(nèi)的方法和系統(tǒng)可用于由發(fā)酵培養(yǎng)物有效產(chǎn)生穩(wěn)定但非復合的肉毒桿菌毒素。在其他實施方案中，該方法還包括，提供包含肉毒桿菌毒素復合物的樣品，并用該樣品裝載疏水相互作用柱，從而允許通過疏水相互作用柱俘獲肉毒桿菌毒素復合物。然后，用緩沖液從柱洗脫肉毒桿菌毒素復合物。從肉毒桿菌毒素復合物解離粗制的非復合的肉毒桿菌毒素，以獲得包含粗制的非復合的肉毒桿菌毒素的混合物。在這ー實施方案中，包含粗制的非復合的肉毒桿菌毒素的混合物根據(jù)以上描述的方法進行純化，以得到純的或基本純的肉毒桿菌毒素。本發(fā)明的ー個方面是認識到，包含非復合的肉毒桿菌毒素作為活性成分的藥物組合物提供了比包含復合形式的藥物組合物更高的純度。通常與肉毒桿菌毒素復合物相關的非毒素蛋白可占復合物重量的約90%。因此，提供復合物形式的肉毒桿菌毒素必然包括按重量計至少約90%的雜質。換言之，按重量計藥物組合物的至少約80%至約90%將包括細胞衍生的雜質，它們不是活性分子的一部分，也不是其生物活性所必須的。然而，這些雜質代表這樣的細胞衍生的物質，當其被施用于患者時，可増加對藥物的不期望的免疫反應的風險；可増加不期望的副作用的風險；和/或可増加致病劑的傳播的風險。相反，可通過本文描述的方法和系統(tǒng)獲得的非復合的產(chǎn)物的高純度減少了可能殘留在藥物組合物中的宿主細胞雜質的量，由此減少了伴隨的不期望的反應和/或傳播的風險。因此，本文描述的方法和系統(tǒng)可提供更適合于制備更安全、更純的藥物組合物的形式的肉毒桿菌毒素。此外，不同于復合形式，根據(jù)本文描述的方法制備的游離的肉毒桿菌毒素不需要在血液源產(chǎn)品中被穩(wěn)定以便儲存。例如，A型肉毒桿菌毒素復合物通常被穩(wěn)定在包含白蛋白的賦形劑中，所述白蛋白源自人類血液。例如，Β0Τ0Χ 包括以真空干燥形式包裝的純化的A型肉毒桿菌毒素復合物、人類血清白蛋白和氯化鈉。Dysport和Xeomin也是這樣。雖然篩選降低了致病劑污染的可能性，但是人類血液在藥物制劑中的使用通常増加了某些致病劑(例如不能或還沒有被篩選出來的致病劑)的不期望的傳播的風險。相反，如本文所教導的，根據(jù)本發(fā)明制備的游離的肉毒桿菌毒素可穩(wěn)定地儲存在硫酸銨中。此外，如本文所 討論的，在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)基本上、大體上或完全不含動物產(chǎn)物。穩(wěn)定儲存基本上、大體上或完全不含動物產(chǎn)物的毒素產(chǎn)物的能力還降低與動物源產(chǎn)物相關的潛在風險。因此，本文描述的方法和系統(tǒng)提供了在安全性方面特別適合于藥物應用的形式的肉毒桿菌毒素，例如，可制備和儲存基本上、大體上或完全不含動物產(chǎn)物的藥物組合物。在某些優(yōu)選的實施方案中，本文描述的方法和系統(tǒng)是可規(guī)?；暮?或依從cGMP的。因此，本文描述的方法和系統(tǒng)可以以商業(yè)化的エ業(yè)規(guī)模使用，以產(chǎn)生用于例如藥物組合物中的非復合的肉毒桿菌毒素。依從cGMP的方法或系統(tǒng)是指，可遵循由美國聯(lián)邦管理法規(guī)要求的當前藥品生產(chǎn)和質量管理的管理機構要求的方法或系統(tǒng)。在一些優(yōu)選的實施方案中，非復合的肉毒桿菌毒素產(chǎn)物因為其易于儲存和使用、高活性、高純度、穩(wěn)定性和/或提高的安全性，特別適合于大規(guī)模的生產(chǎn)。本文使用的“肉毒桿菌毒素”指可由梭菌細菌生產(chǎn)的神經(jīng)毒素蛋白分子，以及其重組產(chǎn)生的形式。重組肉毒桿菌毒素可具有例如由重組梭菌屬和/或非梭菌屬物種經(jīng)重組技術合成的毒素蛋白的輕鏈和/或重鏈?！叭舛緱U菌毒素”在本文中與相關表述“肉毒桿菌神經(jīng)毒素”、“神經(jīng)毒素”或簡單的“毒素”可互換使用?！叭舛緱U菌毒素”包括肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1. D、E、F和G中的任何ー種，并且還包括復合形式和非復合形式?！皬秃闲问健敝赴舛緱U菌毒素蛋白(即具有約150kD的分子量的毒素分子)以及至少ー個締合的天然非毒素蛋白的肉毒桿菌毒素復合物。構成復合物的非毒素蛋白通常包括非毒素血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白。因此，復合形式可包括肉毒桿菌毒素分子(神經(jīng)毒性組分)和ー個或多個非毒素血凝素蛋白和/或ー個或多個非毒素非血凝素蛋白。在某些實施方案中，復合物的分子量大于約150kD。例如，A型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有約900kD、約500kD或約300kD的分子量。B型和C1型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有500kD的分子量。D型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有約300kD或約500kD的分子量。最后，E型和F型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有約300kD的分子量。“非復合的”肉毒桿菌毒素指具有約150kD的分子量的分離的，或大體上或基本上分離的肉毒桿菌毒素蛋白。即，“非復合的”形式不包括通常與復合形式相關的非毒素蛋白，諸如非毒素血凝素和非毒素非血凝素蛋白?！胺菑秃系摹比舛緱U菌毒素在本文中與“游離的”肉毒桿菌毒素可互換使用。由天然肉毒梭菌細菌制備的所有肉毒桿菌毒素血清型由細菌合成為無活性的單鏈蛋白，然后其被蛋白酶切割或切斷，變得具有神經(jīng)活性。該蛋白包括通過ニ硫鍵連接到約50kD輕鏈的約IOOkD重鏈。肉毒桿菌毒素復合物可通過多種方法解離成毒素和非毒素蛋白，包括例如升高pH至約7. 0，在約7. 3的pH下用紅細胞處理復合物，和/或使復合物經(jīng)歷分離過程，諸如在約7至約8的pH下在合適的緩沖液中的柱色譜。本發(fā)明包括能夠純化非復合的肉毒桿菌毒素(其不具有通常被認為是在純化過程中維持穩(wěn)定性所必須的締合的非毒素蛋白)的系統(tǒng)和方法。在優(yōu)選的實施方案中，本文描述的方法和系統(tǒng)有利于純化游離的肉毒桿菌毒素，而沒有穩(wěn)定性損失。“穩(wěn)定性”或“穩(wěn)定的”指保留通過ニ硫鍵彼此連接的約IOOkD重鏈和約50kD輕鏈，并處于提供生物活性的構型的肉毒桿菌毒素蛋白分子。在一些實施方案中，本發(fā)明的范圍中的特定系統(tǒng)連同本發(fā)明的范圍中的特定方法一起操作。本發(fā)明的范圍中的系統(tǒng)可包括用于相應的多個(優(yōu)選連續(xù)系列(consecutive series))色譜步驟的多個(優(yōu)選連續(xù)系列)色譜柱。此外，本發(fā)明的范圍中的系統(tǒng)可包括用于相應的多個(優(yōu)選連續(xù)系列)非色譜步驟(例如色譜前步驟)的多個(優(yōu)選連續(xù)系列)非色譜設備，諸如過濾和/或離心裝置。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的范圍中的方法包括，從發(fā)酵培養(yǎng)物獲得包含肉毒桿菌毒素的樣品；使其經(jīng)受多個色譜前純化；然后，使其通過多個色譜柱，以得到高度純化的高效價的非復合的肉毒桿菌毒素。這樣的純化的游離的肉毒桿菌毒素可用于制備包含游離的肉毒桿菌毒素作為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案的色譜前過程和色譜過程的所有步驟在圖IA中示出。為了比較，圖IB示出了用于獲得純化的肉毒桿菌毒素復合物的常規(guī)方法。簡而言之，圖IB描述了包括以下的過程發(fā)酵培養(yǎng)物的深度過濾，隨后切向流過濾所得的濾液(使用300kD超微過濾)；隨后是凈化離心步驟。然后，將離心步驟獲得的團塊(不溶性級分)再懸浮于氯化鈉中，并裝載到疏水相互作用柱或離子交換柱。重復色譜純化步驟至少三次，以得到含有900 kD A型肉毒桿菌毒素復合物的最終洗脫液。發(fā)酵和酸沉淀如圖IA所示，非復合的肉毒桿菌毒素通常由發(fā)酵培養(yǎng)物純化。本文使用的“發(fā)酵培養(yǎng)物”指包含正在合成和/或已經(jīng)合成至少ー種肉毒桿菌毒素的細胞的培養(yǎng)物或培養(yǎng)基，和/或其組分。例如，梭菌屬細菌，諸如肉毒梭菌可以在有益于細菌生長的環(huán)境(溫暖的厭氧氣氛)中，在瓊脂平板上培養(yǎng)。培養(yǎng)步驟通常允許獲得具有期望的形態(tài)和其他特征的梭菌菌落。然后，所選的培養(yǎng)的梭菌菌落可以在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵成發(fā)酵培養(yǎng)物。所培養(yǎng)的細胞可以包括非梭菌屬物種作為宿主細胞(諸如大腸桿菌(E. coli)或酵母細胞)，通過重組技術使得它們能夠生物合成肉毒桿菌毒素。合適的發(fā)酵培養(yǎng)條件可依賴于所用的宿主細胞，并且通常是本領域已知的。在優(yōu)選的實施方案中，可以允許發(fā)酵進展至完成，以致細胞成熟，并已生物合成了肉毒桿菌毒素。肉毒梭菌培養(yǎng)物的生長通常在約24小時至約36小時之后完成。在一段額外的時間段后，細菌通常溶解，并將合成的肉毒桿菌毒素復合物以復合形式釋放到培養(yǎng)基中。例如，在約60小時至約96小時的發(fā)酵期間，大多數(shù)肉毒梭菌細胞經(jīng)受溶解，并釋放A型肉毒桿菌毒素復合物。
在一些實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)物可包括在常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)程序中使用的ー種或多種動物產(chǎn)物，諸如動物蛋白。例如，肉毒桿菌毒素可使用公知的Schantz方法的改良版本，通過肉毒梭菌的厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)(參見例如Schantz E. J.等人，Properties and use ofbotulinum toxin ana other microbial neurotoxins in medicine (肉_桿菌毒素和其他微生物神經(jīng)毒素在藥物中的性質和用途)，Microbiol Rev 1992年3月；56(1) :80-99;bchantz E. J. ^人Preparation and characterization of botulinum toxin type A forhuman treatment (用于人類治療的A型肉毒桿菌毒素的制備和表征)，第3章JankovicJ 編輯· Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxiru 神經(jīng)字疾病和治療·用肉毒桿菌毒素治療)(1994)，New York, Marcel Dekker ;1994，第41-49頁不ロ ；Schantz E. J. %=人，Use of crystalline type A botulinum toxin in medicalresearch(結晶A型肉毒桿菌毒素在醫(yī)學研究中的用途)，Lewis G EJr編輯BiomedicalAspects of Botulism(肉韋中韋的生物醫(yī)學方面)(1981)New York, Academic Press,第143-50頁，每個文獻通過引用并入本文)。用于獲得肉毒桿菌毒素的Schantz方法和改良的Schantz方法使用動物產(chǎn)物,包括在培養(yǎng)瓶(culture vial)中的動物源Bacto-Cooked肉培養(yǎng)基，和在發(fā)酵培養(yǎng)基中的酪蛋白。此外，Schantz毒素純化使用來自牛來源的DNA酶和RNA酶水解存在于發(fā)酵培養(yǎng)物中的核酸。然而，含有使用包含動物源產(chǎn)物的過程純化的活性成分的藥物的施用可能使患者經(jīng)受接受不同的致病劑的潛在風險。例如，朊病毒可存在于包含污染的動物源產(chǎn)物的藥物組合物中，諸如引起克-雅ニ氏病的朊病毒。作為另ー個實例，當動物產(chǎn)物用于制備藥物組合物的過程中時，存在傳播海綿狀腦病(TSE)，諸如牛海綿狀腦病(BSE)的風險。然而，經(jīng)不含動物產(chǎn)物的過程獲得的肉毒桿菌毒素的使用減少了此類風險。因此，在ー些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了不含動物產(chǎn)物，或大體上或基本上不含動物產(chǎn)物的(APF)方法/過程?！安缓瑒游锂a(chǎn)物的”、“大體上不含動物產(chǎn)物的”或“基本上不含動物產(chǎn)物的”分別包括“不含動物蛋白的”、“大體上不含動物蛋白的”或“基本上不含動物蛋白的”，并且分別指不存在、大體上不存在或基本上不存在源自動物的產(chǎn)物，源自動物的產(chǎn)物的非限制性實例包括源自血液或匯集的血液(pooled blood)的產(chǎn)物。本文使用的“動物”指哺乳動物(諸如人類)、禽類、爬行動物、兩棲動物、魚類、昆蟲、蜘蛛或其他動物物種，但排除微生物，諸如細菌和酵母。不含動物產(chǎn)物的方法/過程(或大體上或基本上不含動物產(chǎn)物的方法/過程)指這樣的方法/過程，其完全、基本上或大體上不含動物源產(chǎn)物、試劑和蛋白諸如免疫球蛋白、其他血液產(chǎn)品、副產(chǎn)物或消化物；肉產(chǎn)物、肉副產(chǎn)物、肉消化物；以及奶或乳制品、副產(chǎn)物或消化物。因此，不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)程序的實例是發(fā)酵過程，諸如細菌培養(yǎng)，其排除血液、肉和乳制品、副產(chǎn)物或消化物。用于獲得非復合的肉毒桿菌毒素的不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵過程降低了當施用于人類時，可伴隨毒素的病毒、朊病毒或其他不期望的物質的污染的可能性。使用梭菌屬培養(yǎng)物的不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵程序描述于例如美國專利 No. 7，452，697和7，354，740，其通過引用在此并入。例如，用于產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的生長培養(yǎng)基可包括基于植物的產(chǎn)物(而不是動物源產(chǎn)物)，諸如基于大豆的產(chǎn)物和/或Lupinus campestris的脫苦種子(debitteredseed)。用于不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)的基于大豆的發(fā)酵培養(yǎng)基例如可包括基于大豆的產(chǎn)物、碳源諸如葡萄糖、鹽諸如NaCl和KC1、含磷酸鹽的成分諸如Na2HPO4和KH2PO4、ニ價陽離子諸如鐵和鎂、鐵粉、氨基酸諸如L-半胱氨酸和L-酪氨酸等等。優(yōu)選地，大豆是水解的大豆，且水解使用非源自動物的酶進行。水解的大豆的來源包括但不限于Hy_Soy(Quest International)、大豆蛋白胨(Gibco)、Bac-soytone(Difco) ,AMISOY (Quest)、NZ大豆(Quest)、NZ 大豆BL4、NZ大豆BL7、SE50M(DMVInternational Nutritionals, Fraser, N. Y.)和 SE50MK(DMV)。如圖IA所示，在某些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品獲自發(fā)酵培養(yǎng)物。例如，在發(fā)酵一段時間之后，在不含動物產(chǎn)物的或非不含動物產(chǎn)物的培養(yǎng)基中，肉毒桿菌毒素復合物被釋放到培養(yǎng)基中，并可通過沉淀收獲。例如，在一些實施方案中，如在公知的Schantz方法中，包含肉毒桿菌毒素的發(fā)酵培養(yǎng)基可經(jīng)受酸沉淀，以促使肉毒桿菌毒素復合物與細胞碎片締合，并形成酸沉淀物。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，約3M硫酸溶液可以被加入到發(fā)酵培養(yǎng)物中，以形成酸沉淀物。優(yōu)選地，將PH降低至約3至約4，更優(yōu)選降低至約3. 2至約3. 8，且更優(yōu)選約3. 5。在一些實施方案中，培養(yǎng)溫度也被降低，例如降低至低于約25で、24で、23で、22で、21で或20で。這些條件還增強了肉毒桿菌毒素復合物與細胞碎片的締合。形成的酸沉淀物將包括結合的肉毒桿菌毒素復合物，并可在進ー步的純化步驟(諸如凈化步驟)中用作起始材料；而棄去濾液。相反，圖IB中描述的常規(guī)過程不包括酸沉淀步驟。即，雖然純化程序也開始于包含肉毒桿菌毒素復合物的發(fā)酵培養(yǎng)物，但培養(yǎng)基經(jīng)受深度過濾，且在隨后的純化步驟中使用濾液而不是細胞碎片。在圖IB的過程中，棄去了細胞碎片而不是濾液,而如圖IA所示，棄去了濾液，且將細胞碎片(酸沉淀物)用于進ー步的純化步驟，例如以下討論的色譜前純化。色譜前純化在一些實施方案中，從發(fā)酵培養(yǎng)基獲得的樣品經(jīng)受ー種或多種色譜前純化。色譜前純化可包括切向流過濾、核酸酶消化和凈化離心和/或過濾中的至少ー種。圖IA提供了本發(fā)明涵蓋的包含色譜前純化的エ藝流程的一個非限制性實例。如上所示，在優(yōu)選的實施方案中，對包含肉毒桿菌毒素的發(fā)酵培養(yǎng)物的沉淀物(或不溶性級分)而不是對發(fā)酵培養(yǎng)物自身或源自其的濾液(如圖IB所示的過程)進行色譜前程序。即，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，色譜前(浄化)步驟起始于酸沉淀物(不溶性級分)。在一些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品(酸沉淀物或不溶性級分)經(jīng)受切向流過濾。切向流過濾是通常用于凈化、濃縮和/或純化蛋白的過程。與正常流動過濾(其中液體在施加的壓カ下直接朝向濾膜移動)相反，在切向流過濾中，液體沿著膜表面切向地或平行地移動。施加的壓カ用于迫使一部分液體通過濾膜，達到濾液側，而太大而不能通過膜孔的顆粒和大分子被滯留下來。然而，不同于正常流動過濾，滯留的組分沒有滯留在膜表面，而是被切向流動的液體清掃。在某些優(yōu)選的實施方案中，切向流過濾用于濃縮與肉毒桿菌復合物締合的不溶物質(細胞碎片)，同時允許濾液通過膜孔。(參見例如圖1A)。切向流過濾參數(shù)，諸如孔徑、進料流量、施加的壓カ等等可由本領域技術人員選擇以濃縮細胞碎片，并產(chǎn)生更濃的含肉毒桿菌毒素復合物的樣品。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，例如，可使用切向流過濾，其使用具有約O. I μ m的孔徑的濾器。在一些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品經(jīng)受核酸酶消化。核酸酶消化可促進肉毒桿菌毒素復合物易干與其結合的核酸組分的去除。在某些優(yōu)選的實施方案中，核酸酶消化在切向流過濾之后，并對由切向流過濾獲得的濃縮的細胞碎片進行。(參見例如圖1A)。例如，濃縮的細胞碎片樣品的pH可被調整以提供核酸酶活性，并可用一種或多種合適的核酸酶進行孵育，所述核酸酶諸如分別消化(水解)DNA和/或RNA的DNA酶和/或RNA酶。依賴于所用的核酸酶，合適的PH可以是約5至約7，優(yōu)選地約6。在一些實施方案中，苯甲脒被用作蛋白酶抑制劑，以防 止核酸酶消化步驟期間毒素的蛋白酶解。使用的核酸酶可源自任何適合的來源，包括動物源和/或非動物源。在更加優(yōu)選的實施方案中，核酸酶由非動物源獲得，以提供不含動物產(chǎn)物的核酸酶和不含動物產(chǎn)物的過程。因此，本發(fā)明涵蓋用于純化肉毒桿菌毒素的不含動物產(chǎn)物的方法和系統(tǒng)(或基本上或大體上不含動物產(chǎn)物的方法和系統(tǒng))，其包括使用核酸酶。不含動物產(chǎn)物的核酸酶可重組制備，例如使用重組細菌、酵母或其他合適的微生物，所述重組細菌、酵母或微生物已經(jīng)被轉化而表達根據(jù)本文描述的方法的核酸酶消化步驟中使用的DNA酶和/或RNA酶。核酸酶消化通常減少樣品的核酸含量，因為宿主細胞的核酸被降解，并且促進了它們的去除。例如，水解的核酸和其他低分子量雜質可通過進ー步的純化步驟除去。在某些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品可經(jīng)受凈化離心和/或過濾。浄化離心或過濾指用于從樣品中除去肉眼可見的成分(gross element),諸如完整的和溶解的細胞和細胞碎片，產(chǎn)生可測量地更澄清的樣品的離心或過濾步驟。在某些實施方案中，離心以約10，OOOxg至約30，000xg，更優(yōu)選地以約15，OOOxg至約20，OOOxg，且最優(yōu)選地以約17，700xg進行。凈化過濾將通常包括正常流動過濾,也稱為“死端”過濾,其中液體在施加的壓カ下直接朝向過濾介質移動，并且太大而不能通過濾孔的顆粒積累在表面或在介質自身中，同時較小的分子作為濾液通過。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，將樣品與硫酸銨混合，并且正常流動過濾使用具有約O. I至約O. 3 μ m的孔徑，且更優(yōu)選地約O. 2 μ m的孔徑的濾器進行。(參見例如圖1A)。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，ー個或多個凈化步驟跟隨核酸酶消化步驟。在某些更加優(yōu)選的實施方案中，一個或多個凈化步驟緊在色譜純化之前進行。值得注意的是，在優(yōu)選的實施方案中，凈化的上清液或濾液(而不是被棄去的不溶性級分)提供了用于進ー步的純化步驟(諸如色譜純化步驟)的含肉毒桿菌毒素的樣品。這與圖IB中描述的過程相反，其中肉毒桿菌毒素復合物包含在來自不包括酸沉淀的色譜前步驟的不溶性級分中，諸如例如從色譜前離心獲得的離心團塊，并且棄去上清液。此外，并且再次與圖IB中描述的過程相反，在本發(fā)明的一些實施方案中，色譜前步驟不需要從發(fā)酵培養(yǎng)物獲得的濾液的切向流過濾步驟。即，在本發(fā)明的一些實施方案中，色譜純化所用的樣品不是通過使發(fā)酵培養(yǎng)物的可溶性級分經(jīng)受切向流過濾來獲得的。而是，在某些實施方案中，本發(fā)明使用不溶性物質(諸如酸沉淀物)，消除了其中使發(fā)酵培養(yǎng)物濾液經(jīng)受切向流過濾以試圖濃縮可溶的肉毒桿菌毒素復合物的任何步驟。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的色譜前步驟消除了對任何此類步驟的需要，作為代替，使用酸來沉淀所需的毒素復合物和其他不溶性物質(細胞碎片)。色譜純化步驟圖IA還闡釋了根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案的色譜純化步驟。根據(jù)本發(fā)明的ー個實施方案，用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的色譜方法包括，使包含肉毒桿菌毒素的樣品通過多個色譜柱，以獲得高度純化的、高效價的、非復合形式的神經(jīng)毒素。在某些實施方案中，使用疏水相互作用柱將復合的肉毒桿菌毒素與其他細胞組分分離(參見例如圖1A)。該柱俘獲復合形式的肉毒桿菌毒素，同時允許雜質流過該柱。所用的柱可以是本領域已知的、適合用于這種目的的任何疏水相互作用柱，諸如商購自GEHealthcare Life Sciences 的丁基瓊脂糖快流(Butyl Sepharose Fast Flow)柱或苯基瓊脂糖HP(Phenyl Sepharose HP)。在一些實施方案中，該方法還包括在裝載到柱上之前,處理用于疏水相互作用色譜的樣品。例如，當用于苯基瓊脂糖HP柱時，樣品可在裝載前與pH6的O. 5M硫酸銨溶液和50mM磷酸鹽合并。可以使用的其他的柱、緩沖液和pH條件包括柱，諸如苯基瓊脂糖快流高置換(Phenyl Sepharose Fast Flow high substitution)、苯基瓊脂糖快流低置換(Phenyl Sepharose Fast Flow low substitution)、丁基瓊脂糖(ButylSepharose)和辛基瓊脂糖(Octyl Sepharose);緩沖液,諸如こ酸鹽、朽1檬酸鹽、MES、組氨酸、哌嗪和丙ニ酸鹽，各自的pH范圍是約4. O至約7. O,更優(yōu)選地約4. 5至約6. 5，且更加優(yōu)選地約5. 5。如本領域所知的，基于本文提供的教導，可確定其他緩沖液和pH條件以使所使用的特定柱的收率最大化。不期望受到理論的束縛，認為分離包括在低于7的pH下使毒素復合物結合于樹脂以避免在該步驟解離，同時允許許多細胞源雜質流過，諸如例如較小的蛋白、核酸等等。如本領域所知的，為了將俘獲的(結合的)毒素從疏水相互作用柱洗脫，可使用合適的緩沖液。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用下降梯度的硫酸銨。下降梯度的濃度范圍可以是約O. 6M至約O. 0M、約O. 5M至約O. OM或約O. 4M至約O. OM0可使用的其他洗脫緩沖液包括例如，下降梯度的硫酸鈉(Na2SO4);氯化鈉(NaCl);氯化鉀(KCl);こ酸銨(NH4OAc)等等。如本領域所知的，可鑒別包含產(chǎn)物峰的級分。例如，當使用硫酸銨時，通常在約O. 4M至約O. OM ;更優(yōu)選地約O. 3M至約O. OM ;且最優(yōu)選地約O. 25M至約O. OM硫酸銨的濃度范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)峰級分，同時將PH保持在約6以維持復合物。即，可鑒別并在隨后的純化步驟中使用含有洗脫的肉毒桿菌毒素復合物的級分。在優(yōu)選的實施方案中，使所得的肉毒桿菌毒素復合物解離，以得到非復合形式。在某些優(yōu)選實施方案中，解離步驟在疏水相互作用色譜步驟之后和/或在隨后的色譜步驟之前進行(例如參見圖1A)。因此，在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涵蓋了其中色譜的目標分子在不同的色譜步驟中不同的方法和系統(tǒng)。即，在初始的色譜步驟中，目標包括肉毒桿菌毒素復合物，而在隨后的色譜步驟中，目標包括從非毒素蛋白(諸如血凝素和非血凝素蛋白)解離的游離的肉毒桿菌毒素。相反，在圖IB中描述的過程包括全部設計用于純化肉毒桿菌毒素復合物的色譜步驟。解離肉毒桿菌毒素復合物以產(chǎn)生非復合的肉毒桿菌毒素蛋白可以以許多方式完成，例如，如本領域所知的和/或本文描述的。例如，可通過將pH升高至約7. O完成解離； 或在其中不含動物蛋白的純化不是必須的實施方案中，可通過在約7. 3的pH下用紅細胞處理復合物完成解離。在優(yōu)選的實施方案中且為了提供不含動物的毒素，基于復合物在合適的緩沖液中的pH調整，使復合物經(jīng)受分離過程。合適的緩沖液包括但不限于陽離子緩沖液，優(yōu)選地不與陰離子交換柱相互作用，或基本上不與陰離子交換柱相互作用的陽離子緩沖液。合適的陽離子緩沖液包括例如，Tris, bis-Tris、三こ醇胺、N-甲基ニこ醇胺。約7至約8. 4之間的pH ;更優(yōu)選地約7. 4至約8. 2之間的pH ;且最優(yōu)選地約7. 8的pH通常適合于解離復合物以釋放非復合的肉毒桿菌毒素。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，將疏水相互作用柱的洗脫液的PH升至約7. 5、約7. 8或優(yōu)選地升至約8. O。例如，在一些實施方案中，洗脫液可被稀釋到具有約7. 8的pH的Tris緩沖液中，以使復合物解離成單獨的組分，包括約150kD非復合的肉毒桿菌毒素蛋白。然后，包含解離組分的所得混合物可經(jīng)受ー個或多個額外的色譜純化步驟，諸如設計用于俘獲并進ー步純化非復合的毒素的離子交換色譜步驟。在根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案中，可使用一個或多個離子交換色譜步驟純化非復合的肉毒桿菌毒素(例如參見圖1A)。離子交換色譜實現(xiàn)基于靜電荷的分級分離。給定的蛋白結合柱基質的程度是蛋白的靜電荷的函數(shù)，蛋白的靜電荷基于其氨基酸組成和柱基質的電荷。陽離子離子交換柱具有帶凈正電荷的基質，而陰離子離子交換柱具有帶凈負電荷的基質。使用含帶電物質的溶劑(洗脫劑)從柱上選擇性地洗脫結合的蛋白，所述帶電物質諸如鹽離子，其與帶電的基質支持體競爭與帶電的蛋白的結合。因此，結合的蛋白可基于 它們的電荷強度分級分離?？蛇x擇地，可通過調節(jié)PH(其可改變蛋白的靜電荷)，由此改變蛋白對帶電基質的親和力來洗脫蛋白。在根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，將包含非復合的肉毒桿菌毒素的混合物裝載到陰離子交換柱上(例如參見圖1A)。值得注意的是，該柱俘獲非復合形式的肉毒桿菌毒素，以使毒素蛋白與解離的非毒素蛋白可洗脫到不同的級分。所用的柱可以是本領域已知的適合分離帶電蛋白的任何陰離子柱，其非限制性實例包括商購自GE Healthcare LifeSciences 的 Q 瓊脂糖 HP (Q Sepharose HP)、Q 瓊脂糖快流(Q Sepharose Fast Flow)或 QXL瓊脂糖(Q XL S印harose)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用Q XL瓊脂糖柱。在一些實施方案中，該方法還包括在裝載到柱上以前，處理用于陰離子交換色譜的包含非復合的肉毒桿菌毒素的混合物。例如，如本領域所知的，基于本文提供的教導，可確定緩沖液和PH條件，以使所使用的特定柱的收率最大化。對于裝載和在柱中的使用，例如，合適的緩沖液包括但不限于陽離子緩沖液，優(yōu)選地不與陰離子交換柱相互作用或基本上不與陰離子交換柱相互作用的陽離子緩沖液。合適的陽離子緩沖液包括例如Tris、bis-Tris、三こ醇胺、N-甲基ニこ醇胺。為裝載和平衡柱，可使用約7. 2至約8. 6的pH ;更優(yōu)選地約7. 4至約8. 2的pH ;且最優(yōu)選地約7. 8的pH。如本領域所知的，為了從陰離子交換柱洗脫俘獲的(結合的)毒素和其他解離組分，可使用合適的緩沖液。合適的緩沖液的實例包括例如，氯化鈉(NaCl);和氯化鉀(KCl)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用上升梯度的氯化鈉。例如，可使用具有約O. OM至約O. 4M NaCl，更優(yōu)選地約O. OM至約O. 5M NaCl，且更加優(yōu)選地約O. OM至約O. 6M NaCl的濃度范圍的氯化鈉緩沖液。在不同級分中分離的雜質可包括例如解離的復合物的ー種或多種非毒素蛋白，諸如非毒素血凝素和/或非毒素非血凝素蛋白。如本領域所知的，可鑒別包含產(chǎn)物峰的級分。在約7. 4至約8. 4之間,優(yōu)選約7. 8的pH下,峰可出現(xiàn)在例如約8mSem至約22mSem(對應于約O. 08M至約O. 18M NaCl)下。相反，其他雜質可在約30至約45mSem(對應于約O. 25M至約O. 35M NaCl)下洗脫?？设b別包含洗脫的非復合的肉毒桿菌毒素的級分，以提供包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。可通過本領域所知的方法鑒別峰，例如使用HPLC、蛋白印跡分析、ELISA、非還原型SDS-PAGE等等。例如，在非還原條件下的SDS-PAGE可鑒別出約150kDa的毒素帶，而其他雜質將出現(xiàn)在對應于更小分子的帯。然后，包含非復合形式的洗脫液可經(jīng)受進一歩的色譜純化步驟。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，通過SDS-PAGE評價毒素純度。如本領域技術人員所了解的，SDS-PAGE分析可以在切割存在于蛋白中的ニ硫鍵的試劑的缺失或存在(即分別地，非還原條件或還原條件)下進行。例如對于A型肉毒桿菌毒素，A型肉毒桿菌毒素蛋白分子的成熟和活性形式包括分別為IOOkD和50kD的兩條肽鏈，其通過非共價相互作用以及ニ硫鍵保持在一起。當使用非還原條件測定通過本發(fā)明的過程產(chǎn)生的A型肉毒桿菌毒素吋，A型肉毒桿菌毒素蛋白分子遷移為約150kD的単一蛋白帶，且測量的純度通常大于98%。當每條凝膠泳道裝載的A型肉毒桿菌毒素蛋白的量保持在光密度計的動態(tài)范圍內(nèi)時，存在很少(如果有的化)的可檢測的雜質帶，得到100%的測量純度。當A型肉毒桿菌毒素過載，以致主要的毒素帶高于光密度計的動態(tài)范圍時，可檢測到一些較少的雜質帶(多達1-2% )。然而，當A型肉毒桿菌毒素的SDS-PAGE分析在還原條件下進行吋，肉毒桿菌毒素的ニ硫鍵被切斷，且A型肉毒桿菌毒素蛋白遷移為分別具有IOOkD和50kD的分子量的兩個組分。當裝載A型肉毒桿菌毒素蛋白以致主要物質高于光密度計的動態(tài)范圍，且SDS-page在還原條件下運行時，可更容易地檢測到較少的雜質物質。例如，在這些條件下，由于在發(fā)酵和回收過程中不完全的蛋白酶解加工，可存在多達5%的150kD物質。在這些條件下，本發(fā)明的方法產(chǎn)生通常大于總蛋白的90%，且更可能大于總蛋白的95%的毒素產(chǎn)物(包括有活性的切割的IOOkD和50kD的多肽鏈)。因此，如本文描述的，報道的毒素的測量純度依賴于所用的SDS-PAGE方法的細節(jié)。此外，雖然以上實例涉及A型肉毒桿菌毒素，但本領域技術人員將理解，可容易地修改本文描述的SDS-PAGE分析，以評價肉毒桿菌毒素的其他血清型的純度。在某些實施方案中，將來自陰離子柱的包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液裝載到陽離子交換柱(參見例如圖1A)。值得注意地，該柱也俘獲非復合形式的肉毒桿菌毒素，以致毒素蛋白和解離的非毒素蛋白可洗脫在不同的級分中。所用的柱可以是本領域已知的適合于分離蛋白的任何陽離子柱，其非限制性實例包括SP瓊脂糖(SP Sepharose)柱，包括 SP 瓊脂糖 HP (SP Sepharose HP)柱或 SP 瓊脂糖快流(SP Sephrose Fast Flow)柱；Mono S柱；或Source-S柱,諸如Source_30S柱或優(yōu)選地Source_15S柱,它們都商購自GEHealthcare Life Sciences。在一些實施方案中，該方法還包括在裝載到柱上之前,處理用于陽離子交換色譜的來自陰離子交換柱的包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。在一些優(yōu)選的實施方案中，調整PH，以致裝載到柱上的洗脫液的pH允許游離毒素與柱有效地結合。例如，pH可以維持在約4至約8的范圍內(nèi)，優(yōu)選地約5至約7. 5，更優(yōu)選地約6至約7，且最優(yōu)選地約7。此外，在一些實施方案中，可在裝載到陽離子交換柱上之前，處理來自陰離子柱的洗脫液以減少電導率，例如使用磷酸鈉緩沖液，其非限制性實例是約20mMNaH2P04的磷酸鈉緩沖液。例如，來自陰離子柱的洗脫液可含有多達約O. 15M的NaCl，從而在約20mMNaH2PO4緩沖液中的稀釋減少了電導率。在ー些特定的實施方案中，電導率從約12mSem減少至約3. 3mSem。在緩沖液稀釋、透析或本領域已知的其他方法也可用于減少電導率。為了裝載和在柱中使用，例如，合適的緩沖液包括但不限于陰離子緩沖液，優(yōu)選地 不與陽離子交換柱相互作用或基本上不與陽離子交換柱相互作用的陰離子緩沖液。合適的陰離子緩沖液包括例如MES、HEPES等等，且優(yōu)選地磷酸鈉緩沖液。為了裝載和平衡柱，可使用約4至約8之間的pH ;優(yōu)選地約5至約7. 5之間的pH ;更優(yōu)選地約6至約7之間的pH ；且最優(yōu)選地約6. 8至約7的pH。如本領域所知的，為了從陽離子交換柱洗脫俘獲的(結合的)毒素(與其他解離的非毒素蛋白和其他雜質分離)，可使用合適的緩沖液。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用上升梯度的氯化鈉。氯化鈉梯度的合適的濃度范圍可以從約O. OM至約IM NaCl。可使用的其他鹽包括例如氯化鉀，其可以約O. OM至約O. 5M KCl的濃度梯度使用。如本領域所知的，可鑒別包含產(chǎn)物峰的級分。在約6. 7的pH下，峰可以出現(xiàn)在例如約18至約25mSem(對應于約O. 3M至約O. 4M NaCl)下。即，可鑒別包含洗脫的非復合的肉毒桿菌毒素的級分以提供來自陽離子柱的包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。在特別優(yōu)選的實施方案中，來自陽離子柱的洗脫液表示高純度的、高產(chǎn)量的并具有高活性的非復合的肉毒桿菌毒素。相反，圖IB中描述的過程在最終的洗脫液中提供了 900kD的A型肉毒桿菌毒素復合物。純化的非復合的肉毒桿菌毒素產(chǎn)物
肉毒桿菌毒素。參見以下實施例I。該產(chǎn)物還易于穩(wěn)定，并可常規(guī)地用于制備安全的藥物組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，純化的非復合的肉毒桿菌毒素是至少約80%純的，優(yōu)選地至少約90%純的，更優(yōu)選地至少約95%純的，更加優(yōu)選地至少約98%純的，且最優(yōu)選地至少約99%純的或甚至是約100%純的。“純化的非復合的肉毒桿菌毒素”指與其他蛋白和雜質分離或基本上分離的游離的肉毒桿菌毒素蛋白分子，所述其他蛋白和雜質在其從培養(yǎng)物或發(fā)酵過程獲得時，可以伴隨非復合的肉毒桿菌毒素。例如“80%純的”純化的非復合的肉毒桿菌毒素指分離的或基本上分離的非復合的肉毒桿菌毒素蛋白，其中如通過其他合適的分析方法所測定的，毒素蛋白占存在的總蛋白的80%，所述分析方法的非限制性實例包括SDS-PAGE、CE和HPLC。例如，在一些優(yōu)選的實施方案中，包含非復合的肉毒桿菌毒素的陽離子柱洗脫液是至少約99%純的，且含有小于約1%的宿主細胞蛋白，所述宿主細胞蛋白不是原本存在的約150kD的肉毒桿菌毒素。在一些優(yōu)選的實施方案中，純化的非復合的肉毒桿菌毒素具有至少約150 LD5tl單位/ng,優(yōu)選地至少約180 LD50單位/ng,更優(yōu)選地至少約200 LD50單位/ng,更加優(yōu)選地至少約210 LD5tl單位/ng，且最優(yōu)選地至少約220 LD5tl單位/ng的活性。肉毒桿菌毒素的一個單位被定義為，當腹膜內(nèi)注射到雌性Swiss Webster小鼠(每只重量為約18-20克)時的LD5tl。換言之，肉毒桿菌毒素的ー個單位是殺死ー組雌性Swiss Webster小鼠的50%的肉毒桿菌毒素的量?！盎钚浴痹诒疚闹信c相關表述“生物活性”、“效價”和“毒性”可互換使用，用于描述肉毒桿菌毒素的作用。在優(yōu)選的實施方案中，可通過本文描述的方法和系統(tǒng)獲得的非復合的肉毒桿菌毒素顯示出生物活性。即，在優(yōu)選的實施方案中，當根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案純化時，產(chǎn)物的生物活性或毒性不損失，即使在純化期間，除去了與毒素蛋白天然締合的非毒素蛋白。在更加優(yōu)選的實施方案中，使用本發(fā)明的范圍內(nèi)的給定的一組過程和參數(shù)獲得的效價是一致的和/或可重現(xiàn)的。例如，進行的效價測量可具有低于約40%的變異性，優(yōu)選地低于約35%的變異性，更優(yōu)選地低于約30%的變異性，更加優(yōu)選地低于約25%的變異性，且最優(yōu)選地低于約20%的變異性。
在一些優(yōu)選的實施方案中，純化過程提供了高產(chǎn)量的非復合的肉毒桿菌毒素。例如從30L發(fā)酵培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)量可以是至少約30mg，優(yōu)選地至少約40mg，更優(yōu)選地至少約70mg，更加優(yōu)選地至少約80mg，且最優(yōu)選地至少約90mg，分別對應于至少約lmg/L，優(yōu)選地至少約I. 3mg/L,更優(yōu)選地至少約2. 3mg/L,更加優(yōu)選地至少約2. 7mg/L,且最優(yōu)選地至少約3mg/L的產(chǎn)量。在更加優(yōu)選的實施方案中，使用本發(fā)明范圍內(nèi)的給定的一組過程和參數(shù)獲得的產(chǎn)量是可重現(xiàn)的。例如，測量的產(chǎn)量可具有低于約40%的變異性，優(yōu)選地低于約35%的變異性，更優(yōu)選地低于約30%的變異性，更加優(yōu)選地低于約25%的變異性，且最優(yōu)選地低于約20%的變異性。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，在使用本文描述的方法和系統(tǒng)的純化期間，純化的非復合的肉毒桿菌毒素是穩(wěn)定的。已認為，從肉毒桿菌毒素復合物，諸如A型肉毒桿菌毒素復合物除去締合的非毒素蛋白產(chǎn)生顯著不穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素產(chǎn)物。然而，如上文所討論的，本發(fā)明提供了可穩(wěn)定分離游離的肉毒桿菌毒素(其不具有通常被認為是在純化過程 期間維持穩(wěn)定性所需的締合的非毒素蛋白)的方法和系統(tǒng)。在一些優(yōu)選的實施方案中，本文描述的方法和系統(tǒng)提供了需要非常少的色譜后步驟(例如在維持儲存期間的穩(wěn)定性方面和在藥物應用的適用性方面)的非復合的肉毒桿菌毒素。例如，如本領域所知的，可以將硫酸銨加入游離的肉毒桿菌毒素，以制備用于儲存的硫酸銨懸浮液。包含游離的肉毒桿菌毒素和硫酸銨的組合物可易于儲存在冰箱中，且隨后可容易地回復以用于藥物應用。事實上，可通過本文描述的方法獲得的毒素的穩(wěn)定性、高產(chǎn)量和純度，和高且穩(wěn)定的效價促進了純化的產(chǎn)物的藥物應用，如在下文更加詳細地描述的。純化的非復合的肉毒桿菌毒素的用途根據(jù)本發(fā)明純化的非復合的肉毒桿菌毒素可用于制備包含毒素作為活性成分的藥物組合物，所述藥物組合物用于施用給將從這種藥物組合物獲得益處的任何受試者。在優(yōu)選的實施方案中，待治療的受試者是哺乳動物，優(yōu)選人類。本文使用的“藥物組合物”指其中活性成分可以是肉毒桿菌毒素的制劑。制劑將含有至少ー種額外的成分，并且適合于向受試者(諸如人類患者)診斷性、治療性和/或美容性施用。藥物組合物可以是液體或固體；且可以是單組分或多組分系統(tǒng)，例如用稀釋劑(諸如鹽水)重構的凍干組合物。本發(fā)明的另一方面提供了純化的肉毒桿菌毒素分子至患者的施用。本文使用的“施用”指向受試者或患者提供藥物組合物。藥物組合物可通過本領域已知的任何方法施用，包括例如肌內(nèi)(i.m.)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下施用，鞘內(nèi)施用，顱內(nèi)、腹膜內(nèi)(i. p.)施用或施用的局部(透皮)和植入(例如緩釋裝置的植入)途徑。在某些優(yōu)選的實施方案中，純化的非復合的肉毒桿菌毒素在組合物中局部或通過注射施用，如美國專利申請No. 09/910,432 ；10/793，138 ；11/072, 026 ;11/073，307，11/824，393 和 12/154，982 (它們通過引用整體并入本文)所描述的。在某些實施方案中，包含非復合的肉毒桿菌毒素的硫酸銨懸浮液的組合物可容易地混合到藥物組合物中。例如，包含非復合的肉毒桿菌毒素蛋白的硫酸銨懸浮液可以被離心，以回收蛋白，且蛋白可以再溶解、稀釋和與一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合。在某些實施方案中，藥物組合物可包含非復合的肉毒桿菌毒素作為活性藥物成分，并還可包 含ー種或多種緩沖劑、載體、穩(wěn)定劑、防腐劑和/或填充劑。藥物組合物可以被凍干成粉末用于儲存，和被重構以進一歩使用。因此，本文描述的方法和系統(tǒng)可提供在易于制備方面特別適合于藥物應用的形式的肉毒桿菌毒素。藥物組合物可用于治療性、診斷性、研究性和/或美容性應用。例如,如上文所討論的，A型肉毒桿菌毒素在臨床上用于治療以骨骼肌活動過度為特征的神經(jīng)肌肉障礙，諸如自發(fā)性瞼痙攣、斜視、頸部肌張カ障礙和眉間紋(面部)皺紋。此外，在某些應用中，非復合的(約150kD)肉毒桿菌毒素是用于治療人類的優(yōu)選形式。參見例如Kohl A.等人Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox ) with the highly-purifiedneurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test(肉毒桿菌_素A (Botox )與高度純化的神經(jīng)毒素(NT 201)在趾短伸肌試驗中的效カ的比較)，MovDisord 2000;15(增刊3) : 165。因此,不同于肉毒桿菌毒素復合物,優(yōu)選地使用非復合的肉毒桿菌毒素來制備某些肉毒桿菌毒素藥物組合物。
實施例實施例I :本發(fā)明的方法與改進的Schantz方法的對比
將使用本發(fā)明范圍內(nèi)的方法的非復合的A型肉毒桿菌毒素的純化(“本發(fā)明的方法，，)直接對比基于傳統(tǒng)的Schantz方法，且通過加入色譜步驟(以提供非復合形式)而進一步改進的純化(“改進的Schantz方法”)。簡而言之，培養(yǎng)肉毒梭菌細菌，并使之生長，直到發(fā)酵完成(從接種到收獲，通常約72小時至約120小吋)。然后，在以下純化程序的每ー個中，使用30L體積的發(fā)酵培養(yǎng)物。所使用的改進的Schantz方法包括，常規(guī)地酸化發(fā)酵培養(yǎng)物以沉淀毒素，隨后超微過濾(UF)和滲濾(DF)以濃縮粗制毒素。將DNA酶和RNA酶加入到收獲的毒素中以消化(水解)核酸，然后通過另外的UF步驟，使用切向流過濾(300kD UF)將核酸除去。隨后，毒素用磷酸鹽緩沖液提取，隨后是三個連續(xù)的沉淀步驟冷こ醇沉淀；鹽酸沉淀和硫酸銨沉淀；其中毎次通常棄去上清液。該程序提供了 900kD A型肉毒桿菌毒素復合物，然后其經(jīng)受額外的色譜步驟以提供游離毒素。具體地，將毒素復合物再溶解，并經(jīng)受陰性成批吸附(negative batch adsorption)到DEAE樹脂上。然后,洗脫液在重力流動陰離子交換柱(DEAE-Sepharose)上運行，隨后是重力流動陽離子交換柱(CM-Sepharose)。測定產(chǎn)量,記錄該方法花費的時間長度(不計算發(fā)酵時間)，并通過SDS-PAGE分析測量純化的非復合的A型肉毒桿菌毒素的純度，并通過例如本領域技術人員已知的技術測定其效價。整個改進的Schantz方法重復三個不同批次(批號1、2和3)，且結果記錄在以下的表I中。根據(jù)本文描述的系統(tǒng)和方法，本發(fā)明的方法進行三個不同批次(批號4、5和6)。簡而言之，發(fā)酵培養(yǎng)物在低于25°C的溫度下經(jīng)受使用3M硫酸(將pH降至3. 5)的酸沉淀。然后，酸沉淀物經(jīng)受O. Ιμπι切向流過濾以濃縮細胞物質。然后，將pH調整至6，并加入核酸酶以減少宿主細胞核酸含量，隨后離心凈化以除去細胞碎片，并加入硫酸銨以O. 2 μ m死端過濾。然后，將濾液直接裝載至疏水相互作用柱，苯基瓊脂糖HP(GELife Sciences)，用下降梯度的硫酸銨洗脫，井分離產(chǎn)物峰。然后，將洗脫液稀釋至Tri s緩沖液pH 7.8中，以解離毒素復合物，然后將其裝載到陰離子交換柱Q XL瓊脂糖(GE Lifesciences)上，用上升梯度的氯化鈉洗脫，并再次收集產(chǎn)物峰。然后，將該洗脫液在磷酸鈉緩沖液中稀釋(以減少導電率)并裝載到陰離子交換柱Q XL瓊脂糖(對于批號4和5)或陽離子交換柱Source-S (GELife Sciences)(對于批號6)上，再次用上升梯度的氯化鈉洗脫，并收集和儲存最終的產(chǎn)物峰。該方法產(chǎn)生非復合的A型肉毒桿菌毒素。測定產(chǎn)量，記錄該方法花費的時間長度(不計算發(fā)酵時間)，并通過SDS-PAGE分析測量毒素的純度，并例如通過本領域技術人員已知的技術測定其效價。結果也記錄在以下的表I中。表I
權利要求
1.一種用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的方法，所述方法包括 (i)提供粗制的非復合的肉毒桿菌毒素； (ii)將所述粗制的非復合的肉毒桿菌毒素裝載到陰離子交換柱上，以允許通過所述陰離子交換柱俘獲所述非復合的肉毒桿菌毒素； (iii)從所述陰離子交換柱洗脫所述非復合的肉毒桿菌毒素，以得到包含所述非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液； (iv)用來自所述陰離子交換柱的所述洗脫液裝載陽離子交換柱，以允許通過所述陽離子交換柱俘獲所述非復合的肉毒桿菌毒素；和 (v)從所述陽離子交換柱洗脫純化的非復合的肉毒桿菌毒素。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述粗制的非復合的肉毒桿菌毒素通過以下獲得 獲得包含肉毒桿菌毒素復合物的樣品； 用所述樣品裝載疏水相互作用柱，以允許通過所述疏水相互作用柱俘獲所述肉毒桿菌毒素復合物； 從所述疏水相互作用色譜柱洗脫所述肉毒桿菌毒素復合物；和 解離所述肉毒桿菌毒素復合物，以獲得包含所述粗制的非復合的肉毒桿菌毒素的混合物。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述樣品是包含所述肉毒桿菌毒素復合物的上清液或濾液。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述樣品通過以下獲得 使包含肉毒桿菌毒素的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)受酸沉淀，以得到酸沉淀物；和 對所述沉淀物進行切向流過濾以濃縮沉淀物。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述樣品通過下列來獲得使發(fā)酵培養(yǎng)物的不溶性級分經(jīng)受切向流過濾。
6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述樣品在裝載至所述疏水相互作用柱之前，經(jīng)受核酸酶消化。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述核酸酶源自不含動物產(chǎn)物的過程。
8.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述方法基本上不含動物產(chǎn)物。
9.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素包括A、B、C1,D、F、F和G型肉毒桿菌毒素中的至少一種。
10.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素包括A型肉毒桿菌毒素。
11.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素是至少95%純的。
12.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素具有至少200LD50單位/ng的活性。
13.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述方法產(chǎn)生至少約2mg/L發(fā)酵培養(yǎng)物的產(chǎn)量。
14.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述陰離子柱選自Q瓊脂糖HP柱、Q瓊脂糖快流柱和Q XL瓊脂糖柱，且其中所述陽離子柱選自SP瓊脂糖柱、SP瓊脂糖HP柱、SP瓊脂糖快流柱、Mono S 柱、Source-S 柱、Source_30S 柱和 Source_15S 柱。
15.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素裝載到所述陰離子柱上的緩沖液選自TriS、biS-TriS、三乙醇胺和N-甲基二乙醇胺。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述緩沖液在7.4至8. 2的pH下使用。
17.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素裝載到所述陽離子柱上的緩沖液選自磷酸鈉、MES和HEPES。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述緩沖液在6.O至7. O的pH下使用。
19.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述陰離子柱的pH是7.4至8. 2。
20.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述陽離子柱的pH是6.O至7. O。
21.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素從所述陰離子柱洗脫的梯度選自氯化鈉的上升梯度和氯化鉀的上升梯度。
22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中所述梯度在7.4至8. 4的pH下使用。
23.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素從所述陽離子柱洗脫的梯度選自氯化鈉的上升梯度和氯化鉀的上升梯度。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述梯度在6.O至7. O的pH下使用。
全文摘要
提供了用于色譜純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法和系統(tǒng)。這些方法和系統(tǒng)允許以高純度和產(chǎn)量有效純化非復合形式的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，所述非復合形式的肉毒桿菌神經(jīng)毒素可在藥物制劑中用作活性成分。
文檔編號C02F1/28GK102666396SQ201080045567
公開日2012年9月12日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權日2009年10月21日
發(fā)明者C·L·魯格 申請人:雷文斯治療公司